由紫芝液體深層發酵菌絲體得到的均一多糖及其製備方法

2023-06-14 04:55:36

專利名稱：由紫芝液體深層發酵菌絲體得到的均一多糖及其製備方法
技術領域：
本發明涉及由紫芝液體深層發酵菌絲體得到的均一多糖GS-C-W-1、其製備方法及其在製備抗腫瘤藥物中的用途。
背景技術：
食藥用真菌具有抗腫瘤抗病毒、降血脂、延緩衰老、護肝排毒、促進核酸和蛋白質生物合成等多種功效，在中國有悠久的使用歷史。國內外大量研究表明，真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體、發酵液中分離得到的，為真菌類藥物的藥效部位，是能夠控制細胞分裂分化，調節細胞生長衰老的一類活性多糖。紫芝(Ganoderma sinense)作為靈芝屬真菌(2005版中國藥典)，其有較明顯的抗 腫瘤、提高免疫力的功效。由於其製備工藝不明確，多糖含量較低(一般<60%)。另外紫芝粗多糖組分複雜，主要藥效部位和組分尚未闡明。且由於紫芝子實體資源稀少，市場上少見紫芝產品。紫芝粗多糖溶解度很差，粘度較大，顏色深，味重，其分子量從幾千到上千萬，分子量跨度很大，難找到合適的質量控制方法。研究表明，分子量是影響多糖組分藥效的主要因素之一，若能將粗多糖分離純化得到均一多糖，闡明其構效關係，不僅能提高藥效水平，並且對質量控制有很大的幫助。中國專利200710045369. 4 「一種紫芝發酵方法及製得的紫芝菌絲體」公開了一種紫芝液體深層發酵產生菌絲體的方法，該菌絲體用水提醇沉法提取得到的粗多糖含量在39 75%，其體內藥理實驗中，口服劑量為40mg/kg/天時有一定抗腫瘤活性。中國專利200710045368. x 「紫芝菌絲體胞內多糖及其製備方法和應用」公開了一種從紫芝液體深層發酵產生的菌絲體中提取製備得到粗多糖的方法。該方法涉及的水提醇沉法提取得到粗多糖含量在39 75%。其藥理實驗的劑量也為40mg/kg/day (給藥方式口服餵藥)。楊國紅，楊義芳，金雋迪(紫芝液體深層發酵的抗腫瘤活性部位研究[J].中草藥，2008，39 (6)877-880)對紫芝液體深層發酵的抗腫瘤活性多糖進行了研究，從紫芝菌絲體中提取得到胞內多糖，其藥理實驗的劑量也為40mg/kg/天(給藥方式口服餵藥)。中國專利0910574:200910197329. O 「一種紫芝菌絲體抗腫瘤多糖組分GS-C及其製備」公開了一定分子量範圍的紫芝液體深層發酵菌絲體多糖的製備。然而，以上專利申請和文章均未涉及多糖分子量、純度及結構解析方面及藥物作用機制方面的研究。鑑於現有技術的狀況，需要尋找多糖含量高、具有明顯的抗腫瘤活性且給藥劑量比常規方法提取得到的粗多糖的更低的紫芝菌絲體多糖組分。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種多糖含量高、抗腫瘤活性更明顯且給藥劑量更低的紫芝菌絲體抗腫瘤多糖組分。如本發明所使用，「液體深層發酵」是發酵工業上常用的一種發酵方法，它的培養基是液態的。如本發明所使用，「菌絲體」是菌絲集合在一起構成一定的宏觀結構。如本發明所使用，「均一多糖」是單糖通過聚合而成的多糖，聚合的糖有特定的結構單元。均一多糖可分為相同單糖形成的聚糖和不同單糖形成的雜多糖。本發明的第一個目的在於提供一種紫芝液體深層發酵菌絲體均一多糖，將其命名為GS-C-W-I，其特徵在於，所述均一多糖的總糖含量為大於95 %，優選為大於97. I % ;且所述均一多糖的分子量大於2000KDa。根據本發明的一個優選的實施方式，本發明所述均一多糖GS-C-W-I中多糖的分子量大於2000KDa。根據本發明的一個優選的實施方式，經TLC和HPLC分析可以得知，所述均一多糖GS-C-W-I中的多糖主要由半乳糖和鼠李糖組成，所述半乳糖與葡萄糖的摩爾比為
