病理形式朊病毒蛋白的結合的製作方法

2023-06-18 06:33:46 2

專利名稱：病理形式朊病毒蛋白的結合的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗蛋白酶結合劑的應用，典型地涉及聚離子物質，諸如聚陰離子物質或聚陽離子物質，聚陰離子物質包括戊聚糖聚硫酸酯、葡聚糖硫酸酯或其它聚陰離子多糖苷，聚陽離子物質包括溴化己二甲胺、polyamidoamine樹突狀聚合物或聚(氯化二丙烯二甲銨)，任選在選擇性條件下俘獲病理或劣種形式朊病毒蛋白PrPc，以及類似於聚集的異常形式蛋白的蛋白，此蛋白在正常形式下是不聚集的。
背景技術：
朊病毒疾病也稱為傳染性海綿狀腦病或TSEs，僅僅是最近才對它有所認識。牛海綿狀腦病(BSE)首次報告於1985年。首例變異CreutzfeldtJakob病(vCJD)報告於1996年。VCJD在人類是一種致命性神經變性疾病，相信它是由消費BSE汙染的肉類引起的。在人類，從感染至出現臨床症狀的潛伏期可為許多年。
朊病毒的唯一識別的組分是PrPSc，它是引起朊病毒疾病的原因，它是一種異常的PrPc同種型(PrPSc也稱為PrPres，PrPc也稱為PrPSen)。先前已經注意到PrPSc與PrPc不同，因為它是比較抗蛋白酶的。但是最近，發表的文獻稱存在一種蛋白酶敏感形式的PrPSc，即存在一種感染性PrP，它是蛋白酶敏感的。
此感染的，但蛋白酶敏感的PrPSc可能可以聚集(即本質上是聚集的)，但是尚未聚集，或者至少僅是部分聚集。
除了上下文中指明特定的其中之一的含意外，蛋白酶不敏感和蛋白酶敏感形式的PrPSc及部分蛋白酶消化後留下的PrPSc核心部分(經常在現有技術中被看作是PrP27-30)在此都被認為是PrPSc。另外，名詞「聚集蛋白」用以包括聚集的抗蛋白酶PrPSc和其它蛋白的類似形式，以及感染性非聚集或部分聚集形式的PrPSc或其它蛋白，其中可包括最近觀察到的蛋白酶敏感感染性PrPSc。
PrPc是一種功能不明的GPI錨定糖蛋白。儘管朊病毒疾病其它一些標誌已經提示PrPSc不僅僅是一種必須的朊病毒組分，而且也是這類疾病唯一可靠而普遍接受的標誌。
目前受推崇的測定PrPSc存在的方法學是應用蛋白酶K使樣品進行蛋白水解，此過程持續足夠的時間，以破壞PrPc，然後通過一種免疫測定法測定留下的PrPSc，這種免疫測定法中應用一種抗體，它對於PrPc存在下的PrPSc不是選擇性的(Serban等，Neurology，Vol.40，No.1，Jan 1990)。在蛋白水解步驟中，應用蛋白酶自然地排除了作為俘獲劑或檢測劑的抗體。在可引入抗體之前，必須除去此蛋白酶，或使其失活。避免對操作的這種限制將是十分有利的。
這種方法依賴於完全除去PrPc，以避免假陽性，而且還依賴於不產生降解PrPSc的情況，以避免假陰性。需要為每種類型的待測樣品開發這種選擇性蛋白水解的條件。所得測定法的敏感性是有限的。例如，在牛腦組織的測定中，其敏感性僅可能是如此，以便大約在此動物可能將表現出BSE臨床可見症狀時，可獲得可靠的陽性結果。因此，此測定法的敏感性限度在1μg/ml範圍內，相當於104-105朊病毒感染單位。
對於朊病毒疾病，需要更靈敏更特異的診斷試驗。特別是，需要應用血液或其它類型樣品的死前試驗，來評價特定動物的疾病狀態。沒有這種方法的情況下，一旦在一群動物中明確一個感染動物，則需要廣泛地屠宰家畜。至關重要的是開發一種診斷試驗，以篩選人群，並保護個體，避免受到捐獻血液、外科手術及器官和組織移植的潛在感染。
US5977324和US6221614兩者均描述了應用磷鎢酸(PTA)結合PrPSc的方法。PTA是一種非特異性蛋白沉澱劑，除了它不與PrPSc結合外，它可與廣泛的蛋白結合，並使其沉澱。樣品中蛋白的濃度也將極大地影響應用PTA的回收。
有報告稱，對於PrPc而言，纖溶酶原可與PrPSc選擇性地結合，並提出纖溶酶原可用於診斷分析(Fischer et al.Nature，2000，Nov23，408(6811)479-83)。但是，還沒有充分地證明此方法可應用於實踐中。在相關公開內容，即US 2002/0004586中，也認為纖溶酶原是一種與PrPSc選擇性結合的因子。
按照US 6419916及相關的公開內容，聚胺化合物SuperfectTM(一種支鏈聚胺混合物，它是通過PAMAM樹突狀聚合物的熱誘導降解產生的)及其它類似的支鏈聚胺可在體外清除細胞中的PrPSc。其機理不清楚。據推測，這些化合物可與按澱粉狀蛋白排列並暴露陰性帶電部分的PrPSc直接結合，而且在酸性條件下誘導構象改變。據說此結果不能簡單地涉及與PrPc的結合和抑制PrPSc的合成，因為存在的PrPSc已被清除了。假如pH低於4，則發現此聚胺可使PrPSc蛋白酶敏感。推測在體外PrPSc清除實驗中，此聚胺在酸性細胞隔室中起作用。
從此項工作中得出，可推論這些聚胺與PrPSc結合。還提出了許多其它的可能性。表明或提示與PrPSc無選擇性結合超過了PrPc。另外，可以推斷，所發生的任何結合僅僅是短暫的，只是用於改變PrPSc的構象，以使蛋白酶進行攻擊。另外，這些聚胺的作用需要低pH值。事實上，我們自己的研究表明在如此低的pH值下，這種樹突狀聚合物聚胺不與PrPSc結合。
戊聚糖聚硫酸酯(聚-b-木糖-2，3-二磺酸酯，PPS)是一系列大聚磺酸鹽多糖苷(PGs)(MW 8,000-12,000)中的一種。它產自山毛櫸木，是一種廉價的化合物，已作為類似於肝素的抗凝劑應用了多年，還有PG。PGs包括PPS和其它聚陰離子，已知它可與PrPc和重組PrP(recPrP)兩者結合。例如參見Brimacombe DB et al，Biochem J，1999 Sep 15；342 pt 3，605-13。因此，已提出PPS可用作潛在的治療劑，以預防和治療TSE疾病。然而沒有表明在體內或體外中除去已存在的PrPSc。
在生產過程中，提取山毛櫸木的鋸屑，以生產木糖的可溶性糖聚合物(一種五元環的糖)，它稱為戊聚糖。然後應用氯磺酸和吡啶的混合物，對此聚合物進行硫酸化反應，這樣導致所有4個糖環羥基中的3個上加有硫酸酯。然後硫酸酯總含量按重量計約為50-55％，此含量大於肝素中的含量，肝素中的含量約為30-35％。接近這種高程度硫酸化的其它唯一類似的分子是葡聚糖硫酸酯(40-45％)。戊聚糖的MW非常低，為3.5-7.0K。
曾有報告，對PrPc結合而言，通過PrPSc聚陰離子或聚陽離子結合沒有選擇性。令人驚奇的是，我們現在建立了條件，在此條件下，聚離子物質與聚集改變的蛋白，比如PrPSc結合，另外還建立了其它條件，在此條件下這些聚陰離子與這些異常形式結合，但不與它們的非聚集正常形式，比如PrPc結合，這種結合足夠強，而且是在優選的條件下進行，為了可用於測定聚集改變蛋白(例如PrPSc)的存在，對這種條件進行了充分地選擇。

