可中和的hgf表位和與其結合的中和抗體的製作方法

2023-06-14 07:33:11 1

專利名稱：可中和的hgf表位和與其結合的中和抗體的製作方法
技術領域：
本發明涉及抑制HGF(肝細胞生長因子)與其受體結合的HGF的可中和表位，以及抗HGF的中和抗體，其作為單獨試劑通過與所述的可中和的HGF表位結合而能夠中和HGF。
背景技術：
HGF(肝細胞生長因子)是由間質細胞產生的多功能的異二聚體多肽。HGF由含有N端結構域和連接到絲氨酸蛋白酶樣β鏈C端結構域的4個Kringle結構域的α鏈組成(參見圖1)。人HGF以無生物活性的單鏈前體形式合成，其由728個胺基酸組成，該胺基酸具有在成熟蛋白中不存在的29胺基酸信號肽。生物學活性的HGF通過特異的細胞外血清絲氨酸蛋白酶在R494殘基切割而獲得。這樣獲得的活性HGF是具有全部活性的異源二聚體，其由二硫鍵連接的69kDa的α鏈和34kDa的β鏈組成。然而，目前還不清楚HGF全面的三級結構，並且也沒有闡明究竟是這些結構中的哪一個對HGF的特異功能起作用(Maulik等，Cytokine Growth Factor Reviews 13(1)1-59，2002)。
HGF與其受體Met的結合誘導多種細胞類型的生長和分布，介導上皮間質細胞的轉移以及管和腔的形成，並促進血管發生。Met和HGF基因敲除的小鼠都是胚胎致死的並表現出在胎盤，胎肝和肢/肌肉形成的發育缺陷(Cao等，PNAS 98(13)7443-7448，2001，Gmyrek等，AmericanJournal of Pathology 159(2)579-590，2001)。
Met首先作為人致癌基因trp-met的產物而被分離，其編碼具有轉化活性的修飾的(altered)組成型活性的蛋白激酶。Met活性還體現在能顯著增強癌症物質從其刺激影響的突起處轉移擴散，例如血管發生，細胞遷移以及細胞表面蛋白酶調控(Wielenga等，American Journal ofPathology 157(5)1563-1573，2000)。由於Met被報導在多種人肝、前列腺、結腸、乳腺、腦和皮膚的癌症中過量表達(Maulik等，見上)，其被視為重要的預防和治療癌症的靶分子。而且，據報導，瘧疾的感染通過分泌的HGF而依賴於HGF受體的活性，因此，HGF及其受體被認為是預防瘧疾的新方法的潛在的靶分子(Carrolo M等，Nat.Med.9(11)1363-1369，2003)。還發現這樣的可能性，即HGF可能與阿爾茨海默症中發生的病理改變相關(Fenton H等，Brain Res.779(1-2)262-270，1998)。此外，還發現HGF明確的參與了增強皮膚傷口癒合的過程，包括再生上皮形成，新生血管和顆粒組織形成(Yoshida S等，J.Invest.Dermatol.120(2)335-343，2003)。
同時，在癌症的發展和擴散中發揮關鍵作用的腫瘤相關生長因子或細胞因子及其受體的選擇性中和是具有吸引力的開發抗腫瘤藥物的策略。最近，使用諸如組合的抗體文庫的噬菌體展示的重組抗體技術已經開發了用於這些靶分子的多種治療單克隆抗體(mAbs)，例如赫賽汀Herceptin，以及抗促血管生成素(angiopoietin)人單抗。
眾所周知，抗HGF的多克隆抗體封閉了HGF的多種生物學功能。另外，最近報導，在動物模型中，抗HGF的中和單抗的混合物顯示出抗腫瘤的活性(Cao等，PNAS 198(13)7443-7448，2001)。特別的，Cao等發現為了在體內和體外抑制HGF活性，需要阻斷三或更多的表位，可能兩個用於Met受體並且一個用於肝磷脂，在體外實驗中，至少3個單抗的混合物能夠中和HGF。
然而，作為單一試劑的能中和HGF並在體外抑制細胞擴散的單克隆抗體還未見報導。
發明概述因此，本發明的目的是提供抑制HGF和其受體結合的可中和的HGF表位。
本發明其它的目的還提供編碼所述可中和表位的多聚核苷酸；抗HGF的中和抗體，其作為單一試劑通過與所述可中和表位的結合而能夠中和HGF；所述中和抗體在預防和治療頑固疾病和癌症中的用途；用於預防和治療頑固疾病和癌症的包括所述中和抗體和藥學可接受載體的藥學組合物；用於預防和治療頑固疾病和癌症的方法，其包括將所述中和抗體給藥於患者。
根據本發明的一個方面，提供含有SEQ ID NO32或33的胺基酸序列的可中和的HGF表位。
根據本發明的另一個方面，提供抗HGF的與所述可中和的表位結合的中和抗體，其包括含有SEQ ID NO27或29的胺基酸序列的VH區和含有SEQ ID NO28或30的胺基酸序列的VL區。


當通過下述說明書與附圖聯合描述時，本發明的上述和其它目的和特徵將變得顯而易見，所述附圖分別表示圖1HGF的結構圖2用於抗體文庫構建的噬菌粒載體pComb3X的基因圖譜A在噬菌粒表面展示Fab的情況B在噬菌粒表面展示scFv或微型雙功能抗體(Diabody)的情況，圖3在培養HGF結合克隆的過程中，通過淘選(panning)富集展示特異結合HGF的Fab的噬菌體庫，圖4用考馬斯亮蘭檢測的純化的Fab片段的結果，1標記，2非還原克隆68抗體(50,000Da)3.還原克隆68抗體(25,000Da)圖5蛋白印跡分析的結果，以檢測純化的Fab片段是否表達，圖6含有本發明的可中和的表位的噬菌體與c-MET結合的水平，1.含有SEQ ID NO32肽的噬菌體，2.含有SEQ ID NO33肽的噬菌體，3和4.不含有SEQ ID NO32或33肽的對照噬菌體，圖7克隆61和68Fabs分別與HGF的特異結合，圖8克隆61和68分別限定的本發明的可中和的表位的構象依賴性A克隆61
B克隆68，泳道1非還原HGF，泳道2還原HGF圖9a表示範圍為1級到6級的細胞擴散水平的標準圖9b擴散鑑定的結果，顯示隨著加入的HGF濃度，抗HGF Fab和抗人Fab抗體的擴散水平的改變，圖10隨著注入克隆68抗體的量，與固定在CM5傳感器晶片上的HGF結合的克隆68抗體的量增加I非特異Fab的注入II注入50nM克隆68抗體III注入100nM克隆68抗體IV注入200nM克隆68抗體V注入400nM克隆68抗體VI注入600nM克隆68抗體圖11克隆68抗體抑制HGF與c-Met的結合，I注入50nM的HGFII注入與50nM克隆68抗體混合的50nM的HGFIII注入與250nM克隆68抗體混合的50nM的HGFIV注入與500nM克隆68抗體混合的50nM的HGFV注入與1uM克隆68抗體混合的50nM的HGFVI注入與1.5uM克隆68抗體混合的50nM的HGF圖12可溶的c-Met抑制HGF與c-Met的結合I注入50nM的HGFII注入與50nM可溶的c-Met混合的50nM的HGFIII注入與100nM可溶的c-Met混合的50nM的HGFIV注入與200nM可溶的c-Met混合的50nM的HGFV注入與400nM可溶的c-Met混合的50nM的HGFVI注入與600nM可溶的c-Met混合的50nM的HGF
