Fsh糖基化突變體的製作方法

2023-06-14 07:27:56 2

專利名稱：Fsh糖基化突變體的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有卵泡刺激激素活性的多肽、這些多肽的製備方法以及這些多肽在治療中的應用，特別是用於治療生殖障礙。
背景技術：
a.促性腺激素卵泡刺激激素(FSH)是對人生育具有關鍵作用的促性腺激素家族其中一個成員。促性腺激素還包括黃體生成素(LH)和絨毛膜促性腺激素(CG)，都是異二聚體，各包括一個共同的α-亞基(92個胺基酸)和一個獨有的β-亞基(FSH的β-亞基有111個胺基酸)。α和β亞基的成熟形式的胺基酸序列分別示於SEQID NO1和SEQ ID NO2。
人FSH已經由腦下垂體和絕經後尿(EP 322，438)分離出來，並且已經在哺乳動物細胞中重組產生(US5,639,640，US5,156,957，US4,923,805，US4,840,896，US5,767,251，EP211，894和EP521,586)。後者文獻也公開了人FSH β-亞基基因。美國專利US5,405,945公開了經修飾的僅包含一個內含子的人α-亞基基因。
Liu等(J Biol Chem 1993，15；268(2)21613-7)、Grossmann等(MolEndocrinol 1996 10(6)769-79)、Roth和Dias(Mol Cell Endocrinol 19951；109(2)143-9)、Valove等(Endocrinology 1994；135(6)2657-61)、Yoo等(J BiolChem 1993 25；268(18)13034-42)、US5,508,261以及Chappel等(HumanReproduction，1998，13(3)1835)揭示了各種關於結構-功能關係的研究並鑑定了參與受體結合和激活以及參與FSH二聚化的胺基酸殘基。
b.促性腺激素在輔助生殖技術中的應用促性腺激素在生殖周期中發揮重要作用，在外源性療法中使用促性腺激素是諸如體外受精(IVF)、體外受精與胞漿內精子注射結合(IVF/ICSI)和胚胎移植(ET)等輔助生殖技術(ART)以及通過天然方式或宮內受精(IUI)接受體內受精的不孕病人排卵誘導(OI)所必需的。
美國專利US4,589,402和US4,845,077公開了不含LH的純化人FSH及其在體外受精中的用途。EP322438公開了一種基本上沒有LH活性但具有至少6200U/mg FSH活性的蛋白質，其中FSHα-亞基和β-亞基可以分別是野生型或其特定的截短形式。
要獲得治療效果，需要較長治療時間，一般要連續8至10日有時甚至長達21日刺激婦女的卵泡生成，要長達18個月誘導促性腺激素分泌不足的男性的精子生成。重組hFSH通常每日經肌內(i.m.)或皮下(s.c.)途徑注射來給予，結果給病人帶來不適，並且局部注射部位可能產生反應。減少給藥頻率有利於治療，並使促性腺激素的給藥更方便，更有耐藥性，感覺更舒適。
c.FSH的糖基化促性腺激素是糖蛋白，每個亞基帶有對體內活性和功能非常重要的天冬醯胺聯的(N-聯的)低聚糖側鏈。多肽中加入碳水化合物(糖基化)是翻譯後事件，結果是將糖鏈加入特定的天冬醯胺(N-聯的)或絲氨酸/蘇氨酸(O-聯的)胺基酸中。與糖蛋白類蛋白質部分的不變胺基酸序列相反，碳水化合物結構是變化的，這個特徵稱為微不均一性。例如，同一蛋白質上N-糖基化位點可含有不同的碳水化合物結構。此外，對於一給定糖蛋白上相同糖基化位點，也可以有不同的碳水化合物結構。這種不均一性是非模板引導合成碳水化合物的結果。
蛋白質的N-糖基化具體發生在共有模式Asn-Xaa-Ser/Thr上，在較少情況下發生在共有模式Asn-Xaa-Cys上，其中Xaa可以是任何胺基酸殘基。不過，一個共有三肽的存在不足以確保天冬醯胺殘基發生糖基化。例如，Asn-Pro-Ser/Thr序列的N-糖基化速率比Asn-Xaa-Ser/Thr的其它共有模式低50倍。
人FSH含有4個N-聯糖基化位點兩個在共同的α-亞基的位置52和78上，另外兩個在β-亞基的位置7和24上。與FSH的α-亞基相連的碳水化合物是二聚體組裝、整合、信號轉導的關鍵，而β-亞基碳水化合物對二聚體組裝、分泌以及將異二聚體從循環中清除是十分重要的。
Galway等(Endocrinology 1990；127(1)93-100)論證了在N-乙醯氨基葡萄糖轉移酶-I CHO細胞系或缺乏唾液酸轉運的CHO細胞系中產生的FSH突變體具有與野生型細胞分泌的FSH或純化垂體FSH相同的體外活性，但沒有體內活性，這可能是由於糖基化不足夠的突變體在血清中很快被清除所致。D′Antonio等(Human Reprod 1999；14(5)1160-7)描述了在血流中循環的各種FSH同種型。這些同種型具有相同胺基酸序列，但它們的翻譯後修飾程度不同。已經發現，酸性較弱的同種型組別比酸性同種型組別在體內更快被清除，這可能是同種型之間唾液酸含量不同所致。另外，Bishop等(Endocrinology1995；136(6)2635-40)認為循環半衰期似乎是體內活性的主要決定因子。由這些觀察結果可以推斷，導入附加糖基化位點以增加多肽的唾液酸含量可以延長FSH的半衰期。
d.FSH突變體將hCG(CTP)的羧基末端肽與天然重組人FSH(rhFSH)融合，已經獲得了半衰期延長的FSH激動劑。CTP部分由胺基酸112-118至145組成，有4個O-聯的糖基化位點，分別位於位置121、127、132和138上。美國專利US5,338,835和US5,585,345公開了一種修飾FSH β-亞基，它在hCG的CTP部分C-末端Glu延伸。這種修飾類似物據說具有天然FSH的生物活性，但其循環半衰期較長。美國專利US5,405,945公開了hCG β-亞基的羧基末端部分或其突變體對CG、FSH和LH的清除產生重大的影響。
