一株木黴k9301菌株及其在製備木黴蛋白酶中的應用的製作方法

2023-06-14 10:04:31 3

專利名稱：一株木黴k9301菌株及其在製備木黴蛋白酶中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株木黴K9301 (Trichoderma sp. K9301)菌株及其在製備木黴蛋白酶中的應用，屬於微生物技術領域。
背景技術：
木黴是一類典型的生物防治菌株。木黴屬中許多種類比如哈茨木黴、綠色木黴、康寧木黴都已被開發成為生防製劑。木黴對於病原真菌的拮抗作用是通過分泌細胞壁降解酶，產生抗生肽，誘導植物抗性，爭奪營養與空間以及重寄生作用等機制協同實現的。木黴產的蛋白酶是一種細胞壁降解酶，它可以降解病原真菌細胞壁中的蛋白成分，並且失活病原真菌分泌的重要酶類，從而在木黴抗真菌過程中發揮作用。有報導從哈茨木黴中分離的蛋白酶抑制Botrystiscinerea的菌絲生長及孢子萌發，另外許多高產蛋白酶的木黴突變體的拮抗效果明顯提高。蛋白酶是一大類可以降解蛋白質的水解酶類，根據催化結構域中功能基團的不同，它可以分為絲氨酸蛋白酶，天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸蛋白酶以及金屬蛋白酶四大類。 根據作用最適PH值的不同可以分成酸性蛋白酶，中性蛋白酶和鹼性蛋白酶。鹼性蛋白酶在洗滌等工業領域得到了廣泛應用。

發明內容
本發明針對現有技術的不足，提供一株木黴K9301 (Trichoderma sp. K9301)菌株及採用該菌株並利用淺層固體發酵技術製備具有抑制植物病原真菌功能的木黴蛋白酶的方法。一株木黴K9301 (Trichoderma sp. K9301)菌株，2010年9月7日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCC NO :M2010223，地址中國，武漢，武漢大學。木黴K9301菌株，能夠在以纖維素、半纖維素為碳源、以硫酸銨、豆粕為氮源的培養基中快速生長，並且該木黴菌株高產蛋白酶，該蛋白酶可抑制植物病原真菌的生長，在植物真菌病害的防治中具有很好的應用潛力。上述木黴K9301 (Trichoderma sp. K9301)菌株在製備木黴蛋白酶中的應用。上述應用，步驟如下(1)將菌種保藏號為CCTCC NO :M2010223 的木黴 K9301 (Trichoderma sp. K9301)
經活化培養基活化後，接種至液體培養基進行培養，然後接種至液體發酵罐培養基發酵，製得液體菌種；(2)按每百重量份淺層固體發酵培養基接種6 8重量份經步驟⑴製得的液體菌種，在25 ，空氣相對溼度80 85%的條件下，淺層固體發酵3 4天，發酵期間每隔20 30小時翻曲一次，製得木黴蛋白酶發酵培養物；(3)將步驟( 製得的木黴蛋白酶發酵培養物按1 (5 8)的重量比加水浸泡 11 12小時，板框過濾，過濾液即為蛋白酶的提取液；
(4)將步驟C3)製得的蛋白酶的提取液經濃縮後，加入穩定劑，即得。步驟(1)中的活化培養基、液體培養基、液體發酵罐培養基成分及活化、培養、發酵條件均可採用本領域常用技術，優選方案如下活化培養基的製備方法及活化條件如下活化培養基的製備方法將處理後的土豆塊按每重量份與4 6重量份的水混合， 78 82°C浸泡1小時或煮沸半小時，過濾後，濾液加水稀釋至原來的體積；再加葡萄糖1 2份，瓊脂1. 5 2份，自然pH值，8磅滅菌，即得活化培養基；活化條件劃線接種木黴K9301 CTrichoderma sp. K9301)菌株，28 30°C活化 25 35h，經與無菌水混合後得菌懸液。液體培養基的製備方法及培養條件如下液體培養基的製備方法將處理後的土豆塊按每重量份與3 6重量份的水混合， 78 82°C浸泡1小時或煮沸半小時，過濾後，濾液加水稀釋至原來的體積；再加葡萄糖1 2份，自然pH值，8磅滅菌，即得液體培養基；培養條件按3 5%重量百分比的接種量接種經活化後的菌懸液，28 30°C搖床培養25 35h，得菌液。液體發酵罐培養基的製備方法及發酵條件如下液體發酵罐培養基的製備方法將麩皮10 15重量份與水100重量份，混合， 煮沸半小時後，過濾，再加入蛋白腖0. 5 0. 6重量份、Na2HPO4 0. 3 0. 5重量份、KH2PO4 0. 04 0. 05重量份，混勻後滅菌，即得液體發酵罐培養基；發酵條件按每百重量份液體發酵罐培養基接種6 8重量份經培養後的菌液， 28 30°C通風攪拌，發酵30 36小時，得液體菌種。