3.3-3. 7 1，優選 3. 5 : I。進一步,經高碘酸氧化及Smith降解分析得知,所述均一多糖由(I — 6)_a_半乳糖連接的主鏈和具有通過I — 6取代在主鏈上的鼠李糖分支所組成。根據本發明的一個優選的實施方式，所述均一多糖在水中pH值為7. 16。本發明的第二個目的是提供一種紫芝液體深層發酵菌絲體提取物，其包含上述均一多糖，所述均一多糖的總糖含量為大於95%,優選為97. I %,且所述均一多糖的分子量大於 2000KDa。本發明通過柱層析將不同分子量多糖分離，從而得到紫芝液體深層發酵菌絲體均一多糖GS-C-W-I，該均一多糖GS-C-W-I在降低給藥劑量、並且不增加毒性的前提下能表現出一定的藥效。柱層析能按照不同的原理將複雜的混合物分離純化，已得到單一組分為目的。而分離純化的關鍵在於所選的填料，根據本發明的一個優選的實施方式，本發明所選擇的兩個填料分別是陰離子交換樹脂和葡聚糖凝膠，前者是根據被分離組分離子交換能力的差別而實現分離，後者根據被分離組分分子的線團尺寸而進行分離。本發明的第三個目的在於提供上述紫芝液體深層發酵菌絲體均一多糖GS-C-W-I的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟紫芝液體深層菌絲體粗多糖經過柱層析，得到紫芝液體深層菌絲體均一多糖GS-C-W-I。上述製備方法簡單易行、生產周期短、成本較低廉。根據本發明的一個優選的實施方式，柱層析步驟通過加負壓進行。採取的儀器設備為螺動泵，自動收集儀。根據本發明的一個優選的實施方式，本發明所選擇的兩個填料分別是陰離子交換樹脂和葡聚糖凝膠。根據本發明的一個特別優選的實施方式，柱層析選擇的填料陰離子交換樹脂為DEAE-cellulose 52。根據本發明的一個特別優選的實施方式，柱層析選擇的填料葡聚糖凝膠的型號為Sephacryl S-300。本發明製備紫芝液體深層菌絲體均一多糖GS-C-W-I的具體步驟如下紫芝液體深層發酵菌絲體多糖組分GS-C(按照中國專利0910574 :200910197329.0 「一種紫芝菌絲體抗腫瘤多糖組分GS-C及其製備」中所述方法得到)經過陰離子交換樹脂，葡聚糖凝膠柱得到紫芝液體深層發酵菌絲體均一多糖GS-C-W-I。本發明利柱層析方法將紫芝液體深層發酵菌絲體粗多糖純化成均一多糖，藥理實驗表明純化後均一多糖GS-C-W-I有明顯的增強機體免疫作用的活性。本發明方法得到的紫芝液體深層發酵菌絲體均一多糖GS-C-W-I含量為大於95%,優選為97. I % (苯酚-硫酸法檢測)，其分子量大於2000KDa。將該均一多糖部位進行藥理實驗，GS-C-W-I在低濃度下對促進的T淋巴細胞增殖活性有非常顯著的作用，對LPS誘導小鼠脾臟B淋巴細胞增殖反應中，隨著濃度升高，其增殖活性可以得到一定的提高，但是提高到一定濃度以後，增殖的促進作用開始減弱；提示GS-C-W-I通過提高機體免疫能力達到抗腫瘤作用。且未見對給藥動物的毒性反應。因此，本發明的第三個目的在於提供上述紫芝液體深層發酵菌絲體均一多糖GS-C-W-I在製備抗腫瘤藥物和提高免疫力藥物中的應用。
與現有的技術相比，本方法提供的紫芝液體深層發酵菌絲體均一多糖GS-C-W-I的多糖含量更高、給藥劑量更低、純度更高，且其製備工藝亦適於工業化生產。