發明內容
因此，本發明的第一個方面是提供一種方法，此方法用於在一種蛋白的非聚集正常形式存在的情況下，選擇性結合此蛋白聚集性異常形式，它包括在選擇性結合條件下使一種含有所述異常和正常形式的物質與一種聚離子物質接觸，當樣品中存在所述的此蛋白聚集形式時，此聚離子物質對其具有結合親合力。這種結合條件可包括溶液中存在一種競爭劑，此競爭劑與此異常形式蛋白的結合親合力低於此聚離子物質。
這種聚離子物質可在溶液中，或者可提供一種具有離子表面基團的表面。在後一種情況中，此表面可為一種聚合物的表面，該聚合物具有所述的離子型基團，此基團是在該聚合物的結構內共價結合的，或者是通過對該聚合物的表面基團修飾而產生的。聚陰離子聚合物適宜的實例為Nafion，它是一種全氟化磺酸化烴聚合物，可用作珠或片。也可應用聚陽離子聚合物。
可選擇的是，此表面為一種底物的表面，該底物上包被有或在其中結合有具有所述離子基團的物質。具有這種表面基團的適宜聚合物的實例為未帶電塑料表面，應用馬來酸酐對其進行活化，並用TRIS衍化而產生表面羧基，或者帶有聚陽離子物質。也可將聚陽離子和聚陰離子被動地塗在諸如聚苯乙烯的聚合物上。
在聚陰離子物質條件下，無論是用在溶液中，還是塗在固體表面，這種聚陰離子物質優選可為一種聚陰離子多糖苷。
通常，競爭劑離子基團的密度比聚離子物質低。未受到理論的限制，可能在此詳述的發現歸因於聚集性異常形式的蛋白，此蛋白比非聚集正常形式的相同蛋白具有更多的結合位點，以與離子基團進行相互作用。具有一個或一些離子基團的競爭劑可以以一定的親合力，既與聚集形式的蛋白相互作用，也可與非聚集形式蛋白相互作用，然而聚離子物質則可以同時通過許多離子基團與此聚集形式的蛋白結合，這樣可使它對聚集形式蛋白的親合力比對非聚集形式蛋白更高。
被感染牛腦的實驗結果提示，固定的聚陰離子(諸如葡聚糖硫酸酯)和聚陽離子(諸如聚乙烯亞胺)能夠俘獲腦均漿中異常形式的朊病毒蛋白PrPSc。應用抗朊病毒蛋白抗體/酶綴合物獲得的信號，在最佳聚陽離子俘獲表面的比最佳聚陰離子俘獲表面約高3～5倍。
在兩種情況下，當使用非特異性抗朊病毒蛋白抗體時，去汙劑Sarkosyl(N-月桂醯肌氨酸)可充當競爭劑，以利於提高俘獲異常蛋白的特異性，並避免正常朊病毒蛋白的信號。另外，當應用聚陽離子，或者應用聚陰離子時，用胰蛋白酶部分消化此樣品基本上可增強PrPSc的信號，但對特異性沒有任何影響(此提示，在所用的這種條件下，胰蛋白酶除去了PrPSc聚離子結合的抑制劑，而不是優選地消化PrPc這與從蛋白酶K所觀察到的一樣)。
科學文獻中有報告稱，PrPSc天然地與聚陰離子相關聯，此聚陰離子諸如為類肝素。可能這些陰性帶電聚合物與PrPSc結構的陽性帶電區相互作用，並且可能存在與這種聚集蛋白的多種相互作用。
我們提出，諸如葡聚糖硫酸酯或戊聚糖聚硫酸酯的聚陰離子，它可與PrPSc結構結合，其親合力比天然類肝素更高，而且這樣可替代內源性化合物。因此，固定至表面的高陰性帶電聚合物可特異性地俘獲異常朊病毒蛋白。正常朊病毒蛋白是非聚集性的，而且與內源性類肝素或諸如葡聚糖硫酸酯的聚陰離子都沒有如此高親合力的作用。在所選擇的這種測定條件下，較低親和性陰離子諸如去汙劑Sarkosyl的存在，通過與固定的聚陰離子競爭較低親和性PrPc作用位點，可進一步提高俘獲的特異性。
相反，我們提出，根據PrPSc結構，聚陽離子不能替代內源性類肝素。我們提出，它反而必須與內源性類肝素/PrPSc聚集體直接絡合-與類肝素上的自由陰性電荷形成離子相互作用。這樣，在這種構型中，天然完整的類肝素/PrPSc複合體與固定的聚陽離子穩固地結合，然而在固定的聚陰離子條件下，非天然「代替的」PrPSc結構則被俘獲。這說明應用最佳的聚陽離子俘獲表面獲得的信號較高，因為聚陰離子競爭內源性類肝素不可能100％有效，而且不是所有的PrPSc聚集體都被陰性帶電聚合物結合。
當不期望聚集性蛋白被天然類肝素天然地結合時，例如當樣品是血液或者血清等而不是組織時，可優選離子俘獲劑。
除了所提到的離子相互作用外，這種PrPSc聚集體的其它區域與所用的這些聚合物之間可能還存在其它的疏水性結合。這些將進一步增強這種結合的相互作用。
此處所用的「親合力」是指具有許多結合位點的分子與多價結合劑的總結合強度，而「親合性」的意思是此分子的每單個結合位點和結合劑之間的結合強度。
如果使用競爭劑，則此競爭劑優選為脂肪酸的胺基酸醯胺，諸如n-月桂醯肌氨酸。這些物質具有去垢特性，但在本說明書中它們通過其末端COO-基團，僅僅充當單價結合劑，或者通過膠束形成而充當部分多價劑。
在另一個方面，本發明提供一種方法，該方法用於在一種蛋白的非聚集正常形式存在的情況下，選擇性結合此蛋白的聚集性異常形式，它包括在諸如提供所述異常形式的選擇性結合的條件下，使含有所述異常和正常形式的物質與聚陰離子多糖苷接觸。
本發明每個方面的優選實施方式中，所述蛋白的異常形式為PrPSc，而且其正常形式為PrPc。但是，本發明在其所有形式中，可廣泛地應用於蛋白異常聚集形式的選擇性結合。
可應用的聚陽離子選擇性結合劑包括聚乙烯亞胺；聚胺，它包括聚賴氨酸、polyamidoamines、例如PAMAM樹突狀聚合物；聚季銨，諸如聚(氯化二丙烯二甲銨)和1，5-二甲基-1，5-二氮十一撐聚甲溴化物(亦即溴化己二甲胺或溴化己二甲胺)。
優選的聚陰離子多糖苷為聚磺酸化多糖苷。但是，也可應用或替代使用其它的陰離子位點，諸如羧酸基團或者磷酸基團。
這種聚磺酸化多糖苷優選為戊聚糖聚硫酸酯(PPS)或葡聚糖硫酸酯。
其它聚陰離子戊聚糖或葡聚糖衍生物也可用作這種聚陰離子多糖苷。
優選高水平磺化作用(或其它陰離子基團)。
角叉膠、葡聚糖和戊聚糖的磺化水平高。如果低比例潛在磺化位點實際上被硫酸基團佔據，那麼可能會發現這些化合物不與PrPSc上的結合位點選擇性地相互作用。
適宜的陰離子選擇性結合劑可包括戊聚糖聚硫酸酯(MW 3500-5000)、葡聚糖硫酸酯500(MW 500,000)、ι-角叉菜聚糖、λ-角叉膠和角叉菜聚糖，例如κ-角叉菜聚糖、肝素和類肝素、葡聚糖硫酸酯8(MW 8,000)、諸如巖藻依聚糖的磺酸化多糖苷、硫酸角蛋白、透明質酸聚硫酸酯、多聚乙醯神經氨酸(細菌聚唾液酸)、III型角叉菜聚糖和IV型角叉菜聚糖、硫酸皮膚素、硫酸類肝素、帚叉藻膠、硫酸化的市售多糖，例如多乙氧基醚、西咗喃、黃原膠、澱粉、纖維素化合物、果膠、胃粘蛋白、ceratonia、瓊脂、阿拉伯膠、硫酸化葡糖苷1、硫酸化葡糖苷2、N-乙醯-D-葡糖胺或者硫酸皮膚素L-艾杜糖醛酸。
可選擇這種聚離子物質使具有此能力在非選擇性條件下，可與蛋白的聚集性改變的形式或劣種形式結合，也可與此蛋白非聚集性正常形式結合，而且還具有在適宜條件下與聚集形式選擇性結合的能力。
通過適當調節反應條件，可獲得所需要的選擇性，特別是競爭劑的存在和濃度、pH和去汙力。因此優選地選擇pH，以獲得所述的選擇性結合。
優選pH為5.6～9，例如7～9，更優選8～9，例如8.2～8.6，尤其是8.4，特別是在應用下面所述的去汙劑時。適宜的緩衝劑包括磷酸鹽緩衝劑和Tris緩衝劑。
此鹽的濃度優選不高於250mM，而且優選顯著更低，例如不超過100mM。
優選應用去汙劑，無論是藉助於去汙力，還是充當競爭劑，它都可促進所述的選擇性結合。
為了此目的，特別優選去汙劑為一種脂肪酸的胺基酸醯胺，例如n-月桂醯肌氨酸或其它脂肪酸肌氨酸。當選擇性結合劑是聚陰離子時，尤其優選這種去汙劑/競爭劑。
優選此去汙劑的濃度至少為0.05％重量計，更優選至少為0.1％，優選至少0.2％，例如0.2～2％，更優選0.5～1.5％，但是也可應用更大的量。
可應用具有類似作用的其它去汙劑，包括CHAPS、Brij、辛基-β-糖苷、Tween 20、Triton X-100和Nonidet P-40。但不希望使用高濃度十二烷基硫酸鈉(SDS)。n-月桂醯肌氨酸(或類似的物質)和其它去汙劑的組合物是適宜的，優選含有0.5～2％，例如約1％肌氨酸去汙劑，例如與0.5～2％上面列舉去汙劑中的一種，例如約1％，特別是TritonX-100或Nonidet P-40。
我們發現胰蛋白酶、糜蛋白酶、蛋白酶K或另一種這樣的蛋白酶的存在有助於防止不明物質的抑制作用，此抑制作用可抑制聚集性蛋白與聚陰離子或聚陽離子選擇性結合劑的結合。當樣品中含有相當高水平的其它蛋白時尤其如此，如果用PrPSc陰性腦材料稀釋PrPSc陽性腦樣品時情況就是這樣。通過包括具有降解性質的其它酶可防止另外的基質抑制作用，這些酶包括DNase和膠原酶。
與所述的此蛋白聚集性異常形式結合後，這種選擇性結合劑可被固定的俘獲劑俘獲，而且可測定所述選擇性結合劑和所述俘獲劑之間形成的絡合物的存在和量。
所述俘獲劑可為外源凝集素(在此結合劑適宜的，例如為多糖苷)或者一種可與所述選擇性結合劑反應的抗體。所述選擇性結合劑可具有選擇性可結合的標記部分，然後所述俘獲劑可與所述標記部分結合。
可選擇和可替代地，在暴露於所述樣品之前，將這種選擇性結合劑固定在固體介質上。此選擇性結合劑可具有選擇性可結合標記部分，而且通過此標記，可將它固定在所述固體介質上。
當存在可結合標記部分時，例如它可為生物素、螢光素、二硝基苯酚、異羥洋地黃毒苷元(digoxygenin)或(His)6。
可將此選擇性結合劑直接固定在固體上，而不是通過可結合標記。例如，當使用例如用環氧基或乙烯碸基衍化的固體相時，通過此PG剩餘的羥基經共價偶合，可直接偶合PG。
在本發明的各個方面，無論異常蛋白的結合發生在選擇性結合劑的固定和俘獲之前或之後，優選對固定的選擇性結合劑/異常蛋白絡合物進行衝洗步驟，以除去正常蛋白，而提高選擇性。此衝洗步驟中優選使用含有所述競爭劑的溶液，它可為去汙劑溶液，其中優選還包括去汙劑，此去汙劑或者憑藉其去汙力或者其它方面而促進選擇性結合。這優選為脂肪酸的胺基酸醯胺，例如n-月桂醯肌氨酸或者另一種脂肪酸肌氨酸。優選地，衝洗步驟中此肌氨酸去汙劑的濃度至少為0.05％，優選至少為0.1％，更優選至少為0.2％，例如0.2～2％，優選0.5～1.5％。也可使用其它去汙劑，而且優選將此衝洗液pH緩衝至5.6～8.4。
將結合PrPSc從未結合PrPSc(或其它正常形式蛋白)分離後，進行PrPSc(或其它聚集性蛋白)的免疫測定，可定性或定量測定所述PrPSc(或其它異常蛋白)的結合。
另外，一旦聚集形式的蛋白被選擇性結合，而且可選擇的在除去正常形式蛋白後，可將另外的聚陰離子物質，例如陰離子多糖苷(用標記物或可檢測的標誌適當標記的)與已經結合的聚集性蛋白結合，而形成一種夾心(例如多糖苷-聚集性蛋白-多糖苷標記)，然後可對其進行定量測定或檢測。當進行第二部分夾心形成時，選擇性結合條件可不是必需的。
如上所述，在與改變的蛋白接觸前或者之後，可將選擇性結合劑固定在一種固體物質上。然後從此固體物質上分離樣品，以從此測定中除去正常形式的蛋白，僅留下改變形式的蛋白進行下一步測定。
在本說明書中，固體支持物質不僅包括宏觀或可控制物質，諸如微量滴定板、測量尺和層流儀，而且還包括微珠和超順磁性微珠，可通過過濾或者磁性俘獲而將它們分離。通過標準的化學方法，可將生物素或其它標記物綴合至葡聚糖硫酸酯或PPS等物質上。PPS中約十分之一的糖主鏈殘基是糖醛酸甲基酯，而且這樣為通過它們的羧基殘基進行偶合提供了一個途徑。其它已知進行偶合的途徑是羥基(在硫酸化反應後還有四分之一是游離的)，或者是還原糖的末端基團。生物素是適宜的可結合標記部分，它可用於將聚陰離子物質或者其它選擇性結合劑結合到一種固體物質上，此固體物質是用抗生物素蛋白或者具有抗生物素蛋白結合特性的物質衍化的，這裡的具有抗生物素蛋白結合特性的物質諸如為鏈黴抗生物素蛋白、Neutravidin或Captavidin。
適宜用作可結合標記部分的其它分子將包括所有容易和聚離子物質綴合，而且有助於被適宜的俘獲劑俘獲的那些分子。例如，諸如螢光素的分子可與PPS或類似分子綴合，這是在碳二亞胺EDC(1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)-碳二亞胺)存在下，通過將一種氨基螢光素衍生物與戊聚糖聚硫酸酯的糖醛酸和側鏈反應進行的，而且可用一種適宜的易於獲得的抗體將這種分子俘獲，這種抗體可固定在固體物質上。適用於此過程中抗體俘獲的其它標記物包括二硝基苯酚DNP、異羥洋地黃毒苷元、核酸或核酸類似序列和(His)6。除了抗體，也可應用結合劑，例如互補核酸或核酸類似序列。
但是，可選擇的是，可應用可選擇性地與此聚離子物質本身，而不是通過標記部分結合的俘獲劑。例如，可通過適宜的凝集素或適宜的抗體結合多糖苷。例如Kongtawelert et al；J.Immunol.Methods 1990，Jan 24；126(1)；39-49公開的結合PPS的抗體。固定這些抗體的標準技術是本領域技術人員所熟知的。
一旦此凝集形式被選擇性結合劑選擇性地結合，而且適當地通過固定結合的形式，衝洗掉剩餘未結合的形式，而將未結合正常形式蛋白分離開，任何已知或未來將設計出的可用於測定被凝集的或凝集改變的蛋白的方法，可用來測定此凝集形式的存在或量，這種改變的蛋白諸如為PrPSc(不需要選擇性地排除正常的形式，諸如PrPc)。這些方法包括已知的ELISA、RIA、IRMA和其它類型的免疫測定法，例如Bio-RadPlateliaTMBSE檢測試劑盒中包含的方法和Serban等描述的方法。
根據所用測定法的類型，在測定之前可要求或需要從選擇性結合劑上洗脫被俘獲的異常形式蛋白。在這種洗脫步驟中，諸如硫氰酸胍的離液劑所要求的濃度至少為1M，優選2～6M，例如4～6M。也可應用包括尿素的的離液劑。
另外或可選擇的，具有較高親合力的競爭劑可用於替代來自選擇性結合劑的蛋白。十二烷基硫酸鈉(SDS)適用於此，其應用的濃度優選為0.5～1％重量計，更優選大於0.75％。
按照本發明可被選擇性結合和測定的其它蛋白包括β-澱粉樣蛋白和τ蛋白，它們形成阿耳茨海默病中的蝕斑。
不欲受到下面理論的限制，認為PPS和類似分子在本發明中發揮作用，它是通過成對陰性硫酸基與相關蛋白中成對陽性胺基酸(賴氨酸和精氨酸)結合，或者通過此蛋白的聚組氨酸金屬結合位點而發揮作用。與聚集形式結合可更牢固，這歸因於聚集蛋白所提供結合位點的數目增多。適宜的陰離子去汙劑，可更有效的競爭與非聚集形式進行的結合，以提高選擇性。適宜地，所獲得的選擇性是如此，以致與聚集蛋白結合的親合力至少是正常形式的3倍，優選至少為10∶1。
在另一方面，本發明包括分離PrPSc與PrPc的方法，它包括在脂肪酸的胺基酸醯胺存在的情況下，選擇性地將PrPSc與結合劑結合。這種結合的優選條件如上詳述，而且可按照所述來測定這種結合的蛋白。
通過下面的實施例可進一步對本發明進行描述和舉例說明，此實施例涉及下面附圖，其中附圖簡述附

