幾株高產蛋白酶芽孢桿菌株的配伍優化方法
2023-06-14 12:45:41
幾株高產蛋白酶芽孢桿菌株的配伍優化方法
【專利摘要】本發明公開了一種幾株高產蛋白酶芽孢桿菌株的配伍優化方法，經過平板培養和試管培養後分別取已經製備好的3種菌液各1ml，13000r/min離心25min，取上清分別以1∶1比例配伍後（200μl+200μl），再與豆粉培養液以1∶4比例混合，同時分別取單獨Pc、Pe、Ps菌株上清（400μl）與豆粉培養液以1:4比例混合，置於25℃恆溫培養箱，酶解6h，測定胺基酸（AA）的變化。對高產蛋白酶菌株選擇性強；Pe、Pc和Ps菌株環境適應性較好，Pe與Ps1∶1配伍後產酶效果最好，有著遠大的工業化前景，這將為進一步的研究奠定理論基礎；方法科學、時間周期短。
【專利說明】幾株高產蛋白酶芽孢桿菌株的配伍優化方法
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及幾株高產蛋白酶芽孢桿菌株的配伍優化方法。
[0003]
【背景技術】
[0004]蛋白酶(protease)是催化肽鍵水解的一類酶，廣泛存在於動物、植物和微生物中，執行許多不同的生理功能。蛋白酶種類的多樣性和水解活性的專一性，使其在食品、皮革、洗滌劑等工業生產領域成為具有重要商業價值的工業用酶。據估計當前世界工業生產酶市值10億美元，蛋白酶為工業生產酶三大類之一，其約佔總市值60%。利用不同的蛋白酶或相關的產酶微生物可以製備各種活性多肽。有關研究表明，利用蛋白酶水解大豆蛋白(或是直接用微生物發酵)獲得的大豆多肽能夠有效抑制血管緊張素轉換酶(Angiotensinconverting enzyme, ACE)的活性，同時可以獲得酪蛋白磷酸肽(Casein phosphopep一tides,CPPs)、玉米肽等對人體非常有價值的活性多肽。現有技術採用的水解高產蛋白酶的菌株環境適應性較差，對高產蛋白酶的水解能力也較低。
[0005]
【發明內容】
[0006]本發明的目的在於提供一種幾株高產蛋白酶芽孢桿菌株的配伍優化方法，特別是使2株枯草芽孢桿菌(Pc和Pe株)和I株地衣芽孢桿菌(Ps株)間的配伍比例達到最優，使其配伍後的水解豆粉的能力達到最強。
[0007]本發明提供的幾株高產蛋白酶芽孢桿菌株的配伍優化方法，包括以下步驟:
(1)平板培養，分別取Pc和Pe株枯草芽孢桿菌及Ps地衣芽孢桿菌保存菌種，劃線接種至脫脂奶粉平板培養基，分別於35°C培養48h後觀察；
(2)試管接種，取發育健壯、菌落典型的菌株接種1Oml種子培養基，170r/min，35°C振蕩培養24h，再將菌種液以體積分數I %接種於發酵培養基，170r/min，35°C振蕩培養48h，12000r/min離心20min,收集上清液；
(3)取步驟(2)3種菌液各lml，13000r/min離心25min，取上清分別以1:1比例配伍後，再與豆粉培養液以1:4比例混合，同時分別取單獨Pc、Pe、Ps菌株上清與豆粉培養液以I: 4比例混合，置於25°C恆溫培養箱，酶解6h，測定胺基酸的變化。
[0008]所述步驟(1)中脫脂奶粉平板培養基是在TS (50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/LNaCl, ρΗ8.0)中加入1%瓊脂糖和1%脫脂奶粉，0.06 MPa高壓滅菌lOmin，待溫後傾注平板；所述步驟(2)中種子培養基是由蛋白腖15g/L、酵母膏5g/L、酪素3g/L、氯化鈉5g/L配製而成，pH為7.5 ;所述步驟(2)中發酵培養基是由蛋白腖10g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉5g/L配製而成，pH為7.5。[0009]本發明提供的幾株高產蛋白酶芽孢桿菌株的配伍優化方法，其有益效果在於，對高產蛋白酶菌株選擇性強；Pe、Pc和Ps菌株環境適應性較好，Pe與Psl:1配伍後產酶效果最好，有著遠大的工業化前景，這將為進一步的研究奠定理論基礎；方法科學、時間周期短。