美國專利US5,883,073公開了一些單鏈蛋白質，它們由對CG、TSH、LH和FSH有激動活性或拮抗活性的兩個α-亞基組成。美國專利US5,508,261公開了一些對LH和FSH受體有結合親和力的異二聚體多肽，它們含有一個糖蛋白激素α-亞基和一個非天然存在的β-亞基多肽，其中所述β-亞基多肽是包含4個相連接次序列(subsequences)的胺基酸鏈，其中各個次序列選自一列特定的序列。Klein等(2003)公開了一個半衰期延長了的單鏈FSH類似物，其中α-和β-亞基由含有2個N-聯糖基化位點的寡肽偶接。
WO 01/58493公開了嘗試提高FSH體內半衰期而可以在FSH α-亞基實施的77種突變以及在FSH β-亞基實施的51種突變。WO 01/58493公開了突變的α-和β-亞基可獨立使用(1個附加糖基化位點)或結合使用(2個附加糖基化位點)。利用FSH三維結構的50個模型鑑定了128種候選突變體，它們是只基於hCG結構以及FSH與hCG的序列對比而產生的，儘管hCG與FSH的β-亞基之間僅有32％同一性。WO 01/58493沒有揭示FSH的任何α-或β-亞基的生產或測試，其中所述FSH的糖基化位點是通過定點誘變技術導入的。
因此，臨床上需要一種產物，它提供部分或全部與FSH相關的治療效果，與現有的FSH產品相比給藥頻率較少，其循環FSH活性的水平與目前治療相比最好更穩定。
本發明針對這樣的產品及製備這樣的產品的方法。

發明內容
本發明涉及一種突變的FSH，其中FSH α-亞基包含SEQ ID NO3所示的序列，FSH β-亞基包含SEQ ID NO4所示的序列。該突變的FSH的N-糖基化可發生在所述突變的FSH的天冬醯胺殘基0、1、2、3、4、5或6上。突變的α亞基的N83可以是糖基化的。突變的β亞基的N55可以是糖基化的。
本發明還涉及一種分離的DNA，其編碼包含SEQ ID NO3所示序列的FSH α-亞基突變體。本發明還涉及一種分離的DNA，其編碼包含SEQ IDNO4所示序列的FSH β-亞基突變體。
本發明還涉及一種含有DNA的載體，其中所述DNA編碼包含SEQ IDNO3所示序列的FSH α-亞基突變體。所述載體可以是表達載體。
本發明還涉及一種含有DNA的載體，其中所述DNA編碼包含SEQ IDNO4所示序列的FSH β-亞基突變體。所述載體可以是表達載體。
本發明還涉及一種含有第一DNA和第二DNA的載體，其中第一DNA編碼包含SEQ ID NO3所示序列的FSH α-亞基突變體，第二DNA編碼包含SEQ ID NO4所示序列的FSH β-亞基突變體。所述載體可以是表達載體。
本發明還涉及一種含有載體的細胞，其中所述載體含有編碼包含SEQ IDNO3所示序列的FSH α-亞基突變體的DNA。所述載體可以是表達載體。所述細胞可以是哺乳動物細胞。
本發明還涉及一種含有載體的細胞，其中所述載體含有編碼包含SEQ IDNO4所示序列的FSH β-亞基突變體的DNA。所述載體可以是表達載體。所述細胞可以是哺乳動物細胞。
本發明還涉及一種含有載體的細胞，所述載體含有第一DNA和第二DNA，其中所述第一DNA編碼包含SEQ ID NO3所示序列的FSH α-亞基突變體，所述第二DNA編碼包含SEQ ID NO4所示序列的FSH β-亞基突變體。所述載體可以是表達載體。所述細胞可以是哺乳動物細胞。
本發明還涉及一種含有第一和第二載體的細胞，其中第一載體含有編碼包含SEQ ID NO3所示序列的FSH α-亞基突變體的DNA，第二載體含有編碼包含SEQ ID NO4所示序列的FSH β-亞基突變體的DNA。所述載體可以是表達載體。所述細胞可以是哺乳動物細胞。
本發明還涉及一種FSH突變體的生產方法，包括培養能夠使蛋白質糖基化的哺乳動物細胞，其中所述細胞含有第一表達載體和第二表達載體，所述第一表達載體含有編碼包含SEQ ID NO1所示序列的FSH α-亞基的DNA，所述第二表達載體含有編碼包含SEQ ID NO2所示序列的FSH β-亞基的DNA。
本發明還涉及一種含有FSH突變體和藥用載體或賦形劑的組合物，其中FSH α-亞基包含SEQ ID NO3所示的序列，FSH β-亞基包含SEQ ID NO4所示的序列。
本發明還涉及一種治療不孕哺乳動物的方法，包括把有效量的突變的FSH突變體給予有需要的哺乳動物，其中FSH α-亞基包含SEQ ID NO3所示的序列，FSH β-亞基包含SEQ ID NO4所示的序列。
本發明還涉及一種刺激哺乳動物卵泡生成的方法，包括把有效量的突變的FSH突變體給予有需要的哺乳動物，其中FSH α-亞基包含SEQ ID NO3所示的序列，FSH β-亞基包含SEQ ID NO4所示的序列。
本發明還涉及一種誘導哺乳動物卵巢超排卵(hyperstimulation)的方法，包括把有效量的突變的FSH突變體給予有需要的哺乳動物，其中FSH α-亞基包含SEQ ID NO3所示的序列，FSH β-亞基包含SEQ ID NO4所示的序列。


圖1所示為表達αtH83N亞基所用的表達載體的質粒圖譜。
圖2所示為瞬時表達βE55/V57T亞基所用的表達載體的質粒圖譜。
圖3所示為表達βE55/V57T亞基所用的表達載體的質粒圖譜。
圖4所示為GM-1的形態學。A和C部分是對GM-1和Gonal-F進行的MALDI-TOF質譜；B部分是對GM-1和Gonal-F進行的LDS-PAGE分析。
圖5所示為GM-1在未完全發育的大鼠兩日排卵誘導模型中的性能。
具體實施例方式
雖然已經發現，增加FSH的碳水化合物含量可以延長體內半衰期，但改善FSH的半衰期遠比簡單地導入附加糖基化位點來得複雜。雖然導入碳水化合物需要一個糖基化共有序列，但不能充分保證將來用到碳水化合物附加位點。其它因子，例如生物合成過程中局部蛋白質摺疊和構象等等，也決定一個寡糖是否附在一給定的共有序列位點上。另外，共有序列必須處於這樣的位置該位點的糖基化不會干擾受體結合，或者影響到糖蛋白的摺疊、構象或穩定性。
為此，目前具有較長半衰期的FSH類似物限於融合蛋白，其中多肽的融合部分包括附加糖基化位點。必須通過定點誘變技術將糖基化位點導入，由此產生半衰期較長的FSH類似物。
因為共有殘基需要加在與碳水化合物的加入相配的位置上，所以利用定點誘變加入糖基化位點時認識FSH的結構至關重要。如果突變引入糖基化位點，則突變的殘基不應該破壞該蛋白質的三維結構或者不應該明顯損害該蛋白質所希望的功能，如受體結合或激活。此外，加入的共有殘基不應該嵌入摺疊蛋白質結構內部，否則不可能在特定位點上發生糖基化。