圖1顯示實施例9中獲得的稀釋曲線。
具體實施例方式
實施例1應用生物素化戊聚糖聚硫酸酯以及隨後的親和俘獲從劣種朊病毒蛋白中分離正常朊病毒介紹應用標準的化學方法，將生物素與戊聚糖聚硫酸酯綴合。使這種生物素化戊聚糖聚硫酸酯與腦均漿中劣種朊病毒蛋白結合，結合後，應用鏈黴抗生物素蛋白衍化的超順磁珠俘獲戊聚糖聚硫酸酯/朊病毒複合物。然後從這些珠上洗脫被俘獲的劣種朊病毒，並用基於免疫的Bio-RadPlateliaTMBSE檢測試劑盒進行測定；此試劑盒不能區分正常和劣種朊病毒蛋白，而且可給出兩種蛋白的信號。對一組兩個BSE感染和兩個非感染牛腦進行研究，用於舉例說明在所述的特殊條件下，可應用戊聚糖聚硫酸酯特異性的俘獲腦均漿中劣種朊病毒蛋白。
方法製備超順磁珠1、僅在使用前，在3個連續的1ml體積的TBST(50mM Tris、150mMNaCl，pH7.5，0.05％(v/v)Tween20[Sigma-Aldrich Company Ltd.，P-7949])中，通過磁性俘獲衝洗400μl鏈黴抗生物素蛋白超順磁珠(Sigma-Aldrich Company Ltd.，S-2415)。
2、最後在400μl TBST中再懸浮這些珠。
3、在4個試管中製備100μl等份，並除去流體。然後準備這些珠備用。
製備腦均漿1、將每種300-500mg的腦組織加入包含研磨珠的研磨試管中，同時將這些試管裝入BSE Purification Kit(Bio-Rad)中。在使用前抽取試劑盒內這些試管中最初裝入的流體，並將其棄去。
2、將經過計算的150mM NaCl加入每個試管中，它可產生均化後的50％(w/v)腦均漿。
3、在ribolyzer(從Bio-Rad購得)上將這些試管均化45秒，速度設定在6.5。
4、用150mM NaCl稀釋這些均漿。
5、將每種50μl的均漿置於分離試管中。
Rogue朊病毒蛋白的特異性俘獲6、將10μl 20％(w/v)N-月桂醯肌氨酸(Sigma-Aldrich CompanyLtd.，L-9150)加入含均漿的每個試管中，並混合。
7、然後將50μl生物素化戊聚糖聚硫酸酯(在無菌蒸餾水中，濃度為10μg/ml)加入每個試管中，混合，在室溫下孵育30分鐘。
8、然後將每種反應物加入衝洗的鏈黴抗生物素蛋白超順磁珠的試管中，在室溫下孵育30分鐘。
9、然後在3個1ml TBST中通過磁性俘獲衝洗這些珠。
Rogue朊病毒蛋白的洗脫和免疫測定1、最後，在最終的衝洗後，將每個反應中的珠再懸浮在10μl Cl(與Bio-Rad的PlateliaTMBSE檢測試劑盒一起提供)中。
2、將5μl 0.2％(w/v)SDS加入每種珠懸浮液中，混合。
3、在每種珠懸浮液中加入5μl 1M硫氰酸胍(Sigma-AldrichCompany Ltd.，G-9277)，並混合。
4、將此反應在100℃加熱5分鐘。
5、然後加入100μl R6(與Bio-Rad的PlateliaTMBSE檢測試劑盒一起提供)，並混合。
6、然後將每種100μl的洗脫物用於Bio-Rad的PlateliaTMBSE檢測試劑盒，並使用此試劑盒一起提供的方案和試劑。簡要地，這種試劑盒包括正常和/或劣種朊病毒蛋白的免疫俘獲，以及應用辣根過氧化物酶綴合抗體的免疫測定。
結果在基於微量滴定平板的PlateliaTM測定中進行免疫測定後，應用ELISA讀數器，在波長450nm下測量每個孔中的信號。

