一種評價棉鈴蟲抗性治理效果的方法
2023-06-17 17:21:36
專利名稱：一種評價棉鈴蟲抗性治理效果的方法
技術領域：
本發明涉及生物檢測領域，具體地，涉及一種評價棉鈴蟲抗性治理效果的方法。
背景技術：
棉花是關係國計民生的戰略物資，也是僅次於糧食的第二大農作物。棉鈴蟲是危害棉田的主要害蟲之一，上世紀90年代初棉鈴蟲的大爆發給我國的國民經濟造成了巨大的經濟損失。為了有效的防治棉鈴蟲，1996年轉基因棉花在美國商業化種植，之後其種植面積在世界範圍內快速增長，我國1997年由河北省開始引種美國Bt-CrylAc抗蟲棉，1999 年國產抗蟲棉開始商業化種植。2001年以前Bt棉花主要種植於黃河流域棉區，種植面積約50萬公頃，到2006年已廣泛種植於各個棉區，面積達400萬公頃，佔全國棉花種植面積的70%，2011年中國的轉基因棉花種植比例達到71. 5%。
轉Bt棉花的廣泛種植在帶來巨大收益的同時，害蟲對Bt的抗藥性也成為一個不容忽視的問題。Tabashnik等2008年報導美國的東南部棉鈴蟲在田間對Bt棉產生了抗性； Tabashnik等2010報導印度從2002年開始使用第一代轉基因棉花，到2009年田間的紅鈴蟲已對CrylAc產生了抗性。很多國際育種公司先後開發了第二代轉基因棉花，如Monsanto 公司的 Bollgard II (表達 Cry2Ab 和 CrylAc 蛋白)，DowAgroSciences 公司的 WideStrike (表達CrylF和CrylAc蛋白)，Syngenta公司的VipCot (表達Vip3A和CrylAb蛋白)等。
轉雙價基因抗蟲棉花除擴大殺蟲譜外，還可以起到延緩靶標害蟲抗性發展的作用。因此，新蛋白的選擇基本原則是表達的兩種蛋白之間不存在交互抗性，評價新蛋白與抗性棉鈴蟲的交互抗性及蛋白間的協同作用，對未來轉雙價基因抗蟲棉花的推廣具有重要影響。轉基因植物的製備過程是一個複雜漫長的過程，受多種因素的影響，轉基因植物由於基因突變等影響，其效果具有不確定性，需要進行大量篩選工作。因此，在新基因轉入棉花前， 在室內對其新型蛋白的效果進行評價可以節省大量的人力、物力、財力。
目前主要是採用多次生物測定的方法分別測定新蛋白對棉鈴蟲的防治效果、新蛋白對抗性棉鈴蟲的治理效果、兩種蛋白混用對敏感棉鈴蟲的增效；沒有評價兩種蛋白混用對抗性棉鈴蟲的治理效果。
因此迫切需要一種通過一次生物測定，就可以評價兩種蛋白混用治理棉鈴蟲的效果O發明內容
本發明目的是提供一種評價棉鈴蟲抗性治理效果的方法，用於簡單、快速、高效的全面評價兩種蛋白的作用效果。
本發明通過二因素D-飽和最優試驗設計、採用表面塗抹法對敏感和抗性棉鈴蟲初孵幼蟲分別進行生物測定，根據回歸方程，對兩種蛋白的作用效果、主要作用因子、最優的濃度組合進行分析。
具體地，所述方法包括以下步驟
I)選擇兩種用於治理棉鈴蟲的藥物；
2)接種敏感或抗性棉鈴蟲幼蟲；
3)觀察幼蟲死亡情況，計算死亡率；
4)建立二因素D-飽和方法建立回歸方程，評價兩種藥物的治理效果。
其中，所述藥物為Cry2Ab蛋白、CryIAb蛋白、CrylF蛋白、Vip3A蛋白和CrylAc蛋白等中的任意兩種。所述藥物的濃度為0-4. 760 μ g/cm2。
其中，所述棉鈴蟲幼蟲的接種量為24頭以上棉鈴蟲幼蟲/單位體積藥物。所述棉鈴蟲幼蟲培養的人工飼料為改進的棉鈴蟲飼料，飼料組成包括玉米粉、黃豆粉、酵母粉、蔗糖、維生素(具體配方參照《人工飼養棉鈴蟲技術的改進》中的配方4，植物保護，梁革梅等， 1999 );所述棉鈴蟲幼蟲培養的條件為溫度27 ± 2°C，溼度75 土 10%，光照14:10 (L: D) h。
對於敏感品系棉鈴蟲，建立回歸方程夕=9.04+.1.83X!+0.31x2-1J9 xf-0.80 χ22-0.808 χ,χ2, χ代表第一種藥物濃度編碼值，χ2代表第二種藥物濃度編碼值、f 代表理論死亡率，
當回歸方程的差異顯著性分析達到顯著水平時(F>F O. 05)，表明實際死亡率與》 吻合，回歸方程能反應實際情況；
當兩因素的回歸係數差異顯著時(t>t O. 05)，表明兩種藥物作用顯著；
將兩因素的回歸係數絕對值大小，絕對值大的為起主要作用的藥物；
通過交互效應、最優濃度配比分析，得到兩種藥物作用的最佳濃度配比。
優選地,所述兩種藥物為CrylAc蛋白和Cry2Ab蛋白時,其治理敏感棉鈴蟲濃度均為1. 75-3. 65 μ g/cm2。
對於BtR品系棉鈴蟲，建立回歸方程f-5.383+0.473xl+0.526x2-0.105xl2-0,474 x22-0.0lSlxU2；xl 代表第一種藥物濃度編碼值，x2代表第二種藥物濃度編碼值、彳代表理論死亡率，