圖I為本發明實施例I所得紫芝液體深層發酵菌絲體均一多糖GS-C-W-I的HPGPC圖譜。圖2為用HPGPC檢測的實施例I步驟2)中w_l的分子量分布(MWD)結果。圖3為實施例I步驟2)中w-1過Sephacry S-300的洗脫曲線。圖4為用HPGPC檢測的實施例I步驟2)中w-l_S300 (15-25)的分子量分布(MWD)結果。圖5為實施例I步驟2)中W-1-S300 (15-25)過S^hacry S-300的洗脫曲線。圖6為GS-C-W-I水解後的TLC結果，其中I為果糖，2為巖藻糖，3為阿拉伯糖，4為鼠李糖，5為葡萄糖，6、7為GS-C-W-1，8為半乳糖，9為木糖，10為半乳糖醛酸，11為甘露糖。圖7A-7D分別為水、半乳糖、鼠李糖、實施例I製得的GS-C_W_1的HPLC圖譜。圖8為高碘酸標準曲線。圖9A-9D分別為水、赤蘚醇、甘油、實施例I製得的GS-C_W_1降解樣品的HPLC圖
-i'TfeP曰。圖10為實施例I製得的GS-C-W-I的紫外圖譜。圖11為實施例I製得的GS-C-W-I的紅外圖譜。圖12為實施例I製得的GS-C-W-I的1H-NMR圖譜。
具體實施例方式為了更好地理解本發明，通過以下實施例來說明，但這些實施例不構成對本發明的限制。實施例I :紫芝液體深層發酵菌絲體均一多糖GS-C-W-I的製備I)紫芝液體深層發酵菌絲體粗多糖GS-C的製備
所述紫芝液體深層發酵菌絲體粗多糖GS-C通過中國專利0910574 200910197329. O 「一種紫芝菌絲體抗腫瘤多糖組分GS-C及其製備」中所述方法得到。具體方法如下紫芝菌種(Ganoderma sinense)從山東購得。平板培養基在121 °C下消毒滅菌30分鐘，28°C培養4-6天。搖瓶種子培養基121°C消毒滅菌30分鐘，冷卻後在無菌室接種，在28± I°C搖瓶間的搖床上，震蕩培養5-7天，挑選好的搖瓶種子進發酵罐內培養5-6天，最後得到紫芝液體發酵菌絲體。菌絲體用水提取I 3h，提取液減壓濃縮，加入乙醇沉澱，沉澱部分乾燥至恆重，得粗多糖。將粗多糖用去離子水溶解，用截留分子量為3萬的材質為聚醯胺的中空纖維素超濾膜超濾，壓力為O. 1-0. 3mPa，溶液流速根據膜保持良好的透過率為宜，收集截留液，用截留分子量為200的納濾膜濃縮液體，冷凍乾燥，得到紫芝菌絲體多糖大於3萬部位。取被超濾膜截留多糖，用水溶解，裝入截留分子量為30萬的透析袋，按透析袋內液袋外液=I 25的比例用水透析，每隔2小時換水I次。用苯酚硫酸法結合HPGPC圖譜檢測透析效果，至不再透出多糖為止。取截留液，濃縮冷凍乾燥，即得多糖組分GS-C。2)柱層析結合HPGPC檢測2. lDEAE-cellulose52 纖維素柱層析分離 取GS-C 2. 5g，用少量去離子水溶液溶解，離心分離，將沉澱再用少量去離子水試溶，離心分離，反覆3次，合併上清液。取上清液上已平衡好的DEAE-cellulose 52纖維素柱，用去離子水洗脫，以IOmL/管收集洗脫液2個柱體積。每隔2 5管用苯酚-硫酸法測定其吸收值，並做洗脫曲線。合併水洗脫液洗脫下來的主峰，記為w-1 ；HPGPC 檢測 色譜條件色譜柱TSK-GEL GMPffxl,柱溫35°C，流動相為超純水，流速O. 3mL/min，檢測器為示差折光檢測器。用HPGPC檢測w-1主峰的行為。樣品配製成5mg/mL的水溶液。分析結果見附圖2。由附圖2可知，該洗脫部分主要由保留時間為19min和22min峰的多糖組成，根據保留時間-分子量對數標準曲線，可知該流份w-1平均分子量大於50w。因此選用SephacrylS_300(分子量分離範圍30000-1500000)對w_l進行反覆層析。2. 2 第一次 Sephacry S-300 純化精密稱取w-1樣品500mg,溶於5mL去離子水，離心除不溶物(離心，IOmin,5000rpm),重複2次,用滴定管吸上清液沿管壁四周緩緩滴入Sephacryl S-300進行分離。