這兩種感染BSE腦均漿含有劣種朊病毒，它們的信號顯著高於未感染的正常腦均漿的信號。
討論這種Bio-Rad的PlateliaTMBSE檢測試劑盒不能區別正常或劣種朊病毒蛋白。正常情況下，應用蛋白酶K進行預消化，蛋白酶K除去對蛋白酶敏感的正常朊病毒蛋白，這樣獲得劣種朊病毒蛋白的特異性。樣品中的任何劣種朊病毒蛋白對蛋白酶消化的抵抗性更高，並存留下來，而且隨後可通過PlateliaTM測定對其進行檢測。在此實驗中，我們證明了一種可替代樣品蛋白酶消化的方法。應用設定好的條件，在此條件下溶液中生物素化戊聚糖聚硫酸酯可特異性地與樣品中的劣種朊病毒蛋白結合。然後應用鏈黴抗生物素蛋白超順磁珠俘獲劣種朊病毒/戊聚糖聚硫酸酯複合物。衝洗後，隨後可洗脫此劣種朊病毒蛋白，並在免疫測定中對其進行檢測。通過這種方案，正常朊病毒蛋白未被俘獲，並被衝洗掉，因此，在免疫測定中未檢測到正常朊病毒蛋白。我們證明通過應用這種技術，可準確地測定兩種感染BSE牛腦中的劣種朊病毒蛋白，而且在兩種正常牛腦中未觀察到任何信號。
實施例2應用固定的生物素化戊聚糖聚硫酸酯分離正常朊病毒和劣種朊病毒蛋白介紹應用標準化學方法，將生物素與戊聚糖聚硫酸酯綴合。使用這種生物素化戊聚糖聚硫酸酯包被鏈黴抗生物素蛋白衍化的超順磁珠。然後應用包被的珠特異地俘獲腦均漿中的劣種朊病毒蛋白。隨後，從這些珠上洗脫俘獲的劣種朊病毒蛋白，並應用基於免疫的Bio-Rad PlateliaTMBSE檢測試劑盒對其進行檢測；此試劑盒不能區別正常和劣種朊病毒蛋白，並可給出兩種蛋白的信號。對一組3種感染BSE和3種未感染牛腦進行研究，並用於證明在所述的特殊條件下，戊聚糖聚硫酸酯可特異地俘獲這些腦均漿中的劣種朊病毒蛋白。
方法製備包被戊聚糖聚硫酸酯的磁性珠1、在3個連續的1ml TBS(50mM Tris、150mM NaCl，pH7.5)中，通過磁性俘獲衝洗600μl鏈黴抗生物素蛋白超順磁珠(Sigma-AldrichCompany Ltd.，S-2415)。
2、最後在540μl TBS中再懸浮這些珠，並加入60μl含10mg/ml生物素化戊聚糖聚硫酸酯的TBS。在室溫下將這些珠孵育1小時，同時輕輕搖動，以使戊聚糖聚硫酸酯包被這些珠。
3、包被後，在3個連串的1ml 5％(w/v)牛白蛋白(Sigma-AldrichCompany Ltd.，A-7906)、pH8.4的50mM磷酸鹽緩衝液中，通過磁性俘獲衝洗這些珠，最後將它們再懸浮在60μl的相同緩衝液中。然後將這些珠備用。
製備腦均漿1、將每種300-500mg的腦組織加入包含研磨珠的研磨試管中，同時將這些試管裝入BSE Purification Kit(Bio-Rad)中。在使用前抽取試劑盒內這些試管中最初裝入的流體，並將其棄去。
2、將經過計算的150mM NaCl加入每個試管中，它可產生均化後的50％(w/v)腦均漿。
3、在ribolyzer(從Bio-Rad購得)上將這些試管均化45秒，速度設定在6.5。
4、用5％(w/v)牛白蛋白、pH8.4的50mM磷酸鹽緩衝液將此均漿稀釋5倍。
5、將每種45μl的均漿置於分離試管中。
6、將5μl 20％(w/v)SDS(十二烷醯硫酸鈉)(Sigma-Aldrich CompanyLtd.，L-5750)加入每個試管中，並充分混合。
7、然後在每個試管中加入450μl 5％(w/v)牛白蛋白、pH8.4的50mM磷酸鹽緩衝液，並混合。
8、然後加入50μl 20％(w/v)N-月桂醯肌氨酸(Sigma-AldrichCompany Ltd.，L-9150)，並混合。
特異性俘獲劣種朊病毒蛋白
1、將10μl製備好的包被戊聚糖聚硫酸酯的超順磁珠加入每種稀釋的腦均漿中，在室溫下孵育1小時，同時進行搖動。
2、然後用3×100μl TBS，通過磁性俘獲衝洗每種反應物。
Rogue朊病毒蛋白的洗脫和免疫測定1、將來自每種反應的珠再懸浮於10μl Cl(與Bio-Rad的PlateliaTMBSE檢測試劑盒一起提供)中。
2、將5μl 0.2％(w/v)SDS加入每種珠懸浮液中，並混合。
3、在每種珠懸浮液中加入5μl 1M硫氰酸胍(Sigma-AldrichCompany Ltd.，G-9277)，並混合。
4、將此反應在100℃加熱5分鐘。
5、然後加入100μl R6(與Bio-Rad的PlateliaTMBSE檢測試劑盒一起提供)，並混合。
6、然後將每種100μl的洗脫物用於Bio-Rad的PlateliaTMBSE檢測試劑盒，並使用此試劑盒一起提供的方案和試劑。簡要地，這種試劑盒包括正常和/或劣種朊病毒蛋白的免疫俘獲，以及應用辣根過氧化物酶綴合抗體的免疫測定。
結果在基於微量滴定平板的PlateliaTM測定中進行免疫測定後，應用ELISA讀數器，在波長450nm下測量每個孔中的信號。

這三種含有劣種朊病毒蛋白的感染BSE腦均漿的信號顯著高於未感染的正常腦均漿的信號。
討論這種Bio-Rad的PlateliaTMBSE檢測試劑盒不能區別正常或劣種朊病毒蛋白。正常情況下，應用蛋白酶K進行預消化，蛋白酶K除去對蛋白酶敏感的正常朊病毒蛋白，這樣獲得劣種朊病毒蛋白的特異性。樣品中的任何劣種朊病毒蛋白對蛋白酶消化的抵抗性更高，並存留下來，而且隨後可通過PlateliaTM測定對其進行檢測。在此實驗中，我們證明了一種可替代樣品蛋白酶消化的方法。應用設定好的條件，在此條件下戊聚糖聚硫酸酯可特異性俘獲與樣品中的劣種朊病毒蛋白。洗脫這種俘獲的劣種朊病毒蛋白，並在免疫測定中對其進行檢測。正常朊病毒蛋白未被戊聚糖聚硫酸酯俘獲，並被衝洗掉，因此，在免疫測定中未檢測到正常朊病毒蛋白。我們證明通過應用這種技術，可準確地測定這三種感染BSE牛腦中的劣種朊病毒蛋白，而且在三種正常牛腦中未觀察到任何信號。
實施例3.PPS的生物素化此方法的原理用糖醛酸殘基取代戊聚糖硫酸酯的聚木糖主鏈中約十分之一的糖殘基，接著用甲基酯在某些羧基上對其進行取代，因此在此分子中存在大量自由羧基，可用碳二亞胺對它們進行衍化，以形成活性的酯。接著可用氨基類對這些進行取代，以產生一種醯胺鍵。在這種特別的情況下，選擇EDC和NHS而形成活性酯，選擇生物素醯肼作為氨基類。進行兩個反應，第一步反應中，最初存在生物素醯肼，沒有加入任何NHS，在第二步反應中，使NHS/EDC與PS和生物素醯肼同時反應。
材料戊聚糖硫酸酯(Norton Healthcare)由Stephen Dealler贈送。
生物素醯肼100mg，Pierce #21339 mw 258.33批號AH41461EDC[1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺甲碘化物]Sigma#16，534-4，1g，NHS[N-羥基琥珀醯亞胺]Sigma #H7377 5g mw 115.1滲析管mwco 3.5k Pierce #68035DMSO Sigma方法應用下面兩種版本的方案進行這兩種反應，使用和未使用NHS
在玻璃瓶中，將100mg生物素醯肼溶解於6ml DMSO中，這可能需要加熱和超聲粉碎。因此其終濃度為16.7mg/ml或65mM。取1000mg戊聚糖硫酸酯，將其溶解在10ml DMSO和水的50/50混合物中，這個可在一種塑料通用容器中進行。在玻璃瓶中將10mg EDC溶解在1ml DMSO中，它可能需要加熱。將NHS(約40-50mg)溶解在1.0ml水中。
在錐形底聚苯乙烯通用容器中進行此反應，在此容器的磁性攪拌器底部具有一個小的環狀磁性攪拌器棒(直徑約10mm)，並且還安裝有一種直徑12mm(或更小)的聯合pH電極。
實施例3a未使用NHS的反應將5.0ml戊聚糖硫酸酯溶液置於反應器皿中，加入1.0ml生物素醯肼溶液，充分攪拌，記錄pH值。期望pH值可為7-8。加入0.2ml EDC溶液，在連續攪拌的同時，記錄pH值，並且通過一個玻璃微注射器和針頭加入10μl等份的1N HCl，在每次添加後均記錄pH值。連續加入酸，直至pH在5-6中。因為此反應產生OH離子，所以這是必須的。此反應物應當保持澄清，而且始終無色。如果產生一些生物素醯肼的白色沉澱，那麼DMSO的濃度應當升高，此靶值＞/＝50％。在室溫下使反應進行2-3小時(或過夜，如果這樣更方便)。
記錄此反應混合物的終pH值。加入等量的1M NaCl，將DMSO稀釋至25％，並替換離子性結合的醯肼，並將整個內容物轉移至長度為35cm，直徑為2.2cm的滲析管中。注意將DMSO濃度降低至25％，以避免破壞此滲析管，還應當在使用前用水試驗此滲析管，以檢測任何小孔，而且應當只充滿至1/3，這樣可在滲析時允許膨脹。對2L水滲析過夜，並這樣重複數次，滲析次數越多，戊聚糖硫酸酯可更強地保留鹼離子，這是藉助其強烈的陰電荷，通過非共價離子相互作用進行的。凍幹這種滲析溶液，並記錄乾重量。最終產物應當是一種堅硬的白色塊狀物。產量可有一些變化，但典型的是50-60％，大部分損耗發生在滲析時，這是由於戊聚糖硫酸酯MW的不均勻性，以及MW小於3500的種類丟失造成的。
實施例3b應用NHS的反應基本上按照上面所述進行此反應，除了在加入啟動反應的EDC試劑前加入1.0ml(44mg)的NHS外。起始pH值為6～7，並應當用1N HCl將其調節至大約5-6。
質量控制計算從乾燥重量的回收率後，在水中形成一種10mg/ml的溶液，並掃描其光譜為200至400nm。峰值應當在260和280nm，儘管有一個或兩者都可為不清晰的肩峰。這種吸附歸因於吡啶殘基，它在硫酸化步驟中被加入此分子中。它們可用於，例如在色譜法過程中監測戊聚糖硫酸酯的濃度。可通過在260nm的UV吸收，或者在較低的濃度下通過Toluidine Blue異染試驗，來監測戊聚糖。
實施例4血漿中朊病毒蛋白的去除Rogue朊病毒蛋白的去除1、將100μl製備好的戊聚糖聚硫酸酯包被的超順磁珠加入新近製備的人血漿等份的兩個中的一個，此血漿中摻加了PrpSc。將兩個等份血漿在室溫下均孵育1小時，同時搖動。
2、然後通過磁性俘獲將這些珠從此摻料的血漿等份中除去。然後檢測這種上清液以及剩餘血漿等份中的劣種朊病毒蛋白。
檢測摻料等份中的劣種朊病毒蛋白1、用蛋白酶K處理這兩種血漿等份，其處理條件是我們已指出的消化正常朊病毒蛋白，而使劣種蛋白完整保留的條件。可憑經驗很容易地確定這些條件。然後應用基於免疫的Bio-Rad PlateliaTMBSE檢測試劑盒，檢測這些蛋白酶K處理樣品中的劣種朊病毒蛋白。
結果在基於微孔板PlateliaTM測定法中進行免疫檢測後，應用ELISA讀數器在波長450nm下測定每個孔中的信號。在尚未用戊聚糖聚硫酸酯處理的摻料血清樣品中，可方便地檢測劣種朊病毒蛋白。相反，在此試驗中，戊聚糖聚硫酸酯處理的樣品中沒有任何信號，此表明在這種樣品中沒有留下任何可檢測的劣種朊病毒蛋白。
討論此實驗表明應用戊聚糖聚硫酸酯可有效地除去所研究樣品中的劣種朊病毒蛋白。
實施例5使戊聚糖聚硫酸酯與劣種朊病毒蛋白特異性結合的去汙劑條件的研究介紹應用標準化學方法，將生物素與戊聚糖聚硫酸酯綴合。使用這種生物素化戊聚糖聚硫酸酯包被鏈黴抗生物素蛋白衍化的超順磁珠。然後應用這些包被的珠建立去汙劑的條件，在此條件下戊聚糖聚硫酸酯可與劣種朊病毒蛋白結合，而不與正常細胞朊病毒蛋白結合。
方法製備包被戊聚糖聚硫酸酯的磁性珠1、在3個連串的1ml TBS(50mM Tris、150mM NaCl，pH7.5)中，通過磁性俘獲衝洗600μl鏈黴抗生物素蛋白超順磁珠(Sigma-AldrichCompany Ltd.，S-2415)。
2、最後在540μl TBS中再懸浮這些珠，並加入5％(w/v)牛白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich Company Ltd.，A-7906)和60μl含10mg/ml生物素化戊聚糖聚硫酸酯的TBS。在室溫下將這些珠孵育1小時，同時輕輕搖動，以使戊聚糖聚硫酸酯包被這些珠。
3、包被後，在3個連串的1ml 5％(w/v)BSA、pH8.4的50mM磷酸鹽緩衝液中，通過磁性俘獲衝洗這些珠，最後將它們再懸浮在60μl的相同緩衝液中。然後這些珠便可使用了。
製備腦均漿1、將每種300-500mg的感染BSE的牛腦組織和正常牛腦組織加入包含研磨珠的研磨試管中，同時將這些試管裝入BSE Purification Kit(Bio-Rad)中。在使用前抽取試劑盒內這些試管中最初裝入的流體，並將其棄去。
2、將經過計算的150mM NaCl加入每個試管中，它可產生均化後的50％(w/v)腦均漿。
3、在ribolyzer(從Bio-Rad購得)上將這些試管均化45秒，速度設定在6.5。
4、用5％(w/v)牛白蛋白、pH8.4的50mM磷酸鹽緩衝液將此均漿稀釋5倍。
5、將等份的每種45μl的均漿置於分離試管中。
6、將5μl 20％(w/v)SDS(十二烷醯硫酸鈉)(Sigma-Aldrich CompanyLtd.，L-5750)加入每個試管中，並充分混合。
7、然後在每個等份中加入450μl 5％(w/v)牛白蛋白、pH8.4的50mM磷酸鹽緩衝液，並混合。
8、然後將不同去汙劑濃度的50μl N-月桂醯肌氨酸(Sigma-AldrichCompany Ltd.，L-9150)加入各種等份，並混合。一組(一個感染BSE的和一個未感染的腦組織)中不加入任何N-月桂醯肌氨酸。
俘獲朊病毒蛋白1、將10μl製備好的包被戊聚糖聚硫酸酯的超順磁珠加入每種稀釋的腦均漿中，在室溫下孵育1小時，同時進行搖動。
2、然後用3×100μl TBS，通過磁性俘獲衝洗每種反應物。
朊病毒蛋白的洗脫和免疫測定1、將來自每種反應的珠再懸浮於10μl Cl(與Bio-Rad的PlateliaTMBSE檢測試劑盒一起提供)中。
2、將5μl 0.2％(w/v)SDS加入每種珠懸浮液中，並混合。
3、在每種珠懸浮液中加入5μl 1M硫氰酸胍(Sigma-AldrichCompany Ltd.，G-9277)，並混合。
4、將此反應在100℃加熱5分鐘。
5、然後加入100μl R6(與Bio-Rad的PlateliaTMBSE檢測試劑盒一起提供)，並混合。
6、然後將每種100μl的洗脫物用於Bio-Rad的PlateliaTMBSE檢測試劑盒，並使用此試劑盒一起提供的方案和試劑。簡要地，這種試劑盒包括正常和/或劣種朊病毒蛋白的免疫俘獲，以及應用辣根過氧化物酶綴合抗體的免疫測定。
結果在基於微量滴定平板的PlateliaTM測定中進行免疫測定後，應用ELISA讀數器，在波長450nm下測量每個孔中的信號。

