病毒載體純化系統的製作方法

2023-06-14 14:50:56

病毒載體純化系統的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種用於純化病毒載體、特別是屬於逆轉錄病毒科的病毒載體的新方法，其基於編碼細胞表面標記物的外源基因在產生此類載體的包裝細胞系中的表達。在載體的病毒包膜中摻入細胞表面標記物允許用免疫學方法進行純化。
【專利說明】病毒載體純化系統
發明領域
[0001]本發明涉及有效純化病毒載體特別是屬於逆轉錄病毒科的病毒載體的方法。更具體來講，本發明涉及通過基於在包裝細胞系中表達外源性細胞表面標記物的免疫學方法純化乂乂。
[0002]背景
病毒載體通常用於將遺產物質遞送入靶細胞內。現在」在基因療法應用中用於將治療基因運送至患者。在臨床應用中，必須發展高質量XV以符合管理機構規定的要求。具體來講，必須發展更安全的生產細胞系用於大規模製備過程以獲得大的病毒儲庫。同時，成本-效率和可擴展的純化過程是製備待給予人的臨床級病毒顆粒所必不可少的。
[0003]XV製備物的純化必須防止因載體組分、細胞和培養基汙染物比如血清所致的毒性、炎症或免疫反應等，2003；等，2002)。理想地純化過程需要保證維持病毒傳染性(穩定性)、病毒顆粒的高回收率、汙染物比如0嫩、蛋白質和轉導抑制劑的去除，濃縮病毒上清液的可能性以及當然還有過程的可擴展性社18等，1999；[7況和 0』311111妨11，1998)。
[0004]今天，基於不同的技術已發展出不同的逆轉錄病毒載體純化程序，所述技術特別是:基於離心的方法、膜 分離法、色譜或其它基於用鹽和聚合物比如沉澱的方法。目前提出的純化方案導致低回收率(約30%)等，2007)。所有這些方法最初發展用於蛋白質製備，它們進一步被修改用於純化」。因病毒顆粒的獨特性和複雜性所致，必須改善純化方法以獲得高生產率和高通量，同時維持終產物的生物學活性，特別是傳染性。
[0005]又一個更近的實例報告於16代611等，2011，其中公開在條件下大規模製備慢病毒載體的方法，所述病毒載體待在試驗性基因療法臨床試驗背景中用於治療
八1辦1也症候群。這種公開的方法包括慢病毒顆粒的製備和下遊純化工藝兩者。具體來講，純化基於合併幾種色譜步驟和基於膜的工藝步驟(包括陰離子交換和分子排阻色譜)的多步驟方案。雖然在生產率和終製備物中不存在0嫩和蛋白質汙染物方面的結果非常好，但純化過程的最終收率在以前公開方法的範圍內(低於30%)並且最終樣品中病毒載體的傳染性下降。
[0006]病毒和細胞蛋白質在病毒成熟期間都被摻入病毒包膜內，特別是在所謂的出芽過程期間從宿主細胞釋放(紅訪111'等，1992)0例如，已顯示多種內源性宿主細胞蛋白被摻入!117-1包膜內，包括I和II類人淋巴細胞抗原(只!^)、⑶44、補體調控蛋白等，反之比如0X^4和等蛋白被排出。根據這種發現，提示細胞類型特異性抗原可充當複製的細胞起點的標記物(00)361^8等，1999)0此外，發展出一種能夠區分淋巴細胞衍生的繁殖病毒和巨噬細胞衍生的繁殖病毒的免疫磁性病毒捕獲測定法仏-11等，2000)。具體來講，1^11等顯示有可能用能夠結合⑶26的抗體分離I細胞衍生的病毒，並將其與巨噬細胞衍生的01^-1病毒區分開，進而可用抗⑶36抗體捕獲巨噬細胞衍生的
病毒。⑶26和⑶36兩者是在感染期間分別在I細胞和巨噬細胞中過度表達的內源性宿主細胞蛋白。兩種蛋白也摻入在病毒包膜中，從而允許選擇性分離病毒。1—11等測試了一組能夠結合宿主細胞特異性抗原的抗體，之後才鑑定出成功的抗體。有趣的是，幾種能夠結合由巨噬細胞高水平內源性表達的抗原(CD32、CD64、CD88和CD89)的抗體反而不能捕獲病毒，從而顯示在宿主細胞表面上某些標記物的過度表達是捕獲病毒的必要但非充分的條件。Lawn等並未顯示由宿主表達的外源性蛋白可成功地摻入病毒包膜內，隨後用於純化功能上有活性的病毒顆粒。
[0007]業已顯示某些修飾的細胞表面標記物可用於純化轉導細胞。具體來講，冊/9506723公開標記真核(哺乳動物)細胞的方法，其通過在這些細胞中表達編碼細胞表面受體的核酸來實現，所述受體進一步提呈在細胞表面。這種細胞選擇方法的特徵在於使用核酸，其中編碼受體胞內域的區域完全或部分缺失，或者被修飾以致提呈在表面的受體在與其結合配偶體結合之後不能實現任何信號轉導。在公開的方法中採用的細胞表面受體是截短形式的低親和力神經生長因子受體，其中已缺失胞內域。所得截短的細胞表面受體稱為八1^0^。八蛋白的存在允許通過使用單克隆抗體和磁珠體外免疫選擇遺傳修飾的細胞。