發明詳述如這裡所使用的，術語「可中和的表位」包括任何蛋白決定簇，其能夠抑制HGF與其受體c-Met的結合。表位決定簇通常由諸如胺基酸或糖側鏈的具有化學活性的表面分子基團組成，並通常具有特異的三級結構特徵，以及特異的電荷特點。優選，本發明的可中和的表位是包含SEQ ID NO32或33的胺基酸序列的多肽。
術語「中和抗體」指能夠特異結合HGF可中和的表位的抗體，並且充分地抑制或消除HGF的生物活性。典型的中和抗體將能至少抑制此HGF生物活性的大約50％，優選大於80％。本發明的中和抗體在治療應用，即預防或治療頑固疾病和癌症中特別有用。
本發明提供含有SEQ ID NO32或33的胺基酸序列的多肽，其功能是作為HGF的可中和的表位。
為了製備根據本發明的HGF的可中和的表位，實施ELISA方法檢測是否來自用HGF免疫的動物的抗血清能夠與重組的人HGF結合；並且該方法顯示來自HGF免疫動物的抗血清特異地與HGF結合。然後，提取HGF免疫動物的總RNA並進行cDNA合成。
為了擴增含有兔輕鏈(VL)(Vκ，Vλ)和重鏈(VH)的可變區以及含有人Cκ和CH1的保守區，通過使用合成的cDNA作為模板和結合SEQ ID NO1到20的引物而實施PCRs，然後，通過使用上述獲得的PCR產物作為模板而擴增兔/人輕和重鏈的嵌合抗體。在擴增的兔VL和VH序列與擴增的人Cκ和CH1序列結合之後，最終編碼抗體片段(Fab)文庫的PCR產物克隆進表達載體，並將得到的載體轉染宿主細胞，例如大腸桿菌，以構建嵌合的兔/人Fab文庫。本發明中使用的載體和宿主細胞包括本領域中常規使用的所用的表達載體和大腸桿菌菌株而沒有限制，但優選使用噬菌粒載體pComb3X(Scripps研究中心，CA，USA)作為表達載體和大腸桿菌ER2537(NEB)作為宿主細胞。
使用HGF包被的ELISA板和抗人山羊Fab多克隆抗體而通過EIA方法選擇含有抗HGF Fab的噬菌體克隆。上述選出的噬菌體克隆命名為H61(克隆61)和H68(克隆68)。
分別對H61和H68克隆進行核酸測序，並通過分析核酸序列確定其胺基酸序列。在本發明一個優選的實施方案中，根據染料標記引物測序方法實施核酸測序(Chung等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.128641-649，2002)。結果發現，H61克隆包括分別含有SEQ ID NOs23和24核苷序列的VH和VL區；而H68克隆包括分別含有SEQ ID NOs25和26核苷序列的VH和VL區。
從分析的核苷序列得出的H61和H68克隆的VH和VL區分別的胺基酸序列提示H61克隆包括含有SEQ ID NOs28的胺基酸序列的VH區和含有SEQ ID NOs28的胺基酸序列的VL區，而H68克隆，VH區含有SEQID NOs29的胺基酸序列和VL區含有SEQ ID NOs30的胺基酸序列。
對H61和H68克隆的胺基酸序列中結構區(FR)和互補決定區(CDR)分析顯示，H61和H68克隆的每個VH和VL區含有4個FRs和3CDRs(參見表2)。
為了確定HGF的可中和的表位，通過使用組合肽文庫的噬菌體展示通過淘選富集H61和H68克隆，使用抗HGF H61 Fab或抗HGF H68Fab和抗HGF H61 Fab-或抗HGF H68 Fab-包被的ELISA板對如此擴增的噬菌體庫進行EIA檢測。然後選擇對抗HGF H61和H68 Fabs顯示有結合親和性的噬菌體克隆。在本發明的優選實施方案中，使用PHD肽庫(New England Biolab)作為肽庫。
選出的噬菌體克隆進行核苷測序，而從分析的核苷測序推斷出的胺基酸序列含有SEQ ID NO32和33的胺基酸序列，其被發現與c-MET結合(參見圖6)。這些結果提示抗HGF抗體H61或H68的抗原結合位點模仿了c-MET的HGF結合位點，結合抗HGF抗體H61或H68的SEQID NO32和33的肽模仿了HGF的c-MET結合位點。因此，本發明的SEQID NO32和33的肽能夠具有作為HGF可中和的表位的功能。
另外，本發明提供編碼所述可中和的表位的多聚核苷酸。特別地，所述可中和的表位含有SEQ ID NO34或35的核苷序列。
此外，本發明提供抗HGF的中和抗體，其通過結合作為HGF可中和的表位的SEQ ID NO32或33的肽而能夠中和HGF。
本發明的中和抗體可以是嵌合抗體，單克隆抗體或人源化抗體。
嵌合抗體是包含人或非人部分的免疫球蛋白分子。特別地，嵌合抗體的抗原結合區(可變區)來自非人源(例如小鼠、兔、家禽)，而賦予免疫球蛋白生物效應器功能的嵌合抗體的保守區來自人源。嵌合抗體應該含有非人抗體分子的抗原結合特異性和由人抗體分子賦予的效應器功能。
一般而言，用於製備嵌合抗體的方法包括下述步驟a鑑定和克隆編碼抗體分子抗原結合區的正確的基因片段，(對於重鏈已知為VDJ，可變區，多變區和連接區，或對於輕鏈已知為VJ，可變區和連接區或對於可變區簡單的為V的上述片段)可以是cDNA或基因組形式；b克隆編碼保守區或其期望片段的基因片段；c連接可變區和可變區，以便完整的嵌合抗體以能夠轉錄和翻譯的形式編碼；d將構建子連接到含有選擇性標記和諸如啟動子、增強子和poly(A)附加信號的載體；e擴增載體並將其導入真核細胞(轉染)，通常為哺乳動物淋巴細胞；f選擇表達選擇標記的細胞g篩選表達期望嵌合抗體的細胞h檢測抗體的適合的結合特異性和效應器功能。
單克隆抗體指分離自單個克隆的抗體，包括任何真核、原核或噬菌體克隆。單克隆抗體可以包括或由兩個蛋白組成，即重鏈和輕鏈。可以使用本領域已知的多種技術中的一種製備單克隆抗體，包括使用雜交瘤、重組和噬菌體展示技術或其組合。
人源抗體指分子的CDRs(互補決定區)來自非人物種免疫球蛋白，並且抗體分子的其餘部分主要來自人免疫球蛋白。這裡使用的術語「抗體」，除非特別指明，廣泛的用作指抗體分子和抗體衍生的分子。這些抗體衍生的分子包括至少一個可變區(可變區的重鏈或輕鏈)並包括分子，例如Fab片段，Fab』片段，F(ab』).sub.2片段，Fd片段，Fab』片段，Fd片段，Fabc片段，Sc抗體(單鏈抗體)，雙功能抗體，個體抗體輕鏈，個體抗體重鏈，在抗體鏈和其它分子中嵌合的融合。
