通過金耳液體發酵生產的金耳發酵液或倍半萜的製作方法

2023-06-14 05:01:16

專利名稱：：通過金耳液體發酵生產的金耳發酵液或倍半萜的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物發酵及醫藥領域，具體的說本發明涉及通過金耳發酵生產金耳發酵液或倍半萜的方法，由該方法獲得的金耳發酵液或倍半萜粗品，以及含有該發酵液或倍半萜粗品的藥物組合物中和/或保健品。所述的金耳發酵液或倍半萜粗品具有多種藥物功能，可用於製備預防和/或治療糖尿病、心腦血管疾病或支氣管炎的藥物，特別是其具有降血糖功效，使其成為降低血糖提供理想藥物。
背景技術：
：糖尿病是目前中老年人的常見病和多發病，由糖尿病引起的併發症嚴重危及人們的生命健康。現有西藥類降糖藥物難免有副作用，而天然中藥類降糖藥物大多數降糖不明顯，同時受物種資源的限制。而以藥用真菌發酵生產降糖藥物則沒有上述缺點。蛋白質非酶糖基化是指葡萄糖、果糖、乙二醛和丙二醛與蛋白質的游離胺基酸進行的一系列非酶促反應，它是糖尿病患者體內的一種非正常的生理生化反應，最終形成糖基化末端產物(advancedglycationend-products,AGEs)，造成蛋白質結構改變、功能降低和老化，引起糖尿病慢性併發症。而糖尿病慢性併發症是糖尿病患者致殘和死亡的主要原因。因此，對非酶糖基化反應(AGEs)的抑制率可作為糖尿病治療效果的指示參數之一。金耳，又名黃金銀耳、黃木耳、金木耳、黃耳、腦耳、膠耳，是一種稀有野生名貴食用菌和藥用菌。生長在海拔1900-3300米。該菌在分類學上，屬於真菌門，擔子菌綱，異隔擔子菌亞綱銀耳目，銀耳科，銀耳屬的一種真菌，學名7Ve/ne//fla"rfl""fl化m;6,生長在殼鬥科植物腐木上。民間對金耳的認識和藥用有著非常悠久的歷史.。早在明朝時期，著名的藥物學家李時珍在他的《本草綱目》中詳細記載金耳。如"其金色者(當指金耳)治癖飲積聚，服痛金蒼"。另外，《中國藥用真菌》、《中國中藥大典宗旨》、《雲南食用菌》對金耳的藥用價值均有詳細介紹。金耳性溫寒，味甘，能化痰，止咳，定喘，調氣，平肝陽；臨床上治神經衰弱，肺熱，哮喘，慢性支氣管炎，高血壓，肝炎等疾病。由於金耳生長在高海拔地區，不易人工栽培，資源受到限制因此金耳的液體深層發酵，具有十分廣闊的應用前景。近年來國內外對金耳的研究主要集中於它的馴化栽培、營養成分分析以及多糖及藥效等方面，對於金耳的液體培養國內也有研究和報導。由於金耳的醫療功效，一些學者從培養基、培養條件和多糖等營養因子對金耳進行了深入的研究，但未見有關次生代謝物報導以及倍半萜類化合物的報導。對於金耳的多糖的降血糖降血脂功能，日本kiho等(BiolPharmBull，2001,24,1400-3)和華東師範大學瞿偉菁(營養學報.2004,26,300-303.)等人進行了菌絲體內多糖降血糖作用的研究，證明了其多糖可開發成預防和治療糖尿病的保健品和(或)藥品的可能性；熊耀康(浙江中醫學院學報.2000，24,71-72;浙江中醫學院學報.1999，23，50-51)報導複方金耳能提高氣管平滑肌的鬆弛百分率，對氣管平滑肌有鬆弛作用，並能延長藥物引喘的潛伏期，故複方金耳具有較強的平喘作用。同時他們證明複方金耳可提高機體免疫功能和較強的止咳作用。李秀花楊莉莉等(山西醫科大學學報.2000，31,206-207)通過實驗提出金耳濃縮液有明顯提高小鼠非特異性免疫作用，並且呈現劑量依賴性關係。劉春卉(天然產物的研究與開發.2003,15,289-292.)報導金耳菌絲髮酵產物能明顯對抗小鼠體內血栓形成，高劑量對腦組織缺血其過氧化脂質的分解產物丙二醛含量明顯增多有顯著抑制作用，能明顯抑制ADP誘導的血小板聚集，對動物凝血酶原的作用時間有延長作用，給藥5分鐘後能明顯增加動物腦膜血流量，因而金耳菌絲髮酵產物對動物血栓形成有較好的抑制作用。萜類化合物在自然界中廣泛存在，包括高等植物、真菌、微生物、昆蟲以及海洋生物，均有萜類成分存在。萜類化合物是中草藥中一類比較重要的化合物，已經發現很多萜類化合物是中草藥的有效成分。其中倍半萜烯類對各種菌類、病原型病毒有防禦性能，而且在植物體內具有防禦蟲害功效，如從向日葵和艾蒿中提取的倍半萜烯內酯和棉子酚具有抗菌、抗病毒功效。