在所有N-月桂醯肌氨酸的濃度下，感染BSE的腦組織和正常腦組織之間存在差別。0.2％ N-月桂醯肌氨酸是最佳的去汙劑濃度，它可使戊聚糖聚硫酸酯結合併俘獲劣種朊病毒蛋白，而不結合或俘獲正常朊病毒蛋白。在沒有N-月桂醯肌氨酸的情況下，即使存在SDS去汙劑，戊聚糖聚硫酸酯與劣種朊病毒蛋白結合和與正常朊病毒蛋白結合之間沒有差異。在這些條件下戊聚糖聚硫酸酯與正常和劣種朊病毒蛋白兩者都結合。
討論1、在這些特殊試驗條件下，戊聚糖聚硫酸酯與劣種朊病毒蛋白結合的特異性有賴於N-月桂醯肌氨酸或類似去汙劑的存在。沒有這種去汙劑，戊聚糖聚硫酸酯與正常和劣種朊病毒蛋白兩者都結合。
實施例6使戊聚糖聚硫酸酯與劣種朊病毒蛋白特異性結合的pH條件的研究介紹應用標準化學方法，將生物素與戊聚糖聚硫酸酯綴合。使用這種生物素化戊聚糖聚硫酸酯包被鏈黴抗生物素蛋白衍化的超順磁珠。然後應用這些包被的珠建立pH的條件，在此條件下戊聚糖聚硫酸酯可與劣種朊病毒蛋白結合，而不與正常細胞朊病毒蛋白結合。
方法製備包被戊聚糖聚硫酸酯的磁性珠1、在3個連串的1ml TBS(50mM Tris、150mM NaCl，pH7.5)中，通過磁性俘獲衝洗1ml等份鏈黴抗生物素蛋白超順磁珠(Sigma-Aldrich Company Ltd.，S-2415)。
2、最後在1ml TBS中再懸浮每等份的珠，並加入5％(w/v)牛白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich Company Ltd.，A-7906)和100μl含10mg/ml生物素化戊聚糖聚硫酸酯的TBS。在室溫下將這些珠孵育1小時，同時輕輕搖動，以使戊聚糖聚硫酸酯包被這些珠。
3、包被後，在3個連串的1ml 5％(w/v)BSA、pH8.4的50mM Tris緩衝液中，通過磁性俘獲衝洗每等份的珠。
4、然後將此等份的珠再懸浮在pH5.7、7.5、8.4和9.6的緩衝液中，這些緩衝液均含有5％(w/v)BSA。
在不同pH的緩衝液中製備腦均漿1、將每種300-500mg的感染BSE的牛腦組織和正常牛腦組織加入包含研磨珠的研磨試管中，同時將這些試管裝入BSE Purification Kit(Bio-Rad)中。在使用前抽取試劑盒內這些試管中最初裝入的流體，並將其棄去。
2、將經過計算的150mM NaCl加入每個試管中，它可產生均化後的50％(w/v)腦均漿。
3、在ribolyzer(從Bio-Rad購得)上將這些試管均化45秒，速度設定在6.5。
4、在均含有5％(w/v)BSA，pH為5.7、7.5、8.4和9.6的緩衝液中，將50μl的每種均漿稀釋5倍。
5、將每種稀釋的45μl的均漿置於分離試管中。
6、將5μl 20％(w/v)SDS(十二烷醯硫酸鈉)(Sigma-Aldrich CompanyLtd.，L-5750)加入每個試管中，並充分混合。
7、然後在每個中加入450μl與起始稀釋緩衝液pH相同的緩衝液，它們均含有5％(w/v)牛白蛋白，並混合。
8、然後加入50μl 20％N-月桂醯肌氨酸(Sigma-Aldrich CompanyLtd.，L-9150)，並混合。
腦均漿的珠俘獲1、將在相應pH值的緩衝液中的10μl製備好的包被戊聚糖聚硫酸酯的超順磁珠加入每種稀釋的腦均漿中，在室溫下孵育1小時，同時進行搖動。
2、然後用3×100μl TBS，通過磁性俘獲衝洗每種反應物。
劣種朊病毒蛋白的洗脫和免疫測定1、將來自每種反應的珠再懸浮於10μl Cl(與Bio-Rad的PlateliaTMBSE檢測試劑盒一起提供)中。
2、將5μl 0.2％(w/v)SDS加入每種珠懸浮液中，並混合。
3、在每種珠懸浮液中加入5μl 1M硫氰酸胍(Sigma-AldrichCompany Ltd.，G-9277)，並混合。
4、將此反應在100℃加熱5分鐘。
5、然後加入100μl R6(與Bio-Rad的PlateliaTMBSE檢測試劑盒一起提供)，並混合。
6、然後將每種100μl的洗脫物用於Bio-Rad的PlateliaTMBSE檢測試劑盒，並使用此試劑盒一起提供的方案和試劑。簡要地，這種試劑盒包括正常和/或劣種朊病毒蛋白的免疫俘獲，以及應用辣根過氧化物酶綴合抗體的免疫測定。
結果在基於微量滴定平板的PlateliaTM測定中進行免疫測定後，應用ELISA讀數器，在波長450nm下測量每個孔中的信號。

