γ-聚穀氨酸的一種分離純化方法

2023-06-14 09:23:41

專利名稱：γ-聚穀氨酸的一種分離純化方法
技術領域：
本發明涉及ー種從發酵液中分離純化聚穀氨酸的方法，屬於エ業微生物技術領域。
背景技術：
Y-聚穀氨酸(Y-polyglutamic acid，以下簡稱Y-PGA)，是由D-穀氨酸和L-穀氨酸單體之間通過a-氨基和Y-羧基形成肽鍵之後生成的同聚醯胺，通常由5000個左右的穀氨酸單體組成，分子質量一般在100 1000kD。Y -PGA的基本骨架呈直鏈纖維狀，分子鏈上具有大量活性較高的游離羧基在分子內部或分子間形成氫鍵，是ー種水溶性和可生物降解的生物高分子物質。 聚穀氨酸可利用細菌產生或者化學合成。同化學合成的聚穀氨酸(a-PGA)相比較，細菌產生的聚穀氨酸依靠Y -醯基結合，並且能被土壤細菌分泌的水解酶所分解，而化學合成的a-PGA儘管也能被土壤細菌分泌的水解酶所分解，但是分解速度慢，因此被列為環境汙染的原因之一，所以目前生物可降解的聚穀氨酸(Y-PGA)已越來越成為人們關注的焦點。根據酸鹼滴定測定結果，游離型Y -PGA的pKa = 2. 23，與穀氨酸的a_羧基的pKa值大體一致Y-PGA金屬鹽(Na型)的旋光度為-70，平均分子量為I. 23 X IO4;利用TGA和DSC進行熱性質分析，得出其熱分解溫度為235. 9°C，熔點為223. 5°C，熱分解物為茶褐色；對Y -PGA的可溶性溶劑研究表明1. Og的Y -PGA可溶於IOOmL的ニ甲基亞礬、熱的N，N- ニ甲基甲酞胺、N-甲基-2-吡咯烷酮Y -PGA酸水解後用GITC做誘導劑，用HPLC進行分離，測得當產量達到高峰的對數増殖後期時Y -PGA中D-穀氨酸和L-穀氨酸的比值穩定在 D : L = 60 : 40。y -PGA的多分散性在2-5之間，聚合度200-700，具有很好的成膜性、成纖維性、阻氧性、可塑性、粘結性和重要的生物降解性、吸水性等。這些特性使Y-PGA具有增稠、乳化、凝膠、保溫、成膜、緩釋、助溶和粘結等功能。由於Y-PGA分子的側鏈上有大量遊尚羧基、分子帶有大量的負電荷,使其具有強吸水性、具有大量的活性位點等特點，這些特點有利於它成為功能化材料，因此Y-PGA在醫藥、エ業、農業等領域有著廣泛的應用前景。1942年Bovarnick等人研究發現芽孢桿菌屬細菌能在培養基中積累Y -PGA,由此揭開了微生物發酵法生產Y-PGA的研究歷史。目前，利用微生物發酵法生產Y-PGA—直是人們關注的熱點，相關研究十分活躍。同化學合成法及酶轉化法相比，微生物發酵法生產Y-PGA具有生產過程容易控制、發酵產量穩定、提取率高、目標產物產量較高以及產物分子量適宜、環境友好等優點，已逐步成為研究和生產Y-PGA的主要方法和途徑。通過微生物發酵得到的高粘度Y-聚穀氨酸發酵液，可通過有機溶劑沉澱法、化學沉澱法和膜分離沉澱法提取Y-聚穀氨酸。(I)有機溶劑沉澱法一般採用有機溶劑(甲醇或こ醇)沉澱後，通過離心、乾燥得到純品。細胞通過離心從發酵液分離出來，再通過冷凍乾燥，加入4倍甲醇放置過夜沉澱離心收集粗品，粗品溶解於蒸餾水，離心去掉不溶性物質。為了節省有機溶剤，Jin Hwang Do發明了從高粘性的培養液中分離和提取的方法，使酒精用量只有原來的1/4。(2)化學沉澱法化學沉澱法是用飽和硫酸銅、氯化鈉溶液代替低級醇類鹽析沉澱獲取Y-聚穀氨酸。為了節省有機溶劑的用量，JinHwanDo發明了膜分離沉澱法，第一步從高粘性發酵液中分離Y -聚穀氨酸，第二步通過超濾的辦法濃縮溶液，通過調低PH值到3在35度條件下進行酸化，離心分離(離心カ22公斤)，同時用空纖維膜圓柱(MWC0500000)，在pH值為5吋，將濃度從20克/升濃縮到60克/升，酒精用量只是原來的四分之一，能量只是原來的83%。(3)膜分離沉澱法國內有人選用截留分子量I萬的有機膜，取超濾壓カ0. 06MPa進行膜過濾，也取得較好效果。膜分離技術是ー種高效節能型分離技木，大多數膜分離過程在常溫下進行，無相變，不產生二次汙染。