[0008]八是目前在基因療法中用於選擇轉導細胞的截短細胞表面標記物。例如，它應用於基因療法中，所述療法使單倍同一性造血幹細胞移植(613(:1)能夠安全地用於治療血液系統惡性腫瘤。1?療法採用攜帶自殺基因和標記基因八CD即!?兩者的逆轉錄病毒載體等，1998)。
[0009]迄今為止，尚無八受體用於純化禮
[0010]因為必須製備純化的XV用於臨床應用，所以已進行幾種嘗試以獲得允許良好地回收XV並且產生就穩定性而言仍然具有良好質量的充分安全的載體的有效純化方法。目前採用的方法允許獲得低回收率且在任何情況下都有一些限制，因為它們來自針對製備重組蛋白開發並適應於」純化的下遊工藝。因此，需要有效、快速且可擴展的V純化方法以用於大規模製備載體用於基因療法，所述方法允許獲得良好回收率和維持高傳染性的安全的病毒顆粒。
[0011]發明概述
本發明涉及^、特別是屬於逆轉錄病毒科的V的純化領域。目前用於V純化的下遊工藝基於通常用於重組蛋白的方法。XV是用於基礎研究和基因療法臨床試驗的特殊顆粒，在後一種情況下，該顆粒需要臨床級生產。因此純化是必需的，但是由於」的特殊性，有幾項要求必須滿足。純化過程必須有效和快速，因為XV對環境條件敏感；必須可擴展，因為臨床應用需要大批量。
[0012]本發明提供一種純化病毒顆粒的新策略，其基於開發此類顆粒將嵌入細胞質膜中的宿主細胞蛋白摻入其外部包膜內的性質。該純化方法在於編碼細胞表面標記物的外源基因在製備」的包裝細胞系中的表達。此類標記物暴露在包裝細胞的細胞膜上。在病毒顆粒製備過程中，在成熟期間，細胞表面標記物通過出芽過程摻入病毒包膜內。當摻入病毒包膜時，標記物事實上是病毒表面標記物，但我們應當繼續將所述標記物稱為「細胞表面標記物」。然後可將病毒顆粒與能夠識別此類標記物的抗體孵育，通過免疫學方法純化。所有對包裝細胞特別是包裝上皮細胞而言是外源性的細胞表面蛋白都可在本發明用作細胞表面標記物。可採用的細胞表面標記物是例如CD26、CD36、CD44、CD3、CD25和其中胞內域缺失的低親和力神經生長因子受體(八在優選實施方案中用於純化過程的細胞表面標記物是八⑶即尺。
[0013]所開發的純化方法非常多用途，因為它適用於在成熟期間通過出芽過程摻入宿主細胞膜蛋白的任何」，比如逆轉錄病毒、慢病毒、0病毒[如36111111^病毒3111(111318病毒(31唚]、棒狀病毒[如水泡性口膜炎病毒037)]和正粘病毒[如甲型流感病毒]。此外，純化方法與製備方法關聯，因為它需要標記物在包裝細胞系中表達，因此允許其中製備和下遊工藝以同一種原料(包裝細胞系)為基礎的整合方法。在這種情況下，有可能製備含有製備」必需的所有元件以及編碼純化必需的細胞表面標記物的另一外源基因的穩定包裝細胞系。這方面對於可擴展性和效率都特別有用。
[0014]該方法基於使用能夠結合細胞表面標記物的配體，以從上清液分離I優選配體是抗體並且通過免疫學方法獲得病毒顆粒的分離。更優選該方法採用免疫磁性選擇。本發明的方法可以容易地按比例放大和自動化，因為存在幾種實施免疫磁性選擇的儀器。
[0015]此外提出的方法方便、非常快速且很有效:純化效率高於目前使用的方法例如色譜方法比如那些採用02八2和3%柱的色譜方法所獲得的效率。
[0016]此外，已發現本發明的純化方法允許高回收率，因為已顯示在大多數小規模實驗中通過該方法純化的載體的滴度收率為至少85%或甚至更高(120%)。此外，在小規模實驗中，用本發明方法純化的慢病毒載體的傳染性已獲得相當大的增加(對瞬時和穩定製備分別為43%和60%)。這樣的滴度收率和傳染性增加用本發明純化方法的單一主要步驟(即複合物病毒載體-配體的分離)達到，而不考慮可影響最終結果的其它步驟。
[0017]也已實施大規 模實驗並已獲得非常好的結果。事實上，使用分離複合物病毒載體-配體的單一步驟，就病毒滴度而言回收率是60%。在開始分離階段之前，通過初步過濾和離心步驟(其粗略清除汙染物和轉導抑制劑)並且還通過與受體的配體孵育來使病毒上清液富集其病毒滴度。在整個多步驟純化過程後的最終滴度收率(收穫病毒上清液對比最終純化產物)達到大於100%。鑑於在文獻中公開的整個純化過程的滴度收率為約30%(60(1:^181168^ 2007)或者在大規模製備的情況下甚至更低等2011)，這些是非常好的結果。此外，根據本發明方法大規模純化的V導致3倍的傳染性增加，該增加比用相同方法小規模獲得的增加還多。這是非常重要和意想不到的優點，因為除了用常規方法進行純化以外文獻還描述傳染性的下降等2011)。
