一種蚯蚓活性蛋白及其提取方法與應用的製作方法
2023-06-14 12:41:41 1
專利名稱：一種蚯蚓活性蛋白及其提取方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種蚯弼l活性蛋白及其提取方法與應用。
背景技術：
蚯蚓，亦稱地龍、曲蟮，環節動物門寡毛綱陸生動物，體內含有大量脂肪酸、核酸及其 衍生物、游離胺基酸、各種微量元素以及多種維生素，其中蛋白質含量尤為豐富。新鮮蚯躬l 含蛋白質20%以上(幹製品高達70%)，含有人體必需的18種胺基酸。蚯蚓是傳統中藥，其 味鹹性寒，具有清熱、平肝、定驚、止喘、通絡、利尿之功效，可用來治療慢性支氣管炎和 支氣管哮喘、中風偏癱、高血壓、神經分裂症、癌症、消化道潰瘍、下肢潰瘍、流行性腮腺 炎、帶狀疙疹、溼疹、蕁麻疹、燒傷燙傷、膀膚結石、小便不暢和癌症等症。
利用現代生物技術，從蚯蚓中提取出具有藥理活性的的生物蛋白或大分子物質，是當前 的熱門之一。
發明內容
針對上述現有技術，本發明提供了一種蚯蚓活性蛋白，以及其提取方法和在治療燙傷中 的應用。
本發明是通過以下技術方案實現的
一種蚯頓活性蛋白，是通過以下方法提取的，包括以下步驟
1) 取鮮活蚯蚓，清洗其表面泥土後，在自然條件下過夜吐泥；
2) 用蒸餾水清洗吐泥後的蚯蚓，去除水分，稱重；
3) 按1: l的比例加入雙蒸水，用組織勻漿機在冰浴條件下高速勻漿；
4) 將勻漿液靜置4小時，10000rpm/min高速離心後收集上清；
5) 冰浴條件下，採用鹽析法或有機溶劑沉澱法或多聚陽離子沉澱法沉澱蛋白；
6) 離心收集上述沉澱後的蛋白，用2倍體積0.1M磷酸鹽緩衝液重溶；
7) 將重溶後的溶液用0.45pm的微孔濾膜過濾後，採用凝膠過濾層析法進行蛋白分離， 流速為0.5ml/min,紫外檢測波長為280nm;
8) 收集洗脫峰，脫鹽；
9) 將脫鹽後的洗脫液乾燥，即得蚯蚓活性蛋白。
所述步驟5)具體為冰浴條件下，向上清液中加入硫酸銨進行鹽析。
所述步驟7)中，採用Superdex75凝膠柱進行層析分離，還可採用其他凝膠填料的層析柱進行層析分離。
所述步驟8)中，採用SephadexG-25凝膠柱進行脫鹽，亦可採用其他脫鹽層析柱及透析 等方式進行脫鹽。
所述步驟9)具體為將脫鹽後的洗脫液冷凍千燥，得凍乾粉，即為蚯蚓活性蛋白；亦 可採用其他可保持蛋白活性的乾燥方法進行乾燥。
所述蚯躬l活性蛋白具有較高藥用價值，所具有的藥理活性包括抗癌、溶栓、抗菌、治療 燒燙傷等，因此，可以將其單獨或與其他藥物混合，製備成各種劑型，應用於燒燙傷的治療， 也可以應用於創傷癒合或開放傷口的炎症治療，或應用於其他各種疾病反應的治療或輔助治 療。
本發明應用現代生化分離技術從鮮活蚯蚓中提取出具有藥理活性的蛋白， 一方面提高了 其藥理活性，另一方面可以有效的去除蚯蚓體內的其它各種雜質，避免了這些雜質引起的不 良反應。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步的說明
實施例l:從鮮活蚯蚓中提取活性蛋白，步驟如下
1) 取鮮活蚯蚓，清洗其表面泥土後，在自然條件下過夜吐泥；
2) 用蒸餾水清洗吐泥後的蚯蚓，去除水分，稱重；
3) 按l: l的比例加入雙蒸水，用組織勻漿機在冰浴條件下高速勻漿；
