利用幼胚拯救獲得菊屬遠緣雜種的方法
2023-06-14 15:18:06 2
專利名稱：利用幼胚拯救獲得菊屬遠緣雜種的方法
技術領域：
本發明利用幼胚拯救獲得菊屬遠緣雜種的方法涉及原產中國的菊屬野生種、栽培菊花品種用於菊花種質創新和育種的方法，屬於生物技術育種領域。
二、技術背景我國是栽培菊花的起源中心和菊屬種質資源的分布中心，37種狹義菊屬(Dendranthema)植物在我國分布的有22種，佔60％左右，特有資源豐富，菊花近緣種屬植物中含有許多栽培菊花所缺乏的優異性狀，如神農香菊(D.lavandulifolum var.aromaticum)的香味，蒙菊的抗旱性，小山菊、北極菊(D.arctium)、阿爾菊(Chrysanthemum alpinum)的抗寒性。
菊花(Dendranthema×grandiflorum)原產我國，是中國十大傳統名花和世界四大切花之一，國內菊花品種3000個以上，是盆栽、切花和園林地被綠化的重要花卉種類，在花卉生產中佔有十分重要的地位。
菊屬植物許多種間，尤其是倍數性比較接近的小花型菊花間容易雜交，這為我們將菊花近緣種屬植物的優良基因導入栽培菊花，進行菊花種質創新和新品種選育成為可能。英國薩頓種子公司(Sutton Seed Co.)早在二十世紀四十年代就以栽培菊花品種與野菊雜交，育成了生長旺盛，適合作巖石植物或懸崖盆景的懸崖小菊(Boase M.R.et al.，1997)。Douzono M.等(1998)利用D.shiwogiku為親本開展了抗病切花小菊新品種選育；Shibata M.(1988b)等利用D.pacificum與14個栽培菊品種雜交育成了抗逆型強的早花性小菊品種，De Jong，J.等(1989)又利用D.pacificum為親本育出了系列切花小菊和盆栽商品菊。在國內，ChenJunyu等(1995)利用毛華菊、小紅菊與美國引進的栽培菊花品種雜交選育出了植株低矮、花朵繁密、抗性強的地被菊新品種群；Chen Xiulan等(1995)利用菊花腦與引自荷蘭的菊花品種雜交育成了耐高溫的小菊新品種。與國外相比，我國有豐富的菊屬植物種質資源，但在菊屬種質資源的研究和開發利用方面還相當薄弱，僅有零星報導，許多物種的優良性狀，特別是各種抗性基因尚未得到充分挖掘和利用，亟待重視和加強。
我國分布的特有菊屬植物多數為二倍體(2n＝2x＝18)。椐研究，在不同菊屬植物雜交中，當二倍體為父本與高倍性物種雜交時，花粉管太短，到達不了胚囊而完成受精(Kaneko K.)；反交時，則因雜種胚早期敗育，得不到雜種(WatanabeK.)。因此，用常規雜交手段很難將這些物種中的優良基因導入栽培菊花[一般為六倍體(2n＝6x＝54)及其非整倍體]。幼胚拯救是有效克服雜種胚敗育而獲得遠緣雜種的重要途徑，但因菊屬植物的未成熟胚小，難以進行切割，因此該技術在菊屬研究中的應用還不多，僅Anderson(1990)和Watannabe(1977)等作過報導，Watannabe利用兩個二倍體的野生菊(Ch.boreale，Ch.makinoi)和多倍體栽培菊花雜交後進行胚拯救，獲得不同倍性的雜種，雜種的外部形態性狀相似於多倍體，同時還得到孤雄生殖的單倍體。因此，利用原產我國的菊屬野生資源，通過幼胚拯救技術獲得栽培菊花品種與各種菊屬野生植物種間雜種，進行菊花種質創新，將是我國菊花抗病蟲育種和抗逆育種取得重要突破的關鍵所在。
發明內容
技術問題 本發明的目的是針對目前菊花資源遺傳基礎狹窄，抗性弱這一現狀，提供一套利用幼胚拯救獲得菊屬遠緣雜種的方法，並創造一批菊屬遠緣雜種。達到擴大菊花基因庫，引進野生種中優異的性狀(基因)目標，形成一套菊花品種改良和育種的方法。
