一種時間分辨螢光免疫層析法的製作方法

2023-06-14 19:00:46 1

本發明屬於生物檢測領域，具體涉及一種時間分辨螢光免疫層析法。

背景技術：

時間分辨免疫螢光法是一種成熟的目標化合物濃度測量方法，其利用長壽命螢光標記物對待測液體中的目標化合物進行基於免疫反應的結合，並利用其較長的螢光萃滅時間進行螢光亮度的測量，最終推算出目標化合物的濃度。免疫層析法是一種比較便捷的目標物質標記、分離方法，其利用層析原理使得與目標化合物免疫結合的標記物在基底的不同位置富集分離，並藉此獲得事宜的測量條件，由於標記物可以是膠體金、量子點、鑭系元素、有機納米粒子、納米磁性材料、碳納米管等，故其並不先天的與時間分辨免疫螢光法搭配。但從目前的生物測量領域商業應用現實來看，能快速並準確測定有機目標化合物含量的產品一般都將上述方法搭配使用。

大部分物質分子在被特定激發光(主要是紫外光)照射時會躍遷至激發態,處於激發態分子以輻射的形式將一部分能量釋放出來並回復到基態的現象稱為光致發光。最常見的兩種光致發光現象是螢光和碟光。當物質經過某特定波長的紫外光照射後,在極短時間內激發產生比入射光波長更長的出射光,這種光就稱為螢光。螢光效應指的是當激發光停止照射時,發光現象也同時消失

一般情況下螢光物所發射螢光會在停止激發光照後熄滅(10us內)，而對於某些長壽命螢光物(鑭系離子等)，其可以在激發光熄滅後一個較長的時間段內(500us以上)發出可測得的螢光(即螢光萃滅時間較長)。因為與本發明的主體內容無直接關聯，此處不再詳細介紹長壽命螢光物的發光原理。將長壽命螢光物作為標記物螯合物後，其可基於免疫原理對待測液體中的目標化合物進行標記，一方面，螢光的多寡即代表了目標化合物的多寡；另一方面，由於長壽命螢光比其他物質具有更長的發光時間，故可以在激發光熄滅一段時間後(100us後)進行螢光強度(或螢光發光功率)的測量，以避免雜物螢光的幹擾。時間分辨免疫螢光法正是建立在這種原理上的。

為了測定的準確性，需要保證待測液體與標記物試劑(螢光物)充分接觸後分離，目前的方法主要有兩種，可稱為水洗法與層析法。

水洗法多用於實驗室環境中(包括固相法與均相法)，其步驟一般包括對於反應基底(基底上可以是對待測液有效成分敏感的抗體或抗原)的「浸染-等待-褪液-衝洗」過程，在單次反應物不具備優良螢光特性的情況下，某些實驗中存在利用可發螢光競爭物或抗體物進行「螢光上色」的「二次浸染-二次衝洗」步驟，最後的測得螢光強度即能與待測液體有效成分濃度成相應比例關係。

層析法在快速測定領域應用廣泛，其必須依賴具備對待測液體具有層析效應的吸附性基底。在將一定濃度的待測液體滴加在基底上後，溶液通過層析作用向前移動,

a)溶解固化在基底特定位置(結合墊)的標記物後與之發生特異性反應；

b)進一步移動到測試線處，一種可能是已經與標記物結合的目標化合物會在此被固化在「測試線」上的某些化合物「捕獲」(雙夾心法)，也可能是目標化合物需要與「測試線」上的同類物質「競爭性」的與標記物結合(競爭法)；

c)當液體攜帶反應剩餘物繼續移動到「控制線」處時，要麼是殘餘的未與目標化合物結合的標記物被固化在「控制線」上的目標化合物同類物「捕獲」(雙夾心法)，要麼是結合了目標化合物的標記物通過目標化合物與被固化在「控制線」上化合物聯結(競爭法)；

d)不論何種原理，最後的測得螢光強度同樣能與待測液體目標化合物濃度成相應比例關係。

相對而言，水洗法方便排除背景噪聲(未反應標記物螢光)但操縱步驟較為複雜，而層析法的測定過程更加便捷，其商用化產品也得到更加普遍的接受。如圖1所示，為一款利用層析法原理製備的典型雙線螢光免疫分析試劑條。