直至最近，促性腺激素的三維結構僅限於hCG晶體結構的兩個獨立的報導基因部分去糖基hCG的其中一個結構(Lapthor等，1994；Wu et al.，1994)以及全糖基化hCG和兩個Fv片段的三元複合物低解離結構(Tegoni等，1999)。
雖然hCG和FSH具有基本上相同的摺疊模式，但這兩種結構明顯不同(Fox等，2001)，由預先確定的hCG結構無法適當地模擬FSH分子各胺基酸殘基的詳細結構(Wu等，1994；Lapthorn等，1994)。
本發明針對一種FSH突變體，它僅基於人FSH分子三維晶體結構而設計(Fox等，2001)。本發明的FSH突變體(「GM-1」)經修飾帶有下列取代，從而產生了附加糖基化識別位點α-亞基的H83N和β-亞基的E55N/V57T。重組FSH的一或多個附加糖基化位點可發生糖基化。突變的FSH中一或多個附加糖基化位點的糖基化可於體內或體外發生。
本發明的FSH突變體可通過本領域已知的任何合適方法產生。這些方法包括構建核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼各自FSH突變體以及在合適轉染宿主內表達胺基酸序列。本發明的FSH突變體也可通過化學合成或者化學合成與重組DNA技術結合來產生。
本發明的FSH突變體可包含FSH的α-和β-亞基，為兩條分離的多肽鏈形式，其中所述兩條鏈在體內二聚化從而形成二聚體多肽，或者它可包含單鏈構造體，所述構造體的兩個亞基由肽鍵或肽接頭共價連接。接頭肽的胺基酸殘基表現出對FSH突變體活性影響不大的性質。
本發明的FSH突變體具有比野生型FSH長的半衰期。本發明的FSH突變體也具有比野生型FSH高的穩定性。FSH突變體包含的寡糖可位於N-聯糖基化位點0、1、2、3、4、5或6上。FSH突變體可含有一或多個FSH突變同種型，其中每個同種型所含的寡糖位於N-聯糖基化位點0、1、2、3、4、5或6上。
通過分離或合成編碼親代FSH亞基(例如分別具有SEQ ID NO3和4所示胺基酸序列的hFSH-α或hFSH-β)的核苷酸序列，可以構建編碼本發明FSH突變體的α-或β-亞基的核苷酸序列。再將該核苷酸序列改性以取代有關的胺基酸殘基。由定點誘變可修飾核苷酸序列。另一個選擇是，由化學合成來製備核苷酸序列，其中基於FSH突變體的具體胺基酸序列來設計寡核苷酸。
可將編碼多肽的核苷酸序列插入重組載體中，並與在所希望的轉染宿主細胞中表達多肽所需的調控序列操作性相連。本領域技術人員無需進行過多實驗就可以在這些載體、表達調控序列和宿主中作出選擇。重組載體可以是自動複製的載體，即以染色體外實體存在的載體，其複雜與染色體複製無關，例如質粒。或者，載體可以是這樣的載體當被導入宿主細胞時與該宿主細胞基因組整合，並與染色體一起複製到它已經被整合的基因組中。
載體可以是一種表達載體，其中編碼本發明多肽的核苷酸序列與該核苷酸序列轉錄所需的附加節段操作性相連。載體可以由質粒或病毒性DNA產生。通過商業途徑可以獲得大量的在本文所述宿主細胞中表達的合適表達載體，或者可參見文獻描述。
重組載體還可以包含能夠使該載體在有關宿主細胞中複製的DNA序列。例如，這樣的序列(當宿主細胞是哺乳動物細胞時)是SV40複製起點。載體還可以包含選擇性標記物，例如其產物與宿主細胞缺失互補的基因，譬如說編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因或者賦予藥物抗性的物質，例如氨比西林、卡那黴素、四環素氯黴素、新黴素、潮黴素或甲氨蝶呤。
載體也可以包含擴增基因，例如DHFR，這樣可為合適的培養基選擇具有擴增基因和側翼序列多重拷貝的細胞，包括突變的FSH DNA。此處的術語「調控序列」定義為包括需要或有利於表達本發明多肽的全部組件。例如，在哺乳動物細胞中引導轉錄的合適調控序列包括SV40和腺病毒的早期和後期啟動子，譬如說腺病毒2主要後期啟動子、MT-1(金屬硫蛋白基因)啟動子和人細胞巨化病毒即刻早期基因啟動子(CMV)。
本發明還涉及編碼FSH H83N α-亞基的分離DNA以及編碼FSHE55N/V57T β-亞基的分離DNA。不論是通過定點誘變、合成、PCR還是其它方法製備的編碼FSH突變體的本發明核苷酸序列，都可任選地包括一個編碼信號肽的核苷酸序列。當多肽由它表達的細胞中分泌出來時就含有信號肽。這樣的信號肽如果存在的話，應該能夠被選取來表達多肽的細胞所識別。該信號肽可以與多肽同源(例如，正常情況下與hFSH亞基聯合)或者異源(例如，來自除hFSH以外的其它來源)，或者可以與宿主細胞同源或異源，即正常情況下由宿主細胞表達或者正常情況下不是由宿主細胞表達。
可使用任何合適的宿主產生本發明的多肽亞基，包括細菌、真菌(包括酵母)、植物、昆蟲、哺乳動物或其它合適的動物細胞或細胞系，以及轉基因動物或植物。合適的哺乳動物宿主細胞的例子包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞系(例如CHO-KL；ATCC CCL-61)、綠猴細胞系(COS)(例如COS 1(ATCCCRL-1650)、COS 7(ATCC CRL-1651))、小鼠細胞(例如NSIO)、幼倉鼠腎(BI-EK)細胞系(例如ATCC CRL-1632或ATCC CCL-10)、和人細胞(例如BEK293(ATCC CRL-1573))、以及組織培養基中的植物細胞。其它合適的細胞系已為本領域所知，可通過公共保藏機構獲得，如美國菌種保藏中心。將外源DNA引入哺乳動物宿主細胞的方法包括磷酸鈣介導的轉染法、電穿孔法、DEAE-右旋糖介導的轉染法、脂質體介導的轉染法和病毒性載體。
運用本領域公知的方法在適合產生多肽的營養培養基中培養細胞。例如，在允許表達和/或分離多肽的條件下，在實驗室或工業發酵罐內的適當培養基中通過振蕩培養瓶培養、小規模或大規模發酵(包括連接式、分批式、流加式或者固態發酵法)培養細胞。根據本領域已知的程序，培養用的適當營養培養基包括碳源和氮源以及無機鹽。適當的培養基可通過商業途徑獲得，或者可按照已公開的組成製備(例如，參見美國菌種保藏中心的目錄)。如果多肽分泌進入營養培養基中，那麼可從培養基中直接回收多肽。如果不分泌多肽，那麼可從細胞溶解物中回收多肽。