[0018]發明陳述
根據本發明第一方面，提供純化病毒載體的方法，其包括:
1.將編碼細胞表面標記物的外源基因和感興趣基因(601)引入包裝細胞系
I1.培養這樣獲得的生產細胞系
II1.收集含有在其外包膜上攜帶所述細胞表面標記物的病毒載體顆粒的上清液
將所述上清液與能夠結合所述細胞表面標記物的配體孵育
1分離複合物配體-病毒載體 VI獲得純化的病毒載體顆粒
在本發明另一方面將含有在其外包膜上攜帶細胞表面標記物的病毒載體顆粒的上清液過濾，任選濃縮然後與能夠結合所述細胞表面標記物的配體孵育。
[0019]優選病毒載體是逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、0病毒載體[如從361111認1？01~68丨病毒3111(111318病毒(31唚獲得的載體]、棒狀病毒載體[如從水泡性口膜炎病毒衍生的載體]和正粘病毒載體[如從甲型流感病毒衍生的載體]。更優選病毒載體是慢病毒載體或逆轉錄病毒載體。
[0020]在一個實施方案中細胞表面標記物是對包裝細胞系(其優選為上皮包裝細胞系)而言為外源性的任何細胞表面標記物。優選細胞表面標記物選自⑶26、⑶36、⑶44、⑶3、0)25和八⑶即尺。
[0021〕 更優選細胞表面標記物是八
[0022]在本發明一方面細胞表面標記物的表達是瞬時的。
[0023]在本發明另一方面細胞表面標記物的表達是穩定的。
[0024]在一個實施方案中將601和細胞表面標記物表達在同一個轉移載體中。
[0025]在另一個實施方案中將601和細胞表面標記物表達在獨立的載體中。
[0026]優選配體是選自激動劑、拮抗劑、肽、擬肽、抗體、抗體片段、親和體(￡181130(17)的化學或生物學實體。在本發明又一方面配體連接至可從上清液分離的部分。
[0027]優選配體是抗體。
[0028]更優選抗體與磁珠綴合，通過對含有複合物抗體-病毒載體的溶液施加磁場獲得分離。
[0029]優選通過除去 磁場獲得病毒載體。更優選在柱上實施複合物抗體-病毒載體的分離，通過除去磁場並將其進一步從柱洗脫獲得病毒載體。
[0030]在一個實施方案中通過斷裂細胞表面標記物-抗體鍵從抗體分離病毒載體。
[0031〕 在本發明另一方面提供在包裝細胞系中表達的外源性細胞表面標記物，用於純化由所述包裝細胞系製備的病毒載體。
[0032]優選病毒載體是逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、0病毒載體[如從361111認1？01~68丨病毒3111(111318病毒(31唚獲得的載體]、棒狀病毒載體[如從水泡性口膜炎病毒(訓衍生的載體]和正粘病毒載體[如從甲型流感病毒衍生的載體]。更優選病毒載體是慢病毒載體或逆轉錄病毒載體。
[0033]細胞表面標記物對包裝細胞系而言是外源性的，優選對上皮包裝細胞而言是外源性的。優選細胞表面標記物選自⑶26、⑶36、⑶44、⑶3、⑶25和八[風正尺。
[0034]更優選細胞表面標記物是八[風正尺。
[0035]在本發明一方面細胞表面標記物的表達是瞬時的。
[0036]在本發明另一方面細胞表面標記物的表達是穩定的。
[0037]發明詳述
將通過非限制性實例的方式描述本發明的優選特徵和實施方案的詳細說明。
[0038]本發明可由採用(除非另外說明)化學、分子生物學、微生物學、重組0嫩和免疫學常規技術的本領域普通技術人員實施。所有此類技術公開和解釋於出版的文獻中。參見例如 X 8^111131-00^, ￡.和1989，1016。111已1~ 01011111^:八1^1301-81:01-7 1冊皿1 (分子克隆:實驗室手冊)，第2版，第1-3篇，(301(1 8^11-1118他1~1301~ ？1~688 ； ^11811)361, 1.等(19% 和定期增刊；？1~0七0。018