由於激發光源照射強度、外界溫度、環境溼度和設備特異性等因素都將影響檢測到的螢光強度，故在真實檢測時並不直接以「測試線」或「控制線」上測得的螢光強度推算目標化合物濃度，而是以「測試線」與「控制線」上測得的光強比例作為濃度的推算依據，此時可認為位於同一試劑條上的「控制線」和「測試線」在短時間(5秒)內所處的測量環境是一致的。依然以「雙夾心法」和「競爭法」來分別說明。

在「雙夾心法」中，與目標化合物結合的標記物被留在了「測試線」，而剩餘未與目標化合物結合的標記物則未能停留，被裹帶並停留在了「控制線」上，由於單位液體所能溶解的標記物總量是一定且有限的，在不考慮試劑條其他位置的微量殘留時，可認為目標化合物溶度＝a*「測量線」光強度/(「測量線」光強度+「控制線」光強度)，其中a為與標記物含量相關的液體體積相關係數。

在「競爭法」中，標記物部分與「測量線」上的目標化合物同類物結合併留在「測量線」位置，部分標記物由於被目標化合物結合而無法留下，只能隨液體繼續湧動至「控制線」處並與其上駐留物結合，在不考慮試劑條其他位置的微量殘留時，可認為目標化合物溶度＝b*「控制線」光強度/(「測量線」光強度+「控制線」光強度)，其中b為與標記物含量相關的液體體積相關係數。

一般情況下，目標化合物濃度相同的不同體積待測液體滴加在相同試劑條上時，只要不超過測量範圍，「測量線」光強度與「控制線」光強度的比值保持一致，「測量線」光強度與「控制線」光強度的和值與待測液體積線性相關。

因此，「雙線式」的試劑條需要觀測兩個敏感帶的螢光強度才能得到所需目標化合物濃度，而為了得以準確的測得兩份螢光強度，存在有多種測量方式與手段。

面控感光陣列測量：即在保證感光陣列(如ccd面板、光電管陣列等)覆蓋試劑條雙線的前提下，直接同時獲取雙線的螢光發光狀態；

線控感光隊列測量：即在保證感光線列與雙線平行的前提下，使得感光線列與試劑條做垂直於雙線的相對運動，保證雙線都有效而穩定的經過感光線列感應區域，並分時得到雙線的螢光發光狀態；

感光點測量：即使得感光點與試劑條做垂直於雙線的相對運動，保證雙線都有效而穩定的經過感光點感應區域，分時得到雙線的螢光發光狀態。

需要注意的是，當標記物帶有長壽螢光螯合物時，為保證測量精度，降低環境噪聲，會在激發光上增加濾光片以保證激發光源的純粹性，同時會在感光器件上增加濾光片以濾除其他波長光亮對螢光強度測量結果的影響。

出於經濟性目的考慮，後兩類測量方法更多的在目標化合物的小型化快速檢測設備中應用，此時需要面對一個問題：如何在運動過程中正確的描述「測試線」與「控制線」的螢光強度。

現行的通用方法是：利用步進電機或減速電機驅動「螢光激發-感應組塊」與試劑條間的相對運動，以開環方式驅動步進電機在每運行相同的指定步數(或減速電機勻速運行相同時間)後停頓，以便模數轉換模塊對光電器件的響應輸出採樣，並最終得到一份「螢光光強-移動步數」(或「螢光光強-移動時間」)關系列表，而列表中的通過擬合法獲得的「螢光光強」局部極大值或者「螢光光強」曲線圍出的「鼓包」面積即可作為前文提到的「測量線」光強度與「控制線」光強度參考值。

在某些應用場合，未避免減速電機的多次啟動停止以及由此帶來的距離輸出誤差，減速電機會以較慢速度勻速行進取代間隔停頓運動，此時一次相對運動同樣可檢測到一份「螢光光強-移動時間」。

在「螢光光強-移動步數/時間」關係獲取的過程中，由於採樣頻率較快，單次螢光萃滅周期內可獲取多個採樣值，此時可依據擬合方法估測出當次周期內的「單次螢光強度」，而當單次停頓間隔內可測得多個「單次螢光強度」數值，則一般使用平均法獲取對應當前「移動步數/時間」的「螢光強度」數值。