運用本領域已知的方法可回收突變的FSH多肽。例如，可用常規方法從營養培養基中回收，包括但不限於，離心、過濾、萃取、噴霧乾燥、蒸發、或沉澱。突變的FSH多肽可通過本領域公知的各種方法純化，包括但不限於，色譜法(例如離子交換色譜法、親和色譜法、疏水色譜法、聚焦色譜法和尺寸排阻色譜法)、電泳方法(例如製備性等電聚焦)、差異溶解度法(例如硫酸銨沉澱法)、SDS-PAGE或者萃取。
本發明還涉及一種含有本發明FSH突變體的藥物組合物。所述藥物組合物用來刺激卵泡生成，例如可與排卵誘導或輔助生殖技術(ART)聯用。因為本發明的FSH突變體用來誘導多卵泡發育和成熟特別有效，所以它特別適用於希望收穫多個卵母細胞的ART。
另一個選擇是，小心選取劑量，本發明的FSH突變體可用於OI的誘導單一卵泡生成，或者用於IUI、體內受精的誘導少量卵泡生成(最多3個卵泡左右)。減少FSH突變體劑量或者給藥頻率比常規FSH製劑少都可實現單一卵泡生成。例如，本發明的FSH製劑用於OI的劑量是每隔二日225-400 IU或以下，取決於病人的反應。通過超聲波檢查法可跟蹤病人的反應。
本發明的FSH突變體可用於控制性超排卵(controlled ovarianhyperstimulation，COH)方案中。COH的標準方案包括一個向下調節的階段，在這個階段中，通過給予促性腺激素釋放激素(GnRH)激動劑來抑制內源性黃體生成激素(LH)，接著的是一個刺激階段，在這一階段中，每日給予卵泡刺激素(FSH)，通常約150-225 IU/天，誘導卵泡發育(卵泡生成)。另一種選擇是在自然月經或誘導月經後開始用FSH刺激，然後給予GnRH拮抗劑(通常在刺激階段的約第6開始)。當至少有3個卵泡＞16毫米(其中一個是18毫米)時，給予單丸劑(single bolus)hCG(5-10,000 IU)模擬天然LH峰並引發排卵。注射hCG後36-38小時定為回收卵母細胞的時間。
本發明的FSH突變體也可用於OI和IUI。例如，在自然月經或誘導月經後開始用本發明的製劑進行FSH刺激，每日劑量為75-150 IU。當有1或3個卵泡的直逕到達至少16毫米時，給予單丸劑hCG誘導排卵。通過定期性交或IUI進行體內受精。
因為本發明的FSH突變體與野生型FSH製劑相比具有較長的半衰期，所以上述方案可採用較低IU劑量的FSH，和/或可縮短FSH刺激階段，但能夠獲得相同或更好的反應(以卵泡數目和卵泡生存能力計)。例如，每日給予約50-150 IU FSH，較好約50-100 IU FSH，更好約50-75 IU FSH，本發明的FSH製劑可以獲得足夠的卵泡生成。FSH的給予通常以日或半日計。給藥時間可少於約14天，較好少於約12天，更好少於約11或10天。對於OI，本發明的FSH突變體製劑的給予劑量是25-150 IU FSH/天，較好是50-125 IU FSH/天。治療男性不孕症時，本發明的FSH突變體製劑的給予劑量是每周三次，每次150-300 IU，直至精子生成水平足夠通過定期性交或ART技術進行受精。
因為本發明的突變FSH具有較長的半衰期，所以可作為長效型製劑給藥。常規FSH可每隔一天給予約300 IU，獲得相似效果要每天給予約150 IU。術語「長效的」指的是包括給藥頻率少於每隔一天的FSH製劑。本發明的突變FSH可每隔二天、每隔三天、每隔四天、每隔五天或每隔六天給予，而獲得的效果與每日給予常規FSH相若或者更好。
在本發明一相關方面中，採用FSH突變體或含有FSH突變體的藥物組合物製備治療疾病、障礙或病症的藥物。在另一方面，本發明的多肽或藥物組合物用於哺乳動物特別是人的治療方法中，所述方法包括把這些多肽或藥物組合物給予有需要的哺乳動物。
對於本領域技術人員顯而易見的是，有效量的本發明的多肽、製劑或組合物取決於疾病類型、劑量、給藥進度、是單獨給予所述多肽、製劑或組合物還是與其它治療藥物聯用、組合物的血清半衰期以及病人的一般健康狀況。一般地，有效量的本發明的製劑或組合物足夠保證治療效果。
本發明的FSH突變體可以藥物組合物形式給予，所述藥物組合物還包括一或多種個藥用載體或賦形劑。「藥用的」指的是不會對接受的病人產生任何不利影響的載體或賦形劑。這樣的藥用載體和賦形劑是本領域熟知的，運用已知方法可將本發明的多肽配製成藥物組合物(例如見A.R.Gennaro的參考書Remington’s Pharmaceutical Sciences，第8部分，第20版，(1990)，MerckPublishin Companyg；S.Frokjaer和L.Hovgaard的Pharmaceutical FormulationDevelopment of Peptides and Proteins，Eds.，Taylor Francis(2000)；以及A.Kibbe的Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，Pharmaceutical Press(2000))。可用於包含本發明多肽的組合物中的藥用賦形劑包括例如緩衝劑、穩定劑、防腐劑、等滲劑、非離子表面活性劑或去汙劑(「潤溼劑」)、抗氧化劑、膨脹劑或填充劑、螯合劑或助溶劑。
包含本發明FSH突變體的藥物組合物可以配製成各種形式，包括液體(例如容易使用的溶液或懸液)、凝膠、凍幹形式或任何其它合適的形式，譬如粉劑或適合製備溶液的晶體。組合物形式取決於要治療的具體情況，這對本領域技術人員是顯而易見的。
包含本發明FSH突變體的藥物組合物可通過靜脈內、肌內、腹膜內、皮內、皮下、舌下、口腔、鼻內、透皮等途徑，或者通過吸入或其它任何可接受的方式(例如用Powder Ject或Pro Lease技術或者筆型注射系統)給予。給藥模式取決於要治療的具體情況，這對本領域技術人員是顯而易見的。本發明的藥物組合物可經皮下途徑給予，因為這種方式允許病人自己給藥。
本發明的藥物組合物可與其它治療藥物聯用。這些藥物可作為同一藥物組合物的一部分，或者可與本發明的多肽分開給予，其給藥時間可以與本發明的多肽同時進行，又可以按照任何其它可接受的治療進度。另外，本發明的多肽、製劑或藥物組合物可作為其它療法的輔助手段。