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了01111 11167 & 80118,界 101? ) ； 8.尺06，了.0^1^66,和八.1996，0嫩1801^1:1011 811(1 86^116110111?: ￡886111:181 16011111^1168 (0嫩分離和測序:必要技術)，了(6)111111167 & 80118 ； 了.1.？。1 成和]811168 0,0.10666, 1990，III 811:11^1-111011)168 811(1 ？1~801:106 (原位雜交:原理和實施):0^^01^(1 11111^61~811:7 ？1~688 ； 1.了.6&11:(編者)，1984， 011^0111101601:1(16 87111:116818:八 ^^3,01103,1 ^1)1-08011 (寡核苷酸合成:實施途徑)，11*1 ？1~688 ；和，0.1.了.[11167 和了.￡.0^1)361-^, 1992，
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[0039]純化方法
本發明提供一種新的^純化方法。優選本發明涉及用於純化XV的方法，XV包括V逆轉錄病毒(原型:莫洛尼鼠白血病病毒，10-117)、慢病毒(原型:1117)、0病毒[如361111讓1 ？0『68七病毒(咖)、義仏讓匕病毒(31唚]、棒狀病毒[如水泡性口膜炎病毒(乂^)]和正粘病毒〔甲型流感病毒]。提出的純化方法基於病毒成熟期之一。病毒顆粒通過出芽過程從宿主細胞分泌，通過該過程病毒衣殼被由病毒生產細胞衍生的質膜包裹。這樣做時，病毒將幾種通常嵌入細胞質膜中的宿主細胞蛋白摻入其外包膜中。
[0040]由瞬時或穩定包裝系統製備的XV以同樣方式從包裝細胞釋放。本發明的方法基於通過使用針對外源性宿主質膜蛋白的抗體可特異性純化巧這一假設。
[0041]根據本發明第一方面提供純化XV的方法，它基於編碼細胞表面標記物的外源基因在包裝細胞系中的表達。細胞表面標記物是對包裝細胞而言為外源性的蛋白，其表達在細胞膜上。一旦表達，此類 標記物固定在包裝細胞膜上，因此在巧成熟期間固定在由所述包裝細胞製備的」的外包膜上。根據本發明的方法，將含有在其包膜上嵌有細胞表面標記物的病毒顆粒的上清液收集並與能夠識別此類標記物的配體孵育。任選地，特別是對於其中必須處理和純化大體積的大規模XV純化，將上清液過濾和濃縮，然後再懸浮並與配體孵育。所有這些初步步驟允許粗略清除汙染物和轉導抑制劑，因此促成在中間製備物觀察到的病毒滴度富集，從而促成純化病毒顆粒的最終滴度。除了這些初步步驟以外，將複合物配體-XV與培養基分離，然後獲得XV。分離階段是本發明純化方法的主要步驟。可通過斷裂配體與細胞表面標記物之間的鍵將V與配體分離。
[0042]在優選實施方案中配體是抗體。
[0043]本發明的方法可概括為5個主要階段:
1)細胞表面標記物在用於」的包裝細胞系中的表達
2)病毒顆粒製備
3)與能夠識別細胞表面標記物的配體孵育
4)複合物配體-受體分離
5)純化的病毒顆粒的回收 標記物的表達和病毒顆粒的製備
本發明的純化方法基於外源性細胞表面標記物在用於巧的包裝細胞系中的表達。在優選實施方案中細胞表面標記物對於上皮包裝細胞而言是外源性的。優選細胞表面標記物選自⑶26、⑶36、⑶44、⑶3、⑶25和在缺失胞內域的截短形式的低親和力神經生長因子受體(八。在優選實施方案中細胞表面標記物是八1^0^。細胞表面標記物的表達可通過幾種方式獲得。在本發明一方面，細胞表面標記物可以瞬時表達在包裝細胞系中。在一個實施方案中細胞表面標記物和治療基因兩者都表達在同一個轉移載體中。在另一個實施方案中細胞表面標記物和治療基因表達在獨立的載體中。
[0044]在本發明另一方面細胞表面標記物的表達是穩定的。本發明因此提供包裝細胞系，它包含製備XV所必需的所有結構元件比如病毒8^/1501、1*6^、任選仏1:和感興趣的包膜蛋白，以及細胞表面標記物。在一個實施方案中，所有這些基因都穩定地整合在穩定的包裝細胞系中。在另一個實施方案中瞬時表達製備XV所必需的元件。包裝細胞系除了可用於引入含有601的轉移載體以外還可用於製備XV。這種包裝細胞系代表含有製備XV所必需的所有元件並允許快速、安全和有效的純化方法的整合技術方案。
[0045]除了引入轉移載體以外，通過培養含有穩定整合或瞬時表達的細胞表面標記物的包裝細胞系獲得產物。病毒顆粒在出芽過程期間將細胞表面標記物摻入其包膜中並且將它們釋放在上清液內。純化的病毒顆粒可通過利用如上文描述的外源性細胞表面標記物的存在而獲得。
[0046]在另一個實施方案中提供生產細胞系，它包含XV製備必需的所有結構元件比如病毒1、1*6 V、任選七社、感興趣的包膜蛋白和⑶I，以及細胞表面標記物。在培養生產細胞後，含有細胞表面標記物的病毒顆粒釋放在上清液中，利用如上文描述的外源性細胞表面標記物的存在將其純化。