PH為7.5和更低時，此包被戊聚糖聚硫酸酯的珠可與正常和劣種朊病毒蛋白都結合。PH為9.6和更高時，此包被戊聚糖聚硫酸酯的珠不能與這兩種形式的朊病毒蛋白結合。PH為8.4時，此包被戊聚糖聚硫酸酯的珠俘獲劣種朊病毒蛋白，但不俘獲正常朊病毒蛋白。在這種pH下，此戊聚糖聚硫酸酯顯示出與劣種朊病毒蛋白結合的特異性。
討論在此試驗條件下，戊聚糖聚硫酸酯與劣種朊病毒蛋白結合的特異性有賴於pH。PH為8.4時，戊聚糖聚硫酸酯與劣種朊病毒蛋白結合，但不能與正常朊病毒蛋白結合。PH為7.5和更低時，戊聚糖聚硫酸酯可與正常和劣種朊病毒蛋白兩者都結合，而PH為9.6和更高時，戊聚糖聚硫酸酯不能與劣種或正常朊病毒蛋白結合。因此，為了在這些條件下使戊聚糖聚硫酸酯與劣種朊病毒蛋白特異性結合，所應用的pH值應當接近8.4。
實施例7應用競爭性較低電荷密度聚陰離子將PrPres(PrPSc)特異性俘獲至高電荷密度聚陰離子配體，以選擇性抑制PrPc的結合的論證背景技術PrP可結合於固定的聚陰離子。俘獲緩衝液中無競爭性聚陰離子存在的情況下，PrPres和PrPSc均可被俘獲。通過在俘獲緩衝液中包括一種聚陰離子，其電荷密度低於俘獲聚陰離子的電荷密度，這樣可獲得特異性的PrPres俘獲。在此實施例中，葡聚糖硫酸酯用作高電荷密度俘獲聚陰離子，N-月桂醯肌氨酸(它形成多分子去汙劑膠束)和戊聚糖聚硫酸酯或巖藻依聚糖用作較弱電荷密度競爭聚陰離子。
方法1、按照標準步驟，用葡聚糖硫酸酯(500000mwt)包被Maxisorp微量滴定孔。
2、將100μl含有1mg腦組織、pH8.3的50mM Tris、1％(w/v)BSA、1％(v/v)Triton X-100的腦均漿加入此包被的孔中。在某些情況下，這種俘獲緩衝液也可含有1％(w/v)N-月桂醯肌氨酸、巖藻依聚糖、葡聚糖硫酸酯或各種濃度的戊聚糖聚硫酸酯。
3、孵育2小時，以進行朊病毒蛋白的俘獲，然後用50mM Tris pH8.3、1％(w/v)BSA、1％(v/v)Triton X-100將此孔衝洗3遍。
4.然後用PBS將這些孔衝洗3遍。
5、將100μl 5M硫氰酸胍加入每個孔中，並在4℃孵育5分鐘。
6、用PBS將孔衝洗3遍，然後應用Bio-rad PlateliaTMBSE檢測試劑盒的抗朊病毒蛋白綴合物，按照此試劑盒的方案，檢測俘獲的朊病毒蛋白。
7、在OD450下，在ELISA讀數器中測定顯影的信號。
結果

討論在俘獲緩衝液中沒有競爭性聚陰離子存在的情況下，所有信號較低，而且感染腦或正常腦的信號沒有差別，即不存在PrPres的特異性俘獲。但是，在俘獲緩衝液中包括一種競爭性聚陰離子後，感染腦的信號則得到提高，而相應正常或未感染腦的信號卻被抑制。在這個實施例中，在俘獲緩衝液中應用1％(w/v)N-月桂醯肌氨酸，感染腦和正常腦之間則可獲得最佳的區別。另外，應用巖藻依聚糖或戊聚糖聚硫酸酯也可獲得感染腦和正常腦之間的區別。應用戊聚糖聚硫酸酯時，通過將俘獲緩衝液中競爭性聚陰離子戊聚糖聚硫酸酯的濃度從0.1提高到1mg/ml，則可增大這種區別。比較而言，如果俘獲緩衝液中包括葡聚糖硫酸酯，則如所期望的那樣，此信號被降低到背景值，因為它競爭並抑制PrP與固定的葡聚糖硫酸酯結合。
實施例8將PrPres特異性俘獲至高電荷密度聚陰離子包被表面的論證背景技術在這個實驗中，證明可將PrPres特異性俘獲至一種聚陰離子表面。在此實例中，所提供的表面為衍化的馬來酸酐聚苯乙烯。對照物為不帶電的polysorp和maxisorp孔。在其它實驗中，已證明可用聚陰離子葡聚糖硫酸酯衍化這些不帶電的表面，然後它們可結合PrPres。
方法1、在室溫下，用TBS 5％(w/v)BSA將馬來酸酐活化的聚苯乙烯微量平板孔(Perbio Science UK Ltd.，Cheshire)衍化60分鐘。這樣在這種塑料上產生一種羧基帶電錶面(參見產品文獻)。也研究作為不帶電對照物的polysorp和maxisorp孔(Nunc)。另外，按照實施例9中所述的步驟，也用聚陰離子葡聚糖硫酸酯配體包被maxisorp孔。
2、將100μl腦均漿加入此孔中，其中腦均漿在50mM Tris pH8.3、1％(w/v)BSA、1％(v/v)Triton X-100、1％(w/v)N-月桂醯肌氨酸中含有1mg感染或未感染的腦組織。
3、孵育2小時，以俘獲朊病毒，然後用50mM Tris pH8.3、1％(w/v)N-月桂醯肌氨酸將這些孔衝洗3遍。
4、然後用PBS將這些孔衝洗3遍。
5、在每個孔中加入100μl 5M硫氰酸胍，並在4℃下孵育5分鐘。
6、用PBS將這些孔衝洗3遍，然後應用Bio-Rad PlateliaTMBSE-檢測試劑盒的抗朊病毒綴合物，按照此試劑盒中的方案檢測俘獲的朊病毒。
7、在OD450下，在ELISA讀數器中測定增強的信號。
結果

討論在本實驗所用的條件下，此陰離子聚苯乙烯表面特異性俘獲PrPres。不帶電塑料沒有這種作用，除非用聚陰離子配體包被它。
實施例9在陰性樣品中稀釋陽性腦樣品的作用的研究材料陽性樣品已知PrPSc陽性腦均漿的25％懸浮液陰性樣品已知PrPSc陰性腦均漿的25％懸浮液製備按照下麵包被方案包被Maxisorb平板。在pH7.4的碳酸鹽緩衝液中，將1mg溴化己二甲胺包被在這些平板上，並使其過夜後，用PBS衝洗3遍。然後用含1mg葡聚糖硫酸酯的PBS包被這些平板，6小時後，用PBS將這些平板衝洗3遍，然後通過加入400μl 5％ BSA溶液並保持30分鐘，用5％ BSA將其封阻。然後用PBS將這些平板衝洗3遍，並使其乾燥。
樣品製備在陰性腦中稀釋樣品的製備

在水中稀釋樣品的製備

進行測定前樣品的製備將40μl樣品與60μl水和25μl俘獲緩衝液混合，此緩衝液含pH8.4的Tris 250mM，5％ BSA，5％ Triton X-100，5％ Sarkosyl，1.25mg/ml胰蛋白酶。
按照下面的測定方案進行測定
1、將100μl樣品加至平板上，並在室溫下孵育120分鐘。
2、用50mM Tris pH8.4+1％ Sarkosyl衝洗3遍，並用PBS衝洗3遍。
3、加入100μl含4M GuSCN的20％PEG，並在2-8℃孵育10分鐘。
4、用PBS衝洗3遍。
5、加入100μl Bio-Rad PlateliaTM酶抗體綴合物，並在2-8℃孵育60分鐘。
6、用Bio-Rad PlateliaTM洗滌劑衝洗5遍。
7、加入100μl Bio-Rad PlateliaTM底物，並在黑暗中孵育30分鐘。
8、加入100μl Bio-Rad PlateliaTM終止溶液，並讀數。
平板布置圖

ABCDEFGH
所得結果如下在陰性腦組織中稀釋10mg腦均漿

在水中稀釋10mg腦均漿

總結

附圖1是這些結果的圖示，它顯示分別用水和陰性腦組織稀釋陽性腦組織的稀釋曲線。這兩個曲線基本上是相同的，表明陰性腦組織材料的存在未乾擾此測定。
實施例10阿耳茨海默腦中的聚集τ蛋白和正常年齡相當對照物的俘獲我們已表明，在設定的條件下，不同選擇性俘獲劑對聚集的病原性朊病毒蛋白是特異的，這樣不會俘獲正常未聚集朊病毒。這種聚集的朊病毒蛋白具有一種伸展的β-摺疊片結構，而正常的朊病毒在結構上大部分為α螺旋。這個實施例表明其它聚集的β-摺疊片蛋白，諸如阿耳茨海默病中發現的τ聚集體可類似地被選擇性俘獲。
方法1、在蒸餾水中製備阿耳茨海默病腦組織和年齡相當對照腦組織的25％(w/v)的腦均漿。
2、在俘獲緩衝液(50mM Tris pH8.4、1％(v/v)Triton X-100、1％(w/v)N-月桂醯肌氨酸、1％(w/v)BSA)中將4μl腦均漿製成100μl。
3、在含有25μg胰蛋白酶的俘獲緩衝液中，將25μl腦均漿製成100μl。
4、將按照上面步驟2和3製備的雙份100μl等份腦均漿加入葡聚糖硫酸酯包被的微量滴定孔中，並在室溫下孵育2小時。
5、然後用50mM Tris pH8.4、1％(w/v)N-月桂醯肌氨酸將這些孔衝洗3遍。
6、用一種在PBS 0.1％(v/v)Tween20中的抗τ單克隆抗體孵育這些樣品。
7、在室溫下1小時後，用PBS 0.1％(v/v)Tween20將這些孔衝洗3遍。
8、按照標準步驟，用一種抗鼠IgG辣根過氧化物綴合物檢測固定的主要抗體。
結果抗τ抗體的結果