用去離子水洗脫，流速為O. 5mL/min,收集5mL/管,收集I. 5-2個柱床的體積。每隔3管以苯酚-硫酸法檢測吸光度A490，並做洗脫曲線。見附圖3。合併主峰，記為W-1-S300 (15-25)，濃縮，凍幹。用HPGPC檢測每個主峰的行為。樣品配製成5mg/mL的水溶液。進行色譜條件相同的純度檢測。分析結果見附圖4。2. 3 第二次 Sephacry S-300 純化精密稱取w-l-S300(15-25)樣品250mg，溶於5mL去離子水，離心除不溶物(離心，IOmin, 5000rpm),重複2次,用滴定管吸上清液沿管壁四周緩緩滴入Sephacryl S-300進行分離。用去離子水洗脫，流速為O. 5mL/min,收集5mL/管,收集I. 5-2個柱床的體積。每隔3管以苯酚-硫酸法檢測吸光度A490，並做洗脫曲線。見附圖5。由圖5可知洗脫曲線出現2個峰，分離效果明顯，收集主峰25#-43#，減壓濃縮到適當體積，凍幹，稱重，得160mg。即得本方法紫芝液體深層發酵菌絲體均一多糖GS-C-W-I。實施例2 :苯酚硫酸法測定本發明紫芝液體深層發酵菌絲體均一多糖GS-C-W-I的
多糖含量具體步驟如下標品配製精密稱定乾燥好的葡萄糖25mg,定溶至100ml,配成250ug/ml標品溶液，分別取O. 05,0. 1,0. 15,0. 2,0. 25,0. 3mL於試管中，加去離子水補足O. 3mL，分別加5%苯酚O. 7mL充分搖勻，快速加入濃硫酸4mL，50°C、40min水浴，冷卻後測定吸光度。空白配製取0.6ml去離子水，加5%苯酚I. 4ml，濃硫酸8ml，水浴加熱，冷卻，作
空白液。 標準曲線繪製將標準待測液和空白液用紫外分光光度法於488nm處測其吸收值，並做標準曲線。樣品配製取GS-C-W-I樣品,精密稱定5mg,加入IOml的去離子水中配製O. 5mg/ml溶液，取O. 05ml於試管中，加水補足O. 3ml，按標品液依次加入苯酚、濃硫酸，水浴加熱，
冷卻，作樣品液。檢測將待測樣品用紫外分光光度法於488nm處測其吸收值，用標準曲線測得GS-C-W-I的多糖含量為97. 1%。實施例3 :用葡聚糖標準品Dextron系列標定本發明紫芝液體深層發酵菌絲體均一多糖GS-C-W-I中多糖的分子量具體方法如下色譜條件TSK-GEL GMPffxl色譜柱；流動相為水；流速0. 3mL/min ;柱溫35°C ;檢測器為示差檢測器。標品Dextron、GS-C-W-l樣品分別用水溶解,進樣。測定葡聚糖Dextron系列和GS-C-W-l的保留時間，以Dextron的保留時間-Dextron系列的分子量對數值做標準曲線，可知GS-C-W-I的分子量大於2000KDa。實施例4 :紫芝液體深層發酵菌絲體均一多糖GS-C-W-I的結構解析I)完全酸水解取樣品8mg溶於2mol/L三氟乙酸(TFA)，充氮氣封管，110°C水解4h，管內液減壓蒸乾，加2mL甲醇溶解並減壓蒸乾，重複3次以除盡三氟乙酸，再加入ImL去離子水溶液使樣品溶解。I. 1GS-C-W-1 水解後的 TLC 結果取O. 05mL該樣品以果糖、巖藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳醒酸、木糖、半乳糖、鼠李糖為對照單糖分別點樣，分別以丙酮水=24 I、正丁醇乙酸乙酯異丁醇醋酸水吡啶=35 100 60 35 30 35展開，最後以苯胺-鄰苯二甲酸顯色，並在110°C烘烤10-15min，觀察結果。見附圖6。由圖6得知4、8號與GS-C-W-I在同一直線，故可以判斷GS-C-W-I存在半乳糖、鼠李糖單糖。I. 2HPLC檢測多糖單糖組分色譜柱條件