[0047]與配體孵育和複合物配體-細胞表面標記物的分離
可分離含有摻入其包膜的細胞表面標記物的病毒顆粒。根據本發明的純化方法，將含有巧的上清液與能夠識別細胞表面標記物的配體孵育。在另一個實施方案中將含有巧的上清液首先過濾和濃縮，然 後與配體孵育。配體連接至允許從上清液分離並因而離析配體複合物的另一種結構。可用於本發明的配體是化學或生物學實體，包括但不限於激動劑、拮抗劑、肽、擬肽、抗體、抗體片段、親和體。
[0048]優選配體是抗體且本發明的方法包括用於分離複合物抗體-XV的免疫選擇。在這種情況下，可根據其與抗細胞表面標記物抗體的反應性選擇在其包膜上含有細胞表面標記物的V、。
[0049]更優選本發明的方法包括免疫磁性選擇。免疫磁性選擇指抗體與能夠通過磁鐵與抗原結構分離的順磁微球(珠)偶聯。例如，可將含有將細胞表面標記物摻入其包膜內的^的上清液與初級I姊抗細胞表面受體抗體孵育。然後可將逆轉錄病毒上清液與包被抗I姊次級仙的免疫磁珠孵育，並施加至磁鐵以分離攜帶所述標記物的逆轉錄病毒載體。在從逆轉錄病毒上清液分離後，可通過除去磁場回收分離的載體。作為替代，可使抗細胞表面受體抗體與磁珠直接綴合。在這種情況下，在單一孵育期後立即對溶液施加磁場。
[0050]本領域已知用於本發明的順磁微球，它們是聚合物顆粒，具有範圍從50 11111小尺寸比如市售獲得的組匕6即1^ 111的較大顆粒比如市售獲得的1鮮11:1~08611的順磁微球可直接或間接與能夠結合摻入，包膜的細胞表面標記物結合的感興趣的特異性抗體綴合。本領域已知抗體與順磁珠的綴合方法，包括例如交聯、在官能團上形成共價鍵、生物素-抗生物素蛋白系統等。通過對含有由綴合至順磁珠並與細胞表面標記物連接的抗體組成的複合物的溶液施加磁場可實現從病毒上清液分離I[0051]在本發明優選方面免疫磁性選擇在柱上實施。具體來講，可將含有XV的上清液直接與能夠識別細胞表面標記物的抗體孵育，此類抗體與順磁珠綴合。在另一個實施方案中將含有巧的上清液首先過濾和任選濃縮，然後按前文描述孵育。在孵育後，將上清液或過濾和任選濃縮的溶液應用於置於磁選機中的柱上，以除去雜質和分離由於磁場而停留在柱中的病毒顆粒。
[0052]純化顆粒的回收
根據本發明的方法，工藝的最後階段是回收純化的病毒顆粒。通過從磁場清除病毒顆粒獲得這樣的回收。如果純化在柱上進行，則通過除去磁場獲得回收。然後可通過斷裂配體與細胞表面標記物之間的鍵將病毒載體與配體分離。本領域已知斷裂所述鍵的方法，包括使用置換配體或含有酶的適當溶液。根據配體和受體及其鍵的性質採用適當的方法。
[0053]效率、擴大和自動化
本發明的方法非常有效並且簡單和快速。目前提出的純化方法允許約30%回收率。引人注目的是在大多數小規模實驗中本發明的方法允許獲得至少85%或甚至更高(120%)的滴度收率。在這種情況下，參考本發明方法的主要步驟:複合物病毒載體-配體的分離，計算滴度收率。上述滴度收率來自與外源性受體的配體孵育的未純化顆粒的滴度與純化顆粒的滴度之間的比率。在小規模實驗中的未純化顆粒通過初步過濾步驟從XV上清液獲得，然後與外源性受體的配體孵育。結果顯示用本發明方法所獲得的就病毒滴度而言的回收率非常聞。
[0054]病毒顆粒非常不穩定且對環境條件敏感。特別是，在巧包膜上存在細胞表面標記物原則上可影響此類包膜的組成以及其結構和病毒包膜蛋白的可用性，轉而影響載體的向性，從而引起病毒滴度和傳染性的問題。相反，通過本發明的方法，不影響或甚至增加滴度，引人注目的是用此類方法純化的慢病毒的傳染性小規模增加(對瞬時和穩定製備分別是43%和60%)。這些結果令人驚奇，因為存在有可能負面影響載體向性和傳染性的結構元件。
[0055]本發明又一個優點是該方法可以簡單地擴大和自動化。鑑於其中通過使用免疫磁性選擇純化XV的情況，有可能採用能夠實施自動選擇的機器(如111112108⑧？111811181:1-111116111:,來自1111:61171 0101:60)。此類機器必須能夠在固體支持物比如柱上實施液體交換和通過產生磁場實施免疫磁性選擇。自動化幫助製備大的%儲庫，因為它允許純化大量病毒上清液。用本發明方法大規模純化」允許在主要的特定分離階段獲得至少60%滴度收率(與受體的配體孵育的未純化顆粒的滴度對比純化顆粒的滴度未純化顆粒在大規模實驗中通過初步純化步驟(過濾，任選濃縮)從^上清液獲得，然後與外源性受體的配體孵育。