相關的研究表明對倍半萜對遺傳型糖尿病小鼠的尿糖有顯著的抑制作用，能增強糖尿病人使用肌松藥琥珀醯膽鹼所致的神經肌肉阻斷作用，對於糖尿病神經系統併發症的治療有積極的意義。同時它們也是一類重要的天然香料，是化妝品工業和食品工業不可缺少的原料。本發明人經過深入的研究摸索出一種將金耳大規模深層發酵獲得金耳發酵液的方法，該方法不同於以往的金耳液體深層發酵法在於培養的目標不同，以往都是以多糖為目標，而本發明以倍半萜類化合物為目標，並進一步由該發酵液生產倍半萜粗品、倍半萜類化合物的方法，和由本發明的方法獲得的金耳發酵液、倍半萜粗品或倍半萜類化合物，含有所述發酵液和倍半萜類粗品的藥物和/或保健品。
發明內容本發明的一個目的是提供了一種以金耳為原料進行液體深層發酵的方法，以及由該發酵方法製備的金耳深層發酵液，或稱金耳發酵液，該發酵液中含有倍半萜類化合物。本發明所使用的金耳菌種可選用任意一種金耳菌種，例如雲南、西藏或山西的野生金耳經組織分離得到的菌種。組織分離方法在多種教科書和論文中均有表述，這裡不再詳細列出(例如上海市農業科學院編，《食用菌栽培手冊》，第1213頁，食用菌雜誌編輯部出版社，1981年)。本發明含有倍半萜的金耳深層發酵液的發酵工藝包括以金耳為出發菌株，進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養和發酵培養，得到含有倍半萜的金耳深層發酵液。具體的，在本發明所述的發酵工藝中，所述的搖瓶發酵培養的培養基組成為(單位為克/升)葡萄糖510，玉米粉1525，黃豆餅粉310，KH2P0436，MgS04l4，加水至適當體積，起始pH值為5.87.0。所述的搖瓶發酵培養的培養條件是培養溫度223(TC，轉速120160轉/分鐘，培養時間2448小時。在本發明所述的發酵工藝中，所述擴大培養的培養基組成為(單位為克/升)為葡萄糖2555,玉米粉1020，麩皮510，黃豆餅粉310，KH2P0424，MgS04l4，加水至適當體積，起始pH值為5.87.0。其中所述擴大培養的培養條件是培養溫度2230°C，轉速120160轉/分鐘，培養時間2436小時。在本發明所述的發酵工藝中，所述的一級種子培養的培養基組成為(單位為克/升)葡萄糖510，玉米粉1525,黃豆餅粉310，KH2P0436，MgS0414，消泡劑0.20.5，加水至適當體積，起始pH值為5.87.0。所述一級種子培養的培養條件是接種量510%(體積百分比)，培養溫度223(TC，攪拌速率9015轉/分鐘，通風量1:0.3lv/v/m，培養時間8090小時。在本發明所述的發酵工藝中，所述發酵培養的培養基組成為(單位為克/升)含大量纖維素物質粉末2555，玉米粉1020，麩皮510，黃豆餅粉310，KH2P0424，MgS0414，CaC030.51，消泡劑0.20.5，加水至適當體積，起始pH值為5.87.0。所述一級種子培養的培養條件是接種量510%(體積百分比)，培養溫度223(TC，攪拌速率90150轉/分鐘，通風量1:0.3lv/v/m，培養時間120180小時。在本發明所述的發酵工藝中，在進行搖瓶發酵培養之前，首先將金耳的斜面菌種接入新配製的斜面培養基中進行培養，培養溫度223(TC，培養時間2448小時；其中所述的斜面培養基是現有技術中常用的斜面培養基，例如常用的是PDA培養基，此類培養基的組成和所用可參見諸葛健和王正祥，工業微生物實驗技術手冊，1994:P367。更具體地，本發明以金耳為原料進行深層發酵的發酵工藝包括以下步驟(1)將金耳的斜面菌種接入新配製的PDA培養基(參見諸葛健和王正祥，工業微生物實驗技術手冊，1994:P367)中，培養溫度2230°C，培養時間2448小時；(2)將步驟1的斜面菌種轉接入裝有搖瓶培養基的三角瓶中，於223(TC進行培養，轉速120160轉/分鐘，培養時間2448小時；(3)將步驟2得到的搖瓶菌種按510%的接種量轉接入裝有搖瓶擴大培養基的三角瓶中進行擴大培養，溫度223(TC，轉速120160轉/分鐘，培養時間2436小時；(4)將步驟(3)得到的擴大培養的菌種按510%的接種量轉接入裝有一級種子培養基的種子罐中進行培養，溫度223(TC，種子罐壓力0.05Mpa，攪拌速率90150轉/分鐘，通風量1:0.3lv/v/m,培養時間8090小時；和(5)將上述種子罐中的菌種按510%的接種量轉接入裝有發酵培養基的發酵罐中進行培養，溫度223(TC，發酵罐壓力0.05Mpa，攪拌速率90125轉/分鐘，通風量1:0.30.8v/v/m，培養時間120180小時；得到金耳的深層發酵液。