步進電機的輸出誤差可能造成較低的測量精度，其可能的誤差來源包括：

步距角精度限制，步距角常用於描述步進電機的輸出精度，步進電機每轉過一個步距角的實際值與理論值的誤差。用百分比表示為(誤差/步距角*100％)。不同運行拍數其值不同，四拍運行時應在5％之內，八拍運行時應在15％以內。

a)失步現象，電機運轉時運轉的步數，有時會不等於理論上的步數。

b)失調角限制，轉子齒軸線偏移定子齒軸線的角度，電機運轉必存在失調角，由失調角產生的誤差，無法用驅動方式補償。

c)減速電機的輸出精度同樣受自身因素與外界條件影響，其實際輸出速度受外部負載以及傳送裝置精度影響。

前文已述，通用方法利用「螢光強度-移動步數/時間」關係確定「測試線」與「控制線」的發光強度與比值，其本質上是建立起了「螢光光強-移動距離」關係表，然而基於以上對於開環輸出誤差來源的說明，可以很明確的得出結論：電機開環控制得到的「步數」或「運動時間」與實際的相對運動「距離」並不嚴格等同，其差異取決於開環輸出精度。

另一方面，在前文論述中也可以看出，由於物理原因，試劑條空白帶上可能會殘留未被「雙線」截取的標記物，其可分為三種情況：

a)結合墊與「測試線」間的空白帶可能會有未運動到測試線的標記物，在兩類方法下(雙夾心法與競爭法)空白帶可能殘留已經以及尚未與目標化合物結合的標記物；

b)「測試線」與「控制線」之間的空白帶可能會殘留未被「測試線」截取且尚未運動到「控制線」的標記物，在雙夾心法中，空白帶上可能殘留未與目標化合物結合的標記物，在競爭法中，空白帶上可能殘留已與目標化合物結合的標記物；

c)「控制線」與吸水墊之間的空白帶可能會殘留未被雙線截取的標記物，不過如果待測液體中目標化合物的濃度不超過試劑條量程，則此空白段的標記物殘留物一般是很少的。

現階段的主流方法都僅將空白帶的測得信號作為噪聲，利用基底螢光的處理方法將其視為一個背景環境幹擾，而忽視了其本身一定程度是揭示了被溶解標記物總量、待測液體液滴體積等信息。

技術實現要素：

本發明為了解決現有技術的步進電機造成的位移誤差帶來的結果不精確問題，提供一種基於位移測量優化的時間分辨螢光免疫層析法。

為實現上述目的，本發明的技術方案如下：

一種時間分辨螢光免疫層析法，包括以下步驟：

(1)、將一定體積的待測液體滴入雙線螢光免疫分析試劑條，等待免疫層析反應完成；

(2)、沿層析反方向，獲取位移量與螢光強度數據，建立螢光強度-位移量函數；

(3)、對步驟(2)獲得的螢光強度-位移量函數進行空白帶螢光特性的修正，獲得修正的雙線強度；

(4)、依據待測液體標樣的螢光強度-濃度關係函數，由步驟(3)的雙線強度獲得該滴入的待測液體濃度與滴入液滴的第一體積估值，並依據空白帶螢光特性得出滴入液滴第二體積估值；

