一種木黴滴丸劑及其製備方法和應用的製作方法
2023-06-14 10:09:41 1
專利名稱：一種木黴滴丸劑及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物活性農藥技術領域，具體涉及一種木黴滴丸劑及其製備方法和應用。
背景技術：
木黴菌隸屬於半知菌亞門，叢梗目，從梗孢科，是一類具有重要經濟意義的生防益 菌。木黴菌對環境的適應性強、生長速度遠比病原真菌快、是土壤中植物病原真菌生存空間 和營養源的有力競爭者。木黴菌能有效地利用植物表面或植物病原真菌侵入點附近低濃度 營養物質迅速佔領空間吸收營養使植物病原真菌無法入侵。近年來人為向土壤中引入木黴 菌防治植物病害的研究較為活躍，例如用哈茨木黴、哈氏木黴和綠色木黴防治洋蔥白腐病、 棉花和黃瓜黃萎病、人參根腐病、茉莉白絹病、西洋參立枯病及多種作物的猝倒病和疫病， 均取得較為理想的防治效果。不同種類木黴菌有不同的植物病害防治功效，但目前尚未有 將木黴菌滴丸劑用於防治香蕉枯萎病的技術記載。木黴菌分生孢子的產生對條件要求不嚴格，便於開發生防製劑，並且木黴對病原 菌的拮抗作用以分生孢子產生的抑菌物質最為明顯。木黴菌經固體發酵後可產生大量的分 生孢子，目前常用的木黴分生孢子製劑有粉劑、顆粒劑等，但是這些製劑田間施用時緩釋作 用比較差，不能在相對長的一段時間內發揮其生防活性，且易受到環境的影響。滴丸劑是固體分散體的成熟劑型之一，採用滴製法將固體或液體藥物與基質加熱 熔化製備成液體分散體後，滴入到與基質不相溶的冷凝液中收縮冷凝成丸劑。滴丸劑製備 工藝具有生物利用度高、能延緩釋藥、增加藥物穩定性和掩蓋藥物的不良氣味及刺激性、生 產設備及操作簡便等特點。滴丸劑主要應用於醫藥工業，在微生物農藥領域的應用未見報 道。鑑於滴丸技術的諸多優點，將滴丸技術應用到微生物活性農藥製備領域，藉以解 決微生物製劑在複雜的田間難以保持生物活性以及緩慢釋放的難題。但滴丸製劑的載藥量 與滴丸成型密切相關，加工溫度也必須嚴格控制，以防高溫條件下微生物容易失去活性。到 目前為止滴丸技術在微生物活性農藥製備領域尚未被合理應用。
發明內容
本發明目的在於根據醫藥製劑加工領域比較成型的滴丸製備技術，結合微生物活 體木黴分生孢子在其製備方法中存在的需要注意的問題，將滴丸技術合理用於微生物活性 農藥製備，提供一種易加工保存，緩釋效果好的木黴滴丸劑。本發明另一目的在於提供上述木黴滴丸劑的製備方法。本發明還有一個目的在於提供上述木黴滴丸劑的應用。本發明上述目的通過以下技術方案予以實現一種木黴滴丸劑，包含木黴孢子懸浮液和滴丸基質，其中，木黴孢子懸浮液是棘孢 木黴菌株T1 (Trichoderma asperellum,保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏號為CGMCC N0:3531，保藏日期 為2009年12月17日)固體培養之後無菌水洗脫下來的孢子懸浮液，其rDNA ITS區片段 序列如SEQ ID NO 1所示。本發明木黴滴丸劑是具有萌發活性的分生孢子製劑，其rDNA ITS區片段序列可以 通過PCR擴增得到，擴增引物序列如SEQ ID NO :2 3所示，PCR反應體系為ddH20 14. 8 μ L， 10XPCR buffer (with Mg2+) 2.5 μ L，dNTPs(10mM each) 0. 5 μ L 上遊引物(5 μ Μ) 3.0 μ L，下 遊引物(5 μ Μ) 3. 0 μ L，模板 DNA 1. 0μ L, Taq 酶 0.2 μ L。PCR 反應條件為(1) 94°C，5min， 熱變性；(2)94°C，4k，熱變性；(3)55°C，妨s，退火；(4)72°C，4k，延伸；(5) 72°C，lOmin，延 伸；其中(2)、⑶、⑷是循環。擴增出的序列如SEQ ID NO 1所示。上述木黴滴丸劑中還含有防腐劑，防腐劑可選擇水楊酸、山梨酸鉀和苯甲酸鈉中 的一種或多種的混合，防腐劑的濃度為0. 