由本發明的方法獲得的金耳發酵液為淡黃色到棕色的、有一定粘度的粘稠液體，其中含有菌絲體殘渣形成的沉澱，該發酵液中倍半萜類化合物的含量可達2.54.2克/升。經試驗證明，該發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率可以達到72-90%。在本發明的發酵工藝中，上述各發酵步驟的培養基使用比為所述搖瓶培養基與三角瓶容積之比可以是3:10左右；所述擴大培養基與三角瓶容積之比可以是3:10左右；所述一級種子培養基的使用比為當本發明上述的一級種子罐的容積為50100L時，其中裝有的一級種子培養基的量相應為3070L;所述發酵培養基的使用比為當本發明上述的發酵罐的容積為5002000L時，其中裝有的發酵培養基的量相應為3001400L。在本發明的金耳深層發酵工藝中，所述發酵培養工藝適於在500L2000L的發酵罐中進行。結合本領域的基本知識還可以進一步根據生產需要擴大發酵規模，以進行工業化規模的生產。本發明的另一目的是提供了一種以金耳為原料通過液體深層發酵生產倍半萜的工藝，其特徵是將上述通過金耳液體深層發酵得到的發酵液進行樹脂吸附提純等後處理得到倍半萜粗品。其中所述的樹脂吸附提純等後處理工藝包括將由本發明上述發酵工藝步驟獲得的含有倍半萜的金耳深層發酵液離心，所得到的上清液樹脂吸附，然後經過洗脫、濃縮和冷凍乾燥，得到倍半萜粗品。其中所述的樹脂優選是大孔樹脂，特別是非極性大孔樹脂，例如AB-8。其中洗脫步驟所使用的洗脫液是乙醇的水溶液，優選含有2060%乙醇的水溶液。具體的，本發明製備倍半萜的方法包括以下步驟(1)用本發明上述金耳深層發酵法製備得到金耳深層發酵液；(2)將上述步驟得到的金耳深層發酵液的酸度調節至酸性，優選pH1.03.0，離心，離心速度大約是3000rpm，離心時間大約30分鐘；(3)得到的上清液用非極性大孔樹脂吸附，每分鐘流量為柱體積的(0.52)/20，所述大孔樹脂的用量為發酵液體積的1/40;(4)吸附結束後柱用大量水衝洗至無色後，用2060%乙醇溶液洗脫；洗脫劑體積大約是20-40個床體積；(5)真空濃縮上一步驟獲得的洗脫液，所得到的濃縮液經冷凍乾燥後得到倍半萜粗品。本發明所得到的金耳發酵液中倍半萜類化合物的含量可達2.54.2克/升；應用本發明上述製備倍半萜的方法，倍半萜的總收率可達0.52克/升發酵液。所得到的倍半萜粗品中倍半萜類化合物的含量可達18-34%。(這是一個結果而非條件，是否不用加優選)利用氣質聯用色譜分析金耳發酵液中倍半萜成分，結果顯示主要化合物分子式為C15H24，其中又以下列化合物為主tableseeoriginaldocumentpage11*:氣質聯用分析圖譜保留時間，分析方法為取10ml樣品溶液置於15ml頂空瓶中，將老化後的100umPDMS萃取頭插入樣品瓶頂空部分，於5(TC吸附40min，吸附後的萃取頭取出後插入氣相色譜進樣口，於250'C解吸3min，同時啟動儀器採集數據。本發明金耳深層發酵生產倍半萜的工藝中，所述發酵培養工藝適於如果需要進一步分離提純其中所含的倍半萜化合物，可按照常規方法，例如重結晶、製備液相色譜等對上述倍半蔽粗品進行分離提純。經試驗證明，應用本發明上述製備倍半萜的方法製備得到的5mg/mL倍半萜粗品對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率高達72-90%，因此具有降低血糖的功能。蛋白質非酶糖基化是指葡萄糖、果糖、乙二醛和丙二醛與蛋白質的游離胺基酸進行的一系列非酶促反應，它是糖尿病患者體內的一種非正常的生理生化反應，最終形成糖基化末端產物(advancedglycationend-products，AGEs)，造成蛋白質結構改變、功能降低和老化，引起糖尿病慢性併發症。而糖尿病慢性併發症是糖尿病患者致殘和死亡的主要原因。因此，對非酶糖基化反應(AGEs)的抑制率可作為糖尿病治療效果的指示參數之一。本發明的又一目的是提供了所述發酵液和倍半萜產品在藥物和保健品製備中的應用。其中所述的藥品和保健品具有降血糖降血脂功能。