液相色譜柱TYPEUG80 (4. 6 X 250mm)軟體處理系統Minennium32版GPC數據處理系統檢測器Water 2410示差折光檢測器流動相乙腈水=3 I柱溫箱35°C檢測器溫度35°C流速lmL/minHPLC檢測結果見附圖7A-7D。根據標品半乳糖與鼠李糖的摩爾量，結合多糖樣品HPLC的峰面積比，可以推斷多 糖GS-C-W-I單糖中半乳糖鼠李糖=3.5 I (摩爾比)。可以進一步證明TLC點板中存在半乳糖和鼠李糖單糖。2)高碘酸氧化2. I高碘酸標準曲線30mmol/L高碘酸液配製精密稱取高碘酸鈉322. 08mg定溶於50mL容量瓶。標準曲線的繪製取7個250mL容量瓶分別依次加入高碘酸鈉溶液O. 2,0. 4,0. 6，O. 8，1，1.5，2mL，加去離子水定容。放置IOmin後，以水作為空白，用分光光度法，在223nm的波長處測吸收度，以高碘酸鈉μ mol/L為橫坐標，光密度值為縱坐標作標準曲線。見表I和附圖8。表I、不同濃度高碘酸在223nm的吸收度
高碘酸濃度(μηιοΙ/L) A(223nm)
240.231
480.483
r^o1720.73
96 0.978 120 1.212 180 1.829 _240__2.4742. 2高碘酸氧化反應精密稱取GS-C-W-I IOmg於IOmL容量瓶中，然後加入15mmol/LNaI04定容至刻
度。放置在暗處反應(4°C )，間隔時間(0h、2h、24h、48h、72h......)取樣O. lmL，用蒸餾水
稀釋250倍，用紫外分光光度計，以蒸餾水作空白對照，在223nm波長處測吸光度值，直到吸光度值恆定為止。加乙二醇終止反應(中和剩餘的高碘酸)，高碘酸氧化完成。2. 3用NaOH滴定甲酸的生成量O. lmol/L NaOH滴定液標定精密稱取105°C恆重的鄰苯二甲酸氫鉀O. 6g溶於50mL新沸過的冷水，酚酞做為指示液，滴定至溶液顯粉紅色。最終測得NaOH溶液濃度為O.092mol/L。甲基紅指示劑配製精密稱取O. 1004g,加O. 05mol/L NaOH溶液7. 4mL使溶解，再加水稀釋至200mL，即得。取2mL上述氧化液，加I滴甲基紅作指示劑，用O. 0092mol/L NaOH(用鄰苯二甲酸氫鉀標定)滴定，計算得甲酸生成量。2. 4實驗結果2. 4. I吸光值恆定時測得A吸收值為O. 295。高碘酸液對照初始A吸收值為O. 607，而高碘酸液在72h後吸收值無變化。故可以得出高碘酸與樣品反應的O. 757mol。2. 4. 2根據滴定最後計算得甲酸生成量為O. 34mmolo2. 4. 3而高碘酸消耗量高於甲酸生成量的二倍，說明存在被高碘酸氧化不產生甲酸的己糖殘基I — 2、I — 2,6、I — 4、I — 4,6鍵型；甲酸生成量顯不分子中I —、1 — 6鍵型的己糖殘基約佔34%，高碘酸消耗量及甲酸生成量顯示分子中的糖殘基均可被氧化。
3) Smith 降解反應將乙二醇處理後的GS-C-W-I用高碘酸氧化後的溶液透析(Mw = 3500)，蒸餾水透析48小時。濃縮，加入NaBH4還原過夜。用冰醋酸中和至pH為6 7，透析，減壓蒸至2mL左右，進行冷凍乾燥。將還原的樣品放入安瓿瓶中，加入2mL 2mol/L後封管，於110°C下水解4h，反應瓶中的溶液減壓蒸乾，再加入I 2mL的甲醇，蒸乾，重複三次以除盡過量的TFA，水解後的樣品用ImL水溶解，做HPLC考察。3. I色譜條件液相色譜柱TYPEUG80 (4. 