所述步驟O)中的淺層固體發酵培養基按如下步驟製得將玉米秸粉或小麥秸粉30 40重量份，麩皮30 40重量份，豆粕20 30重量份，硫酸銨0.5 1.0重量份，混合後，製得原料；然後按原料水=1 4(重量比)混合， 滅菌，冷卻後，即得。所述步驟( 製得的蛋白酶發酵培養物活性為500 700U/g幹曲。所述步驟(4)中的濃縮，步驟如下將步驟(3)製得的蛋白酶的提取液用截留分子量為5000Da的超濾膜濃縮，濃縮至原來體積的1/10 1/5，製得高活性液體木黴蛋白酶，其蛋白酶活性為1000 1500U/ml ； 然後，在高活性液體木黴蛋白酶中加入1 2% (重量百分比)的穩定劑。所述步驟中的穩定劑為海藻糖。所述步驟(4)中加入穩定劑操作後，再經質檢、包裝成品，製得木黴蛋白酶。有益效果(1)本發明公開的木黴K9301 (Trichoderma sp. K9301)可以高產木黴蛋白酶， 該酶對於由植物病原真菌 Pyrenophora tritici-repentis, Sclerotium cepivorum 禾口 Sclerotiniasclerotiorum引起的疾病有顯著的防治效果；(2)本發明以木黴K9301 (Trichoderma sp. K9301)為菌株，採用農作物秸稈、麥麩、豆粕等廉價原料，利用液體深層發酵技術，發酵生產液體菌種，然後應用淺層固體發酵技術，在無菌條件下，發酵生產木黴蛋白酶培養物，提取、濃縮製備液體木黴蛋白酶，應用於
5防治植物真菌病害，可產生很好的經濟和社會效益。(3)本發明製得的蛋白酶，穩定性好，可高效抑制植物病原真菌，可用於防治植物真菌病害，從而可減少農藥的用量，降低農產品中農藥的殘留，符合目前對無公害農產品生產的迫切需求。(4)本發明採用農業廢棄物作物秸稈為原料，解決了作物秸稈無法高效、資源化利用的難題，不僅節約了資源，而且減少了對環境的汙染，在開發利用農作物秸稈的同時，無三廢排出，是一條農業廢棄物資源化、高值化、生態化利用的有效途徑。


圖1木黴K9301 (Trichoderma sp. K9301)蛋白酶抑菌活性的檢測。圖中1、300μ 1蛋白酶提取液；2、150μ 1蛋白酶提取液；3、50μ 1蛋白酶提取液； 4,300 μ 1雙蒸水。
具體實施例方式下面結合實施例及附圖對本發明做進一步闡述，但本發明所保護範圍不限於此。實施例1一株木黴Κ9301 (Trichoderma sp. K9301)菌株，2009年9月7日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCC NO :M2010223。木黴K9301菌株，能夠在以纖維素、半纖維素為碳源、以硫酸銨、豆粕為氮源快速生長，並且該木黴菌株高產蛋白酶，該蛋白酶可抑制植物病原真菌的生長，在植物真菌病害的防治中具有很好的應用潛力。實施例2上述木黴K9301 (Trichoderma sp. K9301)菌株在製備木黴蛋白酶中的應用，步驟如下(1)將菌種保藏號為CCTCC NO :M2010223 的木黴 K9301 (Trichoderma sp. K9301)
經活化培養基活化後，接種至液體培養基進行培養，然後接種至液體發酵罐培養基發酵，製得液體菌種；活化培養基的製備方法及活化條件如下活化培養基的製備方法將處理後的土豆塊按每重量份與5重量份的水混合， 80°C浸泡1小時，過濾後，濾液加水稀釋至原來的體積；再加葡萄糖1. 5份，瓊脂1. 5份，自然PH值，8磅滅菌，即得活化培養基；活化條件劃線接種木黴K9301 CTrichoderma sp. K9301)菌株，28 30°C活化 30h,經與水混合後得菌懸液。液體培養基的製備方法及培養條件如下液體培養基的製備方法將處理後的土豆塊按每重量份與4重量份的水混合， 80°C浸泡1小時，過濾後，濾液加水稀釋至原來的體積；再加葡萄糖1. 5份，自然pH值，8磅滅菌，即得液體培養基；培養條件按3%重量百分比的接種量接種經活化後的菌懸液，觀 30°C搖床培養30h，得菌液。