(5)、步驟(4)中兩液滴體積估值差異判斷，若體積差異在達標範圍內，輸出濃度測量結果；否則，輸出參考結果並警告；

所述雙線強度為測試線強度與控制線強度。

優選地，步驟(2)中，所述位移量是通過與雙線螢光免疫分析試劑條相對運動的位移傳感器而獲取。

優選地，步驟(3)中，對螢光強度-位移量函數進行空白帶螢光特性的修正方法如下：

利用測定的測試線與控制線間空白帶螢光強度函數，以積分方式推算整個試劑條空白帶的殘留螢光強度。

優選地，步驟(3)中，對螢光強度-位移量函數進行空白帶螢光特性的修正方法如下：

結合墊與測試線間的空白帶區段測得螢光強度為第一空白帶強度；

測試線與控制線之間的空白帶區段測得螢光強度為第二空白帶強度；

控制線與吸水墊之間的空白帶區段測得螢光強度為第三空白帶強度；

將螢光強度-位移量函數扣除第三空白帶強度，再分別將第一空白帶強度、第二空白帶強度與第三空白帶強度的差值疊加到該函數的雙峰上。

進一步地，依據空白帶螢光特性得出滴入液滴體積估值的方法如下：

利用實驗或溶解物特性計算得到空白帶殘留螢光強度與滴入液體體積的關係，構建「空白帶螢光特性」函數

vdrop＝fv(ib,t,h)，

其中vdrop為滴入液滴體積、ib為空白帶殘留螢光強度，t為測試環境溫度，h為測試環境溼度。

優選地，步驟(5)中所述達標範圍為±5％以內。

本方法利用位移傳感器測量「螢光激發-感應組塊」與雙線試劑條間在垂直於雙線方向上的相對運動位移量，以時間t為自變量，通過測量實際的位移量fd(t)和螢光強度量ffl(t)，通過算法得到修正後的螢光強度函數f(fd(t),ffl(t))。得到最終的螢光強度曲線函數同時利用空白帶基底螢光函數fb(t)對螢光整體亮度進行修正，從而得到更加準確的雙線螢光強度比以及螢光總發光強度，並最終獲得更加準確的目標化合物濃度信息。

本方法相比現有技術，具有以下的有益效果：

(1)、在時間分辨螢光免疫層析法測量中增加測量「螢光激發-測試模塊」與試劑條相對運動位移量或速度量的手段，獲取準確的位移量與螢光強度的關係，利用準確實測相對距離位移而非時間或步長進行螢光強度測量曲線；利用位移傳感器標註測得螢光的「坐標」，避免了驅動機構、傳動機構誤差導致的螢光強度估值偏差，因而不受外部運動機構運動故障或機械計步不精確的影響；

(2)、利用空白帶螢光信息進行數據修正與輸出結果校驗，不同於一般的背景扣除，本發明中採用了分區段的空白帶修正，並輔助輸出結果校驗，體積差異判定在達標範圍內時，可以獲得更精確目標物濃度結果；同時，利用空白帶測得螢光值修正雙線螢光強度測得值，使得對被溶解標記物的總量得以進行更精準的把控；

(3)、本方法中的液滴體積估算，綜合利用位移函數、螢光強度函數以及空白帶螢光強度函數，估算方法與現有技術顯著不同，具有較好的精確度；

(4)、理論上降低了對於驅動機構控制精度的需求，對其驅動電路與加工精度的要求降低，預期成本要求減少。

附圖說明

圖1為雙線螢光免疫分析試劑條的結構示意圖；

圖2為本發明的測試方法流程圖；

圖3為本發明中(a)修正前與(b)修正後的螢光強度與位移量的關係曲線。

具體實施方式

以下結合附圖和具體實施例，對發明的方法進行詳細說明。

步驟一、首先在雙線螢光免疫分析試劑條(見圖1)上將一定體積的待測液體滴入樣品墊，層析方向為測試線(t線)至控制線(c線)，等待免疫層析反應完成。

步驟二、接著，沿層析反方向，獲取位移量與螢光強度數據，建立螢光強度-位移量函數。其中，所述位移量是通過與雙線螢光免疫分析試劑條相對運動的位移傳感器而獲取。

本發明中通過將位移傳感器與「螢光激發-感應組塊」同步相對試劑條運動，例如，這種相對運動的驅動機構可以但不限於電機驅動的絲杆機構，當雙線試劑條完成的相應反應過程並被正確置於卡扣裝置內後，控制邏輯電路驅動電機帶動絲槓轉動，絲槓將轉動運動轉換為「螢光激發-檢測組件」的緩慢直線運動；同時，控制邏輯電路開始驅動「螢光激發-檢測組件」中的紫外led燈進行頻率為1khz、佔空比為50％的閃爍發光，其所發出的光亮經由濾光片後，360nm波長的激發光照射在距led光源約2cm的試劑條上；同時，與紫外led置於同一切面(切面垂直於直線運動方向)的光電感應器件不斷被經過650nm濾光片的試劑條螢光所激發，且其輸出電壓/電流被以不低於20khz的頻率進行模數採樣，且每一次紫外led熄滅後100us到其重新亮起的所有螢光光強測得值被控制邏輯電路儲存被加以時間戳。

