維生素的生產方法

2023-06-17 17:26:56

專利名稱：維生素的生產方法
技術領域：
本發明涉及維生素，尤其是維生素E和相關化合物的生產方法。
背景技術：
維生素E(d-α-生育酚，1)是人和動物重要的營養補充劑。商業上，可從多種植物油中分離得到化合物1，或者通過環甲基化相關的天然d-γ-生育酚2而半合成得到化合物1。更重要的維生素E來源是可提供d，1-α-生育酚3的全合成。儘管3是異構體混合物，但它能提供1的很多生物活性，並且因其較低廉的價格和更強的效力而得以廣泛應用。有關維生素E的一般性討論，可參見L.Machlin編寫的「維生素E綜合性論文集」，Marcel Dekker，紐約，1980。
通過在酸性催化劑(通常為路易斯酸，如氯化鋅)的存在下，使三甲基氫醌4與植醇5或異植醇6反應即可得到d，1-α-生育酚3。此技術可參見S.Kasparek，於L.Machlin編寫的「維生素E綜合性論文集」，第2章，p8-65，Marcel Dekker，紐約，1965。此章的參考文獻140-166提供了製備化合物3的詳細方法的原始參考文獻。 可通過多步合成得到製備3所需的異植醇6或植醇5。起始物一般包括丙酮(參見Kasparek，於Machlin，「維生素E綜合性論文集」，p44-45，Dekker，紐約，1980和其中提及的參考文獻)和環異戊二烯三聚體(Pond等，US3917710和3862988(1975))。
此外，Jacob，Steiger，Todd和Wilcox(化學會志，1939，542)通過全合成首次製備出γ-生育酚。這些研究人員通過在氯化鋅的存在下使2，3-二甲基氫醌的一苯甲酸酯與植基溴反應，然後除去苯甲酸酯得到低產率(22％)的γ-生育酚，從而生產出維生素。有關生育酚和生育三烯酚的已知合成方法可參見S.Kasparek，於L.Machlin，「維生素E綜合性論文集」，Dekker，紐約，1980；然而，製備γ-生育酚的其它方法尚未見報導。
儘管製備或分離維生素E家族化合物成員的多種方法是已知的，但仍需要改良的和更有效的生產方法。
附圖簡述

圖1A圖示了依賴於甲羥戊酸的類異戊二烯生物合成途徑。
圖1B圖示了不依賴於甲羥戊酸的類異戊二烯生物合成途徑。
圖2闡明了由香葉基香葉醇化學合成維生素E的途徑的實施方案。
圖3闡明了由法尼醇化學合成維生素E的途徑的實施方案。
圖4闡明了菌株MBNA1-13的衍生菌株的生長和法尼醇生產情況。
圖5闡明了野生型erg9和經修復的ERG9菌株的生長情況。
圖6闡明了HMG CoA還原酶產量增加的微生物中的法尼醇生產情況。
圖7闡明了過量表達GGPP合酶的菌株中的法尼醇和GG生產情況。
圖8闡明了FPP合酶的產量增加對法尼醇和GG生產的影響。
圖9闡明了isoprenol和prenol代謝轉變為法尼醇的途徑。
圖10闡明了化學合成γ-生育酚之途徑的實施方案。
發明詳述1.0導言本發明提供了生產α-生育酚和α-生育酯的方法，其中使用生物系統生產法尼醇或香葉基香葉醇(GG)。法尼醇可用作起始物質以化學合成終產物α-生育酯。或者，也可將法尼醇化學轉變為GG。然後將生物體生產的GG或由法尼醇合成產生的GG用作起始物質以製備α-生育酚和α-生育酯。本發明還包括用於生物生產法尼醇或GG的生物材料和中間體的多個方面。本發明還包括將通過任何方法生產的法尼醇和/或GG用作起始物質以生產α-生育酚和α-生育酯的方法。
2.0生物生產法尼醇和GG類異戊二烯是最大的天然產物家族，已知的就有約22,000個不同的結構。所有類異戊二烯都衍生自C5化合物異戊基焦磷酸酯(IPP)。因此，所有類異戊二烯化合物的碳骨架都可通過在逐漸延長的多聚類戊二烯鏈上連續添加C5單位而產生。
儘管由IPP生產類異戊二烯的生物合成步驟是通用的，但卻存在兩種不同的IPP生產途徑。真菌(例如酵母)和動物具有眾所周知的依賴於-甲羥戊酸的途徑(示於圖1A)，該途徑使用乙醯CoA為初始前體。另一方面，細菌和高等植物具有新近發現的不依賴於-甲羥戊酸的途徑，本文也稱之為非-甲羥戊酸途徑(示於圖1B)，該途徑由丙酮酸和甘油醛3-磷酸起始[Lois等，美國國家科學院院報，95，2105-2110(1998)；Rohmer等，美國化學會志，118，2564-2566(1996)；Arigoni等，美國國家科學院院報，94，10600-10605(1997)；Lange等，美國國家科學院院報，95，2100-2104(1998)]。有證據表明，植物中既存在依賴於-甲羥戊酸的途徑，也存在不依賴於-甲羥戊酸的途徑，前者位於胞質中，而後者位於質體中[Arigoni等，美國國家科學院院報，94，10600-10605(1997)；Lange等，美國國家科學院院報，95，2100-2104(1998)]。已經確立了不依賴於-甲羥戊酸的途徑的幾個步驟。第一步，在D-1-脫氧木酮糖5-磷酸合酶的催化下，由丙酮酸和甘油醛3-磷酸形成D-1-脫氧木酮糖5-磷酸。第二和第三步，在D-1-脫氧木酮糖5-磷酸還原異構酶的催化下，催化D-1-脫氧木酮糖5-磷酸轉變為2-C-甲基D赤蘚糖醇-4-P(MEP)。還需要幾個反應才能將MEP轉變為IPP，此時，這些酶是未知的[Lois等，美國國家科學院院報，95，2105-2110(1998)；Takahashi等，美國國家科學院院報，95，2100-2104(1998)；Duvold等，四面體通訊，38，4769-4772(1997)]。
法尼醇和GG分別是通過使法尼焦磷酸酯(FPP)和香葉基香葉基焦磷酸酯(GGPP)去磷酸化而產生的異戊烯醇。FPP和GGPP是生物合成包括固醇，泛醌，血紅素，多萜醇和類胡蘿蔔素的類異戊二烯化合物的中間體，並可用於蛋白質的翻譯後異戊二烯化。FPP和GGPP都衍生自IPP。本發明的實施方案包括在原核或真核細胞培養物和無細胞系統中生物生產法尼醇或GG，而不論生物體利用的是依賴於甲羥戊酸的途徑還是不依賴於甲羥戊酸的途徑來生物合成所有類異戊二烯的前體IPP。除非特指一種特定的形式，本文中凡是提及法尼基磷酸酯或香葉基香葉基磷酸酯，都是指各自的一，二和三磷酸酯化合物。
2.1經修飾的微生物適用於生產法尼醇和GG的生物系統包括原核和真核細胞培養物和無細胞系統。優選的生物系統包括真菌，細菌和顯微藻類系統。更優選的生物系統是真菌細胞培養物，更優選為酵母細胞培養物，最優選為釀酒酵母細胞培養物。之所以優選真菌是因為長期以來它們一直被用於工業方法中，可使用經典的微生物學方法和基因工程技術對其進行操作。特別是，已在基因水平上較詳盡地鑑定了酵母。實際上，釀酒酵母的整個基因組已被測序，並已克隆出編碼類異戊二烯途徑所需酶的基因。另外，釀酒酵母能生長至高細胞密度，據報導，在經基因工程改造的菌株中，角鯊烯和麥角固醇(見圖1)的量高達細胞乾重的16％。有關酵母類異戊二烯途徑的最新評論，可參見Parks和Casey，微生物學年鑑，4995-116(1995)。
優選的原核生物是大腸桿菌，作為生產代謝物(胺基酸，維生素)和多種重組蛋白質所用的工業微生物，大腸桿菌已被研究得較為透徹。整個大腸桿菌基因組也已被測序，其遺傳系統的研究進展迅速。如上所述，大腸桿菌使用不依賴於-甲羥戊酸的途徑合成IPP。大腸桿菌dxs，dxr，idi和ispA基因分別編碼D-1-脫氧木酮糖5-磷酸合酶，D-1-脫氧木酮糖5-磷酸還原異構酶，IPP異構酶和FPP合酶，這些基因已被克隆和測序[Fujisaki等，生物化學雜誌，108，995-1000(1990)；Lois等，美國國家科學院院報，95，2105-2110(1998)；Hemmi等，生物化學雜誌，123，1088-1096(1998)]。
用於本發明的優選顯微藻類包括小球藻屬(Chlorella)和Prototheca。
生產法尼醇和GG所用的適當生物體可得自多個來源，例如美國典型培養物保藏中心(ATCC)，Rockville，MD，藻類培養物保藏中心(UTEX)，Austin，TX，北方地區研究實驗室(NRRL)，Peoria，IL和大腸桿菌基因保藏中心(CGSC)，New Haven，CT。特別是，已使用釀酒酵母保藏培養物來研究類異戊二烯途徑，所述培養物可得自例如加利弗裡亞大學(Berkeley，CA)的JasperRine和北卡羅來納州立大學(Raleigh，NC)的Leo Parks。
優選對細胞培養物中所用的細胞進行基因修飾以增加法尼醇或GG的產量。可通過基因工程技術(即重組技術)，經典的微生物學技術，或所述技術的組合對細胞進行基因修飾，細胞還包括天然的基因變體。一些這種技術一般性地公開於例如Sambrook等，1989，分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社(其全文列入本文作為參考)。經基因修飾的微生物中的核酸分子以一定的方式被插入，缺失或修飾(即突變；例如通過核苷酸的插入，缺失，取代和/或倒位而突變)，從而使所述修飾能提供所需的效果，該效果為使微生物內或培養物上清液中的法尼醇或GG的產量增加。在本文中，可將導致基因表達，基因功能或基因產物(即由基因編碼的蛋白質)功能降低的基因修飾稱為基因失活(完全或部分失活)，缺失，間斷，阻斷或下調。例如，在某一基因中，導致該基因編碼的蛋白質功能降低的基因修飾可能是由於基因的完全缺失(即基因不存在，因此蛋白質也不存在)，導致蛋白質不完整或不翻譯(例如蛋白質未表達)的基因突變，或者降低或廢除蛋白質的天然功能(例如表達的蛋白質具有降低的酶活性或無酶活性)的基因突變。導致基因表達或功能增強的基因修飾被稱為基因擴增，過量產生，過量表達，激活，增強，添加或上調。添加克隆基因以增加基因表達包括在複製質粒上維持克隆基因或將克隆基因整合至生產微生物的基因組中。此外，增加所需克隆基因的表達包括使克隆基因與天然或異源轉錄控制元件可操作相連。
2.1.1角鯊烯合酶修飾本發明的實施方案包括通過培養微生物(優選為酵母)來生物生產法尼醇或GG，所述微生物已被基因修飾，籍此調節其類異戊二烯生物合成途徑中的一個或多個酶的活性。在一個實施方案中，通過降低(包括消除)角鯊烯合酶活性的作用對微生物進行基因修飾(見圖1)。例如，已製備出酵母erg9突變體，該突變體不能將甲羥戊酸轉變為角鯊烯，但能積累法尼醇，Karst和Lacroute，Molec.Gen.Genet.，154，269-277(1977)；美國專利5,589,372。本文中凡是提及erg9突變體或突變，一般指的是降低角鯊烯合酶作用的基因修飾，例如通過阻斷或降低角鯊烯合酶的產生，降低角鯊烯合酶的活性，或抑制角鯊烯合酶的活性而降低角鯊烯合酶的作用，從而導致法尼二磷酸(FPP)積累，除非FPP轉變為另一種化合物，例如通過磷酸酶活性轉變為法尼醇。阻斷或降低角鯊烯合酶的產生包括將ERG9基因置於啟動子的控制之下，所述啟動子需要生長培養基中存在誘導化合物。通過建立使培養基中的誘導物耗盡的條件，ERG9基因的表達(因此，角鯊烯合酶的合成)可被關閉。此外，一些啟動子會因為阻抑化合物的存在而關閉。例如，添加銅會阻抑酵母CTR3或CTR1基因的啟動子。阻斷或降低角鯊烯合酶的活性也包括使用類似於美國專利4,743,546(列入本文作為參考)所述切除技術。在此方法中，ERG9基因被克隆於特定的基因序列之間以從基因組中特異性地受控切除ERG9基因。可通過例如按美國專利4,743,546所述升高培養物的培養溫度，或者通過一些其它的物理或營養信號來促進切除。這種基因修飾包括任何類型的修飾，並特別地包括通過重組技術和經典誘變進行的修飾。角鯊烯合酶的抑制劑是已知的(見美國專利4,871,721和引用在美國專利5,475,029中提及的參考文獻)，可在細胞培養物中加入所述抑制劑。在另一個實施方案中，對具有類異戊二烯生物合成之不依賴於甲羥戊酸的途徑的生物(如大腸桿菌)進行基因修飾，以使其積累FPP和/或法尼醇。例如，降低八異戊二烯基焦磷酸酯合酶(ispB基因的產物)的活性有望導致大腸桿菌中積累FPP(Asai等，Biochem.Biophys.Res.Comm.202，340-345(1994))。磷酸酶的作用可進一步導致大腸桿菌中積累法尼醇。
酵母菌株的細胞膜流動性需要麥角固醇，因此，麥角固醇途徑被阻斷的突變體，如erg9突變體需要在細胞培養基中添加外來的麥角固醇或其它固醇以維持細胞存活。除非在厭氧條件下生長，否則細胞一般不能利用添加的固醇。因此，本發明的另一個實施方案是酵母的應用，所述酵母中的角鯊烯合酶作用降低，如erg9突變體，並能在需氧條件下攝取外部補加的固醇。在下文的實施例章節(見實施例1)中將闡明使酵母在需氧條件下利用固醇的基因修飾是如何進行的，所述基因修飾也是現有技術中已知的。例如，所述基因修飾包括upc(使細胞在需氧條件下攝取固醇的攝取控制突變)和hem1(HEM1基因編碼氨基乙醯丙酸合酶，該酶是始於FPP的血紅素生物合成途徑的第一個受約束的步驟，只要在培養物中補加不飽和脂肪酸，hem1突變體能在麥角固醇生物合成途徑被破壞之後，在需氧條件下攝取麥角固醇)。使用已知技術可產生具有這些突變的酵母菌株，所述菌株也可得自例如北卡羅來納州立大學(Raleigh，NC)的Leo Parks博士。可使用含有這些突變的單倍體細胞，通過與其它單倍體細胞進行遺傳雜交以產生其它突變體。另外，也可使用SUT1(固醇攝取)基因的過量表達以在需氧條件下攝取固醇。SUT1基因已被克隆和測序，Bourot和Karst，基因，16597-102(1995)。
在另一個實施方案中，通過在角鯊烯合酶抑制劑的存在下培養本發明的微生物來生產法尼醇和/或GG。在此方法中，角鯊烯合酶的作用降低。角鯊烯合酶抑制劑是本領域技術人員已知的(例見美國專利5,556,990)。
2.1.2 HMG-CoA還原酶修飾本發明的另一個實施方案是經基因修飾後HMG-CoA還原酶作用有所增強的微生物的應用。應說明的是，增強HMG-CoA還原酶和本文所討論的其它酶的作用指的是所述微生物中的任何基因修飾，該基因修飾可導致酶功能性的增強，包括酶活性的提高，酶抑制作用或降解作用的降低和酶的過量表達。例如，基因拷貝數增加，利用啟動子使表達水平提高，所述啟動子相對於天然啟動子而言能使表達水平升高，或者通過基因工程或經典的誘變改變基因以增強酶活性。依賴於甲羥戊酸的類異戊二烯生物合成途徑中的一個關鍵酶是HMG-CoA還原酶，該酶催化還原3-羥基-3-甲基戊二酸單醯-輔酶A(HMG-CoA)。這是該途徑中的初始限速步驟和第一個不可逆的步驟，HMG-CoA還原酶活性增強會導致野生型釀酒酵母菌株中的角鯊烯和麥角固醇產量增加，erg9菌株中的法尼醇產量增加。HMG-CoA還原酶作用增強的一個機理是通過降低對酶的抑制作用，通過對酶進行基因修飾或者通過改良系統以除去抑制劑。例如，類異戊二烯途徑的固醇和非-固醇產物反饋抑制此酶(例見Parks和Casey，微生物學年鑑，4995-116(1995))。或者或另外，可通過基因工程或經典的誘變技術改變編碼HMG-CoA還原酶的基因以降低或防止抑制作用。此外，通過增加基因拷貝數，提高HMG-CoA還原酶基因的表達水平，或通過基因工程或經典的誘變技術改變HMG-CoA還原酶基因以提高酶活性即可增強HMG-CoA還原酶的作用。例見美國專利5,460,949(其全文列入本文作為參考)。例如，已產生了截短的HMG-CoA還原酶，其中的調控區被除去，高達約6的基因拷貝數的使用也使活性有所增強(文獻同上)，也例見Downing等，Biochem.Biophys.Res.Comm.94，974-79(1980)，其中描述了HMG-CoA還原酶水平提高的兩個酵母突變體。釀酒酵母中存在HMG-CoA還原酶的兩個同工酶，分別由HMG1和HMG2基因編碼。這兩個同工酶的活性受幾種機理調節，包括轉錄調節，翻譯調節，對Hmg2p而言，還包括酶在內質網中的降解(Hampton和Rine，1994；Donald等，1997)。在Hmglp和Hmg2p中，催化結構域位於酶的羧基末端部分，而調節結構域位於橫跨膜的NH2末端區域。已證實，僅過量表達釀酒酵母Hmglp催化結構域即可增加類異戊二烯途徑的碳流量，導致角鯊烯的過量產生(Saunders等，1995；Donald等，1997)。本發明人在具有正常(即未被阻斷的)類異戊二烯途徑的菌株中表達了釀酒酵母Hmg2p的催化結構域，觀察到角鯊烯產量的顯著增加。另外，Hmg2p催化結構域的過量表達導致發酵罐中生長的erg9突變體的法尼醇產量增加，過量表達GGPP合酶的erg9突變體的法尼醇和GG產量增加。
2.1.3 GGPP合酶修飾本發明的另一個實施方案是經基因修飾後GGPP合酶作用增強的微生物的應用。已鑑定出得自多個來源(包括細菌，真菌，植物，哺乳動物和古細菌)的編碼該酶的基因。例見Brinkhaus等，Arch.Biochem.Biophys，266，607-612(1988)；Carattoli等，生物化學雜誌，266，5854-59(1991)；Chen等，生物化學雜誌，268，11002-11007(1993)；Dogbo等，Biochim.Biophys.Acta，920，140-148(1987)；Jiang等，生物化學雜誌，270，21793-99(1995)；Kuntz等，植物雜誌，2，25-34(1992)；Laferrieree等，Biochim.Biophys.Acta，1077，167-72(1991)；Math等，美國國家科學院院報，89，6761-64(1992)；Ohnuma等，生物化學雜誌，269，14792-97(1994)；Sagami等，Arch.Biochem.Biophys，297，314-20(1992)；Sagami等，生物化學雜誌，269，20561-66(1994)；Sand-mann等，J.Photochem.Photobiol.BBiol.，18，245-51(1993)；Scolnik等，植物生理學，104，1469-70(1994)；Tachibana等，Biosci.Biotech.Biochem.，7，1129-33(1993)；Tachibana等，生物化學雜誌，114，389-92(1993)；Wiedemann等，Arch.Biochem.Biophys.，306，152-57(1993)。一些生物具有雙功能酶，該酶也可用作FPP合酶，因此參與IPP和DMAPP轉變為FPP再轉變為GGPP的整個過程(見圖1)。一些酶(例如在植物中發現的那些酶)具有較低的特異性，能將IPP和DMAPP轉變為GGPP(見圖1)。本文所述GGPP合酶基因修飾包括對單功能的GGPP合酶或雙功能的FPP/GGPP合酶進行基因改造以增強酶的GGPP合酶活性組分。優選的GGPP合酶基因是釀酒酵母的BTS1基因。BTS1基因及其分離描述於Jiang等，生物化學雜誌，270，21793-99(1995)和1996年12月6日提交的共同懸而未決的申請流水號08/761,344(全文列入本文作為參考)。然而，也可使用其它宿主的GGPP合酶，使用雙功能的GGPP合酶特別有利於引導碳從FPP流向GGPP，從而避免細胞在競爭反應中損失FPP。