本發明的又一目的是提供了用本發明的方法製備得到的金耳發酵液或倍半萜產品在製備預防和/或治療糖尿病、心腦血管疾病或支氣管炎的藥物和/或保健品中的應用。本發明的又一目的是提供了用於預防和/或治療糖尿病、心腦血管疾病或支氣管炎的藥物組合物，該組合物中含有用本發明的方法製備得到的金耳發酵液或倍半萜產品，以及常規的藥用載體。其中以該組合物的總重量計，所述組合物中倍半萜的含量為45%70%。該藥物組合物中還可含有預防和/或治療糖尿病、心腦血管疾病或支氣管炎的其它活性成分。本發明的藥物組合物可按照製藥領域的常規方法，使用常規的藥用載體製成適於應用的常規劑型，例如可以是液體或固體的劑型，優選適於口服的劑型，例如片劑、膠囊、含片、口服液等。本發明的又一目的是提供了一種保健品，其中含有用本發明的方法製備得到的金耳發酵液或倍半萜產品。所述的保健品具有降低血糖和降低血脂的功能。所述保健品中用本發明的方法製備得到的金耳發酵液或倍半萜產品的含量低於上述藥物組合物中的含量，本領域技術人員根據常識很容易確定其含量，例如其含量可根據用途有所區別，例如用於輔助治療時，劑量可稍大；用於養生或增強營養時，劑量可稍低。按照本領域的常規方法，可將所述的保健品製成適於應用的形式，例如液體或固體的形式，或將其加入飲食品之中。例如可將其製成適於口服的片劑、膠囊、含片、口服液等，也可以製成含有用本發明的方法製備得到的金耳發酵液或倍半萜產品的食品如蛋糕或餅乾，優選飲料。本發明的方法所製備的發酵液或倍半萜的降血糖降血脂功能，可通過下面的藥效試驗證明選取空腹血糖水平在3.56.3mmol/L範圍的正常雄性昆明小鼠，以檸檬酸緩衝液(pH4.6)滅菌後配製的4%的四氧嘧啶(alloxan)注射液，按體重140mg/kg劑量一次性腹腔注射造型，72小時後，選擇血糖值大於10mmol/L的小鼠隨機分為5組，每組12隻，組間差異小於0.5mmol/L，設陽性對照(I)(二甲雙胍)灌胃給予生理鹽水；陽性藥物劑量120mg/kg體重；金耳倍半萜粗品治療低、中、高三種劑量組(分別為ni、IV、V組)，分別以20、40、80mg/kg體重灌胃。上述試驗給藥7d後，金耳倍半萜組與對照組相比，治療組血糖均極顯著降低(p<0.01),可見金耳倍半萜7d即能顯著降低高血糖小鼠血糖。本發明人經試驗研究發現應用本發明的發酵方法生產的發酵液及倍半萜經口服途徑給予高血糖小鼠可顯著降低其血糖和果糖胺，因此證實了金耳發酵液和倍半萜具有製備具有降血糖功能的保健飲品和/或藥品的用途。應用本發明的金耳深層發酵方法，可以大規模或工業化生產金耳發酵液，以及生產其次生產品倍半萜類化合物和含有該混合物的藥物組合物。由於該藥物組合物中所含的金耳發酵液或由該發酵液製備的倍半萜來源於天然菌種的發酵，因此沒有任何毒副作用，從而為糖尿病患者提供了理想的藥物，並為金耳的應用開創了廣闊的前景。具體實施方式為了進一步闡述本發明的技術方案所涉及的材料及工藝，給出了下述實施例。但這些實施例不以任何方式限制本發明的範圍。實施例1:金耳菌種的組織分離取雲南野生金耳新鮮未開傘的子實體，削去菌柄基部和菌柄外表皮，用75y。乙醇進行子實體表面消毒後，移人超淨工作檯，紫外燈照射20min。將解剖刀在酒精燈火焰上灼燒後放人無菌水中降溫，確保解剖刀溫度不會損傷子實體組織。將子實體一分為二，在菌柄內(或柄中)、菌柄與菌蓋交界處、菌蓋和菌褶處切割表皮內組織，黃豆大小的小塊，切割時不能切透子實體表面組織。用無菌鑷子接人試管斜面培養基(即為PDA培養基)，每種組織各接10支，25-28。C暗培養，每天定時觀測菌絲生長汙染情況，當長至4-7天時，用PDA培養基試管斜面轉接。實施例2金耳發酵液的製備1、在新配製的土豆培養基(諸葛健，王正祥，工業微生物實驗技術手冊，1994:P367)中接入實施例1得到的金耳菌種，培養溫度27匸，待菌絲體長滿斜面後，將斜面菌種接入裝有60mL搖瓶培養基的250mL三角瓶中(共5瓶)，於27。C、150轉/分鐘搖床培養24小時。其中所述搖瓶培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖5，玉米粉15，黃豆餅粉5，KH2P043，MgS041，起始pH值為6.3。2、將上述搖瓶菌種接入裝有150mL擴大培養基的500mL三角瓶中(共24瓶)，接種量為每500mL三角瓶接入llmL搖瓶種子，於27。