本發明還涉及多個方面，參見以下非限制性實施例的描述。
實施例1 FSH單突變體候選糖基化位點的鑑定採用人FSH的三維晶體結構來鑑定FSH的α-和β-亞基的候選糖基化位點。晶體結構中每個不對稱單元含有兩個FSH分子(4個亞基)。這兩個FSH分子是疊加的，對它們進行比較，肉眼檢查每個殘基以鑑定潛在的N-糖基化位點。FSH的晶體結構與關於FSH/FSHR受體相互作用的認識結合，有助於選擇潛在的N-糖基化位點。主要設計標準是對三維結構的破壞儘可能小，對預測的結合和激活位點的破壞儘可能小，以及預計的三維結構與糖基化相配。
基於以上標準，對FSH的胺基酸序列作了20個單突變體(8α和12β)，包括以下2個突變體α-亞基H83Nβ-亞基E55N/V57TFSH單突變體的瞬時表達參照實施例3所述的方法，進行定點誘變獲得各個突變體。這些突變體與互補野生型亞基一起小規模地在CHO-Dukx細胞中瞬時表達，表達的方法與實施例4所述的方法類似。對得到的培養上清液進行ELISA分析，結果顯示20個突變體中有19個能夠瞬時表達。對照物和突變體的瞬時表達水平的範圍是0-1.95μg/ml，平均值為0.59μg/ml，中值為0.5μg/ml，模擬轉染重複確認為0μg/ml。
FSH單突變體的形態分析在允許完整FSH異二聚體與自由α-和β-亞基分離的非還原性LDS PAGE條件下，通過電泳分析來自FSH單突變體瞬時表達得到的濃縮培養上清液等分試樣。將蛋白質電泳轉移到PVDF並用針對FSH α-和β-亞基的初級抗體加以分析。預先篩選以測試購買的大量不同初級抗體，有時在測試後再作確認分析，但最有用的初級抗體證明是1.5μg/ml Chromaprobe BHS 104(生物素化的多克隆山羊抗FSHα-亞基)和1.5μg/ml Chromaprobe BHS 105(小鼠單克隆抗FSH β-亞基)。
兩種附加型式的形態分析加上異二聚體-完整樣品的蛋白質印跡。用蛋白質印跡分析異二聚體-解離樣品以及用放射自顯影法分析帶有代謝標記35S-Cys的突變體和對照物的電泳分離異二聚體-解離免疫沉澱物。
在19個可表達的FSH突變體中，由亞基或異二聚體的表觀分子量分布遷移證明，只有5個突變體表現出糖基化程度增大。該5個表現出糖基化程度增大的突變體包括一個α-亞基和四個β-亞基，包括βE55N/V57T在內。
有趣的是，α-亞基突變體αH83N的糖基化沒有增大，但似乎可導致蛋白質群的異二聚體豐度相對於在相同瞬時條件下共表達的野生型FSH亞基的異二聚體豐度高。
瞬時表達的FSH單突變體的半衰期將由瞬時表達獲得的包括βE55N/V57T在內的5個高度糖基化單突變體的藥物動力學與Gonal-F進行比較。Gonal-F是FSH的一種重組形式，不易將它與天然hFSH區分開來。由ELISA定量測定每個PK實驗的注射物質中以及注射後在預定時間收集到的大鼠血清樣品中的FSH含量。包括β亞基突變體E55N/V57T在內的5個單突變體中沒有一個的半衰期比對照Gonal-F的半衰期長。
單一位點糖基化突變體的純化和分析使4個高度糖基化β亞基單突變體中3個突變體(包括E55N/V57T突變體)表達並通過免疫親和色譜法純化。將包括E55N/V57T突變體在內的該3個高度糖基化β亞基突變體的體外活性與重組FSH進行比較，觀察在(i)上和125I放射標記的FSH競爭與含有人FSH受體(Ki)的膜製劑結合的能力以及刺激產生與FSHR偶合的cAMP的能力(EC50)KiEC50βE55N/V57T 8.6×10-10M3.9×10-11MrhFSH 4.8×10-10M1.2×10-11M上述結果顯示，β-亞基突變體E55N/V57T具有與野生型FSH相當的體外活性。事實上，該3個β-亞基單突變體每一個的體外活性都比得上野生型FSH。此外，對純化的β-亞基單突變體作質譜分析，顯示這3個突變體中每一個的質量分布都發生遷移。不過，在靜脈注射單劑給予未發育成熟的雌性大鼠之後測定純化蛋白質的藥物動力學時，沒有一個糖基化突變體的半衰期是大大延長的。rhFSH的半衰期為3.8±0.6h，βE55N/V57T的半衰期是4.8±0.4h。
實施例2 雙糖基化突變體的生產和分析由於單獨α-和β-亞基的單突變體無法提高FSH的半衰期，所以在瞬時表達中將2個α-亞基單突變體與3個β-亞基單突變體結合，構建6個不同雙突變體，包括GM-1，它包括α-亞基突變體H83N和β-亞基突變體E55N/V57T。
6個雙突變體中有5個(包括GM-1)能夠表達。對可表達的5個雙突變體進行分析，分析它們刺激產生與FSHR偶合的cAMP的能力。該5個雙突變體中每一個，包括GM-1在內，在體內刺激與FSHR偶合的cAMP產生的能力比得上rhFSH。
將該同樣的5個FSH雙突變體的藥物動力學與重組hFSH和CTP-FSH進行比較。表1的結果顯示，GM-1的半衰期遠遠大於rhFSH，接近CTP-FSH。
表1-藥物動力學

考慮到β-亞基單突變體E55N/V57T本身對半衰期沒有作用，故GM-1具有延長的半衰期就令人驚訝了。另外，α-亞基突變體H83N不會增大糖基化，所以GM-1的半衰期延長就更令人驚訝了。
實施例3 GM-1的產生將人FSH的α-和β-亞基的cDNA亞克隆到pDONR載體(Invitrogen)。採用QuikChangeTM定點誘變試劑盒(Stratagene)把N-聯糖基化位點導入FSH的α-和β-亞基內。QuikChangeTM系統使用兩個含有所希望的突變的合成寡核苷酸引物。採用以下成對的寡核苷酸導入N-聯糖基化位點表2-寡核苷酸

運用ABI PRISM BigDyeTMTerminator v3.0 Ready Reaction CycleSequencing Kit測序試劑盒確認突變體的序列，然後用ABI PRISM 310 GeneticAnalyzer分析儀進行分析。
運用GatewayTM克隆技術(Invitrogen)，將αH83N和βE55/V57T突變體亞克隆到修飾的pCI表達載體中，得到質粒p13251和p13252，見圖1和圖2。pCI哺乳動物表達載體預先已經用GATEWAY載體轉化系統(Invitrogen)轉化為GATEWAY目的載體。pCI表達載體含有用於調節插入基因表達的人細胞巨化病毒即刻早期增強子/啟動子、用於啟動表達的基因內含子上遊、以及用於終止轉錄的來自插入基因的猿病毒40後期聚腺苷酸化信號下遊。