在本發明的另一個實施方案中，除了修飾上述GGPP合酶外，還需從生產生物體中除去野生型GGPP合酶。這樣可消除經修飾的GGPP合酶和野生型酶對底物FPP和IPP的競爭。編碼GGPP合酶的野生型基因的缺失也可通過除去基因序列同源性高的區域，從而避免潛在有害的基因重組，來改良克隆的GGPP合酶基因的穩定性。
2.1.4 FPP合酶修飾本發明的另一個實施方案是經基因修飾後FPP合酶作用增強的微生物的應用。
已鑑定出得自多個來源的編碼此酶的基因，例見Anderson等，生物化學雜誌，264，19176-19184(1989)；Attucci等，Arch.Biochem.Biophys.，321，493-500(1995)；Cane等，美國化學會志，105，122-124(1983)；Chambon等，當代遺傳學，18，41-46(1990)；Chambon等，脂質，26，633-36(1991)；Chen等，蛋白質科學，3，600-607(1994)；Davisson等，美國化學會志，115，1235-45(1993)；Ding等，生物化學雜誌，275，61-65(1991)；Hugueney等，FEBS Letters，273，235-38(1990)；Joly等，生物化學雜誌，268，26983-89(1993)；Koyama等，生物化學雜誌，113，355-63(1993)；Sheares等，生物化學，28，8129-35(1989)；Song等，美國國家科學院院報，91，3044-48(1994)；Spear等，生物化學雜誌，267，14662-69(1992)；Spear等，生物化學雜誌，269，25212-18(1994)。Anderson等，生物化學雜誌，264，19176-19184(1989)報導了釀酒酵母FPP合酶基因在酵母穿梭載體中過量2-3倍的表達。
如實施例章節中所述，我們驚奇地發現FPP合酶的過量表達不會導致法尼醇產量的增加，但卻在GGPP合酶未過量表達的情況下，出乎意料地導致了GG產量的增加。
在本發明的另一個實施方案中，除了修飾上述FPP合酶外，還需從生產生物體中除去野生型FPP合酶。這樣可消除經修飾的FPP合酶和野生型酶之間對底物IPP，DMAPP和GPP的競爭。編碼FPP合酶的野生型基因的缺失也可通過除去基因序列同源性高的區域，從而避免潛在有害的基因重組來改良克隆的FPP合酶基因的穩定性。
2.1.5磷酸酶修飾本發明的另一個實施方案是經基因修飾後磷酸酶作用有所增強，從而增強了將FPP轉變為法尼醇或將GGPP轉變為GG之能力的微生物的應用。例如，釀酒酵母和大腸桿菌含有多種磷酸酶活性。通過檢測幾種磷酸酶是否能有效地使FPP或GGPP去磷酸化，可選擇適當的磷酸酶，並在生產生物體中表達編碼該酶的基因以提高法尼醇或GG的產量。除了增強所需磷酸酶的作用以提高法尼醇或GG的產量外，還可以通過基因工程方法除去不必要的磷酸酶活性，也可以單獨使用後一種方法。例如，可以通過突變消除特異性地作用於FPP的磷酸酶活性，以使未被處理的FPP能轉變為GGPP，繼而轉變為GG。
2.1.6其它的基因修飾對其它類異戊二烯途徑酶的修飾上文描述的是為增強HMGCoA還原酶，GGPP合酶和磷酸酶的作用所作的修飾。對類異戊二烯途徑酶作用的修飾不局限於這些特定的例子，也可使用類似的策略修飾其它類異戊二烯途徑酶作用，所述酶如乙醯乙醯CoA硫解酶，HMGCoA合酶，甲羥戊酸激酶，磷酸甲羥戊酸激酶，磷酸甲羥戊酸脫羧酶，IPP異構酶，法尼焦磷酸酯合酶或D-1-脫氧木酮糖5-磷酸合酶，D-1-脫氧木酮糖5-磷酸還原異構酶。
對主要代謝進行基因工程改造以增加類異戊二烯途徑的前體供給在具有依賴於甲羥戊酸的類異戊二烯途徑的生物體中，法尼醇或GG的生物合成始於乙醯CoA(示於圖1)。本發明的一個實施方案是對生產生物體進行基因修飾以使乙醯CoA的胞內水平提高，從而使更多的乙醯CoA可以導入類異戊二烯途徑(由此產生法尼醇和/或GG)。例如，通過增強丙酮酸脫氫酶複合物的作用可增加乙醯CoA的供應量。通過增強丙酮酸激酶的作用來提高細胞中的丙酮酸水平可進一步增加乙醯CoA的供應量。在具有不依賴於甲羥戊酸的類異戊二烯途徑的生物體中，類異戊二烯的生物合成始於丙酮酸和甘油醛3-磷酸。通過分別增強丙酮酸激酶和丙糖磷酸異構酶的作用可以增加類異戊二烯生物合成所需的丙酮酸和甘油醛3-磷酸的供應量。
提供上述實例僅為了闡明對主要代謝進行基因工程改造以提高類異戊二烯化合物產量的概念，而並未窮舉可採用的方法。也可成功地使用多種其它策略來達到該目的。
阻斷競爭FPP或GGPP的途徑在酵母中，FPP是分支點中間體，它可導致固醇，血紅素，多萜醇，泛醌，GGPP和法尼基化的蛋白質的生物合成。在大腸桿菌中，FPP在導致泛醌生成的途徑中可用作八異戊二烯基焦磷酸酯合酶的底物。在合成類胡蘿蔔素的細菌(如噬夏孢歐文氏菌)中，FPP在導致類胡蘿蔔素生成的第一步，通過GGPP合酶的作用轉變為GGPP。為了提高法尼醇或GG的產量，需要滅活編碼以FPP或GGPP為底物的酶的基因，或者通過突變或使用特定的酶抑制劑(這一點已在上文提及角鯊烯合酶時討論過)來降低酶本身的活性。例如，在釀酒酵母中，除了滅活ERG9外，滅活FPP至血紅素途徑的第一步較為有利。如上所述，在大腸桿菌中，部分或完全滅活八異戊二烯基焦磷酸酯合酶可提高轉變為法尼醇的FPP水平。最後，在生產類胡蘿蔔素的細菌(如噬夏孢歐文氏菌)中，消除GGPP合酶可使轉變為法尼醇的FPP水平提高，而八氫番茄紅素合酶(crtB基因產物)活性的滅活或降低可使轉變為GG的GGPP水平提高。
阻斷遠離FPP或GGPP的途徑可能對生產生物體的生長和生理有不利影響。我們還希望進行其它基因修飾以抵消這些並發的不利影響。如上所述分離釀酒酵母突變體，其類異戊二烯途徑被阻斷，並可在需氧的條件下攝取固醇，說明可得到補償突變，該突變克服了初始基因修飾的影響。
分離抗法尼醇或GG的生產菌株在實施例章節中，描述了通過釀酒酵母的經基因修飾菌株生產高水平的法尼醇和GG。據認為，由於法尼醇或GG的產量得到進一步提高，這些化合物的水平會達到對生產生物體有毒的程度。實際上，產物毒性是生物生產方法中常會遇到的問題。然而，通過經典方法或重組技術進行基因修飾以克服產物毒性也很常見。預期本發明會遇到產物毒性，因此，本發明的另一個實施方案是分離對法尼醇和/或GG的抗性有所增加的突變體。
分離具有改良的生長特性的生產生物體阻斷釀酒酵母的類異戊二烯途徑的一個影響是突變生物體(在本發明中為erg09突變體)的生長較其親代(未阻斷的)菌株更為緩慢，即使在培養基中加入麥角固醇也是如此。實施例1.G中闡明erg9突變體較緩慢的生長歸因於erg9處的阻斷，erg9突變的修復可使菌株的生長速率恢復至與野生型親代大致相當的水平。erg9突變體較緩慢的生長可歸因於在外源提供的麥角固醇和細胞內合成的麥角固醇上的生長具有差異，或者歸因於其它生理學因素。本發明的一個實施方案是分離具有改良生長特性的法尼醇或GG生產菌株突變體。通過例如連續培養，選擇生長較快的突變體即可達到這一目的。所述突變體可以自發產生，或者通過經典的誘變或分子遺傳學方法得到。
2.2摻入prenol和isoprenol在本發明的另一個實施方案中，通過在發酵培養基中導入isoprenol和/或prenol來生產法尼醇或GG。參照圖9，這些化合物中的每一種被生物體攝取之後，即被焦磷酸基團磷酸化，分別形成3-異戊烯焦磷酸酯和3，3-二甲烯丙基焦磷酸酯，這兩種化合物在異戊烯焦磷酸酯異構酶的作用下可以互相轉變，然後，通過FPP合酶的作用，這些化合物轉變為法尼焦磷酸酯。法尼焦磷酸酯去磷酸化之後即可形成法尼醇。法尼焦磷酸酯可進一步轉變為香葉基香葉基焦磷酸酯。香葉基香葉基焦磷酸酯去磷酸化之後即可形成香葉基香葉醇。通過GGPP合酶和磷酸酶的聯合作用，FPP可形成GG。isoprenol和prenol是可商購的化合物，也可通過本領域已知的方法生產。
在此實施方案中，發酵所用的微生物可以是本文所述任何微生物。另外，可對微生物進行基因修飾以增強二甲烯丙基轉移酶的作用，從而促進香葉基焦磷酸酯和法尼焦磷酸酯的產生。已鑑定出得自多個來源的編碼此酶的基因[Chen等，蛋白質科學，3，600-607(1994)]。另外，可對微生物進行基因修飾以增強isoprenol激酶或prenol激酶的作用。儘管這些酶尚未被發現，但使法尼醇和香葉基香葉醇磷酸化的類似酶已被描述[Bentinger等，Arch.Biochem.Biophys，353，191-198(1998)；Ohnuma等，生物化學雜誌，119，541-547(1996)]。
2.3發酵培養基和條件在生產法尼醇或GG的方法中，在發酵培養基中培養上文所述具有基因修飾的微生物以生產法尼醇或GG。適當的或有效的發酵培養基指的是任何培養基，其中本發明的經基因修飾的微生物經培養之後能產生法尼醇或GG。所述培養基一般是含水培養基，其中含有可同化的碳源，氮源和磷酸鹽來源。所述培養基中也包括適當的鹽，礦物質，金屬和其它的營養物質。此外，當生物體的麥角固醇途徑被阻斷並且需要外源固醇時，發酵培養基中必需含有這種外源固醇。適當培養基的例子示於下文的討論和實施例章節中。然而，應理解多種發酵條件都是適合的，本領域技術人員可以作出選擇。
適當發酵培養基中所用的可同化碳源包括但不限於糖及其聚合物，包括糊精，蔗糖，麥芽糖，乳糖，葡萄糖，果糖，甘露糖，山梨糖，阿拉伯糖和木糖；脂肪酸；有機酸，如乙酸；一元醇，如乙醇和正丙醇；和多元醇，如甘油。本發明的優選碳源包括單糖，二糖和三糖。最優選的碳源是葡萄糖。
發酵培養基中的碳源(如葡萄糖)濃度應該能促進細胞生長，但不應該高至抑制所用微生物的生長。發酵時加入的碳源(如葡萄糖)的水平一般應能達到獲取必需的生長和生物量所需水平，但碳源水平不可測(檢測限約＜0.1g/l)。在其它實施方案中，發酵培養基中的碳源(如葡萄糖)濃度大於約1g/l，優選大於約2g/l，更優選大於約5g/l。此外，發酵培養基中的碳源(如葡萄糖)濃度一般低於約100g/l，優選低於約50g/l，更優選低於約20g/l。應說明的是，發酵組分的濃度指的是原始的和/或發展中的組分濃度。在某些情況下，需要在發酵過程中使發酵培養基中的碳源耗盡。
適當的發酵培養基中所用的可同化氮源包括但不限於簡單的氮源，有機氮源和複雜的氮源。所述氮源包括無水氨，銨鹽和來源於動物，植物和/或微生物的物質。適當的氮源包括但不限於蛋白質水解物，微生物生物量水解物，蛋白腖，酵母膏，硫酸銨，尿素和胺基酸。發酵培養基中的氮源濃度一般大於約0.1g/l，優選大於約0.25g/l，更優選大於約1.0g/l。然而，如果發酵培養基中所添加的氮源濃度超出某一限度，將對微生物的生長不利。因此，發酵培養基中的氮源濃度應低於約20g/l，優選低於約10g/l，更優選低於約5g/l。另外，在某些情況下，需要在發酵過程中使發酵培養基中的氮源耗盡。
有效的發酵培養基可含有其它化合物，例如無機鹽，維生素，痕量金屬或生長促進劑。所述其它化合物也可存在於有效培養基中的碳源，氮源或礦物質來源中，或者被特異性地加入培養基中。
發酵培養基也可含有適當的磷酸鹽來源。所述磷酸鹽來源包括無機和有機磷酸鹽來源。優選的磷酸鹽來源包括但不限於磷酸鹽，如磷酸氫二鈉或磷酸二氫鈉和磷酸鉀，磷酸銨及其混合物。發酵培養基中的磷酸鹽濃度一般大於約1.0g/l，優選大於約2.0g/l，更優選大於約5.0g/l。然而，如果發酵培養基中所添加的磷酸鹽濃度超出某一限度，將對微生物的生長不利。因此，發酵培養基中的磷酸鹽濃度應低於約20g/l，優選低於約15g/l，更優選低於約10g/l。
適當的發酵培養基中也可含有鎂源，優選為生理上可接受的鎂鹽形式，如硫酸鎂七水合物，但也可使用其它鎂源，只要其濃度能提供相似量的鎂即可。發酵培養基中的鎂濃度一般大於約0.5g/l，優選大於約1.0g/l，更優選大於約2.0g/l。然而，如果發酵培養基中所添加的鎂濃度超出某一限度，將對微生物的生長不利。因此，發酵培養基中的鎂濃度一般低於約10g/l，優選低於約5g/l，更優選低於約3g/l。另外，在某些情況下，需要在發酵過程中使發酵培養基中的鎂源耗盡。
發酵培養基中也可含有生物可接受的螯合劑，如檸檬酸三鈉的二水合物。此時，發酵培養基中的螯合劑濃度大於約0.2g/l，優選大於約0.5g/l，更優選大於約1g/l。然而，如果發酵培養基中所添加的螯合劑濃度超出某一限度，將對微生物的生長不利。因此，發酵培養基中的螯合劑濃度一般低於約10g/l，優選低於約5g/l，更優選低於約2g/l。
發酵培養基中起初可含有生物可接受的酸或鹼以維持發酵培養基所需的pH。生物可接受的酸包括但不限於鹽酸，硫酸，硝酸，磷酸及其混合物。生物可接受的鹼包括但不限於氫氧化銨，氫氧化鈉，氫氧化鉀及其混合物。在本發明優選的實施方案中，所用鹼是氫氧化銨。
發酵培養基中也可含有生物可接受的鈣源，包括但不限於氯化鈣。發酵培養基中的鈣源(如氯化鈣二水合物)濃度範圍一般約為5mg/l至2000mg/l，優選約為20mg/l至1000mg/l，更優選約為50mg/l至500mg/l。
發酵培養基中也可含有氯化鈉。發酵培養基中的氯化鈉濃度範圍一般約為0.1g/l至5g/l，優選約為1g/l至4g/l，更優選約為2g/l至4g/l。
如上所述，發酵培養基中也可含有痕量金屬。可在發酵培養基中加入痕量金屬的母液，為了方便起見，將母液的製備與發酵培養基其餘組分的製備分開。發酵培養基中所用的適當痕量金屬母液示於下表1。發酵培養基中所加入的痕量金屬溶液的量一般大於約1ml/l，優選大於約5ml/l，更優選大於約10ml/l。然而，如果發酵培養基中所添加的痕量金屬濃度超出某一限度，將對微生物的生長不利。因此，發酵培養基中加入的痕量金屬溶液的量一般低於約100ml/l，優選低於約50ml/l，更優選低於約30ml/l。應說明的是，除了在母液中加入痕量金屬外，可分開加入各個組分，其各自的濃度範圍獨立地相當於上述痕量金屬溶液範圍所示的組分量。
如下表1所示，本發明所用的適當痕量金屬溶液包括但不限於硫酸鐵七水合物；硫酸銅五水合物；硫酸鋅七水合物；鉬酸鈉二水合物；氯化鈷六水合物；和硫酸錳一水合物。在母液中加入鹽酸以維持溶液中的痕量金屬鹽。
表1痕量金屬母液
發酵培養基中也可含有維生素，可在發酵培養基中加入維生素母液，為了方便起見，可將母液的製備與發酵培養基其餘組分的製備分開。發酵培養基中所用的適當維生素母液示於下表2。發酵培養基中所加入的維生素溶液的量一般大於1ml/l，優選大於5ml/l，更優選大於10ml/l。然而，如果發酵培養基中所添加的維生素濃度超出某一限度，將對微生物的生長不利。因此，發酵培養基中加入的維生素溶液的量一般低於約50ml/l，優選低於約30ml/l，更優選低於約20ml/l。應說明的是，除了在母液中加入維生素外，可分開加入各個組分，其各自的濃度範圍獨立地相當於上述維生素溶液範圍所示的組分量。
如表2所示，本發明所用的適當維生素溶液包括但不限於生物素，泛酸鈣，肌醇，鹽酸吡哆醇和鹽酸硫胺素。
表2
如上所述，當生物體的固醇途徑被阻斷時，必須在發酵培養基中加入外源固醇。所述固醇包括但不限於麥角固醇和膽固醇。可在發酵培養基中加入所述固醇的母液，該母液是獨立於發酵培養基的其餘組分而製備的。使用有助於溶解固醇的去汙劑可製備固醇母液。實施例1.D中描述了典型的麥角固醇母液。發酵培養基中所加入的固醇母液的量一般應使發酵培養基中固醇的終濃度範圍約為1mg/l至3000mg/l，優選約為2mg/l至2000mg/l，更優選約為5mg/l至2000mg/l。
可用常規的發酵模式培養本發明的微生物，其包括但不限於分批，補料-分批，細胞再循環和連續培養。然而，優選以補料-分批模式進行發酵。在這種情況下，發酵過程中培養基的某些組分會被耗盡。發酵開始時，可使各組分的濃度相對較高以在需要補料之前將生長維持一段時間。當發酵耗盡了組分的濃度水平時，通過補料使這些組分在發酵過程中始終保持優選的濃度範圍。通過例如定期取樣發酵培養基並分析其濃度即可監測發酵培養基中的組分水平。或者，一旦展開標準的發酵程序，可以特定的時間間隔進行補料，所述時間間隔對應於發酵過程特定時間點的已知水平。本領域技術人員可以理解，發酵過程中營養物質消耗的速率隨培養基中細胞密度的增加而增加。另外，為了避免在發酵培養基中導入外源微生物，可使用本領域已知的無菌添加法進行補料。另外，可在發酵過程中加入少量消泡劑。
發酵培養基的溫度可以是適於生長和法尼醇或GG生產的任何溫度。例如，在用接種物接種發酵培養基之前，發酵培養基的溫度範圍應達到並維持在約20℃至約45℃，優選溫度範圍約為25℃至40℃，更優選溫度範圍約為28℃至32℃。
通過在發酵培養基中加入酸或鹼可控制發酵培養基的pH。在這種情況下，當使用氨控制pH時，它也可方便地用作發酵培養基的氮源。優選將pH維持在約為3.0至8.0，更優選約為3.5至7.0，最優選約為4.0至6.5。