C、150轉/分鐘搖床培養24小時。其中所述擴大培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖5，玉米粉15，黃豆餅粉5，KH2P043，MgS041，起始pH值為6.3。3、將上述擴大培養的菌種3600mL接入裝有44.9L一級種子培養基的75L種子罐中，種子罐中發酵液的總體為48.5L;維持罐溫27'C，罐壓0.05MPa，攪拌速率120轉每分鐘，通風量1:0.6v/v/m，發酵時間85小時。其中種子罐中的一級種子培養基的配方為(單位為克/升):葡萄糖5，玉米粉15，黃豆餅粉8，KH2P043，MgS04l，消泡劑0.35，起始pH值為6.3。4、將48.5L—級種子菌種接入裝有600L發酵培養基的1000L發酵罐中，發酵罐中發酵液的總體為648.5L。維持罐溫27"，罐壓0.05MPa，攪拌速率IOO轉每分鐘，通風量1:0.5v/v/m，發酵時間144小時。其中發酵罐中的發酵培養基的配方為(單位為克/升):葡萄糖50，玉米粉10,麩皮10，黃豆餅粉8，KH2P042，MgS04l，CaC031，，消泡劑0.35，起始pH值為6.0。經上述步驟後得到金耳發酵液，該發酵液的發酵液菌絲體經水洗、烘乾，得幹菌絲體，重為18Kg，該發酵液桔黃色，具有香味，對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達72%(測定方法見實施例3)。實施例3倍半萜粗品的製備將實施例2得到的發酵液的酸度調節至pHl.O，經3000rpm離心30分鐘後，上清液用非極性大孔樹脂吸附AB-8吸附，流速為1/20柱體積/min，吸附結束後樹脂柱用大量水衝洗至無色後，用20%乙醇溶液洗脫，洗脫液經真空濃縮，濃縮液冷凍乾燥得到倍半萜粗品。該粗品為黃色或淡黃色粉末，溶於40%甲醇和乙醇的水溶液、熱水、吡啶、鹼性溶液，熱水溶解後振搖產生較為持久的泡沫。其組成為tableseeoriginaldocumentpage15最終獲得的倍半萜類組合物的乾重為2.8克/升，濃度為5mg/mLf，半萜對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達84%。發酵液和倍半萜粗品對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的測試方法如下取100ml發酵液，離心(3000r/min)20分鐘，上清液或由上清液進一步獲得的倍半萜類組合物用於測定對非酶糖基化反應抑制率。1]體外非酶糖基化系統將BSA(牛血清白蛋白)(10mg/mL)、已二醛(12mg/mL)和NaN3(疊氮化鈉)(2mg/mL)溶於pH7.4、0.2mol/L的PBS(磷酸緩衝液)中。2]體外非酶糖基化發酵液幹預實驗取lml上述PBS溶液，幹預組加入lml發酵液或粗品溶液、以加lml蒸餾水的未干預組為空白，震蕩混勻，37'C避光孵育15天，而後定容至10ml待測。3]AGEs的測定及抑制率的計算採用HitachiFluorescenceSpectrophotometer650-60型螢光分光光度計測定螢光強度，測定時激發波長選擇370nm，狹縫5nm，發射波長選擇440nm，狹縫6nm。發酵液對非酶糖基化反應的抑制作用以抑制率表示。抑制率根據下列公式計算-翻率:空白管螢光g:g斤g管螢光強度x,。空白管螢光強度實施例4金耳發酵液和倍半萜粗品的製備此實施例所用的菌種為實施例1得到的菌種。1、在新配製的PDA培養基(諸葛健，王正祥，工業微生物實驗技術手冊，1994:P367)中接入實施例1得到的金耳菌種，培養溫度25。C，待菌絲體長滿斜面後，將斜面菌種接入裝有75mL搖瓶培養基的250mL三角瓶中(共3瓶)，22°C、120轉每分鐘搖床培養36小時。2、將此搖瓶菌種接入裝有150mL擴大培養基的500mL三角瓶中(共10瓶)，接種量為每500mL三角瓶接入15mL搖瓶種子，25°C、120轉每分鐘搖床培養36小時。3、將此擴大培養的菌種1500mL接入裝有28.5L—級種子培養基的50L種子罐中，種子罐中發酵液的總體為30L;維持罐溫25°C，罐壓0.05MPa，攪拌速率90轉每分鐘，通風量1:1v/v/m，發酵時間90小時。