特別地，本發明提供作為抗HGF的中和抗體的兔/人嵌合抗體。本發明的中和抗體包含SEQ ID NO27的VH區和SEQ ID NO28的VL區或SEQ ID NO29的VH區和SEQ ID NO30的VL區。
可以採用MDCK2擴散方法檢測中和抗體是否發揮中和活性(Cao等，PNAS 98(13)7443-7448，201)。在用2ng/ml的HGF(29pM)處理的MDCK2細胞情況中，本發明的中和抗體顯示出當抗HGF Fab與HGF的摩爾比為50∶1，抗人Fab與HGF的摩爾比的範圍為50∶1到100∶1時，獲得最高的擴散抑制活性(參見圖9)。這些結果第一次顯示至少在體外，僅僅對一個表位的封閉對於中和HGF是充分的，而區別於Cao的抑制MDCK2細胞擴散需要中和至少三個表位的報導(Cao等，見上)。另外，本發明顯示這樣的事實，即僅僅當結合可中和表位的抗體是二價或更高時，中和抗體發揮其中和活性，這提示同樣的可中和表位可以存在於HGF的兩個或更多個的位點。
也可以用EIA檢測抗HGF Fab對HGF的結合親和性，68克隆對HGF與c-Met結合的的抑制活性和可溶的c-Met對HGF與c-Met結合的抑制活性。隨著注入克隆68抗體的量，與固定在傳感器晶片上的HGF結合的克隆68抗體的量增加(參見圖10)，並且隨著克隆68抗體的濃度的增加，HGF與c-Met結合的量減少(參見圖11)。另外，隨著可溶c-Met濃度的增加，與固定在傳感器晶片上的c-Met結合的HGF的量減少(圖12)。
上述結果顯示本發明的中和抗體可作為能中和HGF的單一試劑。
因此，本發明進一步提供包括有效劑量的本發明中和抗體和藥學可接受載體的藥物組合物，其用於預防和治療由HGF與其受體結合所引起的頑固的疾病和癌症。此外，本發明提供通過使用本發明中和抗體而用於預防和治療頑固疾病和癌症的方法。優選地，癌症包括但不局限於，多種人肝，前列腺，結腸，乳腺，腦和皮膚的癌症，並且頑固疾病包括那些通過HGF與其受體c-Met結合引起的疾病，包括但不局限於瘧疾，阿爾茲海默症等等。
本發明的藥物配方可以結合任何一個常規的方法而製備。在製備配方中，有效成份優選使用載體混合的或稀釋的。合適的載體，賦性劑或稀釋劑是乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，澱粉，阿拉伯樹膠，藻酸鹽，白明膠，磷酸鈣，矽酸鈣，纖維素，甲基纖維素，微晶纖維素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羥基苯甲酸甲酯(Methylhydroxybenzoate)，羥基苯甲酸丙酯(propyl hydroxybenzoate)，滑石，硬脂酸鎂和礦物油。配方還可以包括填充料，抗粘劑，潤滑劑，溼潤劑，芳香劑，乳化劑，防腐劑等等。本發明的組合物通過使用本領域熟知的任何一種方法配製，以便當其對患者給藥後，能構提供活性成份迅速，持續或延遲的釋放。
本發明的藥學配方可以通過注射給藥(例如肌肉注射，靜脈注射，腹腔注射，皮下注射)，或通過其它方法，例如灌注以便確保以有效的形式遞送到血流。藥物配方還可以通過瘤內，瘤周，病灶內或病灶旁途徑給藥，以發揮局部和全身治療效果。局部或靜脈注射是優選的方式。
為了治療人類患者，作為有效成份的本發明中和抗體的典型一日劑量的範圍是大約0.1到100mg/kg體重，優選1到10mg/kg體重，其可以作為一次劑量或均分的劑量給藥。然而，可以理解的是實際上活性成份的給藥劑量應該根據多種相關因素而決定，這些因素包括治療的疾病，選擇的給藥途徑，年齡，性別和個體患者的體重，以及患者症狀的嚴重性，因此，上述劑量將不會在任何方面限制本發明的範圍。
本發明進一步提供下述實施例進行說明。需要理解的是，顯示本發明優選實施方案的這些實施例，僅僅以說明本發明的方式給出。從上述討論和這些實施例，本領域技術人員能夠在不偏離其領域和範圍下確定本發明的必要特徵，能對本發明進行多種改變和修飾以適合不同的用途和條件。
實施例1HGF免疫和抗體文庫構建經過4到5個月的時間，通過間隔3周的5次HGF皮膚注射免疫2隻紐西蘭白兔(RD系統，USA)，HGF分散在MPL(單磷醯脂A，分離自″S.minnesota再次突變(remutants)的高度精練的無毒脂A)+TDM(合成的海藻糖(dicorynomycolate)，來自結核桿菌索狀因子(Cord factor)的海藻糖雙分枝菌酸的類似物)+CWS(細胞壁骨架，來自分枝桿菌去蛋白和去脂質額細胞壁)佐劑中(Sigma)。通過使用辣根過氧化物酶偶聯的抗兔Fc山羊多克隆抗體(Pierce)的ELISA方法檢測來自免疫動物的抗血清對重組人HGF的結合(RD系統或Research DiagnosticsInc.)。結果發現，雖然在HGF免疫之前獲得的抗血清基本不與HGF結合，然而在5次皮膚注射後獲得的抗血清特異的與HGF結合。
在最後增強之後的幾天，從免疫動物分離脾臟和骨髓，並使用TRI試劑(Molecular Reaserch Center，Cincinnati，USA)和氯化鋰沉澱製備總RNA。使用SUPERSCRIPT Preamlification系統和寡(dT)引物(LifeTechnologies，Inc.)合成第一鏈cDNA。
根據Rader等描述的方法構建兔/人嵌合抗體庫(Rader C等，J.Biol.Chem.27513668-13676，2000)。
實施例2兔源抗體可變區和人源抗體保守區的擴增(2-1)兔源抗體可變區的擴增為了擴增兔VL(Vκ，Vλ)和重鏈(VH)，通過使用表1描述的引物組合進行PCR.
表1

PCR反應溶液如下製備混合1μl實施例1合成的cDNA模板(大約0.5μg)，60pmol每種引物，10μl 10×PCR緩衝液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，並將終體積調整為100μl。PCR條件是在94℃ 10分鐘預變性後，94℃ 15秒，56℃ 30秒，72℃ 90秒共30個循環，最後在72℃延伸10分鐘。將擴增DNA進行瓊脂糖凝膠電泳並使用Qiaex凝膠提取試劑盒從凝膠中純化。
(2-2)人源抗體保守區的擴增擴增人源抗體保守區的Cκ區的PCR如下實施製備PCR反應溶液，即混合20ng 1μl pComb3XTT載體(Barbas等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1588(18)，7978-82，1991)，60pmol每種引物(SEQ ID NO14和15)，10μl 10×PCR緩衝液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，並將終體積調整為100μl。PCR條件是在94℃ 10分鐘預變性後，94℃ 15秒，56℃ 30秒，72℃ 90秒共20個循環，最後在72℃延仲10分鐘。