還將αH83N突變體亞克隆到Dα載體中，得到質粒p13538，見圖3。Dα載體是pCLH3AXSV2DHFR的衍生物。把該載體修飾成包括異源內含子，該內含子帶有用合成剪接供體改造的促性腺激素α亞基基因內含子A的2kbXbaI-PstI片段上遊(含有剪接受體)。所述異源內含子位於啟動子與XhoI克隆位點之間，把它放在RNA轉錄物5』未翻譯區內。Dα載體的詳細描述可參見Kelton等的文獻(Mol Cell Endocrinol 89141-151(1992))。
實施例4 突變的FSH的表達使p13251(αH83N)和p13251(βE55/V57T)共轉染，在無血清培養基中瞬時表達促性腺激素，首先得到FSH的GM-1糖基化突變體(「GM-1 Lot 1」)。對於大規模lipofectamine轉染試劑介導的轉染(12-24 T175瓶)，轉染之前需要在生長培養基(MEM a(+)，10％FBS，1％L-谷醯胺)中接種CHO-Dukx細胞18至24小時，為1.3×107細胞/瓶。轉染細胞要大批製備lipofectamine2000/Optimem mix混合物(一份17.6)，並且還要用33mcg DNA為每個T175瓶每個亞基(共66mcg)製備一批在Optimem中的DNA。將Optimem/DNA與Optimem/Lipofectamine製劑混合20分鐘之後，向最新加入的(43.8ml/瓶)細胞單層施加在Optimem中的DNA/Lipofectamine複合物(約10ml/瓶)。保持37°4至6小時，把該細胞單層加到50ml生長培養基中。轉染後約24小時，將細胞轉染到生產培養基(加入了L-谷醯胺的Sigma CHO PFM，或者轉移到Serono專有配方Sigma CHO PFM C0234)中。48小時後收穫條件生產培養基。
實施例5 突變的FSH的克隆原克隆(Protoclones)運用標準方法使CHO-DUKX細胞與在Dα中的αH83N(質粒#13538)以及在pCIattR中的βE55N/V57T(質粒#13252)(兩種突變體比率為1∶3)進行磷酸鈣共轉染。在選擇培養基(MEMα(-)，10％dFBS，4mM L-谷醯胺)中接種細胞，96孔板中每孔10,000個細胞(共1596個孔)，轉染後48小時產生原克隆。大約2星期之後，細胞按1∶8分裂到含0.02μM MTX的選擇培養基中。在6至8星期時間內，提高MTX的濃度(0.1μM(192孔)、0.5μM、1.0μM(116孔))，重複此分裂過程，在1.0μM MTX中有116個原克隆存活。
從96孔板(在1.0μM MTX中，10％FBS)取24h表達樣品，以DSL ELISA評價該116個原克隆的表達。表達水平的範圍是超刻度低值至3.72μg/ml。將最高表達水平的17個原克隆在24孔板、T25瓶中擴增，然後低溫保存每個原克隆，每個一組，每組3個小瓶。解凍頭2個原克隆，按T25規模擴增以便確認表達。GM1-21和GM1-22的容積產率分別是1.74和0.74μg/ml，比產率分別是5.06和1.28pcd。基於這些結果，選取GM1-21進行克隆，並且在滾瓶中生產第二批GM-1，參見實施例6所述。
克隆使96孔板分別接種，至0.25、0.5、1.0和2.0 GM-1-21細胞/孔，從而啟動限制性稀釋克隆。克隆培養基是無MTX的含10％cFBS和1％L-谷醯胺的DMEM/F12。用顯微鏡檢查全部孔，消除含多個細胞的任何孔。
生長大約2星期之後，在24孔板以及最後在T25瓶中擴增細胞群。一旦細胞到80-100％的匯合，用DSL FSH ELISA測定容積產率(樣品含10％FBS)。使最佳的8個克隆在T75瓶中擴增，測定24h容積表達和比表達。每個克隆一組，每組3個小瓶，低溫保存在含10％cFBS、1％L-谷醯胺和10％DMSO的DMEM/F12中。CHO-B1-GM1-21-98的容積產率是7.21μg/ml，比產率是6.25pcd。相反，CHO-B1-GM1-21-107的比產率最高，為7.71pcd，容積產率為5.81μg/ml。
使CHO-B1-GM1-21-98和CHO-B1-GM1-21-107在4個T175瓶中擴增。當到達大約90％匯合時，將pre-MCB(每個克隆25個小瓶)低溫保存在含10％FBS、1％L-谷醯胺和10％DMSO的DMEM/F12中。每小瓶的GM1-21-98(第7代)含有3.26百萬個細胞，每小瓶的GM1-21-07(第6代)含有6.1百萬個細胞。每庫取一小瓶送至Charles River Laboratories實驗室(Malvem，PA)作GMP測試。這些測試包括PTC支原體、不育、LCMV攻擊的MAP測試、HAP測試、分析異嗜性鼠白血病毒的延伸體外聚焦誘導試驗(Extended In Vitro FocusInduction Assay)、分析鼠白血病毒的延伸XC空斑測定(Extended XC PlaqueAssay)、以及同工酶分析，每個小瓶都接受全部測試。
實施例6 突變的FSH的附加表達參照實施例5所述生長原克隆GM1-21的方法，在2個850cm2滾瓶中生產GM-1(「GM-1 Lot 2」)。本實施例採用無血清生產培養基(DMEM-F12+IFCS)的體積是2600ml。含有大約0.2mg GM-1的小量(13ml)濃縮培養基上清液於-80℃保存在SRBI，這是因為在透析轉移過程中損失了36ml濃縮培養上清液。利用DSL ActiveFSH ELISA進行定量分析，轉化比是1IU＝138ngFSH。
實施例7 突變的FSH的純化樣品製備收穫含有突變FSH的生產培養基，用0.22μm過濾裝置過濾，凍存於-70℃。4℃下解凍培養基中的目標蛋白質，過夜，並採用Ultrasette ScreenChannel TFF裝置、10K Omega膜、P/N OS010C70(Pall Life Science)進行超聲波濃縮。回收保留物，相對於3×5升含有0.5M NaCl的pH7.4 0.1M Tris透析，過夜。回收透析後的蛋白質，經0.22μm濾膜過濾，立即純化或者凍存於-70℃直至純化。