4、將30L—級種子菌種接入裝有320L發酵培養基的500L發酵罐中，發酵罐中發酵液的總體為350L;維持罐溫25'C，罐壓0.05MPa，攪拌速率90轉每分鐘，通風量1:0.8v/v/m，發酵時間180小時，得到金耳發酵液。該發酵液為金耳保健飲品，菌絲體乾重0.63Kg，該發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率為81%。上述步驟使用的各種培養基的配方如下搖瓶培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖5,玉米粉15，黃豆餅粉5，KH2P043，MgS041,起始pH值為6.3。擴大培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖10，玉米粉10，黃豆餅粉5，KH2P043，MgS04l，起始pH值為5.8。一級種子培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖IO，玉米粉IO，黃豆餅粉8，KH2P043，MgS04l，消泡劑0.35，起始pH值為5.8。發酵培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖50，玉米粉10，麩皮15,黃豆餅粉8，KH2P042，MgS041，CaC031，消泡劑0.35，起始pH值為6.0。5、將實施例2得到的發酵液的酸度調節至pH2.0，經3000rpm離心30分鐘後，上清液用非極性大孔樹脂AB-8吸附吸附，每分鐘的流量為1/20柱體積，吸附結束後樹脂柱用大量水衝洗至無色後，用50%乙醇溶液洗脫，洗脫液經真空濃縮，濃縮液冷凍乾燥得到倍半萜粗品，其中所含成分及含量類似於實施例3的倍半砲粗品。最終獲得的倍半萜類組合物的乾重為4.2克/升，濃度為5mg/mL倍半萜對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達86%。發酵液和倍半萜粗品對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的測試方法同實施例3。實施例5金耳發酵液和倍半萜粗品的製備此實施例所用的菌種為實施例1得到的菌種。1、在新配製的PDA培養基(諸葛健，王正祥，工業微生物實驗技術手冊，1994:P367)中接入實施例l得到的金耳菌種，培養溫度25'C，待菌絲體長滿斜面後，將斜面菌種接入裝有75mL搖瓶培養基的250mL三角瓶中(共3瓶)，22°C、120轉每分鐘搖床培養36小時。2、將上述搖瓶菌種接入裝有150mL擴大培養基的500mL三角瓶中(共10瓶)，接種量為每500mL三角瓶接入15mL搖瓶種子，25°C、120轉每分鐘搖床培養36小時。3、將上述擴大培養的菌種1500mL接入裝有28.5L—級種子培養基的50L種子罐中，種子罐中發酵液的總體為30L;維持罐溫25。C，罐壓0.05MPa，攪拌速率90轉每分鐘，通風量1:1v/v/m，發酵時間90小時。4、將30L上述一級種子菌種接入裝有320L發酵培養基的500L發酵罐中，發酵罐中發酵液的總體為350L;維持罐溫25。C，罐壓0.05MPa,攪拌速率90轉每分鐘，通風量1:0.8Wv/m，發酵時間180小時。得到發酵液，該發酵液為金耳保健飲品，菌絲體乾重7.35Kg，該發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率為81%。上述各步驟使用的培養基的配方如下搖瓶培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖5，玉米粉15，黃豆餅粉5,KH2P043，MgS04l，起始pH值為6.3。擴大培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖10，玉米粉10，黃豆餅粉5，KH2P043，MgS04l，起始pH值為5.8。一級種子培養基的配方為(單位為克/升)葡萄糖10，玉米粉10，黃豆餅粉8，KH2P043，MgS04l，消泡劑0.35，起始pH值為5.8。