技術方案 本發明利用幼胚拯救獲得菊屬遠緣雜種的方法，包括；1)菊屬種間雜交後代材料的的獲得選擇原產我國的菊屬二倍體野生種菊花腦(D.nankingense)，栽培菊花品種六倍體『黃英』於溫室內進行雜交，以二倍體野生種菊花腦為母本進行人工去雄並套袋隔離，父本栽培菊花『黃英』在舌狀花微開時套袋，於上午9～10時或下午3～4時授粉，同一花序重複授粉2次；雜交後採用子房培養手段進行幼胚拯救，接種時取雜交授粉後13～18d的頭狀花序，剝取邊緣舌狀花的子房，以75％酒精表面消毒30s後置於0.1％(質量比)的升汞溶液中滅菌5min，無菌水衝洗4～5次後用接種針將子房接入MS添加KT2.0mg/L，IAA2.0mg/L；BA2.0mg/L，NAA2.0mg/L的培養基上，每瓶接種子房15～20個，每處理重複12～18瓶；30d後轉入繼代培養，繼代培養基為MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，得到幼苗後轉入MS+BA0.2mg/L的培養基中擴繁，在MS添加NAA0.1mg/L的培養基上生根，培養溫度20～25℃，每日光照10～12h，光照度1600～2000lx，獲得菊屬二倍體野生種菊花腦與栽培菊花品種六倍體『黃英』的種間雜交後代材料。
2)菊屬種間雜種的鑑定對獲得的後代材料同時進行雜種RAPD鑑定、雜種細胞學鑑定、雜種形態學鑑定，其中在雜種RAPD鑑定時，對獲得的種間雜交後代材料進行分子標記鑑定，提取父母本及後代材料的DNA，然後進行PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳，獲得擴增譜帶；在雜種細胞學鑑定時，對後代材料進行染色體減數分裂觀察；在雜種形態學鑑定時，對雜交父母本及後代材料的形態學進行觀察與統計；選擇擴增譜帶中出現母本不具有的父本特異帶或雙親均不具有的帶、染色體倍性為四倍體、形態學特徵為株高27～40cm，冠徑44～60cm，分枝性中等～強，葉長4.6～6.8cm，寬3.0～4.7cm，葉裂中等～深，有託葉，莖紫色，莖及葉片上被絨毛；花序直徑1.8～3.2cm，黃色，初開9月10～20日，盛開9月23日～10月15日，舌狀花17～23，管狀花77～116的後代材料，即為獲得的菊屬二倍體野生種菊花腦與栽培菊花品種六倍體『黃英』的種間雜交種。
有益效果 本發明提供的利用幼胚拯救獲得菊屬遠緣雜種的方法，與現有技術相比具有如下優點和積極效果(1)本發明利用我國原產的菊屬野生種，結合幼胚拯救技術進行菊花種質創新，拓寬了栽培菊花的遺傳基礎，引進了野生種中的優異基因，實現了菊屬種間遠緣雜交，創造了一批新種質。
(2)在幼胚拯救技術上比較了不同培養基、不同激素配比、不同胚齡等的效果，篩選出培養胚齡以13～18d最好，培養基以MS添加KT2.0mg/L+IAA2.0mg/L；BA2.0mg/L+NAA2.0mg/L效果較好。
(3)利用RAPD技術對菊屬種間雜種進行早期鑑定。
(4)利用染色體減數分裂觀察方法對菊屬種間雜種進行鑑定。
(5)獲得了一批我國原產菊屬野生種與栽培菊花的種間雜種。
(6)在本發明基礎上，使利用創新的菊花種質進行菊花育種成為可能，同時可進行菊屬染色體組分析、菊花起源演化及菊屬親緣關係研究。
四
圖1、菊花腦與栽培菊花『黃英』雜交後代的RAPD鑑定菊花腦×『黃英』雜種RAPD分析.引物B02.1.菊花腦；2.『黃英』；3～7.後代材料.