討論已知大部分老年個體的腦組織含有聚集τ蛋白，但在阿耳茨海默病中這些聚集體比年齡相當的對照者更多。在這裡，選擇性俘獲劑俘獲這些聚集體。在本實施例中，胰蛋白酶的消化作用減少了此蛋白的結合，並降低了信號，但在這些條件下，不能將其降低至背景值。在阿耳茨海默病中，胰蛋白酶處理後信號與未處理的信號的比率比對照更高。這提示，與年齡相當的對照者相比，阿耳茨海默病的腦組織中存在更多的抵抗蛋白酶的τ蛋白聚集體。
實施例11在PrPSc陽性樣品上滴定胰蛋白酶的作用方法包被葡聚糖硫酸酯的平板將1mg溴化己二甲胺(溴化己二甲胺)(100μl在pH7.4碳酸鹽緩衝液中含10mg/ml)包被在Maxisorb平板上，在室溫下使其過夜。
然後用PBS將每個平板衝洗3遍，並用1mg葡聚糖硫酸酯(MW500000)(在pH8.6的Tris緩衝液中含10mg/ml)包被這些平板，並在室溫下保持4小時。
然後用PBS將這些平板衝洗3遍，然後用300μl含5％ BSA溶液的TBS封阻，並在室溫下保持30分鐘。
然後用PBS將平板衝洗3遍。
俘獲緩衝液pH8.4的250mM Tris緩衝液，它含有5％ BSA、5％ Sarkosyl、5％Triton。
樣品按照以下處理弱和強陽性的腦BI63和SV10(25％均漿)，以提供用於測定的樣品。
25μl腦均漿+25μl俘獲緩衝液+65μl水，此緩衝液含250mM TrispH8.4、5％ BSA、5％ Triton X-100、5％ Sarkosyl。
將10μl不同濃度的胰蛋白酶加入樣品中。
衝洗緩衝液50mM Tris pH8.4+1％Sarkosyl方法測定方案1、將100μl樣品加至平板上，並在室溫下孵育120分鐘。
2、用50mM Tris pH8.4+1％Sarkosyl衝洗3遍，並用PBS衝洗3遍。
3、加入100μl 4MGuSCN(在20％ PEG中)，在2-8℃孵育10分鐘。
4、用PBS衝洗3遍。
5、加入100μl Bio-Rad PlateliaTM酶抗體綴合物，並在2-8℃孵育60分鐘。
6、用Bio-Rad PlateliaTM洗滌劑衝洗5遍。
7、加入100μl Bio-Rad PlateliaTM底物，並在黑暗中孵育30分鐘。
8、加入100μl Bio-Rad PlateliaTM終止溶液，並讀數。
結果5mg陽性腦Bi63

5mg陽性腦SV10

結論胰蛋白酶的存在似乎可增強此信號。還有，似乎所用胰蛋白酶的濃度範圍可以寬泛，這對測定沒有不良的影響。
實施例12通過聚陽離子對PrPSc特異性結合的論證方法本實施例證明應用不同的聚陽離子進行PrPSc的特異性結合。或者將此配體被動地包被在聚苯乙烯微量平板上，或者適當地，主動地將其包被在馬來酸酐平板上(即結合)。
選擇性結合劑固定在16-25℃，以濃度為10μg/ml，將所有選擇性結合劑固定在pH9.6的50mM碳酸鹽緩衝液中，過夜。固定後，用PBS將這些孔衝洗3遍，然後用含5％(w/v)BSA的PBS封阻30分鐘。封阻後，在使用前用PBS將這些孔衝洗2遍。將PAMA樹突狀聚合物starbust、聚L-賴氨酸和聚乙烯亞胺包被在Maxisorp和馬來酸酐微量平板兩者上，而將polybreen和pDADMAC只包被在Maxisorp板上。
PrPSc的俘獲1、按照市售規定的方案，在蒸餾水中均化感染BSE牛腦和未感染牛腦。
2、在總量為100μl的50mM Tris pH8.3、1％(w/v)N-月桂醯肌氨酸、1％(v/v)Triton X-100、1％(w/v)BSA、0.5mg/ml胰蛋白酶(豬胰腺)中，於包被配體的孔中俘獲0.5mg均化腦組織。
3、在18-25℃俘獲2小時後，用50mM Tris pH8.3、1％(w/v)N-月桂醯肌氨酸將這些孔衝洗3遍。
4、然後用PBS將這些孔衝洗3遍，並在4-8℃，用100μl 4M硫氰酸胍、20％ PEG 8000將這些孔孵育10分鐘。
5、用PBS衝洗這些孔3遍，然後用一種抗朊病毒單克隆抗體辣根過氧化物綴合物孵育這些孔。
6、60分鐘後，用PBS，0.1％(v/v)Tween20將這些孔衝洗5遍，並加入100μl TMB底物。
7、30分鐘後，測定每個反應的OD450，並記錄(見下表)。
結果

*Aldrich 40903-0-mw 400,000-500,000討論當將pDADMAC和PAMA樹突狀聚合物starburst聚陽離子被動地包被在聚苯乙烯微量平板上時，它們很好地充當了PrPSc特異性配體。在這一系列結合劑中pDADMAC作用最佳。當將聚乙烯亞胺固定在馬來酸酐微量平板上時，它通過氨基發揮一定程度的作用。
這個實驗表明，在給定的俘獲緩衝液條件下，不同聚陽離子可用於特異性俘獲感染腦組織中的PrPSc。可將這些結合劑被動或主動地固定在聚乙烯亞胺表面。其它實驗已經表明，在俘獲緩衝液中具有1％(w/v)N-月桂醯肌氨酸時，可獲得20mg陽性腦組織的最大信號；沒有N-月桂醯肌氨酸時，此信號減小。這表明在規定的緩衝條件下這些俘獲劑作用最佳。
實施例13通過聚陽離子結合劑，俘獲阿耳茨海默病腦組織和正常年齡相當對照物中的聚集B澱粉狀蛋白和τ蛋白背景技術在規定的條件下，已顯示出pDADMAC可特異地俘獲聚集的病原性朊病毒蛋白；而正常非聚集朊病毒未被俘獲。這種聚集的朊病毒蛋白具有一種伸展的β-摺疊片結構，而正常的朊病毒在結構上大部分為α螺旋。假定此結合劑可識別其它聚集的β-摺疊片蛋白，諸如阿耳茨海默病中發現的β-澱粉狀蛋白和τ蛋白聚集體。進行下面的實驗，以研究此假說。
方法1、在蒸餾水中製備阿耳茨海默病腦組織和年齡相當對照腦組織的25％(w/v)的腦均漿。
2、在俘獲緩衝液(50mM Tris pH8.4、1％(v/v)Triton X-100、1％(w/v)N-月桂醯肌氨酸、1％(w/v)BSA)中將80μl腦均漿製成100μl，並將其加至包被聚陽離子的微孔(通過用聚(氯化二烯丙基二甲銨)(pDADMAC)包被這些孔而形成，(Aldrich Chemical Company Inc.，產品目錄號40，903-0))上。
3、在室溫下孵育2小時後，用50mM Tris pH8.4，1％(w/v)N-月桂醯肌氨酸將這些孔衝洗3遍，然後用一種在PBS 0.1％(v/v)Tween20中的抗τ單克隆抗體進行孵育。
4、在室溫下1小時後，用PBS 0.1％(v/v)Tween20將這些孔衝洗3遍。
5、按照標準步驟，用抗鼠IgG辣根過氧化物綴合物檢測固定的主要抗體。
結果

討論這些聚陽離子結合劑可俘獲τ聚集體。當用抗τ抗體檢測俘獲的τ蛋白時，阿耳茨海默病的腦組織的陽性信號均高，而陰性對照腦組織則為低的陰性信號。總之，在指定條件下用聚陽離子進行俘獲，可將阿耳茨海默病腦組織和未患病的腦組織區分開。
實施例14不同蛋白酶和DNase對pDADMAC俘獲PrPSc的基質抑制的影響背景技術研究不同蛋白酶對俘獲PrPSc效力的影響，此俘獲是將PrPSc俘獲在聚陽離子包被的平板(通過用聚(氯化二烯丙基二甲銨)(pDADMAC)包被這些孔而形成，(Aldrich Chemical Company Inc.，產品目錄號40，903-0))上。
方法1、加入20μl俘獲緩衝液(250mM Tris pH8.3、5％(v/v)TritonX-100、5％(w/v)N-月桂醯肌氨酸、5％(w/v)BSA)，將80μl腦均漿製成100μl，此緩衝液中含有不同的蛋白酶和/或DNase。
2、然後將這些均漿加至聚陽離子包被的微孔上。
3、在室溫下孵育2小時後，用PBS將這些孔衝洗6遍。
4、將100μl 4M硫氰酸胍、20％(w/v)PEG加至每個孔中。
5、在室溫下孵育10分鐘後，用PBS將這些孔衝洗3遍。
6、加入100μl抗朊病毒蛋白辣根過氧化物綴合物(在PBS 0.1％(v/v)Tween 20和5％(w/v)BSA中稀釋為1∶1500)。
7、在室溫下1小時後，用PBS 0.1％(v/v)Tween20將這些孔衝洗5遍。
8、按照標準方案，用TMB溶液檢測固定的綴合物。
結果評價俘獲緩衝液中糜蛋白酶、胰蛋白酶、DNase和蛋白酶K的作用

滴定俘獲緩衝液中胰蛋白酶和糜蛋白酶的濃度

討論已證明，在某些條件下聚陽離子配體可特異性地結合PrPSc。但是，腦均漿的構成產生的基質作用可減小此信號，這種基質作用可幹擾結合，並減小信號。應用蛋白酶可減小這種基質作用，並增大感染腦組織中的信號。此研究表明胰蛋白酶、糜蛋白酶和蛋白酶K在去除基質抑制方面是有效的；鏈黴蛋白酶(在研究的濃度下)的有效性較低。濃度6.25-1.15mg/ml的胰蛋白酶，其有效性是相等的；而隨著濃度升高，糜蛋白酶的有效性則更高。在去除基質抑制方面，DNase具有可論證的作用，但此作用較小。
實施例15DH和鹽對pDADMAC俘獲朊病毒蛋白的影響背景技術研究pH和鹽濃度對俘獲PrPSc效力的影響，此俘獲是將PrPSc俘獲在聚陽離子包被的平板(通過用聚(氯化二烯丙基二甲銨)(pDADMAC)包被這些孔而形成，(Aldrich Chemical Company Inc.，產品目錄號40，903-0))上。
方法1、加入20μl俘獲緩衝液(250mM Tris，pH見表、5％(v/v)TritonX-100、5％(w/v)N-月桂醯肌氨酸、5％(w/v)BSA和6.25mg/ml胰蛋白酶)，將80μl腦均漿製成100μl，此緩衝液中含有不同濃度的鹽，且被調節至不同的pH。
2、然後將這些均漿加至聚陽離子包被的微孔上。
3、在室溫下孵育2小時後，用PBS將這些孔衝洗6遍。
4、將100μl 4M硫氰酸胍、20％(w/v)PEG加至每個孔中。
5、在室溫下孵育10分鐘後，用PBS將這些孔衝洗3遍。
6、加入100μl抗朊病毒蛋白辣根過氧化物綴合物(在PBS 0.1％(v/v)Tween 20和5％(w/v)BSA中稀釋為1∶1500)。
7、在室溫下1小時後，用PBS 0.1％(v/v)Tween20將這些孔衝洗5遍。
8、按照標準方案，用TMB溶液檢測固定的綴合物，並測定此反應的OD450。
結果pH的影響