發酵培養基的配方為(單位為克/升)含大量纖維素物質粉末50，玉米粉10，麩皮15，黃豆餅粉8，KH2P042，MgS04l，CaC031，消泡劑0.35，起始pH值為6.0。5、將上述發酵液調節至pH2.0，經3000rpm離心30分鐘後，上清液用非極性大孔樹脂AB-8吸附，每分鐘的流量為1/20柱體積，吸附結束後柱用大量水衝洗至無色後，用50%乙醇溶液解析，解析液經真空濃縮，濃縮液冷凍乾燥得到倍半萜粗品，其中所含成分及含量類似於實施例3的倍半萜粗品。最終獲得的倍半萜類組合物的乾重為3.9克/升，濃度為5mg/mL倍半萜對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率達90%。發酵液和倍半萜粗品對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率的測試方法同實施例2。實施6含金耳倍半萜組合物的製備按下述配比(質量百分比)配製組合物倍半萜粗品卯％;微晶纖維素6%;膠體二氧化矽2%;和硬酯酸鎂2%。製備方法將實施例3獲得的倍半萜粗品和藥用輔料以上述比例混合，得到倍半萜組合物，然後按照常規技術製成片劑。實施7含金耳發酵液保健品的製備將實施例2所得到的發酵液於3000轉/分鐘離心，獲得的上清液，將所得到的上清液濃縮3倍後得到濃縮物，該濃縮物為棕色的粘稠的液體。將該濃縮物裝入特製的瓶中，每瓶15毫升，之後封蓋，巴氏滅菌。根據需要，該保健品可每天服用一瓶或每天早晚各服用一瓶。實施例8金耳發酵液的倍半萜類組合物降低四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠血糖試驗倍半萜類組合物樣品由實施例6製備獲得。實驗動物昆明小白鼠，雄性，體重為21-26g，由中科院上海實驗動物中心提供。糖尿病小鼠模型製備雄性小鼠禁食24小時後，腹腔注射160-200ug/kg四氧嘧啶造模型，5天後禁食3-5小時，測血糖，血糖值〉10mmo1/1為實驗性糖尿病模型鼠。實驗模型鼠按禁食3-5小時的血糖水平隨機分組，分為一個模型對照組和3個試驗組，試驗組分三個給藥劑量(低劑量組劑量為20mg/kg，中劑量組劑量為40mg/kg，高劑量組劑量為80mg/kg)和陽性藥物(二甲雙胍，給藥劑量120mg/kg)試驗組按照劑量標準分別灌胃，對照組灌以自來水。連續給予受試物30天，測空腹血糖值。結果顯示中劑量組及高劑量組血糖值顯著低於與對照組的血糖值(PO.05或P〈0.01)，低劑量組與對照組無顯著性差異(P>0.05)。糖耐量試驗結果證明低劑量組、中劑量組及高劑量組與對照組有差異顯著性(po.o5或p〈o.on，這顯示金耳粗提物具有降低血糖的作用。各組血糖曲線下面積有顯著差異(PO.05),中劑量組及高劑量組與對照組有差異顯著性(PO.Ol)。該結果表明金耳發酵液粗提物顯著提高四氧嘧啶誘導的糖尿病鼠的糖耐量。試驗結果表明在降低血糖提高糖耐量同時，金耳粗提物能夠增加試驗小鼠體重。以上已詳細描述了本發明的實施方案，對本領域技術人員來說很顯然可以做很多改進和變化而不會背離本發明的基本精神。所有這些變化和改進都在本發明的保護範圍之內。權利要求1.生產含有倍半萜的金耳發酵液的發酵工藝，其特徵在於以金耳為出發菌株，進行液體搖瓶培養、液體搖瓶擴大培養、一級種子培養和發酵培養，得到含有倍半萜的金耳深層發酵液。2、根據權利要求l所述的發酵工藝，其中所述的搖瓶發酵培養的培養基組成為(單位為克/升)葡萄糖510，玉米粉1525，黃豆餅粉310，KH2P0436，MgS0414，加水至適當體積，起始pH值為5.87.0，其中所述的搖瓶發酵培養的培養條件是培養溫度223(TC，轉速120160轉/分鐘，培養時間2448小時。3、根據權利要求1所述的發酵工藝，其中所述擴大培養的培養基組成為(單位為克/升)為葡萄糖2555，玉米粉1020，麩皮510，黃豆餅粉310，KH2P0424，MgS0414，加水至適當體積，起始pH值為5.87.0;其中所述擴大培養的培養條件是培養溫度223(TC，轉速120160轉/分鐘，培養時間2436小時。