圖2、菊花腦與栽培菊花『黃英』雜種減數分裂染色體配對情況菊花腦(2n＝2x＝18)×『黃英』(2n＝6x＝54)雜種減數分裂染色體配對情況(2n＝4x＝36).
圖3、菊花腦與栽培菊花『黃英』雜種及其父母本的葉、花序形態菊花腦×『黃英』雜種及親本的葉、花序特徵.1.菊花腦；7.『黃英』；2～6.雜種.
五具體實施例方式
本發明所提供的菊屬遠緣雜種幼胚拯救和雜種鑑定的方法，其實施方式如下1.菊屬種間雜交後代材料的的獲得1.1材料選擇選擇原產我國的菊屬二倍體野生種菊花腦(D.nankingense)，栽培菊花品種六倍體『黃英』(均為公知公用品種，見參考文獻李鴻漸，邵建文.《中國菊花》.南京江蘇科學技術出版社，1993，4)。
1.2幼胚拯救及雜種獲得於溫室內進行雜交，二倍體野生種菊花腦為母本與栽培菊花『黃英』雜交，母本進行人工去雄並套袋隔離，父本在舌狀花微開時套袋，於上午9～10時或下午3～4時授粉，同一花序重複授粉2次。雜交後採用子房培養手段進行幼胚拯救，接種時取雜交授粉後13～18d的頭狀花序，用鑷子剝取邊緣舌狀花的子房，以75％酒精表面消毒30s後置於0.1％的升汞溶液中滅菌5min，無菌水衝洗4～5次後用接種針將子房接入MS添加KT2.0mg/L，IAA2.0mg/L；BA2.0mg/L，NAA2.0mg/L的培養基上，每瓶接種子房15～20個，每處理重複12～18瓶。30d後轉入繼代培養，以後每月繼代一次，繼代培養基為MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，得到幼苗後轉入MS+BA0.2mg/L的培養基中擴繁，在MS添加NAA0.1mg/L的培養基上生根。培養溫度20～25℃，每日光照10～12h，光照度1600～2000lx。獲得菊屬二倍體野生種菊花腦與栽培菊花品種六倍體『黃英』的種間雜交後代材料。
2.菊屬種間雜種的鑑定2.1雜種RAPD鑑定(方法見參考文獻戴思蘭等.DNA提純方法對9種菊屬植物RAPD的影響，園藝學報，1996，23(2)169～174.)對獲得的後代材料進行早期分子標記鑑定，提取父母本及後代材料的DNA，然後進行PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳，當後代材料的擴增譜帶中出現母本不具有的父本特異帶或雙親均不具有的帶時，即可判定其為真雜種，否則為假雜種。菊花腦與栽培小菊『黃英』及其後代材料的擴增譜帶見圖1，其中4、5、6號單株具有父本的特異帶，為真雜種；菊花腦(2n＝2x＝18)與栽培小菊『黃英』(2n＝6x＝54)雜交後代減數分裂染色體配對情況見圖2，染色體數為36的，為真雜種。
上述RAPD鑑定的方法為，每材料於不同單株上分別取新鮮嫩葉，於研缽中用液氮混合磨樣。樣品DNA提取參照SDS法。DNA質量的檢測應用紫外分光光度計(PERKIN ELMER MBA 2000)檢測，測定OD260、OD260/OD280。RAPD隨機引物、dNTP、Tap DNA聚合酶、瓊脂糖(進口Spanish分裝)均購自南京生通生物技術有限責任公司。擴增反應採用20μl反應體系2mmol/L MgCl2、10×buffer 2.5μl、0.2mmol/L dNTP、1mmol/L引物、1U Taq E、模板DNA 15ng、ddH2O。反應體系於美國MJ-Research公司PTC-0100型擴增儀中進行PCR擴增，反應程序93℃預變性3min；93℃1min，退火36℃1min，72℃2min，循環40次；延伸72℃10min。擴增產物用1.5％的瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL EB)電泳分離，用紫外成像系統(上海復日公司生產的FR-200紫外與可見分析裝置)觀察並拍照。