同時，擴增人源抗體保守區的CH1區的PCR如下實施製備PCR反應溶液，即混合20ng 1μl pComb3XTT載體(Barbas等，同上)，60pmol每種引物(SEQ ID NO16和17)，10μl 10×PCR緩衝液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，並將終體積調整為100μl。PCR條件是在94℃ 10分鐘預變性後，94℃ 15秒，56℃ 30秒，72℃ 90秒共20個循環，最後在72℃延伸10分鐘。
將擴增DNA進行瓊脂糖凝膠電泳並使用Qiaex凝膠提取試劑盒從凝膠中純化。
實施例3擴增嵌合抗體的輕重鏈(3-1)輕鏈擴增擴增人輕鏈的PCR如下實施製備PCR反應溶液，即混合100ng實施例(2-1)純化的每個PCP產物VL(Vκ，Vλ)和實施例(2-2)純化的PCR產物Cκ，60pmol每種引物(SEQ ID NO18和15)，10μl 10×PCR緩衝液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，並將終體積調整為100μl。PCR條件是在94℃ 10分鐘預變性後，94℃ 15秒，56℃ 30秒，72℃ 120秒共20個循環，最後在72℃延伸10分鐘。
將擴增DNA進行瓊脂糖凝膠電泳並使用Qiaex凝膠提取試劑盒從凝膠中純化。
(3-2)重鏈擴增擴增重鏈的Fd區域(VH和CH1)的重疊PCR如下實施製備PCR反應溶液，即混合100ng實施例(2-1)純化的每個PCP產物VH和實施例(2-2)純化的PCR產物VH1，60pmol每種引物(SEQ ID NO19和17)，10μl 10×PCR緩衝液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，並將終體積調整為100μl。PCR條件是在94℃ 10分鐘預變性後，94℃ 15秒，56℃ 30秒，72℃ 120秒共20個循環，最後在72℃延伸10分鐘。
將擴增DNA進行瓊脂糖凝膠電泳並使用Qiaex凝膠提取試劑盒從凝膠中純化。
實施例4製備嵌合Fab文庫擴增嵌合兔/人Fab基因的PCR如下實施製備PCR反應溶液，即混合100ng實施例(3-1)純化的每個嵌合輕鏈產物和實施例(3-2)純化的嵌合重鏈產物，60pmol每種引物(SEQ ID NO18和20)，10μl 10×PCR緩衝液，8μl 2.5mMdNTP混合物和0.5μl Taq聚合酶，並將終體積調整為100μl。PCR條件是在94℃ 10分鐘預變性後，94℃ 15秒，56℃ 30秒，72℃ 180秒共20個循環，最後在72℃延伸10分鐘。
將擴增DNA進行瓊脂糖凝膠電泳並使用Qiaex凝膠提取試劑盒從凝膠中純化。
在編碼兔VL和VH序列的PCR產物與編碼人Cκ和CH1序列的PCR產物結合之後，編碼抗體片段文庫的終PCR片段進行SfiI消化並克隆到噬菌粒載體pComb3X(Scripps研究中心，CA，USA)(圖2)。通過電轉化將噬菌粒轉化入大腸桿菌ER2537菌株(NEB)。作為融合在噬菌體包被蛋白pIII的導入的噬菌體展示Fab融合蛋白與其DNA形成噬菌體顆粒(基因和多肽作為一個單位)存在於噬菌體DNA。
實施例5選擇含有抗HGF Fab的噬菌體克隆當96孔板(Costar No.3690)每孔包被濃度為10μl/ml的溶解在25μl的TBS的HGF之後，實施例4製備的噬菌體展示Fab加入孔板，孔板在室溫保持2小時，並淘選在孔板中的抗免疫的HGF抗原。使用PBS中的0.5％(v/v)Tween 20洗滌孔板並用0.1M HCl-甘氨酸(PH2.2)洗脫。洗滌步驟從第一個循環的5次增加到第二個循環的10次和隨後循環的15次。實施典型的7循環淘選。隨著淘選進行，特異結合HGF的抗HGF Fab的噬菌體展示庫增加，其在使用HRP-偶聯的抗-M13噬菌體抗體(Pharmacia)和HGF-包被的ELISA板的EIA檢測中，導致顯示HGF結合Fab的吸光率的增加(圖3)。在最後一個淘選循環之後，通過分別使用HGF包被的ELISA板和山羊抗人Fab多克隆抗體(Pierce)EIA方法選擇含有抗HGF Fab的噬菌體克隆。選出的噬菌體克隆命名為H61(克隆61)和H68(克隆68)。相對於背景具有強信號的H61和H68克隆(圖7)進一步進行核苷測序分析。
實施例6篩選噬菌體的核苷測序分析使用SEQ ID NO21和22的兩個測序引物，通過染料標記引物測序方法實施核酸測序(Chung等，J.Cancer Res.Clin.Oncol.128641-649，2002)。結果發現，H61克隆編碼由含有SEQ ID NOs23核苷序列的VH區和含有SEQ ID NOs24的核苷序列的VL區組成的抗HGF Fab；而H68克隆編碼由含有SEQ ID NOs25核苷序列的VH區和含有SEQ ID NOs26的核苷序列的VL區組成的抗HGF Fab組成。
從分析的核苷序列分別得出H61和H68克隆的胺基酸序列。結果發現H61克隆的VH區和VL區分別含有SEQ ID NOs27和SEQ ID NOs28，而H68克隆的VH區和VL區分別含有SEQ ID NOs29和SEQ ID NOs30的胺基酸序列。
根據Harris(Harris等，Protein Science4(2)306-10，1995)描述的方法，作為對H61和H68克隆的胺基酸序列中結構區(FR)和互補決定區(CDR)分析結果，H61和H68克隆含有表2描述的區。
表2

實施例7用於體外實驗的抗HGF Fab的表達和純化將實施例5篩選的克隆的噬菌粒DNAs轉化無抑制因子的大腸桿菌菌株HB2151。克隆生長到A600nm吸光值為0.5到1.0時，使用IPTG(1mM)誘導抗HGF Fab表達20至24小時。使用實驗級TFF系統(Millipore)濃縮培養上清。使用抗HA標籤小鼠單克隆抗體通過親和層析的方法純化濃縮的抗HGF Fab。使用考馬斯亮蘭染色和蛋白質印跡分析純化的Fab片段。