4) 將勻漿液靜置過夜，10000rpm/min高速離心後收集上清；
5) 冰浴條件下，將研細的硫酸銨加入上述上清液進行鹽析；
6) 離心收集鹽析後沉澱，用2倍體積Tris-HCl緩衝液重溶；
7) 將重溶後的溶液用0.45pm的微孔濾膜過濾後，上Superdex 75凝膠柱進行層析，流速 為0.5ml/min,紫外檢測波長為280nm:
8) 收集洗脫峰，用Sephadex G-25凝膠柱脫鹽；
9) 將脫鹽後的洗脫液進行冷凍乾燥，所得凍乾粉即獲得蚯蚓活性蛋白。
實施例2:從鮮活蚯蚓中提取活性蛋白，步驟l)至步驟6)同實施例l,步驟7)中採 用葡聚糖凝膠、聚丙稀醯胺凝膠或瓊脂糖凝膠填料的層析柱進行層析；步驟8)至步驟9)同 實施例1。
實施例3:從鮮活蚯蚓中提取活性蛋白，步驟l)至步驟7)同實施例l,步驟8)中採 用葡聚糖凝膠、聚丙稀醯胺凝膠或瓊脂糖凝膠層析柱及透析方式脫鹽；步驟9)同實施例l。實施例4:從鮮活蚯蚓中提取活性蛋白，步驟l)至步驟8)同實施例l,步驟9)採用
噴霧乾燥或真空乾燥進行乾燥。
實驗例l:蚯蚓活性蛋白對燒燙傷的治療
1. 1試驗材料
1. 1. 1試劑與耗材
受試品依據本發明技術方案製備的蚯蚓活性蛋白； 對照品美寶溼潤燒傷膏(汕頭市美寶製藥有限公司)； 戊巴比妥鈉(上海西唐生物科技公司)；
直徑3cm銅棒(lkg)。
1, 1. 2動物
雄性Wistar大鼠(6 8周，210~280 g) 40隻，由山東大學實驗動物中心提供，合格 證編號SCXK(魯)-20030004。 1.2實驗方法
將大鼠隨機分為模型組、陽性藥物組、高劑量組、中劑量組和低劑量組，每組8隻大鼠。 用2.5%戊巴比妥鈉對大鼠進行腹腔內注射麻醉，然後將大鼠背部兩側脫毛。用2.5%戊巴比 妥鈉對大鼠進行麻醉，將銅棒放於沸水中煮5min，然後把銅棒放於拔完毛後的大鼠背部兩側 分別燙傷4秒。蚯蚓活性蛋白的低、中、高劑量組分別以5mg/ml、 20mg/ml、 100mg/ml每天 3次對燙傷創面給藥。模型組以生理鹽水給藥，對照組以對照藥物給藥。
1.3結果與討論
燙傷癒合時間及燙傷修復後病理切片顯示，蚯蚓活性蛋白對燒燙傷的治療有顯著效果。 其中，蚯頓活性蛋白高劑量組的治療效果超過陽性對照藥物。
2. 1試驗材料
2. 1. 1試劑與耗材
受試品依據本發明技術方案製備的蚯蚓活性蛋白；
DMEM (美國JRH);
胎牛血清(美國GIBCO);
胰蛋白酶(美國GIBCO):
MTT (美國Sigma)。
2. 1.2細胞
大鼠成纖維細胞(NIH3T3):中國典型培養物保藏中心(武漢)。2. 2實驗方法
將NIH3T3細胞接於含10%胎小牛血清的細胞培養液中，培養24h，加入蚯頓活性蛋白 溶液，繼續培養24h後，進行MTT測定。
另取對數生長期NIH3T3細胞經0.25%胰酶消化，製成單細胞懸液，接種於96孔板中， 培養48小時後用平口微量滴管在中央垂直劃一均勻痕跡，更換新的胎牛血清DMEM培養液， 加入蚯蚓活性蛋白溶液，檢測12h, 24h和48h三個時間點的細胞劃痕間距。
2. 3結果與討論
上述細胞增殖實驗及細胞劃痕創面癒合實驗的結果表明，蚯蚓活性蛋白具顯著的促細胞 增殖活性，因此，該蛋白對創傷的治療應具顯著療效。 實驗例3:蚯蚓活性蛋白對炎症的治療
3. 1試驗材料