液體發酵罐培養基的製備方法及發酵條件如下液體發酵罐培養基的製備方法將麩皮10重量份與水100重量份，混合，煮沸半小時後，過濾，再加入蛋白腖0. 5重量份、Na2HPO4 0. 4重量份、KH2PO4 0. 04重量份，混勻後滅菌，即得液體發酵罐培養基；發酵條件按每百重量份液體發酵罐培養基接種6重量份經培養後的菌液二6 通風攪拌，發酵30小時，得液體菌種；(2)按每百重量份淺層固體發酵培養基接種6重量份經步驟(1)製得的液體菌種， 在沈 ，空氣相對溼度80 85%的條件下，淺層固體發酵發酵4天，發酵期間每隔25 小時翻曲一次，製得木黴蛋白酶發酵培養物，蛋白酶發酵培養物活性為600U/g幹曲；所述的淺層固體發酵培養基按如下步驟製得將小麥秸粉30重量份，麩皮30重量份，豆粕30重量份，硫酸銨0. 5重量份，混合後，製得原料；然後按原料水=1 4 (重量比)混合，滅菌，冷卻後，即得；(3)將步驟( 製得的木黴蛋白酶發酵培養物按1 6的重量比加水浸泡11小時，板框過濾，過濾液即為蛋白酶的提取液；(4)將步驟(3)製得的蛋白酶的提取液經濃縮後，加入海藻糖，即得；所述步驟中的濃縮，步驟如下將步驟(3)製得的蛋白酶的提取液用截留分子量為5000Da的超濾膜濃縮，濃縮至原來體積的1/5，製得高活性液體木黴蛋白酶，其蛋白酶活性為1500U/ml ；然後，在高活性液體木黴蛋白酶中加入1.5% (重量百分比)的海藻糖，再經質檢、包裝成品，製得木黴蛋白酶。實施例3實施例2中所製得的木黴蛋白酶的抑菌活性分析，步驟如下(1)雙層培養基平板的製備，底層採用2%的瓊脂培養基，在每個培養皿(直徑 90mm)中加入IOml底層培養基。上層採用含有指示菌的瓊脂培養基，指示菌為植物病原真菌尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum Schlecht ACCC3037)，將5ml冷卻至45°C的上層培養基倒入已凝固的底層培養基表面，冷卻後即為雙層培養基平板。瓊脂培養基的製備方法將處理後的土豆塊按每重量份與4 6重量份的水混合， 78 82°C浸泡1小時或煮沸半小時，過濾後，濾液加水稀釋至原來的體積；再加葡萄糖1 2份，瓊脂1. 5 2份，自然pH值，8磅滅菌，即得瓊脂培養基；(2)在步驟(1)中製得的雙層培養基平板上輕輕放置無菌牛津杯(內徑6. 0mm，外徑7. 8mm,高度10. Omm)，每皿放置4個，牛津杯之間距離相等。然後在3個牛津杯中分別加入300μ 1、150μ 1和50 μ 1實施例2中製得的木黴蛋白酶提取液，第4個杯中加入300 μ 1 無菌水作為對照。(3)將步驟(2)中加入了木黴蛋白酶提取液的雙層培養基平板置於的恆溫培養箱中進行培養，24h後測定抑菌圈直徑。150μ 1木黴蛋白酶提取液的抑菌直徑為 2. 0 士0. 4cm, 300 μ 1木黴蛋白酶提取液的抑菌直徑為3. 3 士0. 5cm，對照孔中的300 μ 1無菌水對尖孢鐮刀菌的菌絲生長有影響。這表明實施例2中製得的木黴蛋白酶提取液對植物病原菌尖孢鐮刀菌具有明顯的抑制作用。實驗結果如圖1所示。實施例4
如實施例2所述的應用，不同之處在於液體培養基的製備方法及培養條件液體培養基的製備方法將處理後的土豆塊按每重量份與6重量份的水混合， 80°C浸泡1小時，過濾後，濾液加水稀釋至原來的體積；再加葡萄糖1份，自然pH值，8磅滅菌，即得液體培養基；培養條件按3%重量百分比的接種量接種經活化後的菌懸液搖床培養 30h，得菌液。液體發酵罐培養基的製備方法及發酵條件如下液體發酵罐培養基的製備方法將麩皮15重量份與水100重量份，混合，煮沸半小時後，過濾，再加入蛋白腖0. 5重量份、Na2HPO4 0. 5重量份、KH2PO4 0. 05重量份，混勻後滅菌，即得液體發酵罐培養基；發酵條件按每百重量份液體發酵罐培養基接種6重量份經培養後的菌液，28°C 通風攪拌，發酵35小時，得液體菌種。實施例5如實施例2所述的應用，不同之處在於淺層固體發酵培養基及培養方法淺層固體發酵培養基按如下步驟製得將玉米秸粉40重量份，麩皮35重量份，豆粕20重量份，硫酸銨0. 5重量份，混合後，製得原料；然後按原料水=1 4 (重量比)混合，滅菌，冷卻後，即得；培養方法按每百重量份淺層固體發酵培養基接種6重量份經步驟(1)製得的液體菌種，在 280C，空氣相對溼度80 85%的條件下，淺層固體發酵發酵4天，發酵期間每隔M小時翻曲一次，製得木黴蛋白酶發酵培養物，蛋白酶發酵培養物活性為600U/g幹曲。
權利要求
1.一株木黴K9301 CTrichoderma sp. K9301)菌株，2010年9月7日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCC NO :M2010223。
2.權利要求1所述的木黴K9301(Trichodermasp. K9301)菌株在製備木黴蛋白酶中的應用。