6 X 250mm)軟體處理系統Minennium32版GPC數據處理系統檢測器Water 2410示差折光檢測器流動相乙腈水=3 I柱溫箱35°C檢測器溫度35°C流速lmL/min對照品為赤蘚醇、甘油。3. 2 結果見附圖 9A-9D。由附圖9D可得知=Smith降解反應產物HPLC檢測出大量的甘油，說明含有可以產生甘油的鍵型，即I—、I — 2、I — 6、I — 2，6 ;未檢測出赤蘚醇，說明不含有生成赤蘚醇的鍵型，即I — 4、1 — 4,6 ;各部分均未檢測出糖殘基，說明分子均由可被高碘酸氧化的鍵型構成。因此推測GS-C-W-I是以I — 6鍵型為主連結構的鍵型。4)紫外圖譜見附圖10。取GS-C-W-1樣品進行紫外全波長掃描，在260nm和280nm處未見吸收,證明不含核酸和蛋白質。5)紅外圖譜取Img GS-C-W-I樣品，用溴化鉀壓片進行IR檢測。見附圖11。GS-C-W-I紅外光譜圖有多糖特徵吸收，3438. 7CHT1的寬峰是-OH的伸縮振動。2925. 8CHT1峰是糖的C-H伸縮振動，1635. 3cm—1為結合的水吸收峰，1384. 4cm—1是糖的C-H變角振動，以上可判斷GS-C-W-I為多糖類化合物。GS-C-W-I在1074. ScnT1的峰為吡喃環的特徵吸收峰，在83701^1處有吸收峰,而在89001^1處無吸收峰,其可能為a -D卩比喃半乳糖的吸收峰，說明GS-C-W-I糖苷鍵類型為α -構型。6)核磁圖譜取多糖樣品IOmg裝入核磁管，溶於重水中，在核磁共振儀上進行1H-NMR,光譜分析。1H-NMR圖譜分析從附圖12中可見Cl質子化學位移位於δ 4. 8 5. 3間，則證明GS-C-W-I含α型吡喃己糖，與紅外結果相符。實施例5 :實施例I製得的紫芝液體深層發酵均一多糖GS-C-W-I的藥理活性DGS-C的體內抗腫瘤實驗I. I動物昆明種小鼠，雄性
I. 2實驗方法取生長良好的小鼠肝癌Η22腹水或Lewis肺癌瘤塊，用生理鹽水以I : 4稀釋(細胞濃度約1-2 X IO7個/ml)，每隻小鼠右腋皮下接種O. 2ml。接種後次日起給藥，給藥體積為O. 5ml/20g體重，小鼠肝癌H22連續腹腔注射7天，Lewis肺癌連續腹腔注射10天。雙靈固本散經口灌胃。接種後10日解剖H22，14日解剖Lewis肺癌，取瘤塊，稱瘤重，結果判定根據以下公式
對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重
腫瘤抑制率％=__X 100%
對照組平均瘤重I. 3實驗結果表I、GS-C對小鼠H22的抑制率
劑量給藥動物數動物體重(g)瘤重(g)
組別一抑瘤率％
(mg/kg) 方案始終 (去瘤後)x 士SD
空白對照15 15 29.49±2.67 2.59±0.67
雙靈固本散250 igx7 10 10 28.38±2.39 1.70±0.45** 34.40
GS-C5 ipx7 10 10 26.64±2.71* 1.23±0·33** 52.50與對照組比較*Ρ < O. 05廣P < O. 01。表2、GS-C對小鼠Η22和Lewis的抑制率
組別劑量給藥動物數動物體重(g)瘤重(g) 抑瘤率％
_(mg/kg) 方案始終_(去瘤後)_x 土 SD_
空白對照丨O 1021.19土 1.353.44±0.64
雙靈固本散250 ig><7 6 621.41±1.35 2.32±0.36** 32.45
GS-C5 ip><7 6 618.71 士 1.63** 2.05士0.54** 40.26與對照組比較*P < O. 05廣P < O. 01。由表1，表2可知分子量大於30萬(GS-C)的多糖部位有較強的抗腫瘤作用。