發明內容
本發明的目的是提供ー種從生物發酵液中分離純化Y -聚穀氨酸的エ藝方法，以膜沉澱過濾和醇析相結合的提取エ藝為特徵，解決了有機溶劑沉澱法提取Y-聚穀氨酸造成的有機溶媒損耗量高、エ序長造成的生產成本較高的問題，具有在常溫下進行、無相變、不產生二次汙染、エ藝簡便，收率高、產品純度高等優點。本發明按下述エ藝步驟操作I、發酵液預處理髮酵結束後將Y-聚穀氨酸發酵液快速攪拌，三氯こ酸調pH3. 0 4. 0，加入5 30g/L硅藻土充分攪拌，粗細硅藻土的比例為0. 5 I 2. 0 I (粗硅藻土為100目，細硅藻土為200目)，加入I. 5 3.0倍發酵酸化液體積的去離子水稀釋後倒入預塗了硅藻土的抽濾裝置中抽濾，直至濾液濁度恆定；隨後進行0. 3 2. Og/L活性炭脫色和濾板過濾。2、超濾提取超濾膜採用聚醚碸(PES)、聚丙烯腈(PAN)中空纖維膜，截留分子量(MWCO)為10000、100000，在pH3. 0 5. 0條件下對預處理液進行超濾濃縮。當截留液體積濃縮為原體積的1/2時，加1/2原體積去離子水稀釋攪勻再重複濃縮。之後繼續濃縮截流液至透過液過膜通量降為原來的1/10為止。3、こ醇沉澱向Y -聚穀氨酸濃縮液緩慢滴加こ醇I 4L，過程採用機械攪拌槳 不斷攪拌，使Y-聚穀氨酸緩慢析出。將析出的Y-聚穀氨酸置於放有P2O5的真空乾燥器中乾燥2 4h，經進ー步粉碎，得到流動性Y -聚穀氨酸粉末。本發明Y-聚穀氨酸的分離純化方法，採用多種現代生物技術提取純化發酵液中的目標產物，提升了終產品質量，具有以下特點I、首先在發酵液中加入活性炭脫色和硅藻土吸附和抽濾，有效地實現了菌液分離以及色素和雜蛋白的去除。2、對除菌後的發酵液進行超濾後，Y-聚穀氨酸濃度增加，用於提取的こ醇用量降低。超濾過程中弓I入加水稀釋和重複濃縮的步驟，儘可能的去掉雜質。最終Y _聚谷氣Ife廣品純度達95%以上，總收率達90%以上。廣品為白色無定型粉末，質量指標已達到化妝品級的要求。
具體實施方式
實施例I聚穀氨酸的ー種分離純化方法，按以下步驟依次進行(I)發酵液預處理髮酵結束後將Y-聚穀氨酸發酵液快速攪拌，滴加50%三氯こ酸調PH3. 0，加入20g/L、發酵酸化液2%的吸附劑硅藻土充分攪拌，粗細硅藻土的比例為1.5 I (粗硅藻土為100目，細硅藻土為200目)，加入2. 5倍發酵酸化液體積的去離子水稀釋後倒入預塗了發酵酸化液0.5%硅藻土的抽濾裝置中，0. IMPa壓カ循環抽濾，直至濾液濁度恆定，檢測雜蛋白含量和Y -聚穀氨酸濃度；隨後進行0. 5g/L活性炭脫色和濾板過濾。(2)超濾提取超濾膜採用聚醚碸(PES)中空纖維膜，截留分子量(MWCO)為10000，在pH3. 0條件下對預處理液進行超濾濃縮。當截留液體積濃縮為原體積的1/2吋，加1/2原體積去離子水稀釋攪勻再重複濃縮，以儘可能濾去鹽分和小分子雜質。期間取透過液滴加0. I % AgNO3溶液檢測有無渾濁。之後繼續濃縮截流液至透過液過膜通量降為原來的1/10為止。(3)こ醇沉澱向Y -聚穀氨酸濃縮液緩慢滴加こ醇3L，過程採用機械攪拌槳不斷攪拌，使Y-聚穀氨酸緩慢析出。將析出的Y-聚穀氨酸置於放有P2O5的真空乾燥器中乾燥4h，經進ー步粉碎，得到流動性Y -聚穀氨酸粉末，純度為96. 8%。實施例2聚穀氨酸的ー種分離純化方法，按以下步驟依次進行(I)發酵液預處理髮酵結束後將Y-聚穀氨酸發酵液快速攪拌，滴加50%三氯 こ酸調PH4. 0，加入15g/L、發酵酸化液2%的吸附劑硅藻土充分攪拌，粗細硅藻土的比例為