首先，通過加樣到NuPAGE Novex 4-12％ Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上對純化的H68抗體Fab(大約1-3ug)進行電泳。負載的凝膠在考馬斯亮蘭凝膠染色溶液中浸泡(Invitrogen)，搖動30分鐘，轉移至考馬斯亮蘭脫色液中，搖動直到能夠觀察到蛋白條帶。圖4顯示考馬斯亮蘭染色的結果。如圖4所示，在非還原的H68抗體(泳道2)中，大部分的Fab抗體在分子量為50000Da的位置處檢測到；而在還原的H68抗體(泳道3)中，Fab抗體被分別分離在Fd區域的輕鏈和重鏈，因此在分子量為25000Da的位置處檢測到條帶；而其它非抗體的條帶沒有檢測到。由於H68抗體Fab的輕重鏈的大小分別約為25000Da，而通過輕重鏈間的二硫鍵共價連接形成的Fab的大小為大約50000Da的事實，H68抗體Fab被成功的分離並獲得滿意的純度。然而，在泳道2中25000Da位置處的弱帶是由於存在彼此沒有連接的自由的Fab輕重鏈。
同時，為了進行蛋白質印跡，過加樣到NuPAGE Novex 4-12％Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上對純化的抗HGF Fab(大約1-3ug)進行電泳。根據分子量分離的Fab印跡到BioTrace硝化纖維膜上(PALL)。使用5％脫脂奶粉/TBS封閉處理30分鐘。辣根過氧化物酶偶聯的抗人山羊Fab多克隆抗體(Pierce)使用3％脫脂奶粉/TBS按1∶1000的比例稀釋，並與膜搖動反應1小時。使用TBS洗滌膜30分鐘並用等體積的Supersignal West Pico穩定過氧化物溶液(Pierce)和Supersignal WestPico氨基苯二醯一肼/增強溶液(Pierce)的混合溶液基本潤溼膜。在暗室中將膜曝光於X-射線(Kodak)。
圖5顯示了分析純化的Fab片段的表達的蛋白質印跡結果，其中左邊泳道是大小標記，而另一泳道是純化的Fabs。如圖5所示，在相應於50000Da的位置檢測到大量的Fab，在相應於25000Da的位置檢測到游離的輕重鏈Fd區。
實施例8核苷序列分析和HGF可中和的表位的特點(8-1)核苷測序96孔板(Costar No.3690)每孔包被濃度為10μl/ml的溶解在25μl的TBS的抗HGF H61 Fab或抗HGF H68 Fab。PHD肽文庫(重組肽的噬菌體展示文庫)(New England Biolab)加入孔板，然後孔板在室溫保持2小時。使用PBS中的0.5％(v/v)Tween 20洗滌孔板並用0.1M HCl-甘氨酸(PH2.2)洗脫。洗滌步驟從第一個循環的5次增加到第二個循環的10次和隨後循環的15次。實施典型的7循環淘選。在最後一個淘選循環之後，通過使用抗HGF H61 Fab或抗HGF H68 Fab包被的ELISA板和辣根過氧化物藕聯的抗-M13噬菌體山羊單克隆抗體(Roche)的EIA方法選擇含有抗HGF H61 Fab或抗HGF H68 Fab的噬菌體克隆。選出的克隆進行核苷測序，並且從分析的核苷序列確定胺基酸序列。
使用SEQ ID NO31的測序引物，根據染料標記引物測序方法實施核酸測序(Chung等，同上)。結果發現，從分析的核苷序列推導的編碼抗HGF H61和H68 Fabs的肽分別含有SEQ ID NOs32和33的胺基酸序列。
然後，96孔板(Costar No.3690)每孔包被濃度為10μl/ml的溶解在25μl的TBS的c-Met，並且含有SEQ ID NOs32和33的肽的克隆也每個加入。使用PBS中的0.5％(v/v)Tween 20洗滌孔板，辣根過氧化物藕聯的抗-M13噬菌體山羊單克隆抗體(Roche)也加入。
如圖6所示，當分別含有SEQ ID NOs32和33的肽(1和2)的噬菌體與c-Met結合，兩個沒有所述肽的對照噬菌體(3和4)沒有結合。這些結果提示因為抗HGF抗體H68的抗原結合位點模仿了c-MET的HGF結合位點，以及結合克隆68的SEQ ID NO32和33的肽模仿了HGF的c-MET結合位點，所以SEQ ID NO32和33的肽能夠具有作為HGF可中和的表位的功能。
(8-2)特點為了表徵抗HGF抗體的抗原結合位點，如下實施蛋白質印跡。通過加樣到NuPAGE Novex 4-12％ Bis-Tris凝膠(Invitrogen)上對1-3ug HGF進行電泳。此時，一些在經過還原劑處理之後上樣，而其它則不經過上述處理而上樣。根據分子量分離的蛋白印跡到BioTrace硝化纖維膜上(PALL)。使用5％脫脂奶粉/TBS封閉處理膜30分鐘。將抗HGFH61和H68 Fabs加到膜上，然後膜搖動1小時。辣根過氧化物酶偶聯的抗人山羊Fab多克隆抗體(Pierce)使用3％脫脂奶粉/TBS按1∶1000的比例稀釋，並與膜搖動反應1小時。使用TBS洗滌膜30分鐘並用等體積的Supersignal West Pico穩定過氧化物溶液(Pierce)和Supersignal WestPico氨基苯二醯一肼/增強溶液(Pierce)的混合溶液基本潤溼膜。在暗室中將膜曝光於X-射線(Kodak)。
圖8顯示了H61和H68限定的可中和的表位的構象依賴性，其中箭頭代表大小標記；A，克隆61；B，克隆68；泳道1，非還原HGF，泳道2還原HGF。結果發現，克隆61和68與非還原的HGF結合，而不與還原的HGF結合。這些結果提示作為克隆61和68結合位點的抗原決定簇的三級結構，例如表位，對於抗原-抗體反應是關鍵的，並且本發明的可中和的表位具有非線性的結構。
實施例9MDCK擴散試驗MDCK細胞(Madine Darby犬腎細胞；ATCC CCL 34)在補充有5％FCS的DMEM培養基中，37℃，95％空氣和5％二氧化碳的潮溼空氣培養箱中培養。以2×103細胞/孔的濃度將細胞接種於96孔板中，並與新鮮培養基中的2ng/ml(29pM)的HGF孵育過夜。然後，以不同濃度將抗HGF Fab和抗人Fab抗體加入孔板。通過光學顯微鏡監控擴散效果，結果在圖9顯示。圖9a表示範圍為1級到6級的細胞擴散水平的標準，其中6級指HGF引起的擴散效果100％的抑制；5級指HGF引起的擴散效果為從90-100％的抑制；4級指HGF引起的擴散效果為從60-90％的抑制；3級指HGF引起的擴散效果為從30-60％的抑制；2級指HGF引起的擴散效果為從10-30％的抑制；1級指HGF引起的擴散效果為10％以及更少的抑制。圖9b顯示根據加入的HGF濃度，抗HGF Fab和抗人Fab抗體的擴散水平可能改變。
結果發現，當抗HGF Fab與HGF的摩爾比為50∶1，以及時抗人Fab抗體與HGF的摩爾比範圍為50∶1到100∶1時，可以獲得預料的最有效的擴散效果。