在發酵過程中，也應維持發酵培養基中的溶解氧含量，從而維持細胞生長並維持細胞代謝以生產法尼醇或GG。使用已知方法，例如通過使用氧電極可監測發酵培養基中的氧濃度。也可使用本領域已知的方法，例如通過攪拌，振搖或噴氣振蕩培養基和往其中通氣，從而在發酵培養基中加入氧。優選發酵培養基中的氧濃度範圍約為培養基中氧飽和值的20％至100％，所述飽和值是基於大氣壓下，約20℃至40℃的溫度範圍內，發酵培養基中氧的溶解性而得出的值。在發酵過程中，氧濃度會周期性地下降至上述範圍以下，然而，不會對發酵有不利的影響。
儘管本文描述了使用空氣往培養基中通氣，但也可使用其它氧源。通氣用的氣體中的含氧量大於空氣中的含氧量較有利。另外，通氣用的氣體中可含有對發酵無不利影響的其它氣體。
在本發明發酵方法的實施方案中，按上文和實施例1.H所述製備發酵培養基。用活躍生長的本發明微生物的培養物接種此發酵培養基，接種量應足以在合理的生長周期之後產生高細胞密度。根據細胞的乾重，接種細胞密度的範圍一般約為0.01g/l至10g/l，優選約為0.2g/l至5g/l，更優選約為0.05g/l至1.0g/l。然而，在生產規模的發酵罐中，優選較高的接種細胞密度。然後將細胞培養至細胞密度範圍約為10g/l至100g/l，優選約為20g/l至80g/l，更優選約為50g/l至70g/l。在發酵過程中，微生物達到所需細胞密度的時間一般低於約200小時，優選低於約120小時，更優選低於約96小時。
在本發明的一個運作模式中，需要在發酵過程中監測發酵培養基的碳源濃度，如葡萄糖濃度。使用已知技術可監測發酵培養基的葡萄糖濃度，例如可使用葡萄糖氧化酶試驗或高壓液相層析，它們可用於監測上清液，如發酵培養基的無細胞成分中的葡萄糖濃度。如上所述，碳源濃度應該維持在使細胞生長受抑制的水平以下。儘管該濃度對各個生物體而言有所不同，但是如果碳源為葡萄糖的話，當葡萄糖濃度大於約60g/l時，細胞生長將會受抑制，通過試驗可容易地測定此抑制作用。因此，當將葡萄糖用作碳源時，優選將葡萄糖補加至發酵罐中，並將其濃度維持在檢測限以下。或者，將發酵培養基中的葡萄糖濃度範圍維持在約為1g/l至100g/l，更優選約為2g/l至50g/l，更優選約為5g/l至20g/l。儘管通過加入例如基本上純的葡萄糖溶液能使碳源濃度維持在所需的水平，但通過加入原始發酵培養基的等分試樣維持發酵培養基中的碳源濃度是可以接受的，也是優選的。使用原始發酵培養基的等分試樣是合乎需要的，因為同時也可維持培養基中其它營養成分(如氮源和磷酸鹽來源)的濃度。類似地，通過加入痕量金屬溶液的等分試樣也可維持發酵培養基中痕量金屬的濃度。
2.4法尼醇和GG的回收一旦通過生物系統生產出法尼醇或GG，應進行回收或分離，隨後化學轉變為α-生育酚或α-生育酯。本發明人證實對法尼醇和GG而言，產物存在於培養物上清液中和/或與酵母細胞相關。關於細胞，法尼醇或GG的回收包括一些透化或裂解細胞的方法。使用包括但不限於下列的回收方法可回收培養物中的法尼醇或GG層析，提取，溶劑提取，膜分離，電透析，反滲透，蒸餾，化學衍生化和結晶。當產物為磷酸酯形式時，即法尼基磷酸酯或香葉基香葉基磷酸酯時，它僅出現在細胞內部，因此，需要一些透化或裂解細胞的方法。
3.0 GG和法尼醇的化學合成3.1 GG的化學合成如上所述，在本發明的一個實施方案中，以生物學方法生產GG，而在另一實施方案中，可以由其它方法生產GG。例如，GG也可以通過化學合成由法尼醇生產。許多合適的方法在本領域是已知的。在上述的一個方法中，法尼醇被轉變為法尼基溴(乙醚中的PBr3)並用乙醯乙酸乙酯置換。所產生的粗酮基酯被皂化，脫羧，並將產生的酮通過蒸餾純化。按照Klinge和Demuth(Synlett1993，783)的方法，該酮與膦醯基乙酸二異丙基乙基酯(NaH，甘醇二甲醚)進行Wittig-Homer反應，給出香葉基香葉酸t，t，t-和t，t，c-乙酯的大約80/20混合物。用氫化二異丁基鋁還原香葉基香葉酸乙酯給出純淨的GG。t，t，t-和t，t，c-混合物可以在酯(例如，通過蒸餾)或醇(例如通過如EP711749中所述結晶化)氧化水平上分開。可以通過生物生產完成作為GG化學生產起始物質的法尼醇的生產，如通過使用具有某些上述經修飾特性的經修飾微生物而完成。
3.2法尼醇的化學合成如上所述，在本發明的一個實施方案中，以生物學方法生產法尼醇，而在另一實施方案中，可以由其它方法生產法尼醇。例如，也可以通過化學合成生產法尼醇。許多合適的方法在本領域是已知的。
4.0通過化學合成由GG生產生育酚在本發明的另一實施方案中，提供了由香葉基香葉醇生產維生素E的方法。香葉基香葉醇含有4個烯烴組成成分。如本發明中所用的，香葉基香葉醇的烯烴組成成分從羥基端順序編號，即，第一個烯烴組成成分稱為C2-C3雙鍵，第二個烯烴組成成分稱為C6-C7雙鍵，第三個烯烴組成成分稱為C10-C11雙鍵，而第四個烯烴組成成分稱為C14-C15雙鍵。
本發明的方法包括還原香葉基香葉醇的至少一個烯烴組成成分以形成烯丙基醇。優選地，烯丙基醇是植醇或異植醇。烯丙基醇的形成可以通過烯烴的選擇性還原實現，即還原第二，第三或第四烯烴組成成分的至少一個，但不還原第一烯烴組成成分。優選地，還原反應將還原除第一烯烴組成成分之外的所有烯烴組成成分。烯烴組成成分的還原可以通過任何已知的烯還原條件完成，包括偶氨還原；溶解金屬還原；金屬氫化物還原；和金屬催化劑如鈀，銠，鎳，鉑，錸，銅，鉻或其組合存在下的氫化。優選地，通過氫化還原第二，第三或第四烯烴組成成分。
如果需要合成對映體富集或對映體純的維生素E，可以用不對稱催化劑如領域已知不對稱氫化反應的催化劑進行烯烴組成成分的還原。或者，可以生產烯丙基醇的外消旋混合物並進行手性分離，以提供烯丙基醇的所需立體異構體。
在本發明的一個實施方案中，在還原第二，第三和/或第四烯烴組成成分之前將保護基加到香葉基香葉醇上。用於本發明中的保護基指的是在還原一個或多個烯烴組成成分之前能夠被加到香葉基香葉醇上(或與之結合)，而在還原之後能夠被脫除，從而由香葉基香葉醇提供烯丙基醇的任何化合物。優選地，保護基是羥基保護基。選擇羥基保護基，使得第二，第三和第四烯烴組成成分的還原可以選擇性地實現，而不還原第一烯烴組成成分。許多本領域已知的羥基保護基都可以使用。很多這些可能基團的例子可以在「有機合成中的保護基」(T.W.Green，John Wiley和Sons，1981，pp.10-86」)中找到，該文獻全文列入本文作為參考。優選地，該羥基保護基是酯。更優選地，該酯是在將香葉基香葉醇還原為保護的烯丙基醇的條件下，為C2-C3烯烴組成成分提供足夠保護，使其不被還原的立體位阻(即體積阻礙)的酯。例舉的體積阻礙酯基包括異丁酸酯和新戊酸酯。
由烯丙基醇和氫醌形成維生素E。優選地，該氫醌是三甲基氫醌，更優選地，該氫醌是2，3，5-三甲基氫醌。應該理解，維生素E相關化合物(即α-生育酚)的形成可以用特定生育酚衍生物的相應氫醌實現。例如，β-，γ-和δ-生育酚可以分別由烯丙基醇和2，5-二甲基氫醌，2，3-二甲基氫醌和2-甲基氫醌合成。不受任何理論的束縛，據信烯丙基醇與酸接觸產生碳正離子，該離子與氫醌反應形成維生素E。類似的碳正離子可以從植醇的滷素衍生物產生。例如，使滷代植烷如溴-，氯-或碘代植烷與路易斯酸如滷化鋅，包括溴化鋅，氯化鋅和碘化鋅；滷化鋁包括溴化鋁和氯化鋁；滷化硼包括三氯化硼和三氟化硼；滷化銀包括氯化銀，溴化銀和碘化銀；滷化鎳如氯化鎳和溴化鎳；和其它金屬滷化物路易斯酸接觸，可以產生能與氫醌反應形成維生素E的碳正離子。
圖2舉例說明了由香葉基香葉醇合成維生素E的特別優選的實施方案。用相應的酸或其衍生物如酸酐或醯氯將香葉基香葉醇2-1的羥基保護為異丁酸酯或其它體積位阻酯。然後用金屬催化劑如載於碳上的鈀(Pd/C)選擇性氫化香葉基香葉基異丁酸酯2-2，產生植基異丁酸酯2-3。香葉基香葉基異丁酸酯2-2的氫化還原了第二，第三和第四烯烴組成成分，但不影響第一烯烴組成成分。據信異丁酸酯的立體體積位阻降低了被保護的香葉基香葉醇中第一烯烴組成成分的氫化速率，從而導致烯烴組成成分的選擇性氫化。然後通過在鹼性條件下水解除去羥基保護基，給出植醇2-4。植醇2-4與2，3，5-三甲基氫醌2-5在酸存在下反應，形成維生素E2-6。另外，植基異丁酸酯2-3可以被脫保護，並與2，3，5-三甲基氫醌2-5通過酸催化劑一步反應形成維生素E2-6。維生素E2-6還可以通過游離羥基組成成分的乙醯化而轉化為保護的維生素E，如維生素E乙酸酯2-7。
另一將GG轉化為α-生育酚或α-生育酯的化學合成法包括如下步驟(a)選擇性地氧化香葉基香葉醇7中的2，3-碳-碳雙鍵，產生香葉基香葉醇-2，3-環氧化物8；(b)使環氧化物8中的其餘三個碳-碳雙鍵氫化，產生環氧基植醇9；(c)通過與氧受體反應，使環氧基植醇9脫氧，產生植醇5和異植醇6的混合物；和(d)植醇5和異植醇6的混合物與三甲基氫醌4反應，產生α-生育酚3。 選擇性地氧化香葉基香葉醇中的2，3-碳-碳雙鍵而產生香葉基香葉醇-2，3-環氧化物的步驟可以用任何已知能選擇性地使烯丙基醇的烯烴官能團環氧化的試劑，如叔丁基氫過氧化物和釩或鉬催化劑的聯合，按Sharpless和Michaelson，美國化學會志，95，6136(1973)所教導的方法進行。過氧化氫或其它烷基氫過氧化物可以代替叔丁基氫過氧化物，可以使用惰性溶劑如芳香烴，脂肪烴，脂環烴或脂族酯。術語「脂肪烴」包括具有5至8個碳原子的直鏈或支鏈烷烴。庚烷是最優選的脂肪烴。術語「脂環烴」包括C5-C8環烷烴，並被一個或多個C1-C4烷基取代。術語「芳香烴」包括苯和被一至三個C1-C4烷基取代的苯。甲苯是最優選的芳香烴。術語「脂族酯」包括具有通式R1CO2R2且含有三至九個碳的脂族酯，其中R1和R2分別表示直鏈或支鏈C1-C4烷基，而乙酸乙酯是優選的脂族酯。
氫化環氧化物8中所剩三個碳-碳雙鍵產生環氧基植醇9的步驟可以用任何非均相或均相催化劑在氫氣氛中進行。因此，載體上的催化劑如Pd/C，Pt/C，氧化鉑，Raney鎳等等可以在相對於8約0.001至0.2份重量的水平，有或沒有惰性溶劑如脂族酯，烷醇，芳香烴，脂肪烴或脂環烴或醚的情況下，在約1至約200大氣壓的氫氣壓，在約0℃至約150℃的溫度下使用。術語「烷醇」表示式R3-OH的醇和式R3OCH2CH2OH的取代醇，其中R3表示直鏈或支鏈C1-C4烷基。術語「醚」表示具有式R1-鄰R2，其中R1和R2如上定義的醚類，和四氫呋喃。通過與氧受體反應使環氧基植醇9脫氧產生植醇5和異植醇6的混合物的步驟可以是錸催化的氧轉移反應，並可以在無溶劑的情況下進行，或者在惰性溶劑如芳香烴，脂肪烴，脂環烴，脂族酯，烷醇，醚或水存在下進行。該反應也可以在2-相水-有機溶劑體系中，加或不加相轉移催化劑進行。該催化劑可以是取代的三氧化錸或這類三氧化錸化合物的聚合物-承載形式。該催化劑可以在基於9約0.01-5.0重量百分數的水平被使用。氧受體必須以每摩爾91.0-3.0摩爾的水平存在，並可以選自三芳基膦，三-C1-C6烷基膦，亞磷酸三芳基酯，亞磷酸三-C1-C18烷基酯，鹼金屬次磷酸鹽或次磷酸。其它能夠從9不可逆地接受氧的化合物也可以使用，例如二-C1-C6烷基硫化物和某些含氮鹼如正C1-C6烷基嗎啉。術語「芳基」包括苯基和萘基，及它們被一至三個C1-C6烷基取代的物質。術語「芳烷基」包括具有芳基(CH2)正結構的一價基團，其中n＝1至4。術語「取代的三氧化錸」包括式R-ReO3的化合物，其中R是選自C1-C10烷基，C6-C6芳基，芳烷基，環戊二烯基和被一至五個C1-C4烷基取代的環戊二烯基的烴基。
應該注意，在本發明中的環氧基植醇脫氧步驟，如通過與三苯膦或其它合適的氧受體在錸化合物如甲基三氧化錸催化下反應，是新穎和未預料到的反應。甲基三氧化錸在許多有機反應中用作催化劑已經有綜述[Schmidt(J.Prakt.Chem./Chem.-Ztg.339，493-496(1997)]。Espenson和Zhu[(J.Molecular Catalysis AChemical103，87-94(1995)]給出了用MTO催化氧從環氧化物轉移到三苯膦並形成烯烴的六個實施例。已經注意到，從環氧化物產生烯烴的所有Espenson和Zhu的實施例都與簡單的非功能性烴如環己烯，苯乙烯，環十二碳烯等等有關。這些作者都沒有證明在含有其它官能團如一級羥基的分子內進行這類轉移的可行性。事實上，Espenson和Zhu隨後證實(有機化學雜誌，61，324-328(1996)MTO催化一級醇的脫氫並形成醚和烯烴。因此，出人意料並令人驚奇地發現，當被用於環氧基植醇時，MTO/三苯膦給出高產率的烯丙基醇產品如異植醇和植醇。
在酸催化劑，通常是路易斯酸如氯化鋅存在下以已知方法常規進行植醇5和異植醇6混合物與三甲基氫醌4的反應給出α-生育酚3。已經確定，植醇5和異植醇6的混合物可以被用於以與單個前體相同的產率製備α-生育酚。
適用於本發明術語的特例化合物如下。典型的芳香溶劑包括苯，甲苯，和o，m或對二甲苯或其混合物。甲苯是優選的芳香溶劑。典型的脂族溶劑包括正戊烷，正己烷，正庚烷和正辛烷和其異構體，正庚烷是優選的脂肪烴。典型的脂環烴包括環戊烷，環己烷，甲基環己烷和環庚烷。典型的脂族酯包括乙酸甲酯，乙酸乙酯，乙酸正丙基酯，乙酸正丁基酯，乙酸異丙基酯，丙酸甲酯，丙酸乙酯，丁酸甲酯和丁酸乙酯。乙酸乙酯是優選的脂族酯。典型的烷醇和取代的烷醇包括甲醇，乙醇，正丙醇，異丙醇，正丁醇，異丁醇，2-甲氧基乙醇，2-乙氧基乙醇和2-異丙氧基乙醇。典型的醚包括二乙醚，二異丙基醚，二丁基醚，正丁基甲基醚，叔丁基甲基醚和四氫呋喃。典型有用的路易斯酸包括氯化鋅，氯化鋁，三氟化硼，氮化鐵和磷酸。氯化鋅是優選的路易斯酸。
5.0法尼醇至維生素E在本發明的另一實施方案中，提供了由法尼醇生產維生素E的方法。該方法一般性地包括將法尼醇轉化為第一中間體化合物，其所含碳原子數量足以形成具有至少一個三甲基十三碳烷基取代基的維生素E，當該中間體隨後與合適的氫醌反應時，形成維生素E。該方法進一步包括使中間體化合物與氫醌反應形成維生素E。優選地，中間體化合物含有的碳原子足以在維生素E的苯並二氫吡喃環組成成分的2-位形成甲基和三甲基十三碳烷基取代基。更優選地，中間體化合物選自植醇和異植醇。
該中間體化合物可以通過將法尼醇氧化為法尼醛而製備。醇氧化為醛的例子可以在「高等有機化學B分冊反應與合成，第二版」Carey和Sundburg，Plenum Press，1983，pp.481-490中找到，該文獻全文列入本文作為參考。例如，法尼醇可以用二氧化錳；氧化鉻如三氧化鉻和重鉻酸鹽；氧化銀；Swem氧化條件；和Oppenauer氧化條件氧化為法尼醛。另外，法尼醇可以用在Marko等，科學，1996，274，2044中公開的催化劑，經催化的空氣氧化而被氧化。一般說來，法尼醇空氣氧化為法尼醛包括在相對非極性溶劑如甲苯或苯中，在約80℃的溫度下使用催化量的氯化銅，1，10-菲咯啉，亞肼基二羧酸二-叔丁基酯，和過量的碳酸鉀。
由法尼醇生產維生素E的方法可以進一步包括由法尼醛形成甲基酮。該甲基酮可以通過包括與合適的酮如丙酮或其等價物醇醛縮合的許多方法形成。例如，法尼醛與乙醯乙酸酯進行醇醛縮合，接著進行脫羧基反應，提供與法尼醛和丙酮進行醇醛縮合相同的甲基酮產品。該甲基酮也可以用適當的Wittig或Homer-Emmons-Wadsworth試劑形成。這些試劑的應用在，例如「高等有機化學」，第三版，J.March，John Wiley Sons，1985，pp.845-854中公開，該文獻全文列入本文作為參考。
從法尼醇生產維生素E的方法可以進一步包括還原甲基酮中的烯烴組成成分形成烷基甲基酮。烯烴組成成分的還原在上面關於由GG生產維生素E的段落中討論，並被引入本文作為參考。優選地，烷基甲基酮是6，10，14-三甲基十五烷-2-酮。該烷基甲基酮然後被轉化為烯丙基醇。可以通過加入乙炔化物如乙炔鋰，乙炔鈉和乙炔基滷化鎂，並部分地將所產生的乙炔基還原為乙烯基而生產該烯丙基醇。另外，可以通過本領域已知的其它方法直接形成烯丙基醇，例如通過烷基甲基酮與乙烯基陰離子如乙烯基滷化鎂，乙烯基鋰或乙烯基鈉反應。
由烯丙基醇形成維生素在上面由香葉基香葉醇生產維生素的部分討論。
圖3舉例說明了由法尼醇合成維生素E的特別優選的實施方案。在Oppenauer氧化條件下，用異丙基氧化鋁和丙酮將法尼醇3-8氧化為法尼醛3-9。然後，法尼醛3-9通過與丙酮進行醇醛縮合反應而轉化為脫氫法尼基丙酮3-10。通過氫化還原脫氫法尼基丙酮3-10的烯烴組成成分，則產生6，10，14-三甲基十五烷-2-酮3-11。將乙炔化物加入酮3-11則產生炔丙基醇3-12，將其用Lindlar氫化條件部分還原產生異植醇3-13。異植醇3-13與2，3，5-三甲基氫醌3-5在酸催化劑存在下反應則產生維生素E。
6.0 γ-生育酚的生產根據圖10，本發明的另一實施方案是經濟地製備合成的γ-生育酚的方法。該方法包括使具有化合物10的分子式的4-苯並二氫吡喃酮生育三烯酚進行催化氫化，還原三個側鏈雙鍵和4-酮基，給出γ-生育酚11。起始化合物10是已知的，並可以如下生產。法尼基丙酮12和2，5-二羥基-3，4-二甲基乙醯苯酮13在鹼性催化劑存在下反應，給出4-苯並二氫吡喃酮生育三烯酚化合物10。該反應是本領域已知的。其一般性方法由Kabbe和Heitzer(合成，1978，888)描述，其具體反應由Pearce等(J.Med.Chem.37，526(1994))公開。而且，可以從天然來源中分離4-苯並二氫吡喃酮10，Lane等在US-5591772(1997)中公開了4-苯並二氫吡喃酮10。
相反，將4-苯並二氫吡喃酮生育三烯酚氫化的步驟既是新的，也是出人意料的。據Kabbe和Heitzer(合成，1978，888)報導，在α-生育酚系列中，4-苯並二氫吡喃酮經三步程序被轉化為α-生育酚。首先，用硼氫化鈉將4-苯並二氫吡喃酮的酮基還原為醇，然後消除水給出四烯。然後催化氫化該化合物，產生α-生育酚。包括昂貴試劑硼氫化鈉的這種多步程序的應用顯然是不能令人滿意的，但是是必需的。現已確定，用Kabbe和Heitzer的工藝製備的4-苯並二氫吡喃酮不能通過單獨的催化氫化轉化為α-生育酚。企圖進行該轉化，結果卻形成了飽和的酮。因而不能通過催化氫化來還原4-苯並二氫吡喃酮的羰基。因此，出人意料並令人驚奇的是，酮10被同源γ系氫化為生育酚11的步驟可以通過簡單而便宜的鎳或銅鉻鐵礦催化劑的一步催化氫化以高產率進行。這種轉化方法大大優越於如Kabbe和Heitzer教導的包括氫化物還原劑的多步法。