4、根據權利要求l所述的發酵工藝，其中所述的一級種子培養的培養基組成為(單位為克/升)葡萄糖510，玉米粉1525，黃豆餅粉310，KH2P0436，MgS04l4，消泡劑0.20.5，加水至適當體積，起始pH值為5.87.0;其中所述一級種子培養的培養條件是接種量510%(體積百分比)，培養溫度2230°C，攪拌速率90150轉/分鐘，通風量1:0.3lv/v/m，培養時間8090小時。5、根據權利要求1所述的發酵工藝，其中所述發酵培養的培養基組成為(單位為克/升)含大量纖維素物質粉末2555，玉米粉1020，麩皮510，黃豆餅粉310，KH2P0424，MgS0414，CaC030.51，消泡劑0.20.5,加水至適當體積，起始pH值為5.87.0;其中所述一級種子培養的培養條件是接種量510%(體積百分比)，培養溫度2230'C，攪拌速率90150轉/分鐘，通風量1:0.3lv/v/m，培養時間120180小時。6、按照權利要求1所述的發酵工藝，其中在進行搖瓶發酵培養之前，首先將金耳的斜面菌種接入新配製的斜面培養基中進行培養，培養溫度2230°C，培養時間2448小時；其中所述的斜面培養基是土豆培養基。7、根據權利要求l-6任意一項所述的發酵工藝，該發酵工藝包括以下步驟(1)將金耳的斜面菌種接入新配製的斜面培養基中，培養溫度2230°C，培養時間2448小時；(2)將步驟1的斜面菌種轉接入裝有搖瓶培養基的三角瓶中，於223(TC進行培養，轉速120160轉/分鐘，培養時間2448小時；(3)將步驟2得到的搖瓶菌種按510%的接種量轉接入裝有搖瓶擴大培養基的三角瓶中進行擴大培養，溫度2230。C，轉速120160轉/分鐘，培養時間2436小時；(4)將步驟(3)得到的擴大培養的菌種按510%的接種量轉接入裝有一級種子培養基的種子罐中進行培養，溫度2230°C，種子罐壓力0.05Mpa，攪拌速率90150轉/分鐘，通風量1:0.3lv/v/m，培養時間8090小時；和(5)將上述種子罐中的菌種按510%的接種量轉接入裝有發酵培養基的發酵罐中進行培養，溫度223(TC，發酵罐壓力0.05Mpa，攪拌速率90125轉/分鐘，通風量1:0.30.8v/v/m,培養時間120180小時；得到金耳的深層發酵液。8、由權利要求1-6任意-一項所述的發酵工藝得到的含有倍半萜的金耳發酵液;該發酵液為淡黃色到棕色的粘稠液體，該發酵液對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率在72%以上，優選體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率高達84%以上。9、一種製備倍半萜的方法，該方法包括將權利要求8所述含有倍半萜的金耳深層發酵液離心，所得到的上清液樹脂吸附，然後經過解析、濃縮和冷凍乾燥，得到倍半萜粗品，其特徵在於該方法包括以下步驟(1)將權利要求11-13任意一項所述含有倍半萜的金耳發酵液調節至pH1.03.0，離心；(2)得到的上清液用非極性大孔樹脂吸附，吸附結束後色譜柱用大量水衝洗至無色，然後用2060%乙醇溶液解析；和(3)真空濃縮上一步驟獲得的解析液，所得到的濃縮液經冷凍乾燥後得到倍半蔽粗品；用上述方法所得到的倍半萜的總收率可達0.52克/升發酵液；以及用該方法獲得的倍半萜對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率高達84%以上。10、用於預防和/或治療糖尿病、心腦血管疾病或支氣管炎的藥物組合物，其特徵在於該組合物中含有權利要求8的發酵液或權利要求9所述的方法製備的倍半萜作為活性成分。全文摘要本發明涉及生物發酵及醫藥領域，具體的說本發明涉及金耳發酵液中倍半萜生產工藝流程，以及金耳產生的倍半萜的降血糖功效。本發明申請人經試驗研究發現應用該生產工藝生產的發酵液及倍半萜經口服途徑給予高血糖小鼠可顯著降低其血糖和果糖胺，因此證實金耳發酵液和倍半萜具有製備降低血糖保健飲品及藥物的用途。本發明的發酵液為桔黃色至黃褐色液體，發酵液及5mg/mL的倍半萜對體外非酶糖基化(AGEs)的抑制率高達72-90％。本發明不僅為深度開發利用金耳打開了一條嶄新的途徑，而且為降低血糖提供理想的中藥。文檔編號C12N1/14GK101225361SQ200710062838公開日2008年7月23日申請日期2007年1月18日優先權日2007年1月18日發明者丁重陽,張志才,王玉紅,章克昌,顧正華申請人:章克昌