實施例10BIAcore檢測(10-1)抗HGF Fab與HGF的親和分析使用BIAcore 3000(BIAcore AB，Uppsala，Sweden)通過SPR(表面等離子共振技術)檢測抗HGF Fab與HGF的結合親和性。
大約，通過胺偶聯方法將HGF的1069共振單位(RU)耦合到CM5傳感器晶片(BIAcore AB)。在含有0.005％表面活性劑P20，25℃流速為30μl/分鐘的PBS緩衝液中進行結合相互作用。用1M NaCl/50mMNaOH再生表面。檢測了動力速率常數(Kon和Koff)以及平衡離解常數(Kd)。圖10顯示抗HGF H68 Fab與HGF的結合親和性。結果發現，隨著抗HGF H68 Fab的濃度，與固定在傳感器晶片上的HGF結合的抗HGFH68 Fab的量增加。
(10-2)抗HGF的克隆68抗體的HGF結合抑制活性的分析為了在實時確定抗HGF H68 Fab能抑制HGF與c-Met結合的事實，通過胺偶聯方法將c-Met耦合到CM5傳感器晶片。然後，分別將HGF以50nM的濃度單獨，與5個不同濃度(50nM，250nM，500nM，1μM和1.5μM)的抗HGF H68 Fab和可溶的5個不同濃度(50nM，100nM，200nM，400nM和600nM)的c-Met預混合注入。在含有0.005％表面活性劑P20，25℃流速為30μl/分鐘的PBS緩衝液中進行結合相互作用。用1MNaCl/50mM NaOH再生表面。
圖11顯示抗HGF H68 Fab抑制HGF與c-Met的結合。結果是，在注入50nM的HGF時，HGF與c-Met的結合為455.5RU(I)，當50nM的HGF與5個不同濃度50nM(II)，250nM(III)，500nM(IV)，1μM(V)和1.5μM(VI)的抗HGF H68 Fab注入時，HGF與c-Met的結合分別為406.5，328，260，111.1和71RU。這些結果提示隨著抗HGF H68 Fab濃度的增加，HGF與c-Met的結合減少。當抗HGF H68 Fab單獨注入時，HGF沒有結合。
(10-3)可溶的c-Met抗c-Met與HGF結合的抑制活性檢測可溶的c-Met是否抑制HGF與c-Met的結合如下進行。通過胺偶聯方法將2979RU的c-Met耦合到CM5傳感器晶片。在含有0.005％表面活性劑P20，25℃流速為30μl/分鐘的PBS緩衝液中進行結合相互作用。用1M NaCl/50mM NaOH再生表面。
圖12顯示可溶c-Met抑制HGF與c-Met的結合。如圖12所示，在注入50nM的HGF時，HGF與c-Met的結合為455.5RU(I)，當50nM的HGF與5個不同濃度50nM(II)，100nM(III)，200nM(IV)，400nM(V)和600nM(VI)的可溶c-Met注入時，HGF與c-Met的結合分別為310.3，225.7，167.4，93.7和70.9RU。這些結果提示隨著可溶c-Met濃度的增加，HGF與耦合到傳感器晶片上的c-Met的結合逐漸減少。
儘管本發明主題的實施方案已經做過描述和解釋，顯而易見的是，在不脫離僅僅被權利要求的範圍所限定的本發明的精神的前題下，可以進行多種改變和修飾。
序列表110國立癌中心120可中和的HGF表位和與其結合的中和抗體130PCA31170/NCC16035170KoDatentIn 1.71210121138212DNA213人工序列220
223Vkappa 5′正向引物RSCVK14001gggcccaggc ggccgagctc gtgmtgaccc agactcca38210221138212DNA213人工序列220
223Vkappa 5′正向引物RSCVK24002gggcccaggc ggccgagctc gatmtgaccc agactcca38210321138212DNA213人工序列
220
223Vkappa 5′正向引物RSCVK34003gggcccaggc ggccgagctc gtgatgaccc agactgaa38210421142212DNA213人工序列220
223Vkappa 3′反向引物RHybK1-B4004agatggtgca gccacagttc gtttgatttc cacattggtg cc 42210521142212DNA213人工序列220
223Vkappa 3′反向引物RHybK2-B4005agatggtgca gccacagttc gtaggatctc cagctcggtc cc 42210621142212DNA213人工序列220
223Vkappa 3′反向引物RHybK3-B4006agatggtgca gccacagttc gtttgacsac cacctcggtc cc 42210721140212DNA213人工序列220
223VIambda 5′正向引物RSCIambda14007gggcccaggc ggccgagctc gtgctgactc agtcgccctc 40210821145212DNA213人工序列220
223VIambda 3′反向引物RHybL-B4008agatggtgca gccacagttc ggcctgtgac ggtcagctgg gtccc45210921142212DNA213人工序列220
223VH 5′正向引物RHyVH1
4009gctgcccaac cagccatggc ccagtcggtg gaggagtccr gg 422101021142212DNA213人工序列220
223VH 5′正向引物RHyVH240010gctgcccaac cagccatggc ccagtcggtg aaggagtccg ag 422101121142212DNA213人工序列220
223VH 5′正向引物RHyVH340011gctgcccaac cagccatggc ccagtcgytg gaggagtccg gg 422101221144212DNA213人工序列220
223VH 5′正向引物RHyVH440012
gctgcccaac cagccatggc ccagsagcag ctgrtggagt ccgg 442101321145212DNA213人工序列220
223VH 3′反向引物RHyIgGCH1-B40013cgatgggccc ttggtggagg ctgargagay ggtgaccagg gtgcc452101421124212DNA213人工序列220
223用於從克隆的人Fab擴增人Ckappa區和peIB引導區序列的正向引物HKC-F40014cgaactgtgg ctgcaccatc tgtc 242101521121212DNA213人工序列220