免疫親和純化用抗FSH免疫親和樹脂B5(Serobio)純化糖基化突變體GM-1，每毫升樹脂含有2.2mg抗-FSH抗體。在1.5cm×10cm OmniFit柱中製備10.2ml床體積。預先用含有0.5M NaCl的pH7.4 0.1M Tris平衡樹脂。以1ml/分鐘的速率裝載透析後的粗蛋白質。依次用5柱體積含0.5M NaCl的pH7.4 0.1MTris、5柱體積pH7.6 100mM碳酸氫銨洗滌柱，目標蛋白質用18-20柱體積1M NH4OH洗脫。合併含有洗脫蛋白質的餾分，用冰醋酸中和，用Amicon stirredcell裝置和Amicon YM 10膜進行超聲波濃縮。在Pierce Snakeskin透析管10KMWCO中相對於4×5升水透析保留物，透析時間為24小時。回收透析後的蛋白質，通過Centriprep YM 10濃縮至體積大約1ml。
特性分析對於異二聚體純度為73.8-80.6％，通過此單一步驟免疫親和方法回收純化蛋白質GM-1的表觀回收率是31.4-52.9％，蛋白質的濃度由胺基酸組成分析確定，其中分子量根據亞基的MALDI-TOF糖型分布最初估計是35,000 Da。
通過N-末端肽測序來確認蛋白質的特性。在GM-1中鑑定到的全部N-末端序列反映FSH的α-亞基或β-亞基末端。雖然不能夠確定可用銀染色看到的單一低豐度蛋白質帶的特性，但是數據仍然與亞基純度≥80％相一致。
實施例8 突變的FSH的形態為了測定純化蛋白質的糖型分布，對GM-1和Gonal-F進行MALDI-TOF質譜分析。質譜分析結果示於圖4A，由此圖可見，GM-1中含有高度糖化形式的質量等級(mass class)的相對豐度比Gonal-F高26％，其中，GM-1含有總共36.8％亞基糖型，而Gonal-F含有29.2％亞基糖型。Gonal F與GM-1的MALDI-TOF質譜之差異與通過銀染色的PAGE以及蛋白質印跡(圖4B)觀察到的亞基和異二聚體的表觀分子量分布遷移是一致的。
在MALDI-TOF質譜條件下，GM-1似乎偏向於保留αβ異二聚體構象，見圖4C，與在Gonal F看到的αα、αβ和ββ二聚體的隨機分布相反。這提示在MALDI-TOF樣品製備條件下GM-1的解離比Gonal-F少，與GM-1異二聚體可能有更高的熱力學和動力學穩定性相符。設計了一個GM-1糖基化模型，通過雙觸角、巖藻糖基化、二唾液酸化糖型不分等級地隨機佔據完全無糖基化亞基的6個位點，隨機佔據呈二元分布，將該模型與觀察到的質譜作比較。結果顯示，端點級(α0)的佔據率比預期高(0.021 vs 0.0)，(α1或β0)級的佔據率比預期低(0.095 vs 0.214)，(α2或β1)級的佔據率比預期高(0.516 vs 0.428)，(α3或β2)級的佔據率比預期高(0.312 vs 0.285)，β3級的佔據率比預期低(0.056 vs0.071)。
實施例9 突變的FSH的分析突變的FSH的體外結合用FSHR cAMP試驗測定GM-1 Lot1和GM-1 Lot2的功效。使大批重組地表達人FSH受體或人LH受體的CHO細胞系在pH7.4 0.025M Tris(含有0.25M蔗糖、10mM MgCl2、1mM EDTA以及千分之一Sigma蛋白酶抑制劑雞尾酒(p8350))中生長，並通過氮氣空化作用(20分鐘內平衡至900psi，然後快速釋放壓力)使其分裂。待初步澄清後(10min×1000xg，4℃)，超離心使膜餾分沉澱(60min×100,000xg，4℃)。將膜餾分重懸於結合緩衝液(pH7.40.01M Tris，含有5mM MgCl2)中，以Bradford(BioRad)蛋白質檢測法估算蛋白質濃度，凍存於-80℃以備將來使用。一般地，每孔取15μg適當帶有FSHR或LHR的膜蛋白進行競爭試驗作分析。
評價96孔板(100μl/樣品孔)的放射配體結合情況。分析緩衝液是pH7.40.01M Tris，含有5mM MgCl2和0.1％BSA以及0.3nM125I-hCG(分析LHR時)或者0.4nM125I-FSH(分析FSHR時)。用分析緩衝液稀釋競爭GM-1，使其與帶放射標記的配體混合，然後加入帶受體的膜。在500nM無標記hCG或FSH存在下測定非特異性結合。在37℃下搖動平衡90分鐘進行結合。用低蛋白質結合微孔濾膜(Millipore Multiscreen)過濾，終止結合試驗，所述濾膜預先在分析緩衝液中培育。用冰冷結合緩衝液(無BSA的分析緩衝液)洗滌濾孔三次，乾燥，再穿插。運用專門針對125I放射的預先編程檢測窗口在HP CobraII gamma計數器上測量結合放射活性。以單一位點模型和Graph Pad Prizm軟體分析數據。
突變的FSH的體外功能測定上述促性腺激素受體轉染的CHO細胞中產生cAMP的劑量反應曲線，確定GM-1 Lot1和GM-1 Lot2的功能。下表3給出了兩批各自前導蛋白質的豁免鑑定(release qualification)數據
表3-GM-1的體外功能與受體結合特性

實施例10 突變的FSH的穩定性使GM-1無菌等分試樣在4℃保持3個月，進行為期3個月的穩定性研究，測定GM-1生物活性穩定性。抽取該等分試樣中的GM-1，在以下不同時間進行FSHR cAMP試驗對其進行測試時間0點、7天、32天和91天。在本研究條件下，GM-1在4℃儲存91天，其EC50變化少於2倍。這些數據表示，4℃儲存GM-1，其生物活性可穩定地保存長達3個月。
實施例11 突變的FSH的活性圖5所示為GM-1在未發育成熟大鼠2日排卵誘導模型中的性能。給予單劑重組hFSH無法引起排卵反應，但給予單劑GM-1就能夠引起排卵反應。此外，在標準Steel-man Pohley卵巢增重試驗中，GM-1的性能與Gonal-F相若(數據未示出)。
圖5測試用的劑量是6、12和24 IU FSH。在此模型中以單劑、10 IU、三劑方案(4×25％、2×50％和1×100％)測試FSH-CTP(Organon 36286)，觀察到每隻動物的平均卵巢數目分別是16.3±3.8、19.1±3.6和21.5±3.9(數據未示出)。由以上數據可見，以1×100％給予12 IU GM-1可引發排卵反應，每隻動物平均產生9.4±2.1卵子(給予6 IU產生6.8±1.6卵子/動物，給予24 IU產生14.6±3.6卵子/動物)。這些數據也證實了通過調節劑量方案，GM-1有可能趨向於產生「單一排卵」或更容易受控。
