包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法

2023-06-14 08:35:31 2

專利名稱：包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，特別涉及ー種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法。
背景技術：
SiRNA是一段21 — 25個鹼基對的RNA分子，發現於單細胞生物抵禦病毒侵襲的機制。單細胞生物針對入侵病毒的mRNA序列合成出一段與之互補的siRNA，主動結合mRNA，從而阻斷病毒的複製。siRNA因其獨特的靶點特異性、結構可設計性和代謝安全性，成為科研界普遍看好的新的治療藥物。然而，在過去的20年裡 ，研究人員設計了一系列的載體用於siRNA的體內輸送，但僅有極少數進入臨床階段，迄今，仍未有ー個載體得到FDA認證，一個有效載體的缺位，導致核酸物質體內輸送仍然處於臨床瓶頸期。將核酸物質輸送到靶細胞的胞漿或細胞核內，需要克服一系列的體內輸送屏障，因此，核酸載體是否高效，是其能否用於臨床治療的關鍵所在。核酸物質輸送的載體ー般為以下兩類(1)病毒載體病毒載體(如慢病毒載體、腺病毒載體)作為基因的輸送載體，雖然有較高的體外轉染活性，然而，其免疫原性與易導致突變的缺點為臨床試驗帶來了巨大的安全問題，使得其應用受限。(2)非病毒載體非病毒載體的優勢主要在於，在保證預期的轉染活性的條件下，可以大大降低病毒載體所帯來的免疫原性與諸多炎症反應，其一般為以下兩種載體設計(a)陽離子脂質體；(b)聚陽離子基因載體。而目前研究更多的主要集中於聚陽離子基因載體與陽離子脂質體的修飾，使之適用於基因物質的靶向輸送。陽離子脂質體具有較高的體內外轉染活性，然而，由於表面的正電荷影響其體內的正常分布，同時，由於選用陽離子脂質，免疫原性與炎症反應在動物試驗中也成為不可避免的缺點之一(Gao, K. &Huang, L. Nonviral methods for siRNA delivery. Molecularpharmaceutics6, 651-658(2008).)。魚精蛋白，是ー種天然的富含多精氨酸結構的多肽，表面帶有正電荷，可通過靜電作用カ壓縮核酸物質至納米尺度。目前，魚精蛋白已經用於高效的體內、體外的基因輸送載體。其優勢在幹，血漿敏感度低，在低質量比時，無免疫原性，低毒，成為基因輸送的優良載體。然而，存在的ー個問題是，沒有經過修飾的魚精蛋白基因顆粒，會產生一定的非靶組織粘附，同時，其血液半衰期也較低，易被血漿清除。鑑於此，諸多文獻中報導，可選用魚精蛋白與陽離子脂質體對DNA或者siRNA進行壓縮包封，即LPD- I (Iipopolyplexes),並在表面接枝PEG以及靶向基團，以延長體內循環時間，並提高靶向效率。但由於選用非天然的陽離子脂質，存在體內毒性與體內免疫原性等問題，同時，未能中和的陽離子表面的正電荷會引起體內非靶組織的粘附，並與血漿成分發生聚集，從而降低靶向效果，並直接影響體內病變細胞的內呑。

發明內容
本發明目的在於提供ー種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，以解決現有的以魚精蛋白與陽離子脂質體對DNA或者siRNA進行壓縮包封得到的納米顆粒，由於選用非天然的陽離子脂質，存在體內毒性和體內免疫原性的問題，並且，未能中和的陽離子表面的正電荷從而引起體內非靶組織的粘附，並與血漿成分發生聚集，從而降低靶向效果，並直接影響體內病變細胞的內吞的技術性問題。本發明目的通過以下技術方案實現—種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟I)以PEG為連續相製備親水相系統；2)將嵌段高分子、魚精蛋白和基因物質加入步 驟I)所製備的親水相系統中，攪拌或搖動，形成納米顆粒；3)用透析袋透析除去所述納米顆粒水相中留存的PEG，即可製得包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒。優選地，所述親水相系統中PEG的濃度為0. I 20wt%。優選地，所述基因物質與所述魚精蛋白的質量之和與所述嵌段高分子質量之比為I :0. f 1000，所述基因物質與所述魚精蛋白的質量比為0. rioo :1。優選地，所述透析袋的截留分子量為500(T20000Da，透析時間為6 72h。優選地，所述嵌段高分子包括依次連接的第一嵌段、第二嵌段和第三嵌段，所述第一嵌段和所述第三嵌段為親水嵌段，所述第二嵌段為疏水嵌段。優選地，所述第一嵌段可選自PEG或PE0。優選地，所述第二嵌段可選自聚乳酸、聚こ交酷、聚こ交酷-丙交酯共聚物或聚己內酯中的ー種。優選地，所述第三嵌段包括蛋白親和作用力強的高分子，所述蛋白親和作用力強的高分子選自葡聚糖、麥芽糖或殼聚糖中的ー種。