4-苯並二氫吡喃酮生育三烯酚10催化氫化為γ-生育酚11可以用非均相催化劑如Raney鎳或銅鉻鐵礦在升高的溫度和氫氣壓力下進行。可以在相對於4-苯並二氫吡喃酮生育三烯酚約0.001至0.3份重的水平，有或沒有惰性溶劑如甲醇，乙醇，異丙醇，脂族酯，醚等的情況下使用催化劑。該反應可以在約50℃至約250℃的範圍，更優選約135℃至約175℃的溫度範圍進行。該反應可以在約100psi至約3000psi氫氣，更優選約400psi至約750psi氫氣的壓力下進行。反應時間可以在約0.5至48小時之間變化。
除Raney鎳或銅鉻鐵礦之外的催化劑也可以被用於本發明的方法中。這類催化劑可以包括，但不限於，貴金屬催化劑如載體上的或均相的鉑，鈀，銠，氧化鉑及其衍生物，和Raney鈷。
7.0由GGPP或GG以生物學方法生產植醇本發明提供了將GG化學轉化為植醇或植醇與異植醇混合物的方法。然後植醇或植醇加異植醇混合物可以如本文所述與氫醌在酸存在下反應形成維生素E。
最近，從擬南芥哥倫比亞生態型中克隆出了編碼香葉基香葉基還原酶的基因[Keller等，歐洲生物化學雜誌，251413-417(1998)]。該酶能夠催化香葉基香葉基-葉綠素逐步還原為植基-葉綠素，並將GGPP還原為植基二磷酸酯。根據本發明，香葉基香葉基還原酶被用於生物系統以代替GG至植醇的化學轉化。例如，香葉基香葉基還原酶在也表達GGPP合酶活性的釀酒酵母erg9突變菌株中表達。該還原酶與體內形成的GGPP反應產生植基二磷酸酯。如前面段落所述，如同在生產法尼醇和GG的菌株中所發生的那樣，磷酸酶然後將植基二磷酸酯轉化為植醇。在簡單的發酵過程中，所產生的微生物直接由生長底物如葡萄糖生產植醇。
或者，對於能將GG用作底物的香葉基香葉基還原酶而言，提供了一種生物學方法，其中通過發酵生產GG(如上文章節所述)，並將GG純化至將其用作生物轉化法所用原種所必需的水平。生物轉化法利用香葉基香葉基還原酶將GG一步轉變為植醇。該生物轉化法利用分離的香葉基香葉基還原酶或含有香葉基香葉基還原酶活性的完整細胞。通過交聯使酶或細胞固定於支持物上以增強生物轉化的效力。希望通過基因操作修飾香葉基香葉基還原酶以增強其在工業用生物學方法中生產植醇的活性。
回收使用香葉基香葉基還原酶經生物學方法形成的植醇，將其純化至在酸的存在下與氫醌反應以形成維生素E所必需的水平。
提供下列實施例是為了闡明本發明的實施方案，而不是限制中所述本發明的範圍。
實施例實施例1本實施例描述了使用亞硝酸化學誘變釀酒酵母菌株ATCC28383從而產生erg9突變體。
如上所述，提高法尼醇或GG產量的一種方法是降低或消除角鯊烯合酶活性。在釀酒酵母中，角鯊烯合酶由ERG9基因編碼。
A.誘變菌株28383得自ATCC，它是下文一些比較實驗中所用菌株64031(也得自ATCC)的親代菌株。菌株64031是生產法尼醇的erg9-1突變體。
使用亞硝酸處理ATCC28383以繪製殺傷曲線。根據殺傷曲線所提供的信息，按下述用亞硝酸誘變ATCC28383。於30℃，在YPD培養基(1％細菌培養用酵母膏，2％細菌培養用蛋白腖和2％葡萄糖)中將28383細胞振蕩培養過夜。洗滌並誘變細胞，誘變之後，通過於22℃在YPDC(YPD加4mg/l膽固醇)中培養過夜以回收細胞。然後洗滌培養物，並將其鋪於含有多種水平制黴菌素(20，30，40，50mg/l)的YPDC瓊脂(YPDC加2％細菌培養用瓊脂)上。於22℃將這些培養物保溫2周。
抗真菌的多烯抗生素制黴菌素通過特異性結合麥角固醇，繼而導致選擇性通透性的改變，最終抑制生長細胞的細胞壁合成。已證實，一些制黴菌素抗性菌株的麥角固醇產量降低。制黴菌素對膽固醇的親和力很低(如果有的話)，當外源提供膽固醇時，固醇營養缺陷型可以象利用麥角固醇一樣有效地利用膽固醇。
得到約3000個制黴菌素抗性菌落，篩選其中的溫度敏感型(ts)和固醇營養缺陷型。為了測定溫度敏感性，在允許的溫度(22℃)下，在YPDC上培養經誘變的細胞，隨後影印鋪板至YPD瓊脂上，在限制性溫度(37℃)下保溫。任何在高溫下不能生長的細胞包括固醇途徑具有條件致死和組成型致死缺陷的那些細胞。通過影印鋪板於YPD瓊脂(不含膽固醇)並於28℃保溫過夜，篩選溫度敏感型突變體中的固醇營養缺陷型。在3000個制黴菌素抗性菌落中，有170個被證實為ts和固醇營養缺陷型。
B.試管試驗按下述，首先在試管試驗中評價這170個菌株生產法尼醇和類異戊二烯途徑的其它中間體的情況。於28℃，在含10ml YPDC的螺口試管中將細胞振蕩培養48小時。以2800rpm的轉速離心細胞5至10分鐘，將上清液轉移至另一個試管中。用5ml蒸餾水將細胞洗滌1次，以2800rpm的轉速再次離心5至10分鐘。
通過加入2.5ml 0.2％的1，2，3-連苯三酚(溶於甲醇中)和1.25ml 60％KOH(溶於蒸餾水中)，渦旋混合，並於70至75℃的水浴中保溫1.5小時以提取細胞沉澱物。如此皂化之後，加入5ml己烷，給試管重新加蓋，渦旋15至30秒。以2800rpm的轉速離心試管5分鐘以分離相，回收己烷層。必要時，通過在氮氣氛中蒸發溶劑以濃縮樣品，並回加適量己烷供分析時用。
為了提取上清液，在上清液中加入5ml己烷，給試管重新加蓋，渦旋15至30秒。以2800rpm的轉速離心試管25分鐘以分離相，回收己烷層，通過在氮氣氛中蒸發溶劑以濃縮樣品，並回加適量己烷供分析時用。
通過薄層層析(TLC)分析初步篩選得到的己烷提取物，並通過氣相層析(GC)/質譜(MS)法證實法尼醇和類異戊二烯途徑的其它中間體的存在。在反相C18矽膠板上進行TLC，使用6∶4(v/v)乙酸乙酯/乙腈(EtOAc/MeCN)為流動相，並使用溶於乙醇中的2％(w/v)磷鉬酸(PMA)進行檢測。使用HewlettPackard 5890 GC和5970系列質譜選擇性檢測儀進行GC/MS。所用柱是Restek Rtx-5MS(15m長，0.25mm ID，1μm薄膜系統)。將13個突變體鑑定為法尼醇或其它中間體的生產者。
C.搖瓶試驗然後在搖瓶中篩選這13個突變體以及親代菌株28383和法尼醇生產菌株64031。將原始OD600nmc為0.05的過夜培養物接種於含50ml YPDC培養基的250ml帶擋板錐瓶中，於28℃振蕩培養。對錐瓶進行取樣，測定600nm下的OD值，細胞乾重和固醇含量。為了測定乾重，以8000rpm的轉速離心5ml培養物。用蒸餾水將細胞洗滌2次，將細胞沉澱物重新懸浮於3至5ml蒸餾水中，並轉移至預先稱重的乾重盤中。將盤置於100℃的烘箱中放置24小時，然後在乾燥器中冷卻，在分析天平上稱重，按下式確定以g/l計的乾重[總重量(盤＋細胞)－盤重]×200＝乾重(g/l)為了測定固醇含量，處理20ml培養物，提取細胞沉澱物和上清液，按上述測定法尼醇和其它固醇。
13個突變體中有7個似乎能產生麥角固醇途徑的中間體，在另一燒瓶實驗中進一步評價這些突變體(見下文)。通過對最高水平制黴菌素的抗性選擇所有13個突變體。
使用7個突變菌株(MBNA1-1，MBNA1-5，MBNA1-9，MBNA1-10，MBNA1-11，MBNA1-13，MBNA1-14)，親代菌株28383和突變菌株64031中的每一株的過夜培養物接種燒瓶中的50ml YPDC培養基，每個菌株重複3份搖瓶試驗。如上所述，在24，48和72小時後將細胞和培養基分開提取至己烷中。在上述每個時間點進行乾重分析(按上述進行)以測定細胞密度。通過GC/MS分析己烷提取物中的法尼醇，角鯊烯，膽固醇和麥角固醇的水平。法尼醇的結果示於下表3。
我們發現培養物上清液中的法尼醇水平較低，而細胞中積累的法尼醇水平要高得多。在第72小時時，菌株MBNA1-1產生出1％法尼醇和0.1％麥角固醇。菌株MBNA1-5未產生任何法尼醇，但產生了0.3％的角鯊烯。菌株MBNA1-9 48小時產生了0.64％法尼醇。MBNA1-10，MBNA1-11和MBNA1-14在細胞中產生很低水平的法尼醇，但似乎能製備麥角固醇。根據細胞乾重(42，187ng/ml培養物)，MBNA1-13產生的法尼醇水平最高(2.5％)，但不能產生任何麥角固醇。因此，在生產法尼醇的菌株(MBNA1-1，MBNA1-9和MBNA1-13)中，麥角固醇途徑被阻斷的程度不等，因為MBNA1-1和MBNA1-9產生較低水平的法尼醇，它們的生長不需要麥角固醇，而MBNA1-13產生最高水平的法尼醇，該菌株的生長對固醇添加具有嚴格的需求。親代菌株28383生產的麥角固醇高達0.4％(未生產出法尼醇)，erg9突變菌株64031的法尼醇積累約為0.4％。
表3在搖瓶實驗中鑑定新的突變體
D.酶分析所有酶分析所用的細胞都在YPDE培養基(含有5mg/l麥角固醇的YPD培養基)中培養。離心收集細胞，將1g(乾重)細胞懸浮於4ml 0.1M Tris-HCl，pH7.0中，然後穿過弗氏壓碎器(20,000psi)以破碎細胞懸浮液。離心所得(經裂解的)細胞懸浮液(15,000×g)，除非另有說明，否則可直接將上清液(無細胞提取物)用於酶分析。
分析突變體的角鯊烯合酶活性。角鯊烯合酶分析試驗包括在還原形式的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的存在下，將無細胞提取物與FPP保溫，用乙酸乙酯抽提，並通過GC檢測角鯊烯。具體地說，混合0.1M Tris/HClpH7(Xμl)，0.1M DTT(2μl)，0.1M MgCl2(10μl)，0.1M NADPH(4μl)，1mg/mlFPP(6μl)和無細胞提取物(7000×g上清液)(Yμl)，其中X＋Y＝178μl以使總體積為200μl。於37℃，在玻璃管中保溫此混合物40分鐘，然後用0.15ml乙酸乙酯進行抽提。將提取物轉移至塑料管中，15,000×g下離心5分鐘。使用GC/MS分析乙酸乙酯提取物。
表4顯示出突變體MBNA1-1，MBNA1-9，MBNA1-13和ATCC菌株64031和28383的角鯊烯合酶水平。野生型菌株28383的角鯊烯合酶活性為每mg蛋白質每分鐘形成0.12μg角鯊烯。其它4個菌株的活性水平低於此分析試驗的可測限。預期MBNA1-1，MBNA1-9和64031具有降低的角鯊烯合酶水平，因為它們已被鑑定為部分-受阻斷的突變體，可產生法尼醇和少量麥角固醇。MBNA1-13是生產法尼醇的突變體，不添加固醇即無法生長，因此預期該阻斷突變體不具有可測水平的角鯊烯合酶。用較高濃度的無細胞提取物和較長的保溫時間重新分析這些菌株的提取物。在任何突變體中再次未檢測到角鯊烯合酶。
表4
對法尼醇-生產菌株(MBNA1-1，MBNA1-9和MBNA1-13)及其親代菌株28283進行酶分析。比較乙醯乙醯CoA硫解酶，HMG-CoA合酶，HMG-CoA還原酶，FPP合酶和磷酸酶的酶水平。按上述製備無細胞提取物。
為了進行FPP合酶分析，混合0.1M DTT(2μl)，0.1M MgCl2(2μl)，1mg/mlIPP(6μl)，1mg/ml GPP(6μl)，無細胞提取物(Yμl)和0.1M Tris/HCl(pH7.0)(Xμl)，其中X＋Y＝84μl，於37℃保溫15分鐘。然後用0.3ml己烷抽提該混合物2次以除去預先存在的法尼醇。接著，加入0.1ml 2×甘油緩衝液(0.2M甘油，2mM MgCl2，2mM ZnCl2)，pH104和33單位鹼性磷酸酶，於37℃保溫混合物1小時。用0.1ml乙酸乙酯抽提混合物，用硫酸鈉乾燥。通過GC測定法尼醇。每次分析中需包括無-磷酸酶的對照。
HMG-CoA還原酶催化HMG-CoA與NADPH反應形成甲羥戊酸，煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)和CoA(見圖1)。為了進行這些分析，按上述製備無細胞提取物，不同的是用7,000×g而不是15,000×g離心破碎的細胞懸浮液。反應之後，通過高效液相層析(HPLC)監測HMG-CoA的消耗。為了進行此分析，於37℃將含有0.1M Na2H2P2O7，pH6.5，2mM DTT，1mM NADPH，0.4mM HMG-CoA和無細胞提取物(提取物的體積有所不同，通過補加0.1MNa2H2P2O7，pH6.5以達到0.1ml的反應平衡)的反應混合物(終體積為0.1ml)保溫15分鐘。使用0％溶劑B梯度1分鐘，接著使用0-11％B梯度42分鐘以上，通過HPLC(Luna C18，Phenomenex)反相柱監測反應。溶劑A是86∶14(v/v)40mM磷酸鉀(pH6.0)/甲醇。溶劑B是甲醇。檢測波長為260nm。
HMG-CoA合酶將乙醯乙醯CoA和乙醯CoA轉變為HMG-CoA和CoA。通過HPLC分析監測HMG-CoA的產生。為了進行此分析，混合0.1MNa2H2P2O7，pH6.5(Xμl)，20mM乙醯乙醯CoA(4μl)，20mM乙醯CoA(2μl)和無細胞提取物(Yμl)，其中X＋Y＝94μl(總體積為100μl)，並於37℃保溫5分鐘。然後將反應混合物加熱至60℃達5分鐘以滅活酶，接著在小型離心機中全速離心5分鐘。通過HPLC分析上清液。
乙醯乙醯CoA硫解酶催化可逆反應，在正向上，乙醯CoA的兩個分子反應形成乙醯乙醯CoA和CoA。通過HPLC分析監測乙醯CoA的形成(反向反應)。為了進行此分析，混合0.1M Na2H2P2O7，pH6.5(Xμl)，20mM乙醯乙醯CoA(2μl)，20mM CoA(3μl)和無細胞提取物(Yμl)，其中X＋Y＝95μl(總體積為100μl)，並於37℃保溫5分鐘。然後在Microcon-10(Amicon)離心機中離心反應混合物以將酶和產物分開。通過HPLC分析上清液。
磷酸酶分析試驗通過測定p-硝基苯酚的形成(400nm處增加的光吸收值)來定量磷酸酶活性。為了進行磷酸酶分析，混合0.1M Tris-HCl，pH7(Xμl)，1mMMgCl2(2μl)，50mMp-硝基苯基磷酸酯(10μl)和無細胞提取物(Yμl)，其中X＋Y＝1ml，並於37℃保溫15分鐘，然後測定400nm處的光吸收值。
表5顯示出這4個菌株中5種酶的水平。在所有這些菌株中，乙醯乙醯CoA硫解酶的水平差不多。突變菌株中的HMG-CoA合酶和HMG-CoA還原酶水平約高2至3倍。突變體中的FPP合酶水平等同於或低於28383中的FPP合酶水平。相對於親代菌株而言，突變菌株中的磷酸酶水平提高3至4倍。由於所有這些菌株都是通過經典的誘變方法分離得到的，這些菌株中除了存在erg9突變之外，可能還存在其它突變。
表5
E.ERG9基因分析根據Sherman等所述方法(Sherman，F.，G.R.Fink和J.B.Hicks，1989，酵母遺傳學方法，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約)，製備菌株ATCC28383，MBNA1-1，MBNA1-9和MBNA1-13的染色體DNA。用限制性酶ApaI和NsiI消化基因組DNA，使用生物素化的ERG9DNA片段為探針進行Southem印跡分析。ERG9探針由2044bp ERG9DNA片段組成，該片段是用ApaI和NsiI消化質粒pTWM103之後從瓊脂糖凝膠中分離得到的。pTWM103由ERG9基因和側翼序列組成，所述側翼序列從GenBank登記號為#U00030的序列的第#10916位延伸至#13868位。使用下列兩個寡核苷酸，通過聚合酶鏈反應(PCR)擴增ERG9基因和側翼區以構建該質粒5』-寡核苷酸＝VE107-5 CTC AGT ACG CTG GTA CCC GTC AC(本文稱之為SEQ ID NO1)3』-寡核苷酸＝VE105-3 gat gga TCC CAA TAT GTG TAG CTC AGG(本文稱之為SEQ ID NO2)大寫字母表示得自ERG9側翼區的DNA序列，而小寫字母表示為了產生限制性位點而添加的鹼基。VE107-5含有GenBank登記號為#U00030的序列的第#10905位至#10928位的序列。VE105-3含有第#13868位至#13847位序列的反向互補序列。
擴增條件如下模板DNA是分離自菌株S288C(酵母基因保藏中心，Berkeley，CA)的基因組DNA。
2分鐘，94℃/1個循環1分鐘，94℃；1分鐘，52℃；1.5分鐘，74℃/30個循環5分鐘，74℃/1個循環用KpnI和BamHI消化由此PCR反應產生的2969bp ERG9DNA，然後連接至經KpnI和BamHI消化的YEp352中，產生質粒pTWM103。YEp352是酵母/大腸桿菌穿梭質粒(Hill，J.E.，Myers，A.M.，Koemer，T.J.，和Tzagaloff，A，1986，具有多個唯一限制性位點的酵母/大腸桿菌穿梭載體，酵母2163-167)。
通過用ApaI和NsiI消化pTWM103，並純化含有ERG9基因和側翼序列的2044bp片段即可得到上述ERG9探針的DNA。然後使用隨機引物延伸(NEBlot Phototope Kit，New England BioLabs，Beverly，MA)使ERG9DNA生物素化。
使約1μg生物素化的ERG9探針與菌株ATCC28383，MBNA1-1，MBNA1-9和MBNA1-13經ApaI和NsiI消化的基因組DNA進行Southem印跡雜交。印跡揭示出所有4個菌株均含有位於2044bp片段上的單個雜交序列。
為了從這4個菌株中克隆ERG9基因，再次用ApaI和NsiI消化各菌株的基因組DNA。用ApaI和PstI(NsiI和PstI具有相容的粘性末端)消化酵母/大腸桿菌穿梭載體pRS315(Sikorski，R.S和P.Hieter，1989，為了在釀酒酵母中進行有效的DNA操作而設計的穿梭載體系統和酵母宿主菌株，遺傳學，12219-27)。在瓊脂糖凝膠上分離經消化的DNA，從凝膠上切下大小範圍約為1.6kb至約3kb的染色體DNA片段以及對應於經消化的pRS316的3895bp帶，使用GeneClean(BIO101公司，Visa，CA)進行純化。將經純化的得自4個菌株的基因組DNA片段各與pRS316連接，並轉化至大腸桿菌。使用上述ERG9探針進行菌落雜交以鑑定出含有pRS316/ERG9克隆的轉化子。按照此方法分離這4個菌株各自的ERG9克隆。使用Applied Biosystems公司生產的ABI100型DNA自動測序儀，通過ACGT公司，Northbrook，IL對得自各菌株的克隆ERG9基因進行測序。