5 1. 5g/升孢子懸浮液。所述的滴丸基質為聚乙二醇1000、聚乙二醇2000和聚乙二醇4000中的一種或二 種或三種的混合。所述木黴孢子懸浮液與基質的體積比為1 10 3 10。本發明木黴孢子滴丸劑的製備方法包括如下步驟(1)將棘孢木黴菌株T1植於PDA培養基上使其復甦，再採用酵母膏蔗糖培養基進 行菌種繼代培養，待長出直徑為5 7mm的深綠色菌落後，將菌落接種，在酵母膏蔗糖培養 基和麩皮木屑培養物中進行擴大培養，直至長出白色菌絲或綠色孢子；(2)將白色菌絲或綠色孢子製成孢子懸浮液，過濾沉澱為濃縮孢子液；(3)向濃縮孢子懸浮液中添加防腐劑，溶解攪拌均勻，即得木黴滴丸劑原藥；(4)將滴丸基質預熱至熔化狀態；注入冷凝劑至滴丸機中並設置溫度進行預冷；(5)將木黴滴丸原藥迅速加入預熱的滴丸基質中，然後將混合液加入滴丸機的儲 液罐中，打開攪拌器，待儲液罐的油浴溫度穩定後，調整滴距打開滴頭開始滴丸，即得木黴 滴丸劑。上述製備方法中，所述酵母膏蔗糖培養基為高溫滅菌過的培養基，滅菌溫度為 121°C，滅菌時間為30min，酵母膏蔗糖培養基的配方為酵母膏15g，蔗糖20g，KH2PO4Ig,麥 芽膏15g，硫酸鈉2g，氯化鉀0. 5g，維生素B 0. 5mg,維生素C 0. 5mg,七水合硫酸鎂0. 05g, 硫酸鐵0. Olg，瓊脂20g，水IL0步驟(1)中所述菌種繼代培養的溫度為30°C，溼度為70 85%，培養時間為48 72h ；所述擴大培養的溫度為30°C，溼度為70 85%，培養時間為5 7d。所述麩皮木屑培養物是麩皮、木屑、蔗糖、維生素B和水的混合物，其中，麩皮、木 屑、蔗糖三者的質量比為2 1 0.02;維生素B用量為每千克麩皮木屑培養物中加入 0. 5mg，每瓶裝瓶量為15g;每瓶加水量5ml ；防腐劑為水楊酸、山梨酸鉀和苯甲酸鈉中的一 種或多種的混合，用量為0. 5 1. 5g/L孢子懸浮液；用於酵母膏蔗糖培養基和麩皮木屑培 養物滅菌的溫度為121°C，滅菌時間為30min。步驟(4)所述木黴滴丸的基質為聚乙二醇1000、聚乙二醇2000和聚乙二醇4000 中的一種或二種或三種的混合；原藥與熔化的基質按照體積質量比1 10 3 10混合； 冷凝劑可選擇液體石蠟或二甲基矽油或植物油，冷凝溫度為0°C;步驟(5)中藥液的油浴溫度為53 57°C，攪拌速度為20 300轉/分鐘，滴距為Mem。上述木黴滴丸劑用於防治香蕉枯萎病。木黴菌對環境的適應性強且生長速度遠比病原真菌快，能對病原真菌產生營養或 空間的競爭，能有效利用植物表面的病原真菌侵入點附近的低濃度營養物質迅速生長佔領 空間消耗掉營養物質，從而抑制了病原真菌的生長和對寄主植物的入侵，達到對植物病害 的防治效果。本發明木黴滴丸劑作為微生物活性農藥，不僅能有效防治香蕉枯萎病，還因為棘 孢木黴菌株T1具有廣譜性拮抗能力，因此本發明木黴滴丸劑能拮抗多種病原真菌，防治其 他多種植物病害。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果(1)本發明採用棘孢木黴菌株T1作為生產菌株，其孢子粉生存能力強，適應性廣， 具有廣譜性拮抗能力，除了能對香蕉枯萎病起到有效防治，還能夠拮抗多種病原真菌，尤其 對土傳真菌有顯著的拮抗效果。(2)本發明將滴丸技術合理用於微生物活性農藥木黴滴丸劑的製備中，解決了田 間複雜條件下難以保持微生物活性以及緩釋性的技術難題，使得微生物滴丸劑可以在保持 高活性的前提下緩慢釋放，逐步發揮其生防效果，製備工藝簡單易行，採用的設備簡單，易 於推廣。(3)本發明木黴滴丸劑木黴孢子成型效果好，生物活性高，易於貯藏，便於施用。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例並不對本發明做任何形式的限定。