3.如權利要求2所述的應用，其特徵在於，步驟如下(1)將菌種保藏號為CCTCCNO :M2010223 的木黴K9301 (Trichoderma sp. K9301)經活化培養基活化後，接種至液體培養基進行培養，然後接種至液體發酵罐培養基發酵，製得液體菌種；(2)按每百重量份淺層固體發酵培養基接種6 8重量份經步驟(1)製得的液體菌種， 在25 ^°C，空氣相對溼度80 85%的條件下，淺層固體發酵3 4天，發酵期間每隔 20 30小時翻曲一次，製得木黴蛋白酶發酵培養物；(3)將步驟( 製得的木黴蛋白酶發酵培養物按1 (5 8)的重量比加水浸泡11 12小時，板框過濾，過濾液即為蛋白酶的提取液；(4)將步驟C3)製得的蛋白酶的提取液經濃縮後，加入穩定劑，即得。
4.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，步驟(1)中的活化培養基的製備方法及活化條件如下活化培養基的製備方法將處理後的土豆塊按每重量份與4 6重量份的水混合， 78 82°C浸泡1小時或煮沸半小時，過濾後，濾液加水稀釋至原來的體積；再加葡萄糖1 2份，瓊脂1. 5 2份，自然pH值，8磅滅菌，即得活化培養基；活化條件劃線接種木黴K9301 (Trichoderma sp. K9301)菌株，觀 30°C活化25 35h，經與無菌水混合後得菌懸液。
5.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，步驟(1)中的液體培養基的製備方法及培養條件如下液體培養基的製備方法將處理後的土豆塊按每重量份與3 6重量份的水混合， 78 82°C浸泡1小時或煮沸半小時，過濾後，濾液加水稀釋至原來的體積；再加葡萄糖1 2份，自然pH值，8磅滅菌，即得液體培養基；培養條件按3 5%重量百分比的接種量接種經活化後的菌懸液，28 30°C搖床培養25 35h，得菌液。
6.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，步驟(1)中的液體發酵罐培養基的製備方法及發酵條件如下液體發酵罐培養基的製備方法將麩皮10 15重量份與水100重量份，混合，煮沸半小時後，過濾，再加入蛋白腖0. 5 0. 6重量份、Na2HPO4 0. 3 0. 5重量份、KH2PO4 0. 04 0. 05重量份，混勻後滅菌，即得液體發酵罐培養基；發酵條件按每百重量份液體發酵罐培養基接種6 8重量份經培養後的菌液二8 30°C通風攪拌，發酵30 36小時，得液體菌種。
7.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述步驟(2)中的淺層固體發酵培養基按如下步驟製得將玉米秸粉或小麥秸粉30 40重量份，麩皮30 40重量份，豆粕20 30重量份， 硫酸銨0.5 1.0重量份，混合後，製得原料；然後按原料水=1 4(重量比)混合，滅菌，冷卻後，即得。
8.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述步驟(2)製得的蛋白酶發酵培養物活性為500 700U/g幹曲。
9.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述步驟中的濃縮，步驟如下 將步驟C3)製得的蛋白酶的提取液用截留分子量為5000Da的超濾膜濃縮，濃縮至原來體積的1/10 1/5，製得高活性液體木黴蛋白酶，其蛋白酶活性為1000 1500U/ml ；然後， 在高活性液體木黴蛋白酶中加入1 2%(重量百分比)的穩定劑。
10.如權利要求3所述的應用，其特徵在於，所述步驟中的穩定劑為海藻糖。
全文摘要
本發明涉及一株木黴K9301菌株及其在製備木黴蛋白酶中的應用，屬於微生物技術領域。本發明公開了一株木黴K9301(Trichoderma sp.K9301)菌株，2010年9月7日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏號CCTCC NOM2010223；及該菌株在製備木黴蛋白酶中的應用。本發明公開的木黴K9301可以高產木黴蛋白酶，該酶對於由植物病原真菌Pyrenophoratritici-repentis，Sclerotium cepivorum和Sclerotinia sclerotiorum引起的疾病有顯著的防治效果。
文檔編號C12N9/58GK102168018SQ20101056803
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月1日 優先權日2010年12月1日
發明者周百成, 孫彩雲, 宋曉妍, 張玉忠, 石梅, 陳秀蘭, 陳蕾蕾 申請人:山東大學