這些步驟各自粗略清除汙染物和轉導抑制劑，經受分離的樣品的病毒滴度漸次富集。整個大規模過程的滴度收率(收穫病毒上清液的滴度對比純化顆粒的滴度)結果大於100%。鑑於據報告整個純化過程的滴度收率為約30% ^0(11-181168等2007)或在大規模製備的情況下甚至 更低(16代611等2011),這些是非常重要的結果。用本發明方法大規模純化允許^的傳染性增加，其導致在分離後傳染性為未純化顆粒的傳染性的約3倍。此外，為了使對用本發明純化方法獲得的製備物質量有概念，有可能計算慢病毒傳染性顆粒數(從病毒滴度可推出的轉染單位)對比總物理顆粒數(可從如報告於&11111011和11*0110，2006的1叩對應於107個物理顆粒這一常規方程獲得，)。非常有趣的是注意到通過本發明的方法，如顯示於例如表4的實驗2，從含有1個傳染性顆粒/5, 318總物理顆粒的上清液(非常差的原料)開始，有可能獲得含有1個傳染性顆粒/250個總物理顆粒的純化製備物，其在IV製劑的質量和功能性方面都有非常好的富集。
[0056]現在將通過非限制性實施例和參考附圖描述本發明的其它優選特徵和實施方案，其中:
【專利附圖】

【附圖說明】。
[0057]圖1.基於抗八-仙的純化過程的示意圖。「構建體」表示瞬時或穩定製備待純化V所需要的質粒或載體(步驟1)。可將選擇標記物八的盒摻入轉移載體構建體內或在自包裝細胞瞬時或穩定表達的不同質粒中。將XV通過與磁珠偶聯的抗八^純化，然後其保留在磁性柱中(步驟2)並最終洗脫(步驟3〉。純化的XV可與連接的珠一起使用(步驟3.1)或者在除去連接的珠後使用(步驟3.2)。
[0058]圖2.本發明實驗程序的示意圖。將程序分為3個簡單步驟:1) XV的磁性標記，其在於將上清液與抗仙綴合的微珠混懸液在室溫下孵育30分鐘:2) ^的磁性分離，其在於將樣品應用於放入磁選機的磁性柱內；所有樣品組分(即汙染物、蛋白質和過量仙)流過並通過幾次洗滌進一步清除；3) XV的洗脫，其在於從磁選機移出柱和收集純化的XV。純化的XV可與連接的珠一起使用(步驟3.1)或者在清除連接的珠以後使用(步驟
3.2)。 [0059]圖3.概括小規模實驗數據的圖。將XV滴度收率計算為純化XV滴度相對於將樣品上樣至柱之前磁性標記巧的滴度的百分數。數值是5次慢病毒載體實驗的平均數，由尺02-101？%卜01111^ 14包裝克隆穩定產生所述慢病毒載體，其攜帶80114-1^包膜(穩定IV，80114-1? ；6次慢病毒載體實驗的平均數，通過瞬時轉染冊1(-2931產生所述慢病毒載體，其攜帶卿? 包膜(瞬時轉染V，787-6) ；5次逆轉錄病毒載體實驗的平均數，由
克隆48產生所述逆轉錄病毒載體，其攜帶如迪。包膜(穩定―，八即「)。
實施例
[0060]實施例1: V的製備
醫逆轉錄病毒載體(⑶)的穩定製備
在37 I在5% (?氣氛下使鼠肌！！-313衍生的64070-假型艦克隆48包裝細胞生長在補充10% ？88和2禮穀氨醯胺的腫￡1 (1)111136000
氏改良培養基)(^肅匕以 810 80101106 181^61-8^1116, 1110.181^61-8^1116, 10)或15 中。在轉導構建體版後獲得艦
克隆48，它編碼修飾形式的基因，其特徵在於在0即330位核苷酸的單個沉默突變(10 2005/123912) 0通過使用八2細胞的抗-八[如服111^免疫選擇轉導的細胞，然後通過有限稀釋進行克隆(0.3個細胞/孔)。克隆48含有2拷貝的$(:11-3 1機2載體。在滾瓶或在填充床32-升生物反應器中在乂；170 15培養基中在1%穀氨醯胺、10% ？88和異亮氨酸/色氨酸/枸櫞酸鈉的存在下製備61？級逆轉錄病毒載體上清液批次。
[0061]慢病毒載體(⑶的穩定製備
使人冊1(-2931及其衍生物詘2-101？%卜0111113包裝細胞在補充10% 和的1)111136000 氏改良 2叫16 培養基(0121)中繁殖。^1)2-101^80^-01111113.14 和 01111113.25 克隆穩定地製備第二代IV用於抗基因療法。用整合載體通過序貫整合包裝構建體和轉移載體獲得克隆。簡言之，將冊[2931'細胞用編碼腺伴隨病毒(八八」 861)-78蛋白的質粒瞬時轉染，然後用雜交棒狀病毒.載體感染，其中棒狀病毒主鏈含有由湖反向末端重複(11?序列側接的表達結構8叫、？01、調控性1*6^和七取"。抗性基因的整合盒(國際專利申請號冊2012/028680)。這種系統允許III？側接的盒861)78-介導性整合入冊1(-293丁基因組內，產生名為？1(-7的第一中間克隆。從？1(-7克隆開始，通過序貫整合表達1117-1調控仏丨和嵌合80114-11？包膜基因的31化1^和表達抗!117 VI？顯性失活轉基因⑶丨…的丁社-依賴性IV載體獲得14和(^丨….25包裝克隆(國際專利申請號10 2012/028681 ^通過將有限稀釋度的細胞接種在96孔板(0.中獲