223用於從克隆的人Fab擴增人Ckappa區和peIB引導區序列的反向引物Lead-B40015ggccatggct ggttgggcag c 2121016
21124212DNA213人工序列220
223用於從克隆的人Fab擴增人CH1鏈的正向引物HIgGCH1-F40016gcctccacca agggcccatc ggtc 242101721121212DNA213人工序列220
223用於從克隆的人Fab擴增人CH1鏈的反向引物dpseq40017agaagcgtag tccggaacgt c 212101821141212DNA213人工序列220
223用於兔VL序列與人Ckappa PCR產物連接的PCR正向引物RSC-F40018gaggaggagg aggaggaggc ggggcccagg cggccgagct c412101921121212DNA213人工序列220
223用於兔VH序列與人CH1 PCR產物連接的PCR正向引物LeadVH40019gctgcccaac cagccatggc c 212102021139212DNA213人工序列220
223用於嵌合的輕鏈序列與嵌合的重鏈序列(Fd)連接的PCR反向引物dp-EX40020gaggaggagg aggaggagag aagcgtagtc cggaacgtc 392102121120212DNA213人工序列220
223測序引物40021agaaacacaa agtctacgcc202102221120212DNA213人工序列220
223測序引物40022
gttgggcagc gagtaataac2021023211348212DNA213人工序列220
223編碼克隆61的VH區的核苷酸序列40023caggagcagc tgatggagtc cgggggtcgc ctggtcaatc ctggcgaatc cctgacactc 60acctgcaaag cctctggatt caccttcagt agctactaca tgagctgggt ccgccaggct120ccagggaagg ggctggagtg gatcggatac attggtacta gtagtggtac cacttactac180gcgaactctg tgaagggccg attcaccatc tccagcgaca acgcccagaa taccgtattt240ctgcgaatga ccagtctcac agactcggac acggccacct atttctgtgc aagagggctg300ggcagaatca acttgtgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcttca 34821024211327212DNA213人工序列220
223編碼克隆61的VL區的核苷酸序列40024gagctcgtgc tgacccagac tccatcctct atgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60atcaattgcc aggccagtca gagtgttagc aactacttag cctggtatca gcagaaacca120gggcagcctc ccaagctcct gatctacagg gcatccactc tggcatctgg ggtcccatcg180cgtttcagcg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagtgg catgaaggct240
gaagatgctg ccacttatta ctgtcaaagt ggttattata gtgctggtgc gacttttgga300ggtggcacca atgtggaaat caaacga32721025211348212DNA213人工序列220
223編碼克隆68的VH區的核苷酸序列40025cagcagcagc tggtggagtc cgggggtcgc ctggtcaatc ctggcgaatc cctgacactc 60acctgcaaag cctctggatt caccttcagt acctactaca tgagctgggt ccgccaggct120ccagggaagg ggctagagtg gatcggatac attggtacta gtagtggtac cacttactac180gcgaactctg tgaagggccg attcaccatc tccagcgaca acgcccagaa taccgtattt240ctgcaaatga ccagtctgac agactcggac acggccacct atttctgtgc aagagggctg300ggcagaatta acttgtgggg cccaggcacc ctggtcaccg tctcctca 34821026211327212DNA213人工序列220
223編碼克隆68的VL區的核苷酸序列40026gagctcgatc tgacccagac tccatcctct gtgtctgcag ctgtgggagg cacagtcacc 60atcaattgcc aggccagtca gagtgttagc aacctcttag cctggtatca gcagaaacca120
gggcagcctc ccaagctcct gatttatggt gcatccaatc tggaatctgg ggtcccatcg180cgtttccgtg gcagtggatc tgggacagag ttcactctca ccatcagtgg catgaaggct240gaagatgctg ccacttatta ctgtcaaagt ggttattata gtgctggtgc gacttttgga300gctggcacca atgtggaaat caaacga32721027211116212PRT213人工序列220
223克隆61的VH區的胺基酸序列40027Gln Glu Gln Leu Met Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Asn Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Gly Thr Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Phe65 70 75 80Leu Arg Met Thr Ser Leu Thr Asp Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Gly Leu Gly Arg Ile Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser
11521028211109212PRT213人工序列220
223克隆61的VL區的胺基酸序列40028Glu Leu Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Met Ser Ala Ala Val Gly1 5 10 15Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Met Lys Ala65 70 75 80Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Tyr Tyr Ser Ala Gly85 90 95Ala Thr Phe Gly Gly Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg100 10521029211116212PRT213人工序列220
223克隆68的VH區的胺基酸序列40029Gln Gln Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Asn Pro Gly Glu1 5 10 15Ser Leu Thr Leu Thr Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr20 25 30Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile35 40 45Gly Tyr Ile Gly Thr Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asn Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Phe65 70 75 80Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Asp Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys85 90 95Ala Arg Gly Leu Gly Arg Ile Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val100 105 110Thr Val Ser Ser11521030211109212PRT213人工序列220
223克隆68的VL區的胺基酸序列40030Glu Leu Asp Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly1 5 10 15Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Leu
20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Gly Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Met Lys Ala65 70 75 80Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Gly Tyr Tyr Ser Ala Gly85 90 95Ala Thr Phe Gly Ala Gly Thr Asn Val Glu Ile Lys Arg100 1052103121120212DNA213人工序列220
223測序引物40031ccctcatagt tagcgtaacg202103221112212PRT213人工序列220
223neutralizable epitope of HGF40032
His His Pro His Phe Lys Pro Val Ser Asn Ser Arg1 5 102103321112212PRT213人工序列220
223HGF可中和的表位40033Lys Ser Leu Ser Arg His Asp His Ile His His His1 5 102103421136212DNA213人工序列220
223編碼SEQ.ID.No.32的核苷酸序列40034catcatccgc attttaagcc tgtgtctaat agtcgt 362103521136212DNA213人工序列220
223編碼SEQ.ID.No.33的核苷酸序列40035
aagtctctta gtcggcatga tcatattcat catcat 3權利要求
1.一種含有SEQ ID NO32或33的胺基酸序列的HGF(肝細胞生長因子)的可中和的表位，其抑制HGF與其受體的結合。
2.編碼如權利要求1所述的可中和的表位的多聚核苷酸。
3.根據權利要求2所述的多聚核苷酸，其特徵在於，其含有SEQ ID NO34的核苷酸序列。
4.根據權利要求2所述的多聚核苷酸，其特徵在於，其含有SEQ ID NO35的核苷酸序列。
5.一種特異結合於如權利要求1所述的可中和的表位的中和抗體。
6.根據權利要求5所述的中和抗體，其特徵在於，其選自嵌合抗體、單克隆抗體或人源抗體。
7.根據權利要求5所述的中和抗體，其特徵在於，其包括含有SEQ ID NO27的胺基酸序列的VH區和含有SEQ ID NO28的胺基酸序列的VL區。
8.根據權利要求5所述的中和抗體，其特徵在於，其包括含有SEQ ID NO29的胺基酸序列的VH區和含有SEQ ID NO30的胺基酸序列的VL區。
9.一種用於預防或治療由HGF與其受體結合引起的疾病的方法，其包括將如權利要求7所述的中和抗體給藥於哺乳動物。
10.根據權利要求9所述的方法，其中的疾病是肝癌、前列腺癌、結腸癌、乳腺癌、腦癌、皮膚癌、瘧疾和阿爾茲海默症。
全文摘要
本發明涉及結合本發明HGF可中和的表位的抗HGF的中和抗體能夠作為單獨試劑中和HGF，並可以有效的用於預防和治療由HGF與其受體Met結合所引起的頑固疾病和癌症。
文檔編號C07K14/475GK1878790SQ200480033164
公開日2006年12月13日 申請日期2004年11月9日 優先權日2003年11月11日
發明者鄭埈昊, 許英美 申請人:國立癌中心