序列表110L.加羅內(Garone，Louise)S.阿金斯託(Arkinstall，Steven)W.布龍迪克(Brondyk，William)R.坎貝爾(Campbell，Robert)江旭亮(Jiang，Xuliang)S.麥肯納(McKenna，Sean)M.泰珀(Tepper，Mark)120FSH糖基化突變體13005558.00003.PZUS001608170PatentIn版本3.2210121192212PRT213智人(Homo sapiens)4001Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro1 5 10 15Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys20 25 30Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu35 40 45Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser50 55 60Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr65 70 75 80
Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser85 902102211111212PRT213智人(Homo sapiens)4002Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu1 5 10 15Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Glu Leu Val Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu100 105 110210321192212PRT213人工序列
220
223alpha亞基突變體H83N4003Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro1 5 10 15Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys20 25 30Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu35 40 45Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser50 55 60Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr65 70 75 80Ala Cys Asn Cys Ser Thr Cys Tyr Tyr His Lys Ser85 902104211111212PRT213人工序列220
223beta亞基突變體E55N/V57T4004Asn Ser Cys Glu Leu Thr Asn Ile Thr Ile Ala Ile Glu Lys Glu Glu1 5 10 15
Cys Arg Phe Cys Ile Ser Ile Asn Thr Thr Trp Cys Ala Gly Tyr Cys20 25 30Tyr Thr Arg Asp Leu Val Tyr Lys Asp Pro Ala Arg Pro Lys Ile Gln35 40 45Lys Thr Cys Thr Phe Lys Asn Leu Thr Tyr Glu Thr Val Arg Val Pro50 55 60Gly Cys Ala His His Ala Asp Ser Leu Tyr Thr Tyr Pro Val Ala Thr65 70 75 80Gln Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp Cys Thr Val85 90 95Arg Gly Leu Gly Pro Ser Tyr Cys Ser Phe Gly Glu Met Lys Glu100 105 110210521126212DNA213人工序列220
223alpha H83N突變生成oligo 14005cacacggcgt gcaactgcag tacttg26210621126212DNA213人工序列220
223alpha H83N突變生成oligo 2
4006caagtactgc agttgcacgc cgtgtg 26210721149212DNA213人工220
223beta E55N/V57T突變生成oligo 14007gcactctcac tgtttcatat gtcaggttct tgaaggtaca tgttttctg 49210821149212DNA213人工序列220
223beta E55N/V57T突變生成oligo 24008cagaaaacat gtaccttcaa gaacctgaca tatgaaacag tgagagtgc 49
權利要求
1.一種突變的FSH，其中α-亞基包含SEQ ID NO3所示的序列，β-亞基包含SEQ ID NO4所示的序列。
全文摘要
本發明描述了一種可用來誘導人病人卵泡生成的新穎FSH突變體，其糖基化程度增大，半衰期延長。所述FSH突變體允許使用較低累積劑量的FSH，就可獲得相同或更好的臨床效果。
文檔編號C07H21/04GK1984926SQ200480032665
公開日2007年6月20日 申請日期2004年9月2日 優先權日2003年9月2日
發明者L·M·加羅內, S·J·阿金斯託, W·H·布龍迪克, R·K·坎貝爾, 江旭亮, S·D·麥肯納, M·泰珀 申請人:應用研究系統Ars股份公司