在螢光光強不斷被測得的同時，「螢光激發-檢測組件」與雙線試劑條間的相對運動距離數值也在被以不低於20khz的頻率進行模數採樣(這個採樣的頻率與螢光採樣的頻率同頻)，以保證有效螢光強度被感應的同時，其對應的相對運動位移量也被測得，以保證「螢光強度-相對位移」關係的建立。這三組數據，採樣時間、螢光強度與相對位移，被存儲於控制邏輯電路中的存儲介質中。

當裝置利用合適的方式確保雙線都被探測後，探測將停止，系統將轉入信號處理階段。

信號處理的第一階段是確定led光源每一次熄滅後所對應的試劑條被測試區域的螢光強度。

信號處理的第二階段是本發明的核心，即利用「螢光光強-移動距離」關係表，進行雙線測得螢光亮度曲線的擬合。以相對運動移動距離為橫軸，以測得螢光光強為縱軸，可以獲得一幅反應雙線光強亮度的「雙包圖」，其中測得點是如圖3(a)中所示的離散數據(空心圓點)。以測得數據為基礎擬合曲線，即可得到對於試劑條的連續螢光發光連續數據。

步驟三、再接著，對上步驟獲得的螢光強度-位移量函數進行空白帶螢光特性的修正，獲得修正的雙線強度。即利用空白帶測得螢光強度數據對前述擬合曲線進行修正，得到更加準確的「雙包」數據值。

在假定待測液體及其內含目標化合物不超過試劑條測量範圍時，可以認定空白帶的螢光情況可按區域劃分為：

a)空白帶1，結合墊與「測試線」間的空白帶，可能會有尚未運動到「測試線」的標記物，區段測得螢光強度為背景噪聲和殘留標記物的結合，亮度最大,；

b)空白帶2，「測試線」與「控制線」之間的空白帶，可能會殘留未被「測試線」截取且尚未運動到「控制線」的標記物，區段測得螢光強度為背景噪聲和殘留標記物的結合，亮度稍弱；

c)空白帶3，「控制線」與吸水墊之間的空白帶，無殘留標記物，其區段測得螢光可認為是單純背景噪聲。

依據以上知識，螢光背景噪聲被抹去，部分螢光強度被疊加到「雙包」上，得到修正後的「螢光光強-移動距離」曲線(見圖3(b))，此時可以得到雙線「最大光強數值」和雙線「螢光光強面積」。

步驟四、依據待測液體標樣的螢光強度-濃度關係函數，由步驟三的雙線強度獲得該滴入的待測液體濃度與滴入液滴的第一體積估值，並依據空白帶螢光特性得出滴入液滴第二體積估值。

先確定目標化合物濃度＝c*「測量線」最大光強值/(「測量線」最大光強值+「控制線」最大光強值)，

其中c為與標記物含量相關的液體體積相關係數，由離線測量經驗得到，由此獲得目標物濃度。另外，由目標物濃度及體積相關係數c可以獲取滴入液滴的第一體積估值。

再求滴入液滴第二體積估值，依據空白帶螢光特性得出滴入液滴體積估值的方法如下：

利用實驗或溶解物特性計算得到空白帶殘留螢光強度與滴入液體體積的關係，構建「空白帶螢光特性」函數

vdrop＝fv(ib,t,h)，

其中vdrop為滴入液滴體積、ib為空白帶殘留螢光強度，t為測試環境溫度，h為測試環境溼度。

步驟五、步驟(4)中兩液滴體積估值差異判斷，若體積差異在達標範圍內，輸出濃度測量結果；否則，輸出參考結果並警告。

由步驟四中的兩體積進行比較，若結果接近，則認為測得結果滿足期望；否則，則在輸出測得結果的同時進行告警，提示數據衝突的可能；此處的達標範圍可以預設為一定的百分比，如±5％以內。

以上所述，僅為本發明較佳的具體實施方式，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明披露的技術範圍內，根據本發明的技術方案及其發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。