大鼠白介素-6ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)； 大鼠腫瘤壞死因子ELISA試劑盒(上海西唐生物科技有限公司)。 3. 2實驗方法
取實驗例1各大鼠的燙傷皮膚，勻漿後分別用大鼠白介素-6ELISA試劑盒及大鼠腫瘤壞 死因子ELISA試劑盒測定其TNF-a和IL-6含量。 3. 3結果與討論
炎症因子含量測定結果顯示，蚯蚓活性蛋白對炎症因子具有良好的抑制作用，因此，該 蛋白對於炎症的治療應具顯著效果。
由上可見，本發明所製備的蚯蚓活性蛋白具有顯著藥理學活性，可以用於治療燒燙傷， 完全可以開發成為新型藥物。
權利要求
1.一種蚯蚓活性蛋白的提取方法，包括以下步驟1)取鮮活蚯蚓，清洗其表面泥土後，在自然條件下過夜吐泥；2)用蒸餾水清洗吐泥後的蚯蚓，去除水分，稱重；3)按1∶1的比例加入雙蒸水，用組織勻漿機在冰浴條件下高速勻漿；4)將勻漿液靜置4小時，10000rpm/min高速離心後收集上清；5)冰浴條件下，採用鹽析法或有機溶劑沉澱法或多聚陽離子沉澱法沉澱蛋白；6)離心收集上述沉澱後的蛋白，用2倍體積0.1M磷酸鹽緩衝液重溶；7)將重溶後的溶液用0.45μm的微孔濾膜過濾後，採用凝膠過濾層析法進行蛋白分離，流速為0.5ml/min，紫外檢測波長為280nm；8)收集洗脫峰，脫鹽；9)將脫鹽後的洗脫液乾燥，即得蚯蚓活性蛋白。
2. 根據權利要求l所述的一種蚯蚓活性蛋白的提取方法，其特徵在於所述歩驟5)具體為冰浴條件下，向上清液中加入硫酸銨進行鹽析。
3. 根據權利要求l所述的一種蚯蚓活性蛋白的提取方法，其特徵在於所述步驟7)中，採 用Superdex 75凝膠柱進行層析分離。
4. 根據權利要求1所述的一種蚯蚓活性蛋白的提取方法，其特徵在於所述步驟8)中，採 用Sephadex G-25凝膠柱進行脫鹽。
5. 根據權利要求1所述的一種蚯蚓活性蛋白的提取方法，其特徵在於所述步驟9)具體為 將脫鹽後的洗脫液冷凍乾燥，得凍乾粉，即為蚯蚓活性蛋白。
6. 用權利要求1所述的一種蚯蚓活性蛋白的提取方法製備的蚯蚓活性蛋白。
7. 權利要求6所述的蚯蚓活性蛋白在製備治療燙傷藥物中的應用。
8. 權利要求6所述的蚯蚓活性蛋白在製備促進傷口癒合藥物中的應用。
9. 權利要求6所述的蚯蚓活性蛋白在製備具有抗炎症作用藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種蚯蚓活性蛋白，是通過以下方法提取的1)取鮮活蚯蚓，清洗，自然條件下過夜吐泥；2)蒸餾水清洗，去除水分，稱重；3)加入雙蒸水，冰浴條件下高速勻漿；4)將勻漿液靜置4小時，離心收集上清；5)冰浴條件下，採用鹽析法或其它方法沉澱蛋白；6)離心收集蛋白，用0.1M磷酸鹽緩衝液重溶；7)將重溶後的溶液用微孔濾膜過濾後，採用凝膠過濾層析法進行蛋白分離；8)收集洗脫峰，脫鹽；9)將脫鹽後的洗脫液乾燥，即得蚯蚓活性蛋白。本發明應用現代生化分離技術從鮮活蚯蚓中提取出具有藥理活性的蛋白，一方面提高了其藥理活性，另一方面可以有效的去除蚯蚓體內的其它各種雜質，避免了這些雜質引起的不良反應。
文檔編號C07K1/16GK101607990SQ20091001668
公開日2009年12月23日 申請日期2009年7月3日 優先權日2009年7月3日
發明者吉愛國, 宋淑亮, 浩 梁 申請人:山東大學威海分校