實施例1一種木黴滴丸劑，含有木黴孢子懸浮液、防腐劑和滴丸基質，其中，木黴孢子懸浮 液是由棘孢木黴菌株T1 (Trichoderma asperellum T1,保藏於中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO 3531)的孢子粉製備，其rDNA ITS區片段序列 如SEQ ID NO :1所示；防腐劑為水楊酸，濃度為lg/L孢子懸浮液；基質選擇質量比為1 1 的PET2000和PET4000的混合物，原藥(即木黴孢子懸浮液和水楊酸)與基質的質量比 1 10。本實施例木黴滴丸劑的製備方法如下1.菌株的復甦和擴大培養(1)將冷藏的棘孢木黴菌株T1 (Trichoderma asperellum T1)植於PDA培養基上 使其復甦；(2)採用酵母膏蔗糖培養基，並設定培養溫度為30°C、溼度為80%，對經過步驟 (1)復甦後的菌株採用平板進行菌種繼代培養48h，直至長出直徑約為5mm的深綠色菌落；(3)將由步驟( 平板繼代培養成的菌落用無菌水洗下，接種於裝有經高溫滅菌 的由麩皮、木屑、蔗糖、維生素B和水組成的培養料的茄形瓶中進行孢子擴大培養，設定培 養溫度為30°C、溼度為70%，培養時間為5d，每天翻動拍打茄形瓶，至培養物上長出白色菌 絲並在其上長出綠色孢子。
2.原藥製備用無菌水將茄形瓶中的菌絲和孢子洗下製成孢子懸浮液，再將孢子懸浮液經過濾 處理後沉澱為濃縮孢子液，添加濃度為lg/L孢子懸浮液的水楊酸，製成木黴滴丸劑原藥。3.滴丸劑製備將木黴滴丸原藥，迅速加入預熱的滴丸基質中。然後將混合液加入滴丸機的儲液 罐中。打開攪拌器，待儲液罐的油浴溫度穩定後，調整滴距打開滴頭，開始滴丸。基質選擇 質量比為1 1的聚乙二醇(PET) 2000和聚乙二醇(PET)4000的混合物，原藥與熔化的基 質按照體積質量比1 10混合。冷凝劑為液體石蠟，冷凝溫度為0°C。藥液的油浴溫度為 55°C，攪拌速度為100轉/分鐘，滴距為Mem。其中酵母膏蔗糖培養基的主要配方酵母膏15g，蔗糖20g，KH2PO4Ig,麥芽膏 15g，硫酸鈉2g，氯化鉀0. 5g，維生素BO. 5mg,維生素CO. 5mg,七水合硫酸鎂0. 05g,硫酸鐵 0.0^，瓊脂2(^，水1000ml。麩皮木屑培養料的每瓶裝瓶量為15g，每瓶加水量5ml，其中麩 皮、木屑、蔗糖乾重比為2 1 0.02，維生素B用量為每千克麩皮木屑培養物中含0.5mg。 防腐劑為水楊酸，含量為lg/L孢子懸浮液。用於酵母膏蔗糖培養基和麩皮木屑培養物滅菌 的溫度為121 °C，滅菌時間為30min。實施例2以下進一步說明基質、藥液含量、藥液溫度等參數的變化對木黴滴丸劑製備的影 響。以滴制的難易、成丸效果為指標對滴丸的基質的選擇和藥液含量做單因素分析， 製備過程中變化藥液溫度、藥液含量、基質測得不同藥液溫度、藥液含量、基質對所製備滴 丸的影響，從而對比並選擇利於保證滴丸成型良好、具有一定生防活性的基質和藥液含量。從水溶性滴丸基質聚乙烯二醇中選擇熔點低成丸效果好的基質，設定1 10、 2 10,3 10、4 10等四個藥液基質配比，測定各比例所製備的滴丸難易和成丸情況。 測得結果如表1、表2:表1木黴滴丸基質的選擇
權利要求
1.一種木黴滴丸劑，其特徵在於包含木黴孢子懸浮液和滴丸基質，其中，木黴孢子懸 浮液是由棘孢木黴菌株T1 (Trichoderma asperellum T1，保藏於中國微生物菌種保藏管理 委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO :3531，保藏日期為2009年12月17日)的孢 子粉製備，其rDNA ITS區片段序列如SEQ ID NO 1所示。
2.根據權利要求1所述的一種木黴滴丸劑，其特徵在於還含有防腐劑，防腐劑為水楊 酸、山梨酸鉀和苯甲酸鈉中的一種或多種的混合，防腐劑的濃度為0. 5 1. 5g/L孢子懸浮液。