得克隆。關於每種細胞類型克隆實驗，通過在光學顯微鏡下目測觀察選擇至少5-10個單個克隆或更多個，並將其逐漸擴繁。通過小規模培養在125或175燒瓶中和通過大規模培養在丁162燒瓶中從詘2-101？^^-0111113獲得IV。
[0062]IV的瞬時製備
通過瞬時共轉染以下質粒從冊1(-2931細胞獲得假型IV:包裝構建體構建體和2—-8611.11113轉移載體(國際專利申請號冊2012/028681)。包裝:包膜:
轉移載體的比率對應於6.5:3.5:10 11 8 0嫩。用標準012+-904方法或？呢6116116系統按照製造商說明書(1)18^11081:108 0)11)01^1:1011，111(11^1^)0118，1^)實施瞬時轉染，獲得相似結果。在轉染後48小時收穫上清液，通過0.45-9 III濾器過濾。
[0063]實施例11:通過抗^小規模純化V
V、的小規模純化如下進行。 將含有XV的上清液用含有0.5% 8「的？83 1:5 (^01/^01)稀釋，然後用0.45 11111濾器過濾。將1至501稀釋的上清液與抗仙綴合的微珠混懸液(00271 微珠 1111:61171 0101:60, 011)3? 601-1118117 目錄號 130-091-330)以 1:40比率(701/^01)孵育。然後將樣品在轉臺上在室溫(奶)下孵育30分鐘。將磁性標記的樣品上樣至放入磁選機的柱(1111:61171, 13柱目錄號130-042-201)。在收集流過液用於分析和用0.5 1111洗滌緩衝液(含有2% 和0.5% 83八的？8幻洗滌3次後，從磁選機取出柱，收集純化的乂乂。
[0064]實施例1I1:滴度計算
在881: 101118, 10)的存在下通過以1，240X8達1
小時離心接種(81)1110(3111511:1011) —個周期轉導3111)11細胞，在3111)11細胞上計算V滴度。使用？10界了0 軟體(1^66 81:81-, 1110.,八0?，通過如描述於？01X6111 = 1 等，2009& 2010的流式細胞術分析0&1113111- 80 81080101106, &111 了086，⑶八⑶表達，監測轉導效率。只有範圍為5至20%陽性細胞的轉導值用於根據下式計算滴度:幾=[細胞數X (%陽性細胞/100) V上清液體積(以「計)。
[0065]實施例1V:在小規模製備中純化，對比未純化，的效價分析
如表1和表2概括，使用3種類型的V實施了幾個實驗，所述V通過不同方式製備並用獨特包膜假型化。用穩定的包裝細胞系14或通過瞬時轉染如在實施例1報告的冊1(-2931細胞製備表達0111113轉基因的第2代IV。在第一種條件下，用嵌合1^0114-11？包膜使IV假型化，所述嵌合1^0114-11？包膜由貓科內源性逆轉錄病毒即114包膜的胞外域和跨膜域和八-祖^6鮮4070八的胞質尾區(1?構成等，2002),而在第二種條件下用水泡性口膜炎病毒糖蛋白6包膜使IV假型化。7 —用
克隆48製備，攜帶祖^ 64070包膜。
[0066]每次實驗都在以下條件進行:1)稀釋的上清液體積(101上清液用？83/2%^08/0.5% 83八1:5稀釋)；2〉上清液:微珠混懸液^1/^01)比率1:40⑶抗-[腳尺汕直接偶聯磁珠(60271微珠)。分析的輸出對應於相對於未純化磁性標記V而言純化V滴度收率的百分數(圖3八)和純化XV的傳染性增加量的百分數(圖38)。滴度計算在3即丁1細胞上進行，詳見實施例1II。顯著地，穩定製備的IV的收率超過100% (平均121%)，瞬時製備的IV的收率是90%。這意味著無論它們固定的包膜類型怎麼樣，IV的純化在除去血清蛋白或可能降低滴度值的其它汙染物方面都非常有效。7 的純化收率略低於IV (85%)。此外，用本發明方法純化的慢病毒載體的傳染性已獲得相當大的增加(對瞬時和穩定製備分別是43%和60%)。