2.2雜種細胞學鑑定對後代材料進行染色體減數分裂觀察，如果後代材料的染色體倍性介於雙親之間(如二倍體與六倍體雜交後代為四倍體)，即可判定其為真雜種。
減數分裂研究方法為于晴天上午8時至11時，取直徑2～6mm大小的花蕾，剝去外層膜質苞片，立即用3份95％酒精1份冰醋酸的固定液固定，於冰箱中保存備用。製片時，取出頭狀花序，置於60℃1N HCL中解離5～15min，席夫試劑染色至管狀花呈紫紅色，取管狀花的花葯，在45％醋酸中壓片，用臨時片統計染色體數和照相。
2.3雜種形態學鑑定將雜交父母本及後代材料雜種於4月份同時定植在田間，6月起開始對雜交父母本及後代材料的形態學進行觀察與統計，後代材料的莖、葉、花序等形態學特徵介於雙親之間、出現父本特異性狀或雙親不具有的新的性狀，即可判定其為真雜種。
上述形態學鑑定的方法為，將雜交父母本及後代材料同時定植在田間，對它們進行性狀觀察和登記，性狀登記均按李鴻漸(1993)標準(李鴻漸，邵建文.《中國菊花》.南京江蘇科學技術出版社，1993，4)進行，花色以英國皇家園藝學會的色譜為標準(Colour chart，the Royal Hort.Culture Society，London，1996)。依據雜交父母本及雜種的表現型對所得的可能的雜種植株進行鑑定。
對雜交父母本及後代材料的初步觀察表明新材料的株型、冠幅、株高、葉、花序等形態特徵介於雙親之間，具有父母本綜合性狀；同時具備某些父本特異性狀，如二倍體野生種菊花腦莖為綠色、莖、葉光滑無毛、無託葉，栽培菊花『黃英』的莖為紫色、有託葉、莖及葉上均被絨毛，菊花腦與『黃英』雜種表現父本『黃英』莖紫色、有託葉、莖及葉被絨毛的特點。菊花腦與栽培小菊『黃英』及經RAPD鑑定與形態學觀察判定為真雜種的葉、花序見圖3。菊花腦、栽培小菊『黃英』及菊花腦×『黃英』組合雜種的形態特徵描述如下菊花腦莖直立，株高20～160cm，冠徑17～46cm，分枝性中等，葉長5.8cm，寬3.0cm，葉裂淺，無託葉，莖綠色，莖及葉片上均無毛；花序直徑1.7cm，黃色，花期10～11月，舌狀花16，管狀花108。
『黃英』(D.morifolium『Huangying』)株高25cm，冠徑46cm，分枝性中等，葉長6.2cm，寬4.9cm，葉裂淺，有託葉，莖紫色，莖及葉片上被絨毛；花序直徑3.9cm，黃色，初開10月10日，盛開10月24日，舌狀花23，管狀花126。
菊花腦與『黃英』雜種1株高31cm，冠徑47cm，分枝性強，葉長4.9cm，寬3.0cm，葉裂中等，有託葉，莖紫色，莖及葉片上被絨毛；花序直徑1.8cm，黃色，初開9月10日，盛開9月23日，舌狀花23，管狀花77。
菊花腦與『黃英』雜種2株高35cm，冠徑57cm，分枝性強，葉長6.8cm，寬4.1cm，葉裂中等，有託葉，莖紫色，莖及葉片上被絨毛；花序直徑3.2cm，黃色，初開9月15日，盛開10月5日，舌狀花21，管狀花115。
菊花腦與『黃英』雜種3株高40cm，冠徑60cm，分枝性強，葉長5.7cm，寬3.8cm，葉裂中等，有託葉，莖紫色，莖及葉片上被絨毛；花序直徑2.3cm，黃色，初開9月20日，盛開10月8日，舌狀花17，管狀花100。
菊花腦與『黃英』雜種4株高29cm，冠徑46cm，分枝性中等，葉長5.7cm，寬4.7cm，葉裂深，有託葉，莖紫色，莖及葉片上被絨毛；花序直徑2.9cm，黃色，初開9月20日，盛開10月8日，舌狀花22，管狀花107。