[0010]
【具體實施方式】
[0011]下面結合一個實施例，對本發明提供的幾株高產蛋白酶芽孢桿菌株的配伍優化方法進行詳細的說明。
[0012]
實施例
[0013]本實施例的幾株高產蛋白酶芽孢桿菌株的配伍優化方法，包括以下步驟:
(1)平板培養，分別取Pc和Pe株枯草芽孢桿菌及Ps地衣芽孢桿菌保存菌種，劃線接種至脫脂奶粉平板培養基，分別於35°C培養48h後觀察；
(2)試管接種，取發育健壯、菌落典型的菌株接種IOml種子培養基，170r/min，35°C振蕩培養24h，再將菌種液以體積分數I %接種於發酵培養基，170r/min，35°C振蕩培養48h，12000r/min離心20min,收集上清液；
(3)取步驟(2)3種菌液各 lml，13000r/min離心25min，取上清分別以1:1比例配伍後，再與豆粉培養液以1:4比例混合，同時分別取單獨Pc、Pe、Ps菌株上清與豆粉培養液以1:4比例混合，置於25°C恆溫培養箱，酶解6h，測定胺基酸的變化，AA增量為52.5 μ mo I/ml。
[0014]所述步驟(1)中脫脂奶粉平板培養基是在TS (50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/LNaCl, ρΗ8.0)中加入1%瓊脂糖和1%脫脂奶粉，0.06 MPa高壓滅菌lOmin，待溫後傾注平板；所述步驟(2)中種子培養基是由蛋白腖15g/L、酵母膏5g/L、酪素3g/L、氯化鈉5g/L配製而成，pH為7.5 ;所述步驟(2)中發酵培養基是由蛋白腖10g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉5g/L配製而成，pH為7.5。
【權利要求】
1.一種幾株高產蛋白酶芽孢桿菌株的配伍優化方法，其特徵在於:包括以下步驟: (1)平板培養，分別取Pc和Pe株枯草芽孢桿菌及Ps地衣芽孢桿菌保存菌種，劃線接種至脫脂奶粉平板培養基，分別於35°C培養48h後觀察； (2)試管接種，取發育健壯、菌落典型的菌株接種IOml種子培養基，170r/min，35°C振蕩培養24h，再將菌種液以體積分數I %接種於發酵培養基，170r/min，35°C振蕩培養48h，12000r/min離心20min,收集上清液； (3)取步驟(2)3種菌液各lml，13000r/min離心25min，取上清分別以1:1比例配伍後，再與豆粉培養液以1:4比例混合，同時分別取單獨Pc、Pe、Ps菌株上清與豆粉培養液以I: 4比例混合，置於25°C恆溫培養箱，酶解6h，測定胺基酸的變化。
2.根據權利要求1所述的幾株高產蛋白酶芽孢桿菌株的配伍優化方法，其特徵在於:所述步驟(1)中脫脂奶粉平板培養基是在TS (50 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl,pH8.0)中加入1%瓊脂糖和1%脫脂奶粉，0.06 MPa高壓滅菌lOmin，待溫後傾注平板。
3.根據權利要求1所述的幾株高產蛋白酶芽孢桿菌株的配伍優化方法，其特徵在於:所述步驟(2)中種子培養基是由蛋白腖15g/L、酵母膏5g/L、酪素3g/L、氯化鈉5g/L配製而成，pH 為 7.5。
4.根據權利要求1所述的幾株高產蛋白酶芽孢桿菌株的配伍優化方法，其特徵在於:所述步驟(2)中發酵培養基是由蛋白腖10g/L，牛肉膏3g/L，氯化鈉5g/L配製而成，pH為`7.5。`
【文檔編號】C12R1/10GK103865830SQ201210550691
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2012年12月18日 優先權日:2012年12月18日
【發明者】張述智, 夏偉, 朱紹輝, 張 浩, 王曉麗, 徐權汗, 李之詳, 許團輝 申請人:青島中仁藥業有限公司