[0067]實施例V:通過抗仙大規模純化，
V、的大規模純化如下進行。通過在冷凍臺式離心機中在+41低速(3,400^8)離心16小時將含有IV的過濾上清液(0.45 ^ 111) (800 ^1)濃縮8倍。使，沉澱再懸浮於100「緩衝液？83/20171 0.5%人血清白蛋白(肥八)中，然後與抗仙綴合的微珠混懸液(0)271 微珠，111 七 6町1 81。七 6。，0^^ 130-091-330)^1:40^^^01/^01)^150111轉移袋(111丨61171 810^60目錄號183-01)中孵育。然後將樣品在室溫在軌道搖床上孵育30分鐘。將磁性標記的樣品上樣至？1118儀器上，啟動自動分離程序
3.2。回收40「純化的IV，通過效價計算評估等分試樣的純化性能。
[0068]實施例V1:在大規模製 備中純化對比未純化V效價的分析
使用從穩定包裝細胞系1？02-101？%卜01111^ 25產生的表達⑶丨…轉基因的第2代IV，進行了 2個實驗。在表3和4概括結果。每個實驗如實施例V描述實施。分析的輸出對應於相對於與綴合至磁珠的抗6結合的未純化病毒顆粒(表3)或相對於上清液(表4)而言，純化XV的滴度收率百分數和純化IV傳染性增加量的百分數兩者。滴度計算在3111)11細胞上進行，如公開於實施例1II。在複合物病毒載體-配體的單個分離步驟中大規模純化的滴度收率(表3，￡17輸入)為約60%。在開始分離階段之前，通過初步過濾和離心步驟並且還通過與受體的配體孵育使病毒上清液富集其病毒滴度，所述初步過濾和離心步驟粗略消除汙染物和轉導抑制劑。在整個多步驟純化過程後的最終滴度收率(收穫病毒上清液對比最終的純化產物)(表4，￡1/上清液)大於100%:實驗1為118%和實驗2為231%。最重要的是，純化顆粒的傳染性明顯增加至未純化顆粒的3倍，這與小規模實驗相比是甚至更高的富集，提示從^功能性來看大規模和自動化進一步增加該過程的收率。
【權利要求】
1.一種純化病毒載體的方法，其包括: I1.將編碼細胞表面標記物的外源基因和感興趣基因引入包裝細胞系 II1.培養這樣獲得的生產細胞系
收集含有在其外包膜上攜帶所述細胞表面標記物的病毒載體顆粒的上清液 乂.將所述上清液與能夠結合所述細胞表面標記物的配體孵育 分離複合物配體-病毒載體 VII獲得純化的病毒載體顆粒。
2.權利要求1的方法，其中所述病毒載體選自逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、0病毒載體、棒狀病毒載體和正粘病毒載體。
3.權利要求1或2的方法，其中所述細胞表面標記物選自⑶26、⑶36、⑶44、⑶3、⑶25或截短形式的低親和力神經生長因子受體(八。
4.權利要求1至3中任一項的方法，其中所述細胞表面標記物是截短形式的低親和力神經生長因子受體(ΔLNGFR)。
5.權利要求1至4中任一項的方法，其中所述細胞表面標記物的表達是瞬時的。
6.權利要求1至4中任一項的方法，其中所述細胞表面標記物的表達是穩定的。
7.權利要求1至6中任一項的方法，其中感興趣的基因和外源基因在同一個轉移載體中表達。
8.權利要求1至6中任一項的方法，其中感興趣的基因和外源基因在獨立的載體中表達。
9.上述權利要求中任一項的方法，其中所述配體是選自激動劑、拮抗劑、肽、擬肽、抗體、抗體片段、親和體的化學或生物學實體。
10.上述權利要求中任一項的方法，其中所述配體連接至可從上清液分離的部分。
11.權利要求9或10的方法，其中所述配體是與磁珠綴合的抗體，通過對含有複合物抗體-病毒載體的溶液施加磁場獲得分離。
12.權利要求11的方法，其中通過除去磁場獲得純化的V！。
13.上述權利要求中任一項的方法，其中複合物抗體-病毒載體的分離在柱上進行。
14.一種外源性細胞表面標記物，其表達在包裝細胞系上用於純化由所述包裝細胞系製備的病毒載體。
15.權利要求14的外源性細胞表面標記物，其中所述標記物選自⑶26、⑶36、⑶44、⑶3、⑶25或截短形式的低親和力神經生長因子受體。
16.權利要求14或15的外源性細胞表面標記物，其中所述標記物是八1^0^。
【文檔編號】C12N7/02GK103842501SQ201280049032
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年10月5日 優先權日:2011年10月5日
【發明者】C.博沃倫塔, A.斯託奈奧洛 申請人:莫爾梅德股份有限公司