2) GS-C-W-1 的體外 MTT 實驗2. I實驗材料及配製(I)細胞株A549(人肺癌細胞株)、SK0V3(人卵巢癌細胞株)、K562(人白血病細胞株)、SMMC-7721 (人肝癌細胞株)。上述細胞株由上海醫藥工業研究藥理室保存，傳代維持。(2)DMEM完全培養基添加10%新生牛血清(GIBCO BRL)、雙抗；⑶O. 25%胰蛋白酶溶液(Trypsin):購自Invitrogen公司，_20°C保存。(4)磷酸緩衝液(PBS) NaC18g, KC10. 2g，Na2HPO4L 15g，KH2PO4O. 2g，溶於 IL 雙蒸水，121°C高壓消毒20min，4°C保存。
(5) MTT (AMRESC0)溶液用 PBS 配成 5mg/ml 溶液。(6)溶解液每IOOml去離子雙蒸水含SDS 10g，異丁醇5ml，濃鹽酸O. 1ml。(7)對照品泰素 Bristol Myers Squibb SRL.批號0E60359。2. 2實驗方法(I)樣品及對照品製備將樣品溶解於PB S或DMSO中，得到濃度為10mg/ml的溶液。再用PBS作梯度稀釋，得到濃度分別為ΙΟΟΟμ g/ml、100l·! g/ml、10l·! g/ml、l μ g/ml、
0.I μ g/ml、0. 01 μ g/ml的稀釋樣品。對照品原液為6mg/ml，用PBS作梯度稀釋，得到濃度分別為 1000 μ g/ml、100 μ g/ml、10 μ g/ml>I μ g/ml、0. I μ g/ml、0. 01 μ g/ml 的稀釋樣品。(2)將稀釋好的樣品和對照品加入平底96孔板中，每孔10μ 1，每點作兩個平行測
O(3)取處於對數生長期的細胞，細胞經胰酶消化並洗滌後懸浮於含10%血清的DMEM培養基中，並調節細胞懸浮液密度至2 X IO5細胞/ml。(4)在平底96孔板中，每孔加入90 μ I細胞，最後一孔加入90 μ I培養基，於37°C、5% CO2細胞培養箱中培養48小時。(5)每孔中加入20 μ I 5mg/mlMTT溶液，繼續在培養箱中保溫3 4小時。(6)每孔加入100 μ I溶解液，繼續在培養箱中保溫過夜，使生成的甲臢晶體充分溶解。測定570nm光吸收值。(7)通過軟體計算樣品對各腫瘤細胞的IC50。2. 3實驗結果
\^口口名稱~~SKOV3~ SMMC-7721~A549細
GS-C-W-I ~>100>100>100由上表看出GS-C-W-1對SK0V3、SMMC-7721、A549人腫瘤細胞株沒有細胞毒作用。3) GS-C-W-I的體外免疫實驗(Con A和LPS誘導的小鼠脾臟淋巴細胞增殖活性測試的研究。)3. I動物ICR小鼠，雌雄不限。3. 2實驗方法3. 2. I試劑配置L-DMEM完全培養基按常規方法配置。
MTT溶液用PBS配成5mg/mL溶液，4°C保存，兩周內有效。Con A :用無血清L-DMEM培養基配成10ug/mL溶液，O. 22um微孔濾膜過濾除菌。LPS :用無血清L-DMEM培養基配成40ug/mL溶液，O. 22um微孔濾膜過濾除菌。3. 2. 2脾細胞製備小鼠以頸椎脫位致死，無菌取脾臟，Ficoll分離脾細胞，以L-DMEM培養液洗三次，計數，用含10%胎牛血清的L-DMEM培養液配成2 X IO6細胞/mL細胞懸液。3. 2. 3小鼠脾臟淋巴細胞增殖實驗將小鼠脾細胞懸液點於96孔培養板上，每孔IOOuL,設一個對照組，再加入50uL的Con A或LPS (終濃度為2. 5ug/mL或10ug/mL)，最後加入不同量的GS-C-W-I (終濃度為10， 50，100ug/mL)，每孔培養液補足為200uL。將細胞培養板置於含有5% CO2, 37°C培養箱中培養。72h後，加入MTT溶液(5mg/mL)10uL，置於5% C02，37°C培養箱中繼續培養4h。取出反應物，離心(2000rpm，5min)，棄上清，每孔加入150uL DMSO,充分振蕩，待凝塊完全溶解後在酶標測定儀上570nm讀出A值。3. 3實驗結果在體外對小鼠脾臟淋巴細胞轉化的影響的測試結果見表3，表4。表3、GS-C-W-I體外對Con A誘導小鼠脾臟T淋巴細胞增殖的影響