當回歸方程的差異顯著性分析達到顯著水平時(F>F O. 05)，表明實際死亡率與f 吻合，回歸方程能反應實際情況；
當兩因素的回歸係數差異顯著時(t>t O. 05)，表明兩種藥物作用顯著；
將兩因素的回歸係數絕對值大小，絕對值大的為起主要作用的藥物；
通過交互效應、最優濃度配比分析，得到兩種藥物作用的最佳濃度配比。
優選地,所述兩種藥物為CrylAc蛋白和Cry2Ab蛋白時,其治理BtR品系CrylAc 抗性棉鈴蟲的最佳濃度配比為CrylAc蛋白濃度為2. 49-4. 23 μ g/cm2, Cry2Ab蛋白濃度為1. 10-4. 28 μ g/cm2。
本發明實施例中還進一步提供以下具體地實施方案
I)供試棉鈴蟲
敏感品系和BtR品系CrylAc抗性品系棉鈴蟲的初鮮幼蟲。
2)兩種Bt蛋白的濃度配比
利用二因素D-飽和最優試驗設計，針對兩種蛋白因素，按下表的濃度設計3次重複的飽和試驗，進行生物測定。
表I 二因素的編碼及濃度設置
權利要求
1.一種評價棉鈴蟲抗性治理效果的方法，包括以下步驟 1)選擇兩種用於治理棉鈴蟲的藥物； 2)接種敏感或抗性棉鈴蟲幼蟲； 3)觀察幼蟲死亡情況，計算死亡率； 4)建立ニ因素D-飽和方法建立回歸方程，評價兩種藥物的治理效果。
2.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述藥物為Cry2Ab蛋白、CrylAc蛋白、CrylF蛋白、Vip3A蛋白和CrylAb蛋白中的任意兩種。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，所述藥物的濃度為0-4.760 μ g/cm2。
4.根據權利要求I所述的方法，其特徵在於，所述棉鈴蟲幼蟲的培養條件為溫度27±2°C，溼度 75 ±10%，光照 14: IOh。
5.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特徵在於，對於敏感品系棉鈴蟲，建立回歸方程1=9,04+1.831-0,31^-1.891^-0,801/-0.^8 X1X2J1 代表第一種藥物濃度編碼值，χ2代表第二種藥物濃度編碼值、$代表理論死亡率； 當回歸方程的差異顯著性分析達到顯著水平時，表明實際死亡率與f吻合，回歸方程能反應實際情況； 當兩因素的回歸係數差異顯著時，表明兩種藥物作用顯著； 將兩因素的回歸係數絕對值大小相比，絕對值大的為起主要作用的藥物； 通過交互效應、最優濃度配比分析，得到兩種藥物作用的最佳濃度配比。
6.根據權利要求5所述的方法,其特徵在於，所述兩種藥物為CrylAc蛋白和Cry2Ab蛋白。
7.根據權利要求6所述的方法,其特徵在於,CryIAc蛋白和Cry2Ab蛋白治理敏感品系棉鈴蟲的濃度均為I. 75-3. 65 μ g/cm2。
8.根據權利要求1-4任一項所述的方法，其特徵在於，對於BtR品系棉鈴蟲，建立回歸方程卜5.383+0.4731^0.52^2-0.105114.474)1/-0.01811^2; X1 代表第一種藥物濃度編碼值，X2代表第二種藥物濃度編碼值、タ代表理論死亡率； 當回歸方程的差異顯著性分析達到顯著水平吋，表明I與y吻合,回歸方程能反應實際情況； 當兩因素的回歸係數差異顯著時，表明兩種藥物作用顯著； 將兩因素的回歸係數絕對值大小相比，絕對值大的為起主要作用的藥物； 通過交互效應、最優濃度配比分析，得到兩種藥物作用的最佳濃度配比。
9.根據權利要求8所述的方法,其特徵在於，所述兩種藥物為CrylAc蛋白和Cry2Ab蛋白時，其治理BtR品系CryIAc抗性棉鈴蟲的濃度為CryIAc蛋白2. 49-4. 23 μ g/cm2,Cry2Ab蛋白I. 10-4. 28 μ g/cm2。
全文摘要
本發明涉及一種評價棉鈴蟲抗性治理效果的方法。該方法包括以下步驟1)選擇兩種用於治理棉鈴蟲的藥物；2)接種敏感或抗性棉鈴蟲幼蟲；3)觀察幼蟲死亡情況，計算死亡率；4)建立二因素D-飽和方法建立回歸方程，評價兩種藥物的治理效果。本發明方法可操作性強，準確高效，可在Bt蛋白或其他蛋白防治害蟲和治理抗性的效果評價中廣泛應用。
文檔編號G01N33/68GK102981001SQ20121048044
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月22日 優先權日2012年11月22日
發明者梁革梅, 魏紀珍, 張麗麗, 高珍, 張永軍 申請人:中國農業科學院植物保護研究所