3.根據權利要求1或2所述的一種木黴滴丸劑，其特徵在於所述木黴孢子懸浮液與 基質的體積比為1 10 3 10，所述滴丸基質為聚乙二醇1000、聚乙二醇2000和聚乙 二醇4000中的一種或多種的混合。
4.一種權利要求1 3任意一項所述木黴滴丸劑的製備方法，其特徵在於包括如下步驟(1)將棘孢木黴菌株T1植於PDA培養基上使其復甦，再採用酵母膏蔗糖培養基進行菌 種繼代培養，待長出直徑為5 7mm的深綠色菌落後，將菌落接種，在酵母膏蔗糖培養基和 麩皮木屑培養物中進行擴大培養，直至長出白色菌絲或綠色孢子；(2)將白色菌絲或綠色孢子製成孢子懸浮液，過濾沉澱為濃縮孢子液；(3)向濃縮孢子懸浮液中添加防腐劑，溶解攪拌均勻，即得木黴滴丸劑原藥；(4)將滴丸基質預熱至熔化狀態；注入冷凝劑至滴丸機中並設置溫度進行預冷；(5)將木黴滴丸原藥加入預熱的滴丸基質中，用滴丸機進行滴丸，即得木黴滴丸劑。
5.根據權利要求4所述一種木黴滴丸劑的製備方法，其特徵在於步驟(1)中所述酵 母膏蔗糖培養基為高溫滅菌過的培養基，滅菌溫度為121°C，滅菌時間30min，酵母膏蔗 糖培養基的配方為酵母膏15g，蔗糖20g，KH2PO4Ig,麥芽膏15g，硫酸鈉2g，氯化鉀0. 5g，維 生素B 0. 5mg，維生素C 0. 5mg，七水合硫酸鎂0. 05g，硫酸鐵0. Olg，瓊脂20g，水IL。
6.根據權利要求5所述一種木黴滴丸劑的製備方法，其特徵在於步驟(1)中所述菌種 繼代培養的溫度為30°C，溼度為70 85%，培養時間為48 72h ；所述擴大培養的溫度為 30°C，溼度為70 85%，培養時間為5 7d。
7.根據權利要求6所述一種木黴滴丸劑的製備方法，其特徵在於所述麩皮木屑培 養物是麩皮、木屑、蔗糖、維生素B和水的混合物，其中，麩皮、木屑、蔗糖三者的質量比為 2:1: 0.02 ；維生素B用量為每千克麩皮木屑培養物中加入0.5mg，每瓶裝瓶量為15g; 每瓶加水量5ml ；防腐劑為水楊酸、山梨酸鉀和苯甲酸鈉中的一種或多種的混合，用量為 0. 5 1. 5g/L孢子懸浮液；用於酵母膏蔗糖培養基和麩皮木屑培養物滅菌的溫度為121°C， 滅菌時間為30min。
8.根據權利要求7所述一種木黴滴丸劑的製備方法，其特徵在於步驟(4)所述木黴 滴丸的基質為聚乙二醇1000、聚乙二醇2000和聚乙二醇4000中的一種或多種的混合；原 藥與熔化的基質按照體積質量比1 10 3 10混合；冷凝劑可選擇液體石蠟或二甲基 矽油或植物油；冷凝溫度為0°C;步驟(5)中藥液的油浴溫度為55°C，攪拌速度為20 300 轉/分鐘，滴距為Mem。
9.一種權利要求1或2所述木黴滴丸劑的應用，其特徵在於所述木黴滴丸劑用於拮 抗病原真菌。
10. 一種權利要求1或2所述木黴滴丸劑的應用，其特徵在於所述木黴滴丸劑用於防 治香蕉枯萎病。
全文摘要
本發明屬於微生物活性農藥技術領域。本發明木黴滴丸劑包含木黴孢子懸浮液和滴丸基質，其中，木黴T1菌株孢子懸浮液是由棘孢木黴菌株T1(Trichoderma asperellum T1，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC NO3531，保藏日期為2009年12月17日)的孢子粉配製，其rDNA ITS區片段序列如SEQ ID NO1所示；本發明還含有濃度為0.5～1.5g/L孢子懸浮液的防腐劑。滴丸基質為聚乙二醇1000、聚乙二醇2000和聚乙二醇4000中的一種或二種或三種的混合物。本發明木黴滴丸劑具備含藥量大、生物活性高、成型效果好、能在最短時間內溶散、便於貯藏、運輸和使用。
文檔編號A01N25/34GK102144642SQ20101059952
公開日2011年8月10日 申請日期2010年12月20日 優先權日2010年12月20日
發明者周俐, 張頌聲, 方羽生, 李小妮, 李靜美, 蔣剛彪, 詹玉海, 鍾平生, 陳樹華, 高永峰 申請人:華南農業大學, 廣東省植物保護總站, 惠州市南天生物科技有限公司