鹽的影響

討論當俘獲緩衝液的pH值下降時，未感染腦組織的信號升高，但感染腦組織的信號卻下降。當pH值大於8.0時，獲得最佳的陽性/陰性信號比。
當俘獲緩衝液中的鹽濃度升高時，感染腦的信號逐漸下降。這表明對於PrPSc俘獲，低鹽濃度或沒有鹽是最佳的條件。
實施例16不同的N-月桂醯肌氨酸和蛋白酶的濃度對pDADMAC俘獲PrPSc的影響背景技術研究胰蛋白酶存在或不存在情況下，不同N-月桂醯肌氨酸濃度對俘獲PrPSc效力的影響.此俘獲是將PrPSc俘獲在聚陽離子包被的平板(通過用聚(氯化二烯丙基二甲銨)(pDADMAC)包被這些孔而形成，(AldrichChemical Company Inc.，產品目錄號40，903-0))上。
方法1、加入20μl俘獲緩衝液(250mM Tris pH8.3、5％(v/v)TritonX-100、5％(w/v)BSA)，將80μl感染的腦均漿製成100μl，此緩衝液中含有不同濃度的蛋白酶和N-月桂醯肌氨酸。
2、然後將這些均漿加至聚陽離子包被的微孔上。
3、在室溫下孵育2小時後，用PBS將這些孔衝洗6遍。
4、將100μl 4M硫氰酸胍、20％(w/v)PEG加至每個孔中。
5、在室溫下孵育10分鐘後，用PBS將這些孔衝洗3遍。
6、加入100μl抗朊病毒蛋白辣根過氧化物綴合物(在PBS 0.1％(v/v)Tween 20和5％(w/v)BSA中稀釋為1∶1500)。
7、在室溫下1小時後，用PBS 0.1％(v/v)Tween20將這些孔衝洗5遍。
8、按照標準方案，用TMB溶液檢測固定的綴合物。
結果

討論在沒有N-月桂醯肌氨酸的情況下，具有低濃度胰蛋白酶的感染腦組織沒有信號。但是，在較高濃度的胰蛋白酶下，不含N-月桂醯肌氨酸的腦組織恢復一些信號。
儘管通過優選的實施方式對本發明進行了特別的描述，但將會理解到對本發明的許多修改和改變是可能在本發明的一般範圍內。如權利要求詳述的，按照相同方法產生相同結果的對本發明的任何改變是在申請人所給予的保護範圍內。
在本說明書中，除非特意地另作說明，術語「或」用作運算符，當任一或兩者所述的條件符合時，它返回一個真值，這與運算符「異或」相反，「異或」運算符需要只有其中一個條件符合。術語「包括」的意思是「包括」，而不是「由...組成」的意思。
權利要求
1.一種方法，它用於在一種蛋白的非聚集正常形式存在的情況下，選擇性結合此蛋白聚集性異常形式，它包括在選擇性結合條件下使一種含有所述異常和正常形式的物質與一種結合劑接觸，此結合劑為一種聚離子物質，此聚離子物質對樣品中存在的所述蛋白聚集形式具有結合親合力。
2.一種權利要求1要求的方法，其中所述的選擇性結合條件包括溶液中存在一種競爭劑，此競爭劑具有離子基團，此基團對此異常形式蛋白的結合親合力低於聚離子物質。
3.一種權利要求1或2所要求的方法，其中結合劑是抗蛋白酶的。
4.一種上述任一權利要求所要求的方法，其中在所述結合過程中存在蛋白酶，或者其中在被結合後使所述的蛋白暴露於一種蛋白酶的作用。
5.一種上述任一權利要求所要求的方法，其中此結合劑是一種聚陰離子物質，它具有多種陰離子基團，或者此結合劑是一種聚陽離子物質，它具有多種陽離子基團。
6.一種權利要求5所要求的方法，其中所述聚離子物質具有大量陰離子基團，這些基團為硫酸基、羧基或磷酸基，或者所述聚離子物質具有大量陽離子基團，這些基團為氨基、亞胺基或季銨基。
7.一種權利要求6所要求的方法，其中所述聚離子物質為一種聚陰離子多糖苷。
8.一種權利要求7所要求的方法，其中聚陰離子多糖苷為一種聚磺化多糖苷。
9.一種權利要求8所要求的方法，其中聚陰離子多糖苷為一種聚陰離子戊聚糖衍生物或葡聚糖衍生物。
10.一種權利要求9所要求的方法，其中聚磺化多糖苷為戊聚糖聚硫酸酯(PPS)或葡聚糖硫酸酯。
11.一種權利要求5所要求的方法，其中所述聚離子物質為溴化己二甲胺、PAMAM樹突狀聚合物、聚L-賴氨酸、pDADMAC或聚乙烯亞胺。
12.一種上述任一權利要求所要求的方法，其中競爭劑離子基團的密度低於此聚離子物質。
13.一種權利要求12所要求的方法，其中此競爭劑是陰離子的。
14.一種權利要求13所要求的方法，其中此競爭劑為一種陰離子去汙劑。
15.一種權利要求13所要求的方法，其中此競爭劑為一種脂肪酸的胺基酸醯胺。
16.一種權利要求15所要求的方法，其中此競爭劑為n-月桂醯肌氨酸。
17.一種上述任一權利要求所要求的方法，其中pH值是如此，以促進此結合劑與此異常形式蛋白的所述結合。
18.一種權利要求17所要求的方法，其中此pH值為8～9。
19.一種權利要求18所要求的方法，其中此pH值為8.2～8.6。
20.一種上述任一權利要求所要求的方法，其中存在一種去汙劑，它促進結合劑與此異常形式蛋白的結合。
21.一種上述任一權利要求所要求的方法，其中所述結合劑在與所述聚集異常形式蛋白結合後，用一種固定的俘獲劑俘獲此結合劑。
22.一種權利要求21所要求的方法，其中所述俘獲劑為一種凝集素或一種可與所述結合劑反應的抗體。
23.一種權利要求21所要求的方法，其中提供的所述結合劑具有選擇性可結合標記部分，而且所述俘獲劑與所述標記部分結合。
24.一種權利要求1至20中任一所要求的方法，其中在此結合劑暴露於所述異常形式蛋白之前，將此結合劑固定在一種固體介質上。
25.一種權利要求24所要求的方法，其中介質為一種所述結合劑包被在其上的底物。
26.一種權利要求24所要求的方法，其中提供的結合劑具有一種選擇性可結合標記部分，並且通過所述標記部分將此結合劑固定在所述固體介質上。
27.權利要求23或權利要求26中所要求的方法，其中所述的可結合標記部分為生物素、螢光素、二硝基苯酚、異羥洋地黃毒苷元、核酸或核酸類似物序列或(His)6。
28.權利要求1至20中任一所要求的方法，其中為固體形式的所述結合劑提供一種表面，此表面具有所述的結合親合力。
29.一種權利要求28所要求的方法，其中此表面是一種具有離子基團的聚合物的表面，這些離子基團是在此聚合物結構內共價結合的，或者是通過修飾此聚合物的表面基團而產生的。
30.一種測定方法，它用於測定樣品中異常聚集形式蛋白的存在，所述方法包括按照上述任一權利要求，結合所述異常形式蛋白，然後測定此蛋白與結合劑的結合的存在或結合量。
31.一種權利要求30所要求的方法，其中通過對此蛋白聚集形式進行免疫測定，定性或定量地測定所述結合。
32.一種權利要求30或31所要求的方法，其中在正常非聚集形式蛋白存在的情況下，選擇性地進行此蛋白異常聚集形式的結合，然後從非結合正常形式蛋白中分離結合的聚集形式的蛋白，此後測定所述結合的存在或量。
33.一種上述任一權利要求要求的方法，其中所述異常形式的蛋白為PrPSc，所述正常形式的蛋白為PrPc。
34.一種從PrPc中分離PrPSc的方法，它包括在一種脂肪酸的胺基酸醯胺存在下，選擇性將PrPSc結合於一種結合劑。
35.一種權利要求34所要求的方法，其中此結合劑為聚離子物質。
36.一種權利要求34或權利要求35所要求的方法，其中脂肪酸的胺基酸醯胺為N-月桂醯肌氨酸。
37.一種權利要求34至36中任一項的方法，此方法在pH為8～9下進行。
38.一種結合劑，它是一種聚陰離子多糖苷，己二甲胺，或者是一種聚陽離子結合劑，它綴合於可結合的標記部分，由此通過所述可結合標記部分與所述固體介質上的俘獲劑結合，結合劑可被固定在固體介質上。
39.一種權利要求38所要求的選擇性結合劑，其中此結合劑為聚磺化多糖苷。
40.一種權利要求38所要求的選擇性結合劑，其中此結合劑為聚陰離子戊聚糖衍生物或葡聚糖衍生物。
41.一種權利要求38所要求的選擇性結合劑，其中此結合劑為一種聚陽離子物質，它選自溴化己二甲胺、PAMAM樹突狀聚合物、聚L-賴氨酸、pDADMAC或聚乙烯亞胺。
全文摘要
在正常形式蛋白存在情況下，在選擇性結合條件下應用一種聚離子結合劑，選擇性地結合感染的聚集形式蛋白，諸如PrP、澱粉狀蛋白和τ蛋白，所述結合劑諸如為葡聚糖硫酸酯或戊聚糖(陰離子)，或者為聚胺化合物，諸如pDADMAC(陽離子)，所述選擇性結合條件包括在輕度鹼性pH下應用n－月桂醯肌氨酸，然後可測定這種感染的聚集形式的蛋白。
文檔編號G01N33/68GK1643381SQ03806690
公開日2005年7月20日 申請日期2003年2月28日 優先權日2002年2月28日
發明者A·R·萊恩, C·J·斯坦利, S·M·威爾森 申請人:米克羅森拜奧菲哲有限公司