1.0 I (粗硅藻土為100目，細硅藻土為200目)，加入3.0倍發酵酸化液體積的去離子水稀釋後倒入預塗了發酵酸化液0.5%硅藻土的抽濾裝置中，0. IMPa壓カ循環抽濾，直至濾液濁度恆定，檢測雜蛋白含量和Y -聚穀氨酸濃度；隨後進行I. 5g/L活性炭脫色和濾板過濾。(2)超濾提取超濾膜採用聚丙烯腈(PAN)中空纖維膜，截留分子量(MWCO)為100000，在pH4. 0條件下對預處理液進行超濾濃縮。當截留液體積濃縮為原體積的1/2吋，加1/2原體積去離子水稀釋攪勻再重複濃縮，以儘可能濾去鹽分和小分子雜質。期間取透過液滴加0. 1% AgNO3溶液檢測有無渾濁。之後繼續濃縮截流液至透過液過膜通量降為原來的1/10為止。(3)こ醇沉澱向Y -聚穀氨酸濃縮液緩慢滴加こ醇2L，過程採用機械攪拌槳不斷攪拌，使Y-聚穀氨酸緩慢析出。將析出的Y-聚穀氨酸置於放有P2O5的真空乾燥器中乾燥3h，經進ー步粉碎，得到流動性Y -聚穀氨酸粉末，純度為95. 5%。實施例3聚穀氨酸的ー種分離純化方法，按以下步驟依次進行(I)發酵液預處理髮酵結束後將Y-聚穀氨酸發酵液快速攪拌，滴加50%三氯こ酸調PH3. 5，加入30g/L、發酵酸化液2%的吸附劑硅藻土充分攪拌，粗細硅藻土的比例為
2.0 I (粗硅藻土為100目，細硅藻土為200目)，加入2.0倍發酵酸化液體積的去離子水稀釋後倒入預塗了發酵酸化液0.5%硅藻土的抽濾裝置中，0. IMPa壓カ循環抽濾，直至濾液濁度恆定，檢測雜蛋白含量和Y -聚穀氨酸濃度；隨後進行2. Og/L活性炭脫色和濾板過濾。(2)超濾提取超濾膜採用聚醚碸(PES)中空纖維膜，截留分子量(MWCO)為10000，在pH5. 0條件下對預處理液進行超濾濃縮。當截留液體積濃縮為原體積的1/2吋，加1/2原體積去離子水稀釋攪勻再重複濃縮，以儘可能濾去鹽分和小分子雜質。期間取透過液滴加0. 1% AgNO3溶液檢測有無渾濁。之後繼續濃縮截流液至透過液過膜通量降為原來的1/10為止。
(3)こ醇沉澱向Y-聚穀氨酸濃縮液緩慢滴加こ醇4L，過程採用機械攪拌槳不斷攪拌，使Y-聚穀氨酸緩慢析出。將析出的Y-聚穀氨酸置於放有P2O5的真空乾燥器中乾燥2h，經進ー步粉碎，得到流動性Y -聚穀氨酸粉末，純度為95. 5%。
權利要求
1.聚穀氨酸的ー種分離純化方法，其特徵在於本方法包括以下步驟 1)發酵結束後將Y-聚穀氨酸發酵液快速攪拌，調PH值，加入硅藻土充分攪拌，去離子水稀釋後抽濾，直至濾液濁度恆定； 2)進行活性炭脫色和濾板過濾； 3)超濾提取一定條件下對預處理液進行超濾濃縮，引入加水稀釋和重複濃縮的步驟，儘可能的去掉雜質。
4)こ醇沉澱向Y-聚穀氨酸濃縮液緩慢滴加こ醇使Y-聚穀氨酸緩慢析出。真空乾燥、粉碎，得到Y-聚穀氨酸粉末，純度> 95%。
2.根據權利要求I所述方法，其特徵在幹步驟I)中三氯こ酸調pH至3.0 4.O，加入5 30g/L娃藻土,粗細娃藻土的比例為0. 5 : I 2. 0 : I,去離子水稀釋倍數為I. 5 3.0 倍。
3.根據權利要求I所述方法，其特徵在於步驟2)活性炭脫色濃度為0.3 2. Og/L。
4.根據權利要求I所述方法，其特徵在於步驟3)中超濾膜採用聚醚碸(PES)、聚丙烯腈(PAN)中空纖維膜，截留分子量(MWCO)為10000、100000，在pH3. 0 5. 0條件下對預處理液進行超濾濃縮。當截留液體積濃縮為原體積的1/2時，加1/2原體積去離子水稀釋攪勻再重複濃縮。之後繼續濃縮截流液至透過液過膜通量降為原來的1/8 1/10為止。
5.根據權利要求I所述方法，其特徵在幹步驟4)中滴加こ醇I 4L，過程採用機械攪拌槳不斷攪拌，使Y-聚穀氨酸緩慢析出。將析出的Y-聚穀氨酸置於放有P2O5的真空乾燥器中乾燥2 4h。
全文摘要
本發明涉及一種從發酵液中分離純化聚穀氨酸的方法，首先採用三氯乙酸調pH值至3.0～4.0以降低發酵液黏度，然後在發酵液中加入活性炭脫色和硅藻土吸附和抽濾，處理後的發酵液依次經過超濾濃縮和醇析純化，最後經真空乾燥後得到純度≥95％的γ-聚穀氨酸。本發明具有在常溫下進行、無相變、不產生二次汙染、工藝簡便，收率高、產品純度高等優點，適合產業化生產。
文檔編號C08G69/10GK102952266SQ20121039636
公開日2013年3月6日 申請日期2012年10月18日 優先權日2012年10月18日
發明者王克柳, 王美海 申請人:山東魯北藥業有限公司