_樣品_濃度(ug/mL )_平均值對照 - 0.185±0.013_GS-C-W-I_10_0.291 士0.027#與對照組相比，*P< O. 05，< O. 01。表4、GS-C-W-I體外對LPS誘導的小鼠脾臟B淋巴細胞增殖的影響
_樣品_濃度(ug/mL )_平均值
對照-0.196 士 0.014100.173±0.006
GS-C-W-I500.193±0.019
__IjOO__0.122±0.033*與對照組相比，*P < O. 05。表3和表4結果顯示GS-C-W-I在低濃度下對促進的T淋巴細胞增殖活性有非常顯著的作用，對LPS誘導小鼠脾臟B淋巴細胞增殖反應中，隨著濃度升高,其增殖活性可以得到一定的提高，但是提高到一定濃度以後，增殖的促進作用開始減弱；提示GS-C-W-I通過提高機體免疫能力達到抗腫瘤作用。
權利要求
1.紫芝液體深層發酵菌絲體均一多糖，其特徵在於，所述均一多糖的總糖含量為大於95%，優選為大於97. 1%，且所述均一多糖的分子量大於2000KDa。
2.根據權利要求I所述的均一多糖，其特徵在於，所述均一多糖由半乳糖和鼠李糖組成。
3.根據權利要求2所述的均一多糖，其特徵在於，所述半乳糖與鼠李糖的摩爾比為3.3-3. 7 1，優選 3. 5 : I。
4.根據權利要求2或3所述的均一多糖，其特徵在於，所述均一多糖由(I—6)-a-半乳糖連接的主鏈和具有通過I — 6取代在主鏈上的鼠李糖分支所組成。
5.根據權利要求I至4任一所述的均一多糖，其特徵在於，所述均一多糖在水中pH值為 7. 16。
6.紫芝液體深層發酵菌絲體提取物，其包含權利要求1-5任一所述的均一多糖，所述均一多糖的總糖含量為大於95%,優選為97. I %,且所述均一多糖的分子量大於2000KDa。
7.權利要求1-5任一所述的均一多糖的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟紫芝液體深層發酵菌絲體粗多糖經柱層析得到均一多糖。
8.根據權利要求7所述的均一多糖的製備方法，其特徵在於，所述柱層析步驟所用的填料為陰離子交換樹脂和葡聚糖凝膠。
9.根據權利要求8所述的均一多糖的製備方法，其特徵在於，所述填料陰離子交換樹脂為 DEAE-cellulose 52。
10.根據權利要求8所述的均一多糖的製備方法，其特徵在於，所述葡聚糖凝膠的型號為 Sephacryl S-300。
11.權利要求1-5任一所述的均一多糖在製備抗腫瘤藥物和提高免疫力藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開紫芝液體深層發酵菌絲體均一多糖，其特徵在於，所述均一多糖的總糖含量為大於95％，且所述均一多糖的分子量大於2000KDa。本發明也公開上述均一多糖的製備方法。本方法提供的紫芝液體深層發酵菌絲體均一多糖的多糖含量更高、給藥劑量更低、純度更高，且其製備工藝亦適於工業化生產。
文檔編號C12R1/645GK102827297SQ20111015675
公開日2012年12月19日 申請日期2011年6月13日 優先權日2011年6月13日
發明者楊義芳, 牛莉鑫, 金雋迪 申請人:上海醫藥工業研究院