得自ATCC28383的ERG9基因序列與GenBank中登錄的序列(登記號為#U00030)相同。我們發現得自MBNA1-2和MBNA1-9的erg9基因具有相同的突變，即GenBank登記號為#U00030的序列的第#12386位的G變為A，使得TGG密碼子變為TGA終止密碼子。從而導致ERG9蛋白在第237位胺基酸處終止，而在野生型ERG9蛋白中，正常的終止位置為第444位胺基酸處。
我們還發現MBNA1-13的erg9基因在GenBank登記號為#U00030的序列的第#12017位缺失了一個C，導致移碼，使ERG9蛋白早早地在第116位胺基酸處終止，且最後兩個胺基酸不同於野生型ERG9蛋白(移碼所致)。MBNA1-1和MBNA1-9的erg9等位基因保留了低水平的活性。通過用攜有得自MBNA1-1和MBNA1-9的突變erg9基因的質粒轉化需要麥角固醇的erg9缺失突變體可以測定該活性。erg9缺失菌株中克隆基因的存在使得這些轉化子能在缺乏麥角固醇的培養基上生長，儘管生長較為緩慢。當通過此方法進行檢測時，得自MBNA1-13的erg9等位基因未顯示出任何殘留的活性。當用得自ATCC28383的ERG9等位基因轉化時，erg9缺失菌株以野生型的水平生長。
F.第二突變的描述在需氧條件下，釀酒酵母一般不會從其環境中攝入麥角固醇。然而，當添加麥角固醇或膽固醇時，分離的erg9突變體能在需氧條件下生長，因此，必須進行第二次突變以在需氧條件下攝取固醇。分離麥角固醇途徑突變體，如erg9突變體MBNA1-13所用的方法不僅包括選擇麥角固醇途徑突變體，還包括選擇在需氧條件下能攝入固醇的細胞，因為只有固醇途徑基因和固醇攝取基因都具有突變的突變體才能存活。
在下文實施例3中，描述了嘗試通過分子生物學方法得到erg9敲除突變時，即使在攜有upc2突變的菌株中，所遇到的困難，據報導該菌株可以在需氧條件下攝取固醇(Lewis，T，L.，G.A.Keesler，G.P.Fenner和L.W.Parks，1988，釀酒酵母中影響固醇攝取和代謝的多效突變，酵母，493-106)。在erg9突變體中，upc2突變似乎不能賦予有效的需氧固醇攝取，實施例3中所述菌株(以低頻率)獲得了其它自發突變，這些突變可以使菌株在需氧條件下攝取固醇的能力得到改善。
在另一個野生型菌株中進行適當突變以增強麥角固醇和膽固醇的需氧攝取，可以使我們以相對於非-固醇攝取突變菌株而言高得多的頻率分離到該菌株中的erg9突變。為了闡明erg9突變菌株MBNA1-13(以及該菌株的衍生物)已獲得能增強需氧條件下的固醇攝取的突變(稱為固醇攝取增強或sue突變)，需比較在MBNA1-13背景(含有固醇攝取突變)中產生erg9敲除的頻率和在ATCC28383親代背景(可能缺乏固醇攝取突變)中得到erg9敲除突變的頻率。用下面兩個各代表一個菌株背景的菌株進行所述比較。SWE23-ΔHE9(ura3，his3，sue)衍生自MBNA1-13，含有經修復的ERG9基因。SWY5-ΔH1(ura3，his3)是衍生自菌株ATCC28383的營養缺陷型突變體。SWE23-ΔHE9和SWY5-ΔH1的構建詳細描述於下文中的G部分。由於SWE23-ΔHE9衍生自MBNA1-13，該菌株用作攜帶sue突變的宿主，而衍生自ATCC28383的SWY5-ΔH用作不具有sue突變的宿主。用BamHI和XmaI消化pKML19-41(實施例3中所述質粒構建體)並純化所得的2.1kb片段，得到erg9Δ∷HIS3 DNA片段，用等量(約1μg)的該DNA片段轉化上述兩個菌株，使用LiAc轉化法(Gietz，R.D.，R.H.Schiestl，A.R.Willems和R.A.Woods，1995，有關通過LiAc/SS-DNA/PEG法轉化完整酵母細胞的研究，酵母11355-360)，用上述2.1kb片段轉化細胞，在SCE-ura培養基上選擇轉化子。SCE培養基含有0.67％細菌用酵母氮基(不含胺基酸)，2％葡萄糖，20mg/l腺嘌呤硫酸酯，20mg/l尿嘧啶，20mg/l L-色氨酸，20mg/l L-組氨酸，20mg/l L-精氨酸，20mg/l L-甲硫氨酸，30mg/l L-酪氨酸，30mg/l L-亮氨酸，30mg/l L-異亮氨酸，30mg/l L-賴氨酸，50mg/l L-苯丙氨酸，100mg/l L-穀氨酸，100mg/l L-天冬氨酸，150mg/l L-纈氨酸，200mg/l L-蘇氨酸，400mg/l L-絲氨酸和5mg/l麥角固醇。對瓊脂平板而言，需在SCE培養基中加入2％細菌用瓊脂。SCE-ura培養基是缺乏尿嘧啶的SCE。
轉化SWY5-ΔH1總共得到24個HIS+菌落，而轉化SWE23-ΔHE9得到401個HIS+菌落。由於erg9Δ∷HIS3基因可以整合至除ERG9基因座以外的基因座(因此可以使細胞仍為麥角固醇原養型)，通過鋪於YPD培養基(缺乏麥角固醇)上來檢測每類各20個轉化子對麥角固醇的需求。衍生自SWY5-ΔH的所有20個HIS+菌落能在YPD上生長，這表明它們仍含有功能性的ERG9基因，並暗示erg9Δ∷HIS3基因未整合至ERG9基因座。另一方面，衍生自SWE23-ΔHE9的20個HIS+菌落無一能在YPD上生長，這表明erg9Δ∷HIS3DNA已以相對較高的頻率取代了該菌株背景中的野生型ERG9基因。為了證實這一點，通過PCR分析各個菌株的9個HIS+菌落，以測定其基因組中存在的ERG9等位基因的類型。按Sherman等(1989)所述製備基因組DNA。用於分析的寡核苷酸如下5』寡核苷酸＝250UpBam gcgcatCCACGGGCTATATAAA(SEQ ID NO3)3』寡核苷酸＝1764LoBam gcggatCCTATTATGTAAGTACTTAG(SEQ IDNO4)
PCR條件如下94℃，3分鐘。
94℃，30秒；50℃，30秒；72℃，3分鐘；30個循環。
72℃，7分鐘。
寡核苷酸250UpBam含有對應於GenBank登記號為#J05091的序列的第#11555位至#11570位的序列。寡核苷酸1764LoBam含有相同GenBank序列中的第#13049位至#13068位序列的反向互補序列。在SWE23-ΔHE9的所有9個HIS+轉化子中，PCR產物為2.1kbp，這表明ERG9基因已被erg9Δ∷HIS3基因取代。在SWY5-ΔH1的9個HIS+轉化子中，8個PCR產物為2.1kbp和1.5kbp，這表明野生型ERG9基因保持完整，erg9Δ∷HIS3DNA已整合至基因組的其它位置。第9個HIS+轉化子僅顯示出1.4kbp PCR產物，這也表明此菌株中的ERG9基因是完整的。在這種情況下，據信HIS3基因已整合至基因組中，而未同時攜帶所有erg9序列。
這些結果表明在分離菌株MBNA1-13的過程中，菌株中產生了一個額外突變，本文稱之為sue。根據下文實施例3所述結果，sue突變似乎不同於以前報導的upc2突變，它能使菌株更有效地攝取固醇。
G.由MBNA1-13衍生新菌株為了使用erg9突變菌株MBNA1-13進行分子遺傳學操作，可對菌株進行進一步的改造以使其攜有適於此目的的營養缺陷標記。使用標準方法，用甲磺酸乙酯誘變MBNA1-13，通過將經誘變的細胞鋪於含有5-氟乳清酸(5-FOA)的培養基上即可得到抗5-FOA的突變體。5-FOA選擇的應用描述於Sikorski和Boeke，1991(Sikorski，R.S和Boeke，J.D.，1991，體外誘變和質粒改組從克隆的基因到突變的酵母，酶學方法，194302-318)。該篩選方法可以分離含有URA3基因突變的菌株，所述基因編碼的是乳清苷-5』-磷酸脫羧酶。分離幾個表現出5-FOA抗性(即ura-表型)的抗性菌株。為了測定這些菌株中的哪一個特別地在URA3基因中含有突變，使用LiOAc轉化法(Gietz等，1995)，用含有完整URA3基因的pRS316(Sikorski和Hieter，1989)轉化ura-菌株。鑑定出幾個菌株，它們在缺乏尿嘧啶的培養基上原本無法生長，但pRS316恢復了它們的生長能力，這表明所述菌株攜有ura3突變。選擇這些菌株中的一個，即EMS9-23(ura3，erg9)作進一步的修飾。
使用Sikorski和Hieter(1989)所述基因置換型質粒和Rothstein(1991)所述pop-in/pop-out基因取代法(Rothstein，R.，1991，靶向，破壞，取代和等位基因獲救酵母中的整合DNA轉化，酶學方法，194281-301)，對菌株EMS9-23進行基因改造以使其leu2，trp1或his3基因含有缺失。衍生自MBNA1-13的leu2，trp1和his3突變體分別被稱為SWE23-ΔL1，SWE23-ΔT1和SWE23-ΔH1。進一步對菌株SWE23-ΔH1進行改造以使原先的erg9移碼突變(見E部分)與erg9Δ∷HIS3等位基因發生交換。通過用約5μg含有erg9Δ∷HIS3盒(erg9Δ∷HIS3盒的構建詳細描述於實施例3)的線性DNA片段轉化SWE23-ΔH1(使用LiOAc轉化法)即可實現這一目的。通過用BamHI和XmaI消化pKML19-40並純化含有erg9Δ∷HIS3片段的2.1kbp DNA片段即可得到erg9Δ∷HIS3盒。通過將轉化子鋪於缺乏組氨酸的SCE培養基上，選擇出erg9移碼等位基因已被erg9Δ∷HIS3等位基因取代的SWE23-ΔH1轉化子。將所得的一個菌株稱為SWE23-ΔE91。
進一步修飾菌株SWE23-ΔH1以使其leu2和trp1基因含有突變。使用基因置換型質粒(Sikorski和Hieter，1989)和上述pop-in/pop-out基因取代法(Rothstein，R，1991)導入這些突變。將所得的一個菌株稱為SW23-ΔH1#42，其含有erg9，ura3，his3，leu2，trp1和sue突變。進一步修飾菌株SW23-ΔH1#42以使原先的erg9移碼突變與erg9D∷HIS3等位基因發生交換。通過用約5μg含有上述erg9D∷HIS3盒的線性DNA片段轉化SW23-ΔH1#42(使用LiOAc轉化法)即可實現這一目的在SCE-his培養基上選擇出erg9移碼突變已被erg9D∷HIS3等位基因取代的HIS+轉化子。將所得的一個菌株稱為SW23B，該菌株的下列基因攜有突變ura3，leu2，trp1，his3，erg9∷HIS3，sue。
衍生自MBNA1-13的菌株及其各自在搖瓶培養中生產法尼醇的情況概述於表6。在YPDE培養基中將菌株培養過夜(30℃，以180rpm振蕩)。使用這些培養物接種250ml燒瓶中的25ml YPDE培養基，使得起初的OD600為0.05，於30℃將細胞培養72小時(以180rpm振蕩)。按上文C部分所述，分析全部肉湯(即細胞加上培養基)樣品的細胞乾重和法尼醇含量。
表6衍生自MBNA1-13的菌株的生長和法尼醇生產情況
使用下文H部分所述方法，進一步評價菌株MBNA1-13，EMS9-23和SWE23-ΔE91在1升發酵罐中的生長和法尼醇生產狀況。用含有克隆的URA3基因的質粒YEp352分別轉化EMS9-23和SWE23-ΔE91。這樣就無需在這兩個菌株的發酵培養基中加入尿嘧啶。圖4和表7概述了這些發酵的結果。類似地進行有關MBNA1-13和EMS9-23/YEp352的實驗。儘管SWE23-ΔE91/YEp352的生長滯後於其它兩個菌株，但它也能達到與其它兩個菌株差不多的細胞密度和法尼醇生產水平。
表7在1升發酵罐中比較MBNA1-13及其衍生菌株
將菌株EMS9-23和SWE23-ΔH1的erg9突變回復至野生型功能以對其進行進一步的操作。通過用約5μg含有完整ERG9基因的DNA片段轉化這兩個菌株(使用LiOAc轉化法)即可實現此目的。通過用SacI和BamHI消化pTWM103(見上文E部分)並純化含有ERG9基因的2.5kb DNA片段即可得到ERG9基因DNA片段。通過選擇能在缺乏麥角固醇的YPD培養基上生長的細胞，從各菌株中得到EMS9-23和SWE23-ΔH1的轉化子，其中erg9移碼突變已被野生型ERG9基因取代。選擇衍生自EMS9-23的一個erg9-修復菌株(被稱為SWE23-E9)和衍生自SWE23-ΔH1的一個erg9-修復菌株(被稱為SWE23-ΔHE9)進行進一步研究。在分開的實驗中，將營養缺陷突變導入親代菌株ATCC28383。按上述在含有5-FOA的培養基上平鋪細胞之後，得到ATCC28383的ura3自發突變體。用pRS316(如上述)轉化抗5-FOA的突變體，鑑定已特定地在其URA3基因上自發獲得突變的菌株。一個菌株(SWY5)表現出穩定的ura-表型(低回復突變頻率)，選擇該菌株進行進一步研究。使用Sikorski和Hieter(Sikorski和Hieter(1989))所述基因置換型質粒YRp14/his3-Δ200和Rothstein(Rothstein(1991))所述pop-in/pop-out基因取代法進一步對SWY5進行改造以使其攜有his3突變。衍生自SWY5的一個his3突變體被稱為SWY5-ΔH，選擇該菌株進行進一步研究。
表8列出了上述經修復的和營養缺陷型的菌株及其基因型。
表8與ATCC28383和MBNA1-13相關的修復型和營養缺陷型菌株
為了檢測erg9突變的MBNA1-13是否在其分離過程中獲得了任何其它的營養需求，在搖瓶中進行生長實驗以比較親代菌株ATCC28383，erg9突變菌株EMS9-23和erg9-修復菌株SWE23-E9。於30℃，以180rpm在YPD培養基中振蕩培養培養物。還在EMS9-23培養物中添加5mg/l麥角固醇。通過OD600監測生長。
該實驗的結果示於圖5，顯示出erg9突變體的生長降低，但野生型親代菌株28383和erg9-修復菌株SWE23-E9的生長情況類似。SWE23-E9培養物中最終的OD600稍低可能是由於該菌株是尿嘧啶營養缺陷型，而YPD培養基中的尿嘧啶濃度不是最適濃度的緣故。這些結果表明erg9突變體生長缺陷的主要原因是erg9突變自身。erg9突變體中的其它突變，如sue突變對生長沒有顯著影響。
H.1升發酵按下文所述，在1升發酵罐中，在補料分批條件下培養菌株MBNA1-13，EMS9-23/YEp352和SWE23-ΔE91/YEp352。在這些條件下，在191至239小時內，這些菌株產生的法尼醇佔細胞乾重的5.5-6.0％(數據示於上文G部分)。
發酵條件和原料首先於121℃在發酵罐中將下列溶液高壓滅菌45分鐘以進行1升發酵(NH4)2SO410.0g/lKH2PO410.0g/lCaCl2-2H2O 0.5g/lNaCl 0.5g/l
MgSO4-7H2O 3.0g/l酵母提取物(Difco) 2.0g/l鹽溶液 20.0ml消泡劑(Dow1520) 4.0滴去離子水500ml高壓滅菌之後，加入下列無菌溶液葡萄糖溶液(50％，w/v) 5.0ml維生素溶液 15.0ml麥角固醇溶液 0.2ml通過流經0.45微米的濾器對葡萄糖和維生素溶液進行滅菌。麥角固醇溶液被認為是無菌的(見下文)。
葡萄糖補料溶液(製備於去離子水中)葡萄糖溶液(60％，w/v) 360ml酵母提取物溶液(12.5％，w/v)80ml麥角固醇溶液 5.8ml對葡萄糖，酵母提取物進行高壓滅菌；麥角固醇被認為是無菌的。
接種物將1ml冷凍於10％甘油中的細胞懸浮液接種於1000ml帶擋板燒瓶內的250ml YPDE培養基中，於29℃，以150rpm保溫48小時；每個發酵罐使用30ml接種物。
發酵條件28℃pH4.5振蕩300-1000rpm，按需要通氣50-200ml/min以使溶解氧維持為空氣飽和度的10-60％。當最初的葡萄糖耗盡之後，加入葡萄糖補料溶液。考慮到利用葡萄糖的細胞產量為0.25，添加速率應使生長速率為0.04hr-1。最大補料速率＝3.5ml/hr。
鹽溶液(每升去離子水中的量)FeSO4-7H2O0.28gZnSO4-7H2O0.29gCuSO4-5H2O0.08g
Na2MoO4-2H2O 0.24gCoCl2-6H2O 0.24gMnSO4-H2O 0.17gHCl0.10ml維生素溶液(每升去離子水中的量)生物素10mg泛酸鈣120mg肌醇 600mg鹽酸吡哆醇120mg鹽酸硫胺素120mg麥角固醇溶液乙醇 20mlIGEPAL20ml麥角固醇 0.4g於50℃混合加熱直至溶解，儲存於-20℃。IGEPAL是1，3，3四甲基丁基苯氧基(乙氧基)8乙醇(Sigma Chemical Company，St.Louis，MO，ProductIGEPAL CA-630，目錄號為#I3021)。
實施例2本實施例描述了使用甲磺酸乙酯(EMS)化學誘變釀酒酵母菌株64031從而產生erg9突變體。菌株64031(得自ATCC)是erg9-1突變體，它可產生低水平的法尼醇(見實施例1)，進一步誘變產生了表現出改良法尼醇產量的突變體。
使用EMS繪製殺傷曲線，按實施例1所述誘變64031，也按實施例1所述進行選擇。
我們發現總共有163個菌株為制黴菌素抗性，ts，固醇營養缺陷型。在試管和搖瓶中培養這些菌株，按實施例1所述測定法尼醇的產量。搖瓶培養所生產的法尼醇的量示於表9。
表9
實施例3在上文實施例1.G.中，描述了MBNA1-13的erg9Δ∷HIS3突變體的產生。在此實施例中，描述了其它單倍體釀酒酵母菌株(不是衍生自MBNA1-13)的構建，所述菌株含有erg9缺失∷HIS3插入等位基因。