菊花腦與『黃英』雜種5株高27cm，冠徑44cm，分枝性中等，葉長4.6cm，寬4.0cm，葉裂深，有託葉，莖紫色，莖及葉片上被絨毛；花序直徑2.7cm，黃色，初開9月20日，盛開10月15日，舌狀花18，管狀花116。
權利要求
1.利用幼胚拯救獲得菊屬遠緣雜種的方法，包括；1)菊屬種間雜交後代材料的的獲得選擇原產我國的菊屬二倍體野生種菊花腦(D.nankingense)，栽培菊花品種六倍體『黃英』於溫室內進行雜交，以二倍體野生種菊花腦為母本進行人工去雄並套袋隔離，父本栽培菊花『黃英』在舌狀花微開時套袋，於上午9～10時或下午3～4時授粉，同一花序重複授粉2次；雜交後採用子房培養手段進行幼胚拯救，接種時取雜交授粉後13～18d的頭狀花序，剝取邊緣舌狀花的子房，以75％酒精表面消毒30s後置於0.1％(質量比)的升汞溶液中滅菌5min，無菌水衝洗4～5次後用接種針將子房接入MS添加KT2.0mg/L，IAA2.0mg/L；BA2.0mg/L，NAA2.0mg/L的培養基上，每瓶接種子房15～20個，每處理重複12～18瓶；30d後轉入繼代培養，繼代培養基為MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，得到幼苗後轉入MS+BA0.2mg/L的培養基中擴繁，在MS添加NAA0.1mg/L的培養基上生根，培養溫度20～25℃，每日光照10～12h，光照度1600～2000lx，獲得菊屬二倍體野生種菊花腦與栽培菊花品種六倍體『黃英』的種間雜交後代材料；2)菊屬種間雜種的鑑定對獲得的後代材料同時進行雜種RAPD鑑定、雜種細胞學鑑定、雜種形態學鑑定，其中在雜種RAPD鑑定時，對獲得的種間雜交後代材料進行分子標記鑑定，提取父母本及後代材料的DNA，然後進行PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳，獲得擴增譜帶；在雜種細胞學鑑定時，對後代材料進行染色體減數分裂觀察；在雜種形態學鑑定時，對雜交父母本及後代材料的形態學進行觀察與統計；選擇擴增譜帶中出現母本不具有的父本特異帶或雙親均不具有的帶、染色體倍性為四倍體、形態學特徵為株高27～40cm，冠徑44～60cm，分枝性中等～強，葉長4.6～6.8cm，寬3.0～4.7cm，葉裂中等～深，有託葉，莖紫色，莖及葉片上被絨毛；花序直徑1.8～3.2cm，黃色，初開9月10～20日，盛開9月23日～10月15日，舌狀花17～23，管狀花77～116的後代材料，即為獲得的菊屬二倍體野生種菊花腦與栽培菊花品種六倍體『黃英』的種間雜交種。
全文摘要
本發明利用幼胚拯救獲得菊屬遠緣雜種的方法，屬於生物技術育種領域。選擇原產我國的菊屬二倍體野生種菊花腦與栽培菊花品種六倍體『黃英』雜交，採用子房培養手段進行幼胚拯救，對獲得的後代材料同時進行雜種RAPD鑑定、雜種細胞學鑑定、雜種形態學鑑定，選擇擴增譜帶中出現母本不具有的父本特異帶或雙親均不具有的帶、染色體倍性為四倍體、莖、葉、花序等形態學特徵介於雙親之間、出現父本特異性狀或雙親不具有的新的性狀的後代材料，即為獲得的種間雜交品種，實現了菊屬種間遠緣雜交，創造了一批新種質。
文檔編號A01H1/02GK1561694SQ200410014720
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月22日 優先權日2004年4月22日
發明者陳發棣, 李辛雷, 房偉民, 崔娜欣, 管志勇 申請人:南京農業大學