優選地，所述嵌段高分子還包括靶向基團或螢光分子，所述靶向基團或所述螢光分子與所述第一嵌段連接。優選地，所述靶向基團可選自蛋白、多肽、抗體或小分子靶向基團的ー種或幾種；所述蛋白可選自轉鐵蛋白或去唾液酸糖蛋白；所述多肽可選自RGD或胰島素；所述小分子靶向基團可選自葉酸、生物素或半乳糖的ー種。優選地，所述螢光分子可選自羅丹明、FITC、NBD、cy5. 5或FAM的ー種。優選地，在步驟2)中，可將所述魚精蛋白與所述基因物質形成複合物後再加入步驟I)所製備的親水相系統中。優選地,所述基因物質包括DNA或RNA。優選地，在步驟2)中，攪拌或搖動的時間為0. 5 72h。優選地，所述嵌段高分子的合成方法包括以下步驟I)以mPEG-COOH為引發劑，在Sn(Oct)2的催化下，在8(Tl40°C條件下於無水甲苯中引發開環聚合，加入己內酷，反應進行10 72h，合成PEG45-PCL3tl嵌段；2)將葡聚糖與こニ胺按照I: (T50)的摩爾比投料，即稱取葡聚糖，こニ胺，溶解於2 50mL的DMSO中，混合物在0 80で油浴中反應2 10天，每天加入(T50mg氰基硼氫化鈉；反應結束後，加入大量甲醇沉澱，過濾，再加水溶解，甲醇沉澱，反覆三次，最後將產物於室溫下真空乾燥，得到淡黃色還原氨化的DEX-EDA;3)將DEX-EDA的氨基與mPEG45-PCL3Q-C00H的羧基進行反應，稱取DEX-EDA，加入1"10倍摩爾量的PEG-PCL，溶解於I 50mL的DMSO中，加入0 50倍摩爾量的三こ胺，攪拌I 60min後，加入(T50倍摩爾量的2- (7-偶氮苯並三氮唑)-N, N，N，，N，-四甲基脲六氟磷酸酷，在(T90°C下反應2 48h;反應結束後，加入こ醚沉澱，減壓抽濾，產物加入超純水，溶解後，用截留分子量為100(T20000的透析袋透析除去雜質與未反應的反應物，於-2(T-200°C預凍，低溫凍幹，得到白色粉末產物。與現有技術相比，採用本發明的製備方法製成的納米顆粒，可實現基因物質的輸送，並且，不存在體內毒性和體內免疫原性的問題，由於納米顆粒不帶電荷，還可避免體內非靶組織的粘附，並可接枝靶向基團，實現 體內病變細胞靶向，從而有效提高靶向效果，且不影響體內病變細胞的內吞。


圖I為本發明的嵌段高分子結構及合成方法示意圖；圖2為本發明的嵌段高分子的核磁譜圖；圖3為本發明的嵌段高分子的核磁譜圖；圖4為本發明的納米顆粒的製備示意圖；圖5為本發明的納米顆粒螢光共定位結構驗證的示意圖；圖6為本發明的嵌段高分子的細胞毒性檢測示意圖；圖7為本發明的細胞內吞攝取結果示意圖。
具體實施例方式以下結合實施例詳細說明本發明。實施例在以本發明技術方案為前提下進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程。但所舉實施例並非用於限定本發明的保護範圍。本發明對嵌段高分子與protamine/DNA所形成的納米顆粒的理化性質表徵方法包括動態光散射和zeta電位測試。按本方案製備的納米顆粒的細胞攝取、基因轉染和小動物活體成像觀察選用的DNA為小牛胸腺DNA，細胞毒性選用的細胞為Hela、H印G2、SMMC-7721細胞，內吞試驗選用SMMC-7721細胞。實施例I嵌段高分子PEG45-PCL3ci-DEX的合成方法嵌段高分子PEG-PCL-DEX的合成路線如圖I所示。整個反應在無水無氧的環境中進行，將PEG、聚己內酷、辛酸亞錫加至三頸瓶中，加入無水甲苯，於120°C下攪拌反應24小吋，反應完成後加入こ醚沉澱，濾餅加入少量ニ氯甲烷溶解，再用こ醚沉澱，反覆三次，洗除小分子雜質，得到PEG45-PCL3tl嵌段高分子產物，真空乾燥，備用。將葡聚糖與こニ胺溶解於DMSO中，在60°C的油浴中反應8天，同吋，每天補加IOmg氰基硼氫化鈉。反應結束後，加入大量甲醇沉澱，過濾，再加水溶解、甲醇沉澱，反覆三次，最後將產物於室溫下真空乾燥，得到淡黃色還原氨化的DEX-EDA。取 DEX-EDA 與 mPEG45-PCL3Q-C00H，溶解於 20mL 的 DMSO 中，加入適量三こ胺(TEA)，攪拌，而後加入2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N，N，N』，N』-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，在室溫下反應24h。加入こ醚沉澱，產物加入超純水溶解，用截留分子量為10000的透析袋透析除去雜質，_80°C預凍，凍幹，得到白色粉末產物。其1H-NMR 圖譜如圖 2、3 所示在 1H-NMR 圖譜 1H-NMR(DMS0-d6，400MHz):其峰歸屬見圖2、圖3。在圖2中，化學位移為2. 82ppm處出現的峰為DEX還原氨化後的こニ胺上亞甲基的峰，而圖3中，在化學位移為4. 79ppm,4. 63ppm, 4. 87飛.12ppm處，為DEX的特徵化學位移，3. 98ppm, 2. 36ppm, I. 58ppm, I. 27ppm 為 PEG-PCL-DEX 中 PCL 嵌段的化學位移，而在3. 5Ippm處，為PEG嵌段中亞甲基的化學位移。實施例2 PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA ニ元複合物的製備配製PEG (MW8000)外水相溶液，PEG的濃度為10wt%，於外水相溶液中加入基因物質、魚精蛋白和嵌段高分子，其中，基因物質與魚精 蛋白的質量之和與嵌段高分子質量之比為7 :30，基因物質與魚精蛋白的質量比為1:1.5。在50°C油浴下磁力攪拌24h，即可得到內水相為protamine-DNA或siRNA複合物的載體結構，最後，採用截留分子量為10000的透析袋透析，除去水相中留存的PEG。具體製備方法，見圖4。實施例3 PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA ニ元複合物的製備配製PEG (MW8000)外水相溶液，PEG的濃度為0. lwt%，於外水相溶液中加入基因物質、魚精蛋白和嵌段高分子，其中，基因物質與魚精蛋白的質量之和與嵌段高分子質量之比為I :0. 1，基因物質與魚精蛋白的質量比為0. I :1。在50°C油浴下磁力攪拌24h，即可得到內水相為protamine-DNA或siRNA複合物的載體結構，最後，採用截留分子量為10000的透析袋透析，除去水相中留存的PEG。具體製備方法，見圖4。實施例4 PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA ニ元複合物的製備配製PEG (MW8000)外水相溶液，PEG的濃度為20wt%，於外水相溶液中加入基因物質、魚精蛋白和嵌段高分子，其中，基因物質與魚精蛋白的質量之和與嵌段高分子質量之比為I :1000，基因物質與魚精蛋白的質量比為100: I。在50°C油浴下磁力攪拌24h，即可得到內水相為protamine-DNA或siRNA複合物的載體結構，最後，採用截留分子量為10000的透析袋透析，除去水相中留存的PEG。具體製備方法，見圖4。實施例5 PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA ニ元複合物納米顆粒的突光共定位表徵按照上述方法製備PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA ニ元複合物的納米顆粒，通螢光共定位對其進行表徵，具體做法如下，將小牛胸腺DNA用H0echst22258 (藍色)螢光染料標記，並同時用nile red標記嵌段高分子的疏水PCL嵌段，觀察結果見圖5，紅色(nilered)和緑色(FITC)在相同位置出現並重合，驗證了納米顆粒的形成。實施例6PEG-PCL-DEX包裹的protamine/DNA ニ元複合物納米顆粒的粒徑與電位的表徵通過粒徑與電位的測定對納米顆粒結果進行表徵，電位的變化，經過PEG-PCL-DEX包裹後納米顆粒的電位在OmV左右，而未經過包裹的protamine-DNA複合物顆粒明顯帶過量正電荷，由此可以直觀證明本發明的嵌段高分子材料可以屏蔽電荷。由測定結果可得，其粒徑分布比較均勻，結果見表I。表I不同複合物的粒徑與電位變化結果
權利要求
1.一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟 1)以PEG為連續相製備親水相系統； 2)將嵌段高分子、魚精蛋白和基因物質加入步驟I)所製備的親水相系統中，攪拌或搖動，形成納米顆粒； 3)用透析袋透析除去所述納米顆粒水相中留存的PEG，即可製得包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒。
2.如權利要求I所述的一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所述親水相系統中PEG的濃度為O. I 20wt%。
3.如權利要求I所述的一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所述基因物質與所述魚精蛋白的質量之和與所述嵌段高分子質量之比為I :O.f 1000，所述基因物質與所述魚精蛋白的質量比為O. Γ100 :1。
4.如權利要求I所述的一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所述透析袋的截留分子量為500(T20000Da，透析時間為6 72h。
5.如權利要求I所述的一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所述嵌段高分子包括依次連接的第一嵌段、第二嵌段和第三嵌段，所述第一嵌段和所述第三嵌段為親水嵌段，所述第二嵌段為疏水嵌段。
6.如權利要求5所述的一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所述第一嵌段可選自PEG或PEO。
7.如權利要求5所述的一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所述第二嵌段可選自聚乳酸、聚乙交酯、聚乙交酯-丙交酯共聚物或聚己內酯中的一種。
8.如權利要求5所述的一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所述第三嵌段包括蛋白親和作用力強的高分子，所述蛋白親和作用力強的高分子選自葡聚糖、麥芽糖或殼聚糖中的一種。
9.如權利要求5所述的一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所述嵌段高分子還包括靶向基團或螢光分子，所述靶向基團或所述螢光分子與所述第一嵌段連接。
10.如權利要求9所述的一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所述靶向基團可選自蛋白、多肽、抗體或小分子靶向基團的一種或幾種；所述蛋白可選自轉鐵蛋白或去唾液酸糖蛋白；所述多肽可選自RGD或胰島素；所述小分子靶向基團可選自葉酸、生物素或半乳糖的一種。
11.如權利要求9所述的一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所述螢光分子可選自羅丹明、FITC、NBD、cy5. 5或FAM的一種。
12.如權利要求I所述的一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，其特徵在於，在步驟2)中，可將所述魚精蛋白與所述基因物質形成複合物後再加入步驟I)所製備的親水相系統中。
13.如權利要求I所述的一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所述基因物質包括DNA或RNA。
14.如權利要求I所述的一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，其特徵在於，在步驟2)中，攪拌或搖動的時間為O. 5 72h。
15.如權利要求I所述的一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法，其特徵在於，所述嵌段高分子的合成方法包括以下步驟 1)以mPEG-COOH為引發劑，在Sn(Oct)2的催化下，在8(Tl40°C條件下於無水甲苯中引發開環聚合，加入己內酯，反應進行10 72h，合成PEG45-PCL3tl嵌段； 2)將葡聚糖與乙二胺按照I:(1飛0)的摩爾比投料，即稱取葡聚糖，乙二胺，溶解於2 50mL的DMSO中，混合物在(T80°C油浴中反應2 10天，每天加入(T50mg氰基硼氫化鈉；反應結束後，加入大量甲醇沉澱，過濾，再加水溶解，甲醇沉澱，反覆三次，最後將產物於室溫下真空乾燥，得到淡黃色還原氨化的DEX-EDA; 3)將DEX-EDA的氨基與mPEG45-PCL3Q-C00H的羧基進行反應，稱取DEX-EDA，加入I 10倍摩爾量的PEG-PCL，溶解於I 50mL的DMSO中，加入0 50倍摩爾量的三乙胺，攪拌I 60min後，加入(Γ50倍摩爾量的2-(7-偶氮苯並三氮唑)-N，N，N』，N』 -四甲基脲六氟磷酸酯，在(T90°C下反應2 48h ;反應結束後，加入乙醚沉澱，減壓抽濾，產物加入超純水，溶解後，用截留分子量為100(Γ20000的透析袋透析除去雜質與未反應的反應物，於-2(T-200°C預凍，低溫凍幹，得到白色粉末產物。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域，特別涉及一種包括魚精蛋白和基因物質的納米顆粒的製備方法。本發明的製備方法，包括以下步驟1)以PEG為連續相製備親水相系統；2)將嵌段高分子、魚精蛋白和基因物質加入步驟1)所製備的親水相系統中，攪拌或搖動，形成納米顆粒；3)用透析袋透析除去所述納米顆粒水相中留存的PEG，即可製得納米顆粒。與現有技術相比，採用本發明的製備方法製成的納米顆粒，可實現基因物質的輸送，並且，不存在體內毒性和體內免疫原性的問題，由於納米顆粒不帶電荷，還可避免體內非靶組織的粘附，並可接枝靶向基團，實現體內病變細胞靶向，從而有效提高靶向效果，且不影響體內病變細胞的內吞。
文檔編號C08G63/08GK102764442SQ201210248240
公開日2012年11月7日 申請日期2012年7月18日 優先權日2012年7月18日
發明者吳飛, 張奇昕, 段詩悅, 葛雪梅, 蔡雲鵬, 袁偉恩, 金拓 申請人:上海交通大學