使用(根據Sherman等的方法)分離自菌株S288C的基因組DNA為模板和下列兩個引物PCR擴增ERG9基因5』寡核苷酸＝gag cat CCA CGG GCT ATA TAAA(SEQ ID NO5)；250BamUp3』寡核苷酸＝tcc ccc cg GGC GCA GAC TTC ACG CTC(SEQ ID NO6)；1712XmaLo用BamHI和XmaI消化經PCR擴增的ERG9DNA，然後連接於經BamHI和XmaI消化pRS316(酵母/大腸桿菌穿梭載體，Sikorski和Hieter，1989)。
PCR條件如下94℃，1分鐘；1個循環94℃，30秒；58℃，1分鐘；72℃，1分鐘；30個循環72℃，2分鐘；1個循環按此方法克隆的ERG9基因從GenBank登記號為#U00030的序列的第#11555位延伸至第#13047位，所得克隆被稱為pJMB98-12。按下述構建ERG9中的缺失和HIS3 DNA中的插入通過用Eco47III和SspI消化含有HIS3的質粒pRS403(Stratagene，LaJolla，CA)並純化含有HIS3基因的1226bp片段即可得到HIS3基因。
用Van91I消化質粒pJMB98-12，然後用T4 DNA聚合酶處理以使其成為平端。進一步用HpaI消化質粒以使ERG9內的一個內部589bp片段缺失。在此位點連接含有HIS3基因的1226bp Eco47III，SspI片段。所得質粒pKML19-41在缺失的ERG9基因內克隆了HIS3基因，HIS3編碼序列的方向與ERG9編碼序列的方向相同。
為了用此erg9Δ∷HIS3 DNA轉化酵母，用SmaI和XbaI消化質粒pKML19-41，分離含有erg9Δ∷HIS3基因的2141bp片段。使用GeneClean從瓊脂糖凝膠切片中純化DNA。
使用Gietz等(1995)所述醋酸鋰轉化法，用約5μg純化的erg9Δ∷HIS3DNA轉化二倍體菌株CJ3A×CJ3B(a/α，ura3/ura3，his3/his3，leu2/leu2，trp1/trp1，upc2/upc2，得自N.C.州立大學，Raleigh，NC的L.Parks博士)。CJ3A×CJ3B中的upc2突變是純合的。該突變使菌株能在需氧條件下攝取固醇(Lewis等，1988)。據信upc2突變會使攜有erg9基因突變的單倍體菌株易於產生。選擇攜有含功能性HIS3基因之質粒的菌株必須選擇菌株的組氨酸營養缺陷型。
將經轉化的細胞鋪於缺乏組氨酸的SCE培養基(實施例1.F.所述)(SC-His)以選擇HIS+轉化子。
得到幾百個轉化子。然後將這些HIS+細胞鋪於SC-His，培養兩天以上。然後將轉化子鋪於孢子形成培養基(Sherman等，1986)上。孢子形成培養基含有(每升蒸餾水中的量)1％醋酸鉀，0.1％細菌用酵母提取物，0.05％葡萄糖和2％細菌用瓊脂。然後將菌塊培養3至5天使其形成孢子。取出部分細胞，置於溶細胞酶溶液中以消化子囊細胞壁。然後將細胞劃細線鋪於YPD＋2mg/l麥角固醇(YPDE)平板上。形成孢子的二倍體細胞形成含有4個孢子的四聯體，使用顯微操作器分離各個孢子。各個單倍體孢子將會萌發，各含有單拷貝的染色體。
在此菌株中，對erg9Δ4∷HIS3敲除而言，預期的分離比為2∶2。兩個孢子應該在YPD上存活，因為它們含有未被破壞的染色體拷貝(這意味著它們無需麥角固醇，因為它們具有起作用的ERG9基因，它們也能在YPD上生長，因為培養基中存在組氨酸)。其它兩個孢子應該能在SC-His＋2mg/l麥角固醇(SCE-His)上生長，因為如果erg9Δ∷HIS3 DNA整合至ERG9位點，細胞將需要麥角固醇，但能在缺乏組氨酸時生長。
分析一些pKML19-41轉化子的四聯體以測定erg9敲除的表型。結果表明需氧生長時，4個孢子中僅有2個可以存活。將這些孢子影印鋪板於YPD時，這兩個孢子存活，但它們不能在SC-His或SCE-His上存活。這表明分離比為2∶2，這兩個存活孢子為親代型或組氨酸營養缺陷型。不能在需氧條件下存活的兩個孢子可能含有erg9Δ∷HIS3敲除。
PCR分析證實了幾個菌株中的erg9Δ∷HIS3敲除結果。使用快速DNA分離法從幾個顯示出2∶2分離比的二倍體轉化子中分離總DNA。然後將總DNA用作PCR擴增的模板，PCR所用引物與染色體ERG9基因的5』和3』序列互補。
此分析所用寡核苷酸如下5』-寡核苷酸＝250Bam Up(如上述)3』-寡核苷酸＝3ERG9-1＝gat ccg cg GCT CAA GCT AGC GGT ATT ATGCC(SEQ ID NO7)3ERG9-1含有的序列反向互補於GenBank登記號為#U00030的序列中第#14812位至第#14790位的序列。
寡核苷酸250Bam UP位於構建erg9Δ∷HIS3等位基因所用ERG9克隆的序列內，而寡核苷酸3ERG9-1位於克隆的ERG9 DNA邊界序列的下遊。由這兩個引物從基因組DNA中擴增的ERG9序列必須代表位於實際的染色體ERG9基因座的ERG9基因，而不擴增整合至其它染色體位置的erg9Δ∷HIS3序列。
結果顯示出3.271和3.908kb處的兩條帶，表明雙倍體菌株中存在ERG9基因的一個功能性拷貝和一個間斷拷貝，後者由於HIS3基因插入而比前者大637bp。
進行Southem印跡分析以進一步證實二倍體中的erg9Δ∷HIS3間斷。將得自攜有兩個正常的ERG9基因拷貝的親代二倍體菌株的基因組DNA與3個不同的轉化子進行比較，據信所述轉化子攜有一個正常的ERG9基因和一個被破壞的ERG9基因。用AccI或XbaI消化DNA，通過凝膠電泳分離，轉移至Immobilon S膜上，用特異性探針與之雜交以檢查是否存在ERG9基因。此時的探針是含有部分ERG9基因的1.4kb片段。
基因組DNA的Southem印跡分析所用的探針製備自使用寡核苷酸250Bam Up和1712Xma Lo(見上文)PCR擴增的ERG9基因。將質粒pJMB98-12用作模板。PCR條件如下94℃，1分鐘；1個循環94℃，30秒；58℃，1分鐘；72℃，1分鐘；30個循環72℃，2分鐘；1個循環如上所述純化擴增的ERG9DNA，並使其生物素化。使用約1μg生物素化的探針與印跡雜交。
在嚴緊條件下使探針與特定的DNA帶雜交鑑定出互補序列的存在。對親代二倍體CJ3AxCJ3B而言，用AccI消化後在2.1kb處有一條帶出現，用XbaI消化後在2.8kb處有一條帶出現。推定的erg9Δ∷HIS3敲除各含有兩條帶用AccI消化，在2.1kb和1.3kb處出現帶；用XbaI消化，在2.8kb和3.4kb處出現帶。這些結果表明經轉化的二倍體中存在1拷貝野生型ERG9基因以及一個erg9Δ∷HIS3破壞。
然後嘗試在YPDE瓊脂上厭氧培養單倍體細胞。麥角固醇途徑被阻斷的菌株可在厭氧條件下攝取固醇。兩個孢子在厭氧條件下快速生長(ERG9，his-)，兩個孢子生長很緩慢(erg9Δ∷HIS3)。在厭氧條件下，在液體培養基中厭氧培養能在平板上厭氧生長的3個菌株erg9Δ∷HIS3(KML505，KML510和KML521)的孢子，它們顯示出法尼醇生產。接著，需氧保溫最初的YPDE平板，厭氧生長時被檢測為法尼醇生產陽性的幾個單倍體菌株能夠生長。延長需氧保溫時間之後，產生3個這種存活孢子(得自KML505)。這些需氧生長的菌株被稱為BKY1-2D，BKY1-7C和BKY1-8D，它們都能在需氧條件下生產法尼醇。
親代菌株KML510(a/α，ura3/ura3，his3/his3，trp1/trp1，leu2/leu2，upc2/upc2，ERG9/erg9Δ∷HIS3)含有pJMB98-12或pRS316，使其形成孢子，將四聯體分割於YPDE平板上。在需氧條件下保溫平板，觀察到下列孢子生長模式。
用20個四聯體進行KML510/pJMB98-12的四聯體分析。16個四聯體產生2個存活的，快速生長的孢子和2個不能存活的孢子。所有存活的孢子是his-，erg+。3個四聯體產生2個存活的，快速生長的孢子，1個存活的，生長緩慢的孢子和1個不能存活的孢子。存活的，快速生長的孢子都是his-，erg+。存活的，緩慢生長的孢子都是his+，erg-。1個四聯體不產生任何存活的孢子。所有his+，erg-孢子也是ura-，這表明pJMB98-12在減數分裂的過程中未分離成這些孢子。將1個his+，erg-孢子用於進一步研究，並將其稱為BTY19-9C。
用20個四聯體進行KML510/pRS316的四聯體分析。18個四聯體產生2個存活的，快速生長的孢子和2個不能存活的孢子。2個四聯體產生2個存活的，快速生長的孢子，1個存活的，生長緩慢的孢子和1個不能存活的孢子。所有快速生長的孢子都是his-，erg+。所有緩慢生長的孢子都是his+，erg-。所有his+，erg-孢子也是ura-，這表明pRS316在減數分裂的過程中未分離成這些孢子。將1個his+，erg-孢子用於進一步研究，並將其稱為BTY20-2A。
為了證實BTY19-9C和BTY20-2A不攜帶野生型ERG9基因，使用分離自這兩個菌株的基因組DNA，和寡核苷酸VE104-5和VE105-3進行PCR實驗。
5』寡核苷酸＝VE104-5＝gac tct AGA AGC GGA AAA CGT ATA CAC3』寡核苷酸＝VE105-3＝上文所述VE104-5含有對應於GenBank登記號為#U00030的序列的第#11631位至116541位的序列。
功能性ERG9基因的推測PCR產物大小為2.23kb，對erg9Δ∷HIS3破壞而言為2.87kb。菌株BTY19-9C和BTY20-2A的PCR產物約為2.87kb，這表明存在erg9Δ∷HIS3破壞。
在搖瓶中評價5個菌株(BKY1-2D，BKY1-7C，BKY1-8D，BTY19-9C和BTY20-2A)的法尼醇生產情況。在5個菌株中，菌株BKY1-7C和BTY20-2A的法尼醇生產情況最好，但BKY1-7C生長很緩慢。
將轉化子KML505，KML510和KML521轉移至孢子形成培養基中。將四聯體分割至YPDE上，在需氧條件下培養延長的一段時間以尋找超出預期的2∶2分離比(存活不存活)的其它孢子的生長。在需氧條件下進一步保溫之後，另外2個孢子存活。這兩個菌株BJY7-5D和BJY8-1A在試管篩選中產生法尼醇。
在搖瓶中評價菌株BJY7-5D和BJY8-1A。保溫72小時之後，BJY8-1A生產法尼醇的情況最好(0.29mg/ml，佔細胞乾重的4.7％)。BJY7-5D給出0.18mg法尼醇/ml(佔細胞乾重的3.5％)。
實施例4本實施例顯示了含有和不含功能性ERG9基因的菌株中HMG CoA還原酶的過量表達。
據認為，HMG CoA還原酶是調節類異戊二烯途徑的碳流動的關鍵酶。在釀酒酵母中，兩個基因HMG1和HMG2編碼HMG CoA還原酶的兩個同工酶(被稱為HMG1p和HMG2p)。通過聯合使用轉錄和翻譯調節以及蛋白質降解即可調節HMG CoA還原酶。編碼HMG1p和HMG2p同工酶催化結構域的HMG1和HMG2基因區段已被克隆於強啟動子的轉錄控制之下，所述啟動子得自GPD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)基因。含有這些構建體的質粒(pRH127-3和pRH124-31，分別含有HMG1p和HMG2p的催化結構域)得自RHampton，U.C.San Diego。據報導，過量表達HMG1p催化結構域的釀酒酵母菌株的類異成二烯途徑碳流量提高。經證實，增加的碳流量為角鯊烯和麥角固醇過量產生(Donald，K.A.G.，Hampton，R.Y和Fritz，I.B，1997，在釀酒酵母中過量產生3-羥基-3-甲基戊二酸單醯輔酶A還原酶的催化結構域對角鯊烯合成的影響，應用和環境微生物學，633341-3344)。
A.在含有功能性ERG9基因的菌株中過量表達HMG CoA還原酶為了證實與釀酒酵母的其它菌株類似(Donald等，1997)，在衍生自ATCC28383的菌株中過量表達HMG CoA還原酶也會導致類異戊二烯途徑的碳流量增加，用質粒pRH127-3和pRH124-31轉化菌株SWY5(親代菌株ATCC28383的ura3突變體)和SWE23-E9(EMS9-23的erg9修復菌株，描述於上文實施例1.G.)。使用LiOAc法(Gietz等，1995)進行轉化。同時構建攜有空載體YEp352的對照菌株。在搖瓶實驗中檢測代表性轉化子的角鯊烯和麥角固醇生產情況。於30℃，在50ml SCE-ura培養基中，以180rpm的轉速振蕩培養細胞48小時。在第24小時時，取出10ml培養物，按實施例1.D.所述收集細胞，進行HMG CoA還原酶分析試驗。在48小時的生長期結束時，使用培養物等分試樣接種含有50ml YPD培養基的燒瓶，以使培養物的起始OD600為0.1。於30℃，在YPD培養基中，以180rpm的轉速將培養物振蕩培養72小時，然後分析細胞乾重，角鯊烯和麥角固醇的積累。此分析所用的提取方法如下。以1,500×g離心10分鐘以沉澱10ml培養物。將細胞沉澱物重新懸浮於1ml去離子水中，重新沉澱細胞。將細胞沉澱物重新懸浮於1ml去離子水中，用矽酸鋯珠(直徑為0.5mm)振蕩破碎細胞。於75℃用2.5ml 0.2％的連苯三酚的甲醇溶液和1.25ml 60％氫氧化鉀溶液將破碎的細胞懸浮液皂化1.5小時。然後用5ml己烷抽提樣品，渦旋3分鐘，以1,000×g離心20分鐘以分離相。然後按實施例1.B.所述通過GC-MS分析己烷層。
該實驗的數據示於表10。相對於僅攜有Yep352載體的對照菌株而言，過量表達HMGlp或HMG2p催化結構域的菌株含有高水平的HMG CoA還原酶活性和升高水平的角鯊烯。然而，過量表達HMGlp或HMG2p的菌株都不含水平顯著增加的麥角固醇。然而，這些數據表明MBNA1-13菌株譜系中HMG CoA還原酶活性的增加增加了類異戊二烯途徑的碳流量。
表10.在具有正常類異戊二烯途徑的菌株中，HMGCoA還原酶活性的增加對角鯊烯和麥角固醇生產的影響
B.erg9突變體中HMG CoA還原酶的過量表達已證明HMGlp或HMG2p的增加可使流向角鯊烯的碳增加，檢測攜有erg9突變的菌株中HMG1或HMG2的過量表達是否能增加法尼醇產量。用質粒pRH127-3或pRH124-31轉化菌株SWE23-ΔE91(描述於實施例1.G.)。使用LiOAc轉化法(Gietz等，1995)進行SWE23-ΔE91的轉化。在每次轉化中使用約2.5μgpRH127-3或pRH124-31DNA。在SCE-ura平板上選擇轉化子，選出幾個轉化子，在SCE-ura平板上重新劃線以進行純化。為了檢測HMGCoA還原酶的增加對法尼醇生產的影響，在液體SCE-ura培養基中將代表性的轉化子培養48小時。實驗中也包括對照菌株SWE23-ΔE91/YEp352。在48小時的生長期結束時，使用培養物等分試樣接種含有50ml YPDE培養基的燒瓶，以使培養物的起始OD600為0.5。於30℃，以180rpm的轉速將培養物振蕩培養72小時。在保溫期結束時，分析樣品的細胞乾重和法尼醇濃度。為了證實轉化子過量表達了HMG CoA還原酶基因，以1,500×g離心10分鐘以收集20ml在SCE-ura中生長的培養物，使用實施例1.D.所述透化細胞法測定HMG CoA還原酶活性。此實驗的數據示於表11。
表11.在搖瓶培養中生長的erg9∷HIS3突變體中HMGCoA還原酶活性的增加對法尼醇生產的影響
在SWE23-ΔE91/pRH127-3和SWE23-ΔE91/pRH124-31中，HMG CoA還原酶活性水平都有所提高。然而，這些菌株中的法尼醇產量低於對照菌株SWE23-ΔE91/Yep352。在獨立的實驗中幾次觀察到這一出人意料的結果。
儘管在搖瓶培養中生長的erg9∷HIS3菌株的HMG CoA還原酶活性的增加不能提高法尼醇產量，使用實施例1.H.所述方法，在1升發酵罐中檢測表12所列菌株的法尼醇生產情況。在這些情況下，觀察到預期的結果；相對於對照菌株而言，過量表達HMG CoA還原酶的菌株產生顯著更多的法尼醇。數據概述於圖6和表12。使用透化細胞法進行直接酶分析，進一步證實菌株SWE23-ΔE91/pRH127-3和SWE23-ΔE91/pRH124-31中HMG CoA還原酶活性的提高。通過發酵過程中特定時間點的還原酶活性可闡明這一點(如表12所示)。
表12.在1升發酵罐中生長的erg9∷HIS3突變體中HMGCoA還原酶活性的增加對法尼醇生產的影響
實施例5本實施例描述了erg9突變體中多種GGPP合酶的過量表達。
為了將erg9突變菌株產生的FPP轉變為GGPP(所需產物GG的前體)，需過量表達編碼erg9突變體中多種GGPP合酶的基因。為此目的而克隆的基因是釀酒酵母的BTS1基因，如噬夏孢歐文氏菌的crtE基因，粗糙鏈孢黴的a1-3基因和稻惡苗赤黴的ggs基因。按下述構建攜有這些基因的質粒。
為了克隆BTSI1基因，根據Sherman等(1986)所述方法，製備釀酒酵母菌株S288C的基因組DNA。使用下列兩個寡核苷酸，經PCR擴增基因。
5』寡核苷酸＝VE100-5gactctAGAGTTTACGAGTCTGGAAAATC(SEQID NO8)3』寡核苷酸＝VE101-3gtaggATCCATGGAATTGAGCAATAGAG(SEQID NO9)PCR條件是94℃，3分鐘；94℃，1分鐘；52℃，1分鐘；74℃，1.5分鐘；30個循環；然後74℃，7分鐘(1個循環)。用XbaI和BamHI消化PCR產物，連接至經XbaI和BamHI消化的pPGK315得到pTWM101。質粒pPGK315含有被多個克隆位點分開的釀酒酵母PGK啟動子和終止子。按上述將BTS1基因克隆至pPGK315，使BTS1基因置於強的PGK啟動子的控制之下。用SacII和SmaI消化質粒pPGK315，然後用T4 DNA聚合酶處理以產生平端，籍此構建質粒pPGK315。重新連接質粒，產生pRS315-DSS。然後用XhoI消化質粒pRS315-DSS，並與994bp SalI，XhoI片段連接，所述片段得自質粒pPGKMCS，其含有被多個克隆位點分開的PGK啟動子和終止子。用EcoRI和BamHI消化pPGK(Kang等，1990，分子細胞生物學，102582)，然後與下列兩個退火的寡核苷酸連接即可構建質粒pPGKMCS。
5』寡核苷酸＝AATTCCAAGCTTGCGGCCGCTCTAGAACGCGTG(SEQID NO1 0)3』寡核苷酸＝GATCCACGCGTTCTAGAGCGGCCGCAAGCTTG(SEQID NO11)通過將含有PGK啟動子/BTS1/PGK終止子的2397bp KpnI-SalI片段(通過用KpnI和SalI消化pTWM110得到的片段)連接至經KpnI-SalI消化的YEp352，構建出質粒pTWM110-11。
為了克隆crtE基因，使用PureGene基因組DNA分離試劑盒(GentraSystems公司，Minneapolis，MN)，從如噬夏孢歐文氏菌菌株2OD3中分離基因組DNA。使用基因組DNA和下列兩個寡核苷酸擴增crtE基因。
5』寡核苷酸＝20D3Up gaattcGTTTATAAGGACAGCCCGA(SEQ IDNO12)3』寡核苷酸＝20D3Lo ctgcagTCCTTAACTGACGGCAGCGA(SEQ IDNO13)寡核苷酸20D3Up含有對應於Genbank登記號為#D90087的序列的第#206位至第#224位的序列。寡核苷酸20D3Lo含有相同Genbank序列的第#1117位至第#1136位序列的反向互補序列。將擴增的DNA連接至pCR-Script SK(+)(Stratagene，La Jolla，CA)的SrfI位點，產生質粒pSW1-B。然後用EcoRI和SacI消化該質粒，純化含有crtE基因的973bp片段，連接至經EcoRI和SacI消化的pAD314-956，產生質粒pSW2B。用BamHI消化質粒pSW2B，產生含有ADH1啟動子，crtE編碼序列和ADH1終止子的2199bp片段，將此片段連接至經BamHI消化的YEp352，產生pSW4A(將crtE基因置於與該質粒中的URA3基因相反的方向)和pSW4B(將crtE基因置於與URA3基因相同的方向)。
按下列方法產生質粒pADH313-956。用SacI和XbaI消化質粒pRS313(Sikorski和Hieter，1989)，用T4 DNA聚合酶處理以產生平端，然後重新連接產生質粒pDSX313。用SmaI和ApaI消化該質粒，用T4 DNA聚合酶處理產生平端，然後重新連接產生pDSXSA313。用HindIII消化質粒pAAH5(Ammerer，G.，1983，酶學方法，101192-201)，該質粒攜有被HindIII位點分開的ADH1啟動子和終止子，然後與下列兩個退火的寡核苷酸連接以導入多克隆位點並產生pAAH5-MCS。
5』寡核苷酸＝MCS1 AGCTGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGCICTAGAGICGACCIGCAGGCAIGCA(SEQ ID NO14)3』寡核苷酸＝MCS2 AGCTTGCATGCCTCCAGGTCGACTCTAGAGCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC(SEQ ID NO15)以pADH313-MCS為模板，並使用下列兩個寡核苷酸進行PCR反應，得到1232bp PCR產物，其含有ADH1啟動子，多克隆位點和ADH1終止子。
5』寡核苷酸＝ADH1A gacggatCCGTGGAATATTTCGGATATCC(SEQID NO16)3』寡核苷酸＝ADH1B ctcggatccGGACGGATTACAACAGGTATTGTCC(SEQ ID NO17)寡核苷酸ADH1A含有對應於Genbank登記號為#V01292的序列的第#16位至第#37位的序列。寡核苷酸ADH1B含有相同Genbank序列的第#2092位至第#2116位序列的反向互補序列。用BamHI消化1232bp PCR產物，連接至經BamHI消化的pDSXSA313，產生質粒pADH313-956。
為了克隆N.crassa a1-3基因，使用Borges等在真菌基因保藏中心網站(www.kumc.edu/research/fgsc/fgn37/borges.html)的方法部分所述方法，從粗糙鏈孢黴菌株ATCC14692中分離基因組DNA。使用下列兩個寡核苷酸通過PCR擴增基因。
5』寡核苷酸＝VE118-5 cagaatTCACCATGGCCGTGACTTCCTCCTC(SEQ ID NO18)3』寡核苷酸＝VE119-3 caagatctCATACATTCAATCCTCATGGACAC(SEQ ID NO19)寡核苷酸VE118-5含有對應於Genbank登記號為#U20940的序列的第#1216位至第#1240位的序列。寡核苷酸VE119-3含有相同Genbank序列的第#2576位至第#2599位序列的反向互補序列。將擴增的DNA連接至pCR-Script SK(+)(Stratagene，La Jolla，CA)的SrfI位點，產生pSW7-1和pSW7-2(a1-3基因的兩個獨立的PCR克隆)。然後用EcoRI和BglII消化這兩個質粒，純化含有a1-3基因的1393bp片段，並連接至經EcoRI，BamHI消化的pPGK(Kang等，1990)，產生pSW9-1和pSW9-2，它們中的a1-3序列分別衍生自pSW7-1和pSW7-2。
為了克隆ggs基因，使用與上述鏈孢黴相同的方法，從稻惡苗赤黴菌株ATCC12617中製備基因組DNA。使用下列兩個寡核苷酸經PCR擴增ggs基因。
5』寡核苷酸＝VE120-5 gagaattCTTAACACGCATGATCCCCACGGC(SEQ ID NO20)3』寡核苷酸＝VE121-3 ctggatcCGTCAAATCCGTGAATCGTAACGAG(SEQ ID NO21)寡核苷酸VE120-5含有對應於Genbank登記號為#X96943的序列的第#607位至第#630位的序列。寡核苷酸VE121-3含有相同Genbank序列的第#1908位至第#1932位序列的反向互補序列。將擴增的DNA連接至pCR-Script SK(+)的SrfI位點，產生pSW8-1和pSW8-2(ggs基因的兩個獨立的PCR克隆)。然後用EcoRI和BamHI消化這兩個質粒，純化含有ggs基因的1335bp片段，並連接至經EcoRI，BamHI消化的pPGK，產生pSW10-1和pSW10-2，它們中的ggs序列分別衍生自pSW8-1和pSW8-2。
使用LiOAc法，用上述質粒轉化菌株EMS9-23(ura3，erg9，描述於實施例1.G.)，在SCE-ura平板上選擇轉化子。挑選轉化子並在SCE-ura平板上重新劃線以進行純化。檢測代表性轉化子的GG生產。於30℃在液體SCE-ura培養基中培養菌株48小時，然後用於接種含有YPDE培養基的燒瓶以使最初的OD600為0.5。於30℃振蕩培養這些培養物達72小時，分析細胞乾重，法尼醇和GG水平。第二套燒瓶含有20ml SCE-ura培養基，用相同的起始培養物接種並培養48小時。收集這些燒瓶中的細胞，用10ml 50mM雙Tris丙烷緩衝液，pH7.0洗滌並重新沉澱。然後使用細胞沉澱物製備透化細胞懸浮液以分析GGPP合酶。通過將細胞重新懸浮於1ml含有0.1％Triton X100的50mM雙Tris丙烷緩衝液，pH7.0而使細胞透化，於80℃冷凍細胞待用。融化之後，使用透化細胞進行GGPP合酶分析。GGPP合酶分析混合物含有50mM雙Tris丙烷緩衝液，pH7.0(Xμl)，0.1M二硫蘇糖醇(1μl)，1mg/mlFPP(5μl)，1mg/ml IPP(5μl)和透化細胞(Yμl)，其中X＋Y＝87μl。分析中還包括對照反應，其中不含FPP和IPP。於37℃保溫分析混合物20分鐘。加入0.1ml2×甘氨酸緩衝液(0.2M甘氨酸，2mM MgCl2，2mM ZnCl2，pH10.4)和63個單位的鹼性磷酸酶(Sigma Chemical公司，St.Louis，MO)，於37℃保溫混合物60分鐘。然後用0.2ml 1∶1己烷∶乙酸乙酯抽提混合物，並通過GC/MS分析GG。GGPP合酶活性被表示為所形成GGPP的nmol數/min/mg蛋白質。
菌株的細胞乾重，法尼醇產量，GG產量和GGPP合酶活性概述於表13。缺乏克隆的GGPP合酶的對照菌株EMS923/YEp352產生8.7％法尼醇(根據細胞乾重)，並且基本上不產生GG。過量表達不同的克隆GGPP合酶的4個其它菌株產生與對照大致相同量的法尼醇(8.0-9.74％)，並產生水平為0.62-1.73％的GG。
表13.過量表達4個不同的克隆化GGPP合酶基因的菌株在搖瓶培養中的GG產量
在1升發酵罐中進一步評價GGPP合酶活性的增加對GG生產的影響。用攜有克隆的釀酒酵母BTS1基因的質粒pTWM110-11轉化菌株EMS9-23。用YEp352(對照載體)或pSW4A-3(質粒pSW4A的一個分離物，攜有克隆的crtE基因)轉化菌株SWE23-ΔE91(描述於上文實施例1.G.)。使用實施例1.H.所述方法，在1升發酵罐中培養菌株SWE23-ΔE91/YEp352，EMS9-23/pTWM110-11和SWE23-ΔE91/pSW4A-3，比較生長，法尼醇生產和GG生產。
結果示於圖7和表14。3個菌株的生長類似。菌株SWE23-ΔE91/YEp352在236小時內產生2.32g/l法尼醇，但未產生任何可測的GG。EMS9-23/pTWM110-11在239小時內產生2.1g/l法尼醇，在相同的時間內也產生0.42g/l GG。菌株SWE23-ΔE91/pSW4A-3在236小時內產生2.47g/l法尼醇，在相同的時間內也產生0.59g/l GG。對照菌株中的GGPP合酶活性低於可測限。菌株EMS9-23/pTWM110-11和SWE23-ΔE91/pSW4A-3的GG生產與增加的GGPP合酶活性相關。
表14.在1升發酵罐中培養的過量表達GGPP合酶之菌株的生長，及其法尼醇和GG生產
實施例6本實施例闡明了編碼FPP合酶的ERG20基因的過量表達的影響。
為了測定erg9突變體中FPP合酶水平提高的影響，克隆編碼釀酒酵母FPP合酶的ERG20基因以進行過量表達。使用釀酒酵母菌株S288C的基因組DNA(根據Sherman等，1986所述方法製備)和下列兩個寡核苷酸，經PCR擴增ERG20基因。
5』寡核苷酸＝BamFPPUp ggccggatccATATTACGTAGAAATGGCTTCAG(SEQ ID NO22)3』寡核苷酸＝XhoFPPLo gccgctcgagGGTCCTTATCTAGTTTG(SEQ IDNO23)寡核苷酸BamFPPUp含有對應於Genbank登記號為#J05091的序列的第#790位至第#810位的序列。寡核苷酸XhoFPPLo含有相同Genbank序列的第#1891位至第#1907位序列的反向互補序列。用BamHI和XhoI消化PCR產物，連接至含有釀酒酵母GPD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)啟動子和PGK終止子的載體中。通過用BamHI和SalI消化含有釀酒酵母HMG2基因之催化結構域(克隆於GPD啟動子和PGK終止子之間)的質粒，即pRH124-31(描述於實施例4)以除去HMG2 DNA即可得到啟動子/終止子載體。純化對應於啟動子/終止子載體的6.3kb帶，連接至含有ERG20的1129bp片段，產生pJMB19-31和pJMB19-32。使用LiOAc法，用質粒pJMB19-31和pJMB19-32轉化菌株SWE23-ΔE91(ura3，his3，erg9Δ∷HIS3)，在SCE-ura平板上選擇轉化子。挑選轉化子，在SCE-ura平板上重新劃線以進行純化。
為了測定erg9突變菌株中FPP合酶過量表達的影響，搖瓶培養按上述構建的代表性轉化子，並比較生長，法尼醇生產，GG生產和FPP合酶和GGPP合酶活性。於30℃在液體SCE-ura培養基中振蕩培養菌株4g小時，然後用於接種含有YPDE培養基的燒瓶以使最初的OD600為0.5。於30℃振蕩培養這些培養物達72小時，分析細胞乾重，法尼醇和GG水平。第二套燒瓶含有20ml SCE-ura培養基，用相同的起始培養物接種並培養48小時。收集這些燒瓶中的細胞，用10ml 50mM雙Tris丙烷緩衝液，pH7.0洗滌並重新沉澱。然後使用細胞沉澱物製備透化細胞懸浮液以分析FPP和GGPP合酶。通過將細胞重新懸浮於1ml含有0.1％Triton X100的50mM雙Tris丙烷緩衝液，pH7.0而使細胞透化，於80℃冷凍細胞待用。融化之後，使用透化細胞進行分析。GGPP合酶分析混合物與實施例5所述相同。FPP合酶分析混合物含有50mM雙Tris丙烷緩衝中液，pH7.0(Xμl)，0.1M二硫蘇糖醇(1μl)，0.5M MgCl2(2μl)，1mg/ml IPP(6μl)，1mg/ml香葉基二磷酸酯(GPP)(6μl)和透化細胞(Yμl)，其中X＋Y＝85μl。分析中還包括對照反應，其中不含IPP和GPP。於37℃保溫分析混合物15分鐘。加入0.1ml 2×甘氨酸緩衝液(0.2M甘氨酸，2mM MgCl2，2mM ZnCl2，pH10.4)和63個單位的鹼性磷酸酶(SigmaChemical公司，St.Louis，MO)，於37℃保溫混合物60分鐘。然後用0.2ml1∶1己烷∶乙酸乙酯抽提混合物，並通過GC/MS分析法尼醇。FPP合酶活性被表示為所形成FPP的hmol數/min/mg蛋白質。
表15所示的數據表明這些搖瓶培養物中FPP合酶的過量表達不會增加法尼醇的產量，但卻出人意料地增加了GG產量。SWE23-ΔE91/pJMB19-31或SWE23-ΔE91/pJMB19-32產生的GG水平甚至高於過量表達釀酒酵母BTS1(GGPP合酶)基因的菌株(EMS923/pTWM110-11)所產生的GG水平。
表15.過量表達FPP合酶和GGPP合酶的erg9突變體中的GG生產
在1升發酵罐中進一步評價FPP合酶活性的增加對GG生產的影響。使用實施例1.H.所述方法，在1升發酵罐中培養菌株SWE23-ΔE91/YEp352(對照)，EMS9-23/pSW4A3(crtE，GGPP合酶)和SWE23-ΔE91/pJMB19-32(ERG20，FPP合酶)，比較生長，法尼醇生產，GG生產和GGPP合酶活性(圖8和表16)。這3個菌株的生長類似，但SWE23-ΔE91/pJMB19-32在以類似於其它菌株的速率生長之前有些滯後。菌株SWE23-ΔE91/YEp352在258小時內產生2.31g/l法尼醇，但未產生任何可測的GG。EMS9-23/pSW4A3在258小時內產生2.52g/l法尼醇和0.57g/l GG。菌株SWE23-ΔE91/pJMB19-32在258小時內產生1.95g/l法尼醇，也在相同時間內產生0.59g/l GG。SWE23-ΔE91/pJMB19-32中出人意料的GG產量與該菌株中增加的GGPP合酶活性相關(見下文)。
在對照菌株SWE23-ΔE91/YEp352中未檢測到GGPP合酶活性。表達噬夏孢歐文氏菌crtE(GGPP合酶)基因的菌株EMS9-23/pSW4A3顯示出相對較高的GGPP合酶活性(在從258-小時時間點起的細胞中為1.7nmol/min/mg)。如所預期的，過量表達釀酒酵母FPP合酶的菌株SWE23-ΔE91/pJMB19-32含有的FPP合酶活性在發酵過程中的所有時間點都比僅具有正常FPP合酶水平的對照菌株高10倍以上(數據未顯示)。然而，奇怪的是，菌株SWE23-ΔE91/pJMB19-32也具有升高的GGPP合酶活性(表16)。毫無疑問，該活性是該菌株之所以能出人意料地產生GG的原因所在。
菌株SWE23-ΔE91/pJMB19-32中檢測到的升高的GGPP合酶活性是過量表達能誘導GGPP合酶活性的FPP合酶(BTS1基因產物)的結果。然而，該菌株顯示出FPP合酶也可能有一些低水平的GGPP合酶活性，這是FPP合酶高水平過量表達的結果。
表16.FPP合酶增加對1-L發酵罐中生長菌株的生長，及其法尼醇和GG生產的影響
實施例7本實施例評價幾種法尼醇提取工藝。
在第一個實驗中，將MBNA1-13(法尼醇生產菌株)和ATCC28383(麥角固醇生產菌株)的全肉湯(細胞加培養基)提取以及細胞沉澱物和培養基在各種條件下分開提取(見實施例1)進行對比。基本如實施例1所述提取10ml培養物樣品，但如下表17中所標明的進行一些改變。表17中的方法1與實施例1中所述提取方法相同。已經發現，對於法尼醇提取，在方法1，2，3，5和7中全肉湯提取與細胞和培養基分開提取一樣有效。通過方法5提取的法尼醇最多，該方法在提取全肉湯之前，將2ml 0.2％連苯三酚的甲醇溶液加入己烷中。第二高的提取是方法1。
表17
隨後，進行實驗以測定各類提取溶劑的效果(方法1，全肉湯)，提取所用的時間(方法1，己烷提取，全肉湯)，和提取前所加甲醇的量(方法1，己烷提取，全肉湯)。結果在下面表17-19中給出。
表17
*溶劑峰與法尼醇一起洗脫，使法尼醇不能用此法定量測定。
表18
表19
作進一步的工作使法尼醇的提取工藝最優化並簡化，且與從發酵肉湯提取GG的工藝相適應。該工作產生下述最終提取方案。
1.以未稀釋或用水適當地稀釋至2.0ml的最終體積，在15ml帶特氟龍帽的玻璃試管中使用整個發酵肉湯。
2.加入2.0ml己烷。
3.加入2.0ml甲醇。
4.將試管以高速渦旋3.5分鐘。
5.將樣品在臺式離心機中以2800rpm離心25-30分鐘以分離相。
6.分出上清液(有機相)並放入2.0ml帶特氟龍帽的玻璃GC/MS管用於通過GC/MS測定法尼醇和GG。
實施例8此實施例舉例說明香葉基香葉醇-2，3-環氧化物的生產，其中環氧化在甲苯中用叔丁基氫過氧化物在釩存在下進行。
將5.0克香葉基香葉醇(0.0172摩爾)在25ml甲苯中的溶液用50mg三(乙醯丙酮酸)釩(0.8摩爾％)處理，並在氮氣中回流攪拌。滴加5.76ml 3.3M叔丁基氫過氧化物的甲苯溶液(0.019摩爾)。加完後，停止加熱，使混合物冷卻至室溫。薄層層析分析顯示起始物質已經完全轉化為單一產品。反應混合物用約50ML約5％的亞硫酸鈉水溶液處理，攪拌10分鐘並傾析。有機相用水，5％碳酸氫鈉，食鹽水洗滌，硫酸鎂乾燥。減壓除去溶劑，給出5.28g(98％)淺黃色油狀產品。NMR分析支持香葉基香葉醇-2，3-環氧化物的結構。
實施例9此實施例舉例說明通過氫化香葉基香葉醇-2，3-環氧化物而生產環氧植醇將實施例6的所有產物溶於50ml乙醇，並用0.2g 5％Pd/C催化劑處理，在1atm H2中氫化72小時(在40psi H2處理約4小時，40℃更方便)。將該混合物過濾(硅藻土)並除去溶劑，給出5.03克(95％)無色油狀產物，層析和NMR譜與通過植醇環氧化製備的環氧植醇真實樣品一致。
實施例10此實施例舉例說明從環氧植醇製備植醇/異植醇混合物將5.0克從實施例7所得的環氧植醇(0.016摩爾)和4.72克三苯膦(0.018摩爾)在50ML甲苯中的溶液用80mg甲基三氧化錸處理並回流攪拌2小時。薄層層析分析顯示，沒有起始物質存在，而存在異植醇，植醇，和痕量的前面工藝中的烯烴。使混合物冷卻，濾過一個小矽膠墊除去催化劑，除去溶劑給出5.0克粗產物。矽膠層析給出0.4克植二烯(7.4％)和3.9克(83％)異植醇和植醇的3∶1混合物。
用更少催化劑(20-40mg)進行本實驗的後續工藝，並通過用碳酸鈉水溶液洗滌除去催化劑(黃色水解產物ReO4-立即進入水層。從此工藝所得的粗產物基本上不含植二烯(nmr，vpc)。通過蒸餾以大於90％的產率給出植醇/異植醇混合物。
實施施11本實施例舉例說明γ-生育酚的生產。
將18.9克(0.0446摩爾)4-苯並二氫吡喃酮生育三烯酚10在200ml乙醇中的溶液用2克(乙醇-溼重)Raney鎳催化劑處理，並在500psi氫氣和150℃中攪拌氫化7小時。使反應冷卻，放空，濾出催化劑，真空除去濾液中的溶劑，給出18.9克淺黃色粘稠油狀產物。通過質子NMR，質譜，和IR譜分析確定其為γ-生育酚；定量氣相層析分析表明其組成為97.07wt％γ-生育酚，其餘為乙醇。產率為理論值的98.9％。
實施例12本實施例是闡明實施例9製備γ-生育酚的工藝不適於製備α-生育酚的對比實施例。
將6.2克4-苯並二氫吡喃酮14的200ml乙醇溶液用2克(溼重)Raney鎳催化劑處理，並在150℃，500psi氫氣中攪拌氫化7小時。如實施例9所述處理，給出6.1克黃色漿狀物，該物通過質子NMR分析顯示具有飽和酮的結構(沒有觀察到烯烴質子；在3位，羰基的α-位的質子，四重峰，J＝12hz，2.66ppm)；IR分析顯示存在羰基(1663c間1)，而質譜顯示m/e444(11的計算值，444)。氣相層析分析在粗產物中未檢測到任何α-生育酚的存在。
實施例13下列實施例闡明了HMG CoA還原酶的增加對過量表達GGPP合酶之菌株的GG生產的影響。
在此實驗中，構建含有單拷貝質粒的菌株，所述質粒整合至該菌株的基因組中，使細胞過量表達GGPP合酶。已知整合質粒為pSW35-42，該質粒是按下述方法構建的。用BamHI消化質粒pSW4A(見實施例5)，產生含有ADH1啟動子，crtE編碼序列和ADH1終止子融合物的2199bp片段。然後將該片段連接至經BamHI消化的YIp351(Hill等，1986，具有多個唯一限制性位點的酵母/大腸桿菌穿梭載體，酵母2163-167)產生pSW35-42。
為了構建含有pSW35-42的菌株，用限制性內切核酸酶BstEII消化該質粒以在LEU2基因內導入單個切割位點。純化線性化的質粒，使用LiOAc法用該質粒轉化菌株SWE23-ΔL1。在缺乏亮氨酸的培養基上選擇pSW35-42已整合至LEU2基因座的轉化子。所得的一個轉化菌株被稱為SWE23-ΔL1∷pSW35-42。然後用YEp352(空載體對照，Hill等，1986，酵母2163-167)或pRH124-31(含有HMG2基因的催化結構域，見實施例4)轉化該菌株，分別產生菌株SWE23-ΔL1∷pSW35-42/YEp352和SWE23-ΔL1∷pSW35-42/pRH124。菌株SWE23-ΔL1∷pSW35-42/YEp352過量表達GGPP合酶，而SWE23-ΔL1∷pSW35-42/pRH124過量表達GGPP合酶和HMG CoA還原酶。
進行菌株SWE23-ΔL1∷pSW35-42/pRH124和SWE23-ΔL1∷pSW35-42/YEp352的發酵實驗以比較這兩個菌株的GG生產情況。使用實施例1.H.中所述方法，在1升發酵罐中檢測菌株的GG生產。發酵數據示於表20。該實驗表明SWE23-ΔL1∷pSW35-42/pRH124的發酵比SWE23-ΔL1∷pSW35-42/YEp352的發酵積累更多的GG，該實驗還闡明相對於HMG CoA還原酶未增加的類似菌株而言，經設計用於生產GG的菌株中HMG CoA還原酶活性的提高導致GG水平進一步的提高。
表20
在相同菌株中過量表達HMG CoA還原酶和GGPP合酶的第二種方法是將兩個基因都克隆至高拷貝數的酵母載體中，將此質粒轉化至erg9突變菌株。用於此目的的質粒被稱為pSW46-1，其構建方法如下。用EcoRI和SacI消化質粒pSW4A(見實施例5)，純化含有crtE基因的0.9kb片段並連接至經EcoRI和SacI消化的pADH313-956，產生pSW38-10。通過用限制性酶消化缺失該質粒的兩個區域，使用Pfu聚合酶補平DNA末端，連接以重新形成環形質粒。按此方法缺失的區域位於NdeI和SpeI位點之間，和HindIII和PstI位點之間。所得質粒被稱為pSW43-5。用BamHI消化質粒pSW43-5，純化所得的含有ADH1啟動子，crrE基因和ADH1終止子的2199bp片段(稱為ADHp/crtE/ADHt片段)，連接至YEp352的BamHI位點。所得質粒被稱為pSW44-17，它與pSW4A的不同之處是它含有一個而不是兩個PstI位點。
用XbaI和PstI消化質粒pRH124-31，將含有GPD啟動子，HMG2催化結構域基因和PGK終止子的3.2kb片段(稱為GPDp/HMG2cat/PGKt片段)克隆至經XbaI，PstI消化的pSW44-17，產生pSW46-1。該質粒在酵母中複製高拷貝數，並含有HMG2和crtE基因，籍此提供HMG CoA還原酶和GGPP合酶的過量表達。將質粒pSW46-1轉化至erg9突變菌株SWE-ΔE91，分離URA轉化子。在搖瓶實驗中檢測幾個所得轉化子，並與僅過量表達GGPP合酶的菌株(EMS9-23/pSW4A)相比較。實驗結果示於表21，顯示出當與僅過量表達GGPP合酶的菌株相比時，過量表達HMGCoA還原酶和GGPP合酶的菌株中積累了較高水平的GG。
表21
這些數據支持下列觀點，即在能產生提高水平的GG的菌株中過量表達HMG CoA還原酶導致所產生的GG量進一步提高。
實施例14
下列實施例描述了過量表達HMG CoA還原酶的更穩定菌株的產生。
如實施例4所述構建菌株，該菌株中因存在高拷貝數的複製質粒而能過量表達HMG CoA還原酶，其中所述質粒含有HMGlcat或HMG2cat基因。由於複製質粒在細胞分裂過程中頻繁丟失，複製質粒的有絲分裂不穩定性最終導致絕大部分培養物細胞中僅含正常水平的HMG CoA還原酶。為了得到更穩定的，過量表達HMG CoA還原酶的菌株，將編碼HMG2p催化結構域的多拷貝基因整合至菌株SW23B的基因組中。首先構建能使多拷貝HMG2基因整合至rRNA基因間隔區的質粒即可實現此目的。根據Lopes等，1989所述rRNA整合法(Lopes，T.S.，Klootwijk，J.，Veenstra，A.E.，van der Aar，P.C.，van Heerikhuizen，H.，Raue，H.A.，和Planta，R.J.1989，高拷貝數整合至釀酒酵母的核糖體RNA用於高水平表達的新載體，基因79199-206)建立此方法的模型。
使用PCR擴增rRNA基因座的兩個區域，它們位於編碼35S rRNA之基因和編碼5S rRNA之基因之間的基因間隔區，本文稱之為rRNA間隔區。用於擴增兩個rRNA間隔區片段中的第一個的寡核苷酸含有對應於GeneBank登記號為#Z73326之序列的鹼基#11161至#11130的序列和反向互補於#10311至#10330的序列。寡核苷酸序列如下。小寫字母用於表示已改變或被添加以產生限制性內切核酸酶識別位點的鹼基，寡核苷酸序列之後的括號中標明了所述位點。
SEQ ID NO24R6XbaI Lo 5』-tctagaGGCACCTGTCACTTTGGAAAAAAAATATACGC-3』(XbaI)SEQ ID NO25R7SacII Up 5』-ccgcggGCCGGAAATGCTCTCTGTTC-3』(SacII)使用這兩個寡核苷酸經PCR擴增產生的DNA片段在本文被稱為R6/R7片段。先將PCR產生的R6/R7片段克隆至質粒pCR-Script以產生pSW48-1，然後通過用XbaI和SacII消化從此質粒中切除該片段，再將所得的759bp片段克隆至經XbaI，SacII消化的pBluescript SK-(Stratagene)，產生pSW49-1。
用於擴增第二個rRNA間隔區片段的寡核苷酸含有對應於GeneBank登記號為#Z73326之序列的鹼基#11247至#11272的序列和反向互補於#12054至#12072的序列。這些寡核苷酸的序列如下。
SEQ ID NO26R5Sal UpB 5』-CACgtCgACCATTCAAACTTTACTAC-3』(SalI)SEQ ID NO27R4ApaI LoB 5』-GAGGGCccGGTCCAGACAT-3』(ApaI)使用上述兩個寡核苷酸經PCR擴增產生的DNA片段在本文被稱為R4/R5片段。用ApaI和SalI消化PCR產生的R4/R5片段，連接至經ApaI和SalI消化的pSW49-1，產生pSW52-11。
使用PCR擴增TRP1基因以使基因攜有不完整的啟動子。不完整的啟動子會使TRP1基因的表達降低，籍此提供選擇最終表達盒高拷貝數整合的方法。用於擴增TRP1基因的寡核苷酸含有對應於GeneBank登記號為#J01374之序列的鹼基#53至#73的序列和反向互補#804至#823的序列。所述寡核苷酸序列如下。
SEQ ID NO28TRP1 SmaUp 5』-cccgggTATTGAGCACGTGAGTATACG-3』(SmaI)SEQ ID NO29TRP1 BamLo 5』-ggatccGGCAAGTGCACAAACAATAC-3』(BamHI)接著，用BamHI和SmaI消化pSW50-1，純化所得的779bp TRP7片段。用PstI和SmaI消化質粒pRH124-31，產生3261bp含有GPD啟動子，HMG2cat基因和PGK終止子的片段(被稱為GPDp/HMG2cat/PGKt片段)，純化此片段。以三片段連接法將TRP1片段和GPDp/HMG2cat/PGKt片段連接至經PstI，BamHI消化的pSW52-11，產生pSW58-77和pSW58-45。
通過用限制性內切核酸酶KpnI和SacI消化，從pSW58-77上切下含有R6/R7-TRP1-GPDp/HMG2cat/PGKt-R4/R5基因融合物的DNA片段。純化對應於整合構建體的5671bp片段，並用於轉化菌株SW23B。在SCE-trp培養基上選擇轉化子。篩選按此方法分離的菌株以評價HMG CoA還原酶活性，並通過Southem印跡分析評價HMG2基因拷貝數。鑑定出攜有1拷貝整合構建體，2拷貝整合構建體，3拷貝整合構建體和8拷貝整合構建體的菌株，分別稱之為SW23B#19，SW23B#31，SW23B#40和SW23B#74。表22給出了通過體外酶分析測定的HMG CoA還原酶比活，和通過Southern印跡測定的HMG cat基因的拷貝數。HMG CoA還原酶分析如前人所述(Quain，D.E和Haslam，J.M.1979，分解代謝產物的脫阻抑對釀酒酵母中的steryl酯的積累和β-羥基甲基戊二酸單醯-CoA還原酶活性的影響，普通微生物學雜誌，111343-351)。
表22
由於這些菌株具有leu2和ura3突變，它們的生長需要外源添加亮氨酸和尿嘧啶。為了避免在發酵實驗的過程中添加這些營養物質，用含有功能性URA3，LEU2和TRP1拷貝的質粒pTWM138轉化這些菌株。這些菌株中存在此質粒可使菌株生長無需添加亮氨酸和尿嘧啶。
進行發酵實驗以比較這些菌株的法尼醇生產。此實驗中也包括菌株SWE23-ΔE91/pRH124-31，它在高拷貝數質粒上含有GPDp/HMG2cat/PGKt融合基因(見實施例4.B.)。使用實施例1.H.所述方法，在1升發酵罐中檢測菌株的法尼醇生產，此實驗的數據示於表23。
表23
這些數據支持下列觀點，即相對於具有正常水平的HMG CoA還原酶的菌株而言，具有升高水平的HMGCoA還原酶的菌株能生產更多的法尼醇。數據也表明含有8個HMG2cat基因整合拷貝的菌株產生的法尼醇實質上與攜有HMG2cat基因的20個以上染色體外拷貝的菌株(SW23B/pRH124-31)相同。含有單個HMG2cat基因整合拷貝的菌株產生的法尼醇多於對照菌株，但比具有更多HMG2cat基因拷貝的菌株稍低。另外，含有提高的HMG CoA還原酶水平的菌株在培養物中積累了甲羥戊酸，而具有正常水平的HMGCoA還原酶的菌株不能積累甲羥戊酸。這表明一旦HMG CoA還原酶的酶活性提高，HMG CoA還原酶下遊的步驟限制了途徑中的碳流動(見實施例15)。貫穿該途徑的碳流動受限於HMG CoA還原酶下遊，導致培養基中甲羥戊酸的積累的一個酶活性。
實施例15本實施例顯示了具有erg9突變和升高水平的HMG CoA還原酶的菌株中多個類異戊二烯途徑基因的過量表達的影響。
如實施例4和14所述，HMG CoA還原酶水平的提高導致類異戊二烯/固醇途徑碳流量的增加。在含有增加的HMG CoA還原酶的菌株中過量表達其它類異戊二烯途徑基因可進一步增加該途徑中的碳流量。在具有提高水平的HMG CoA還原酶以及缺損的erg9基因的菌株中，類異戊二烯途徑基因的擴增可導致法尼醇水平進一步提高。另外，在具有缺損的erg9基因和提高水平的HMG CoA還原酶和GGPP合酶的菌株中，類異戊二烯途徑基因的擴增可導致GG水平進一步提高。
為了驗證這些觀點，構建質粒以使其過量表達多個類異戊二烯途徑基因。一個質粒提供了分別由ERG12，ERG8和ERG19基因編碼的甲羥戊酸激酶，磷酸甲羥戊酸激酶和二磷酸甲羥戊酸脫羧酶的過量表達。該質粒被稱為pSW77-69，是由得自大量含有單個類異戊二烯途徑基因的質粒的DNA片段構建的。以下首先描述那些質粒的構建。
使用PCR擴增ERG12基因以進行克隆。用於擴增ERG12基因的寡核苷酸含有對應於GeneBank登記號為#Z49809之序列的鹼基#2827至#2846的序列和#5247至#5229的反向互補序列。這兩個寡核苷酸的序列如下。小寫字母用於表示已改變或被添加以產生限制性內切核酸酶識別位點的鹼基，寡核苷酸序列之後的括號中標明了所述位點。
SEQ ID NO30E12.4SN 5』-CCAAATATAACtCGAGCTTTG-3』(XhoI)SEQ ID NO31E12.SALI3 5』-GCAAAGTcCaCCACCGCAG-3』(SalI)
使用兩個寡核苷酸E12.4SN和E12.SALI3和菌株ATCC28383的基因組DNA擴增ERG12基因。將所得DNA克隆至pCR-Script的SfrI位點，產生pSW68。
用於擴增ERG19基因的寡核苷酸含有對應於GeneBank登記號為#Z71656之序列的鹼基#911至#937的序列和GeneBank登記號為#Z71658之序列的鹼基#1930至#1962的反向互補序列。這兩個寡核苷酸的序列如下。
SEQ ID NO32E19 SMAI 5』-GCCACGTGCCCcCGGGTTTCTCTAGCC-3』(SmaI)SEQ ID NO33E19 SACI3 5』-GGAAAAGagCtCGATAATTATTGATGATAGATC-3』(SacI)使用兩個寡核苷酸E19 SMAI和E19 SACI3和菌株ATCC28383的基因組DNA擴增ERG19基因。將所得DNA克隆至pCR-Script的SfrI位點，產生pSW69。
用於擴增ERG8基因的寡核苷酸含有對應於GeneBank登記號為#Z49939之序列的鹼基#2729至#2749的序列和反向互補#5177至#5196的序列。這兩個寡核苷酸的序列如下。
SEQ ID NO34E8.2135N 5』-CCGTTTTGGATccTAGATCAG-3』(BamHI)SEQ ID NO35E8SMAI3 5』-gttcccGGGTTATTGTCCTGCATTTG-3』(SmaI)使用兩個寡核苷酸E8.2135N和E8SMAI3和菌株ATCC28383的基因組DNA擴增ERG8基因。將所得DNA克隆至pCR-Script的SfrI位點，產生pSW71。
用BamHI和SmaI消化質粒pSW71，純化所得的含有ERG8基因的2459bp片段。用SmaI和SacI消化質粒pSW69-3，純化含有ERG19基因的2239bp片段。用BamHI和SacI消化高拷貝數酵母載體YEp352(含有URA3選擇標記)並純化之。將3個純化的DNA片段連接在一起，產生pSW76-11。
接著，用SalI和XhoI消化pSW68，純化所得的含有ERG12基因的2400bp帶，並連接至經SalI消化的pSW76-11，產生pSW77-69。該質粒含有ERG12，ERG8和ERG19，提供了甲羥戊酸激酶，磷酸甲羥戊酸激酶和二磷酸甲羥戊酸脫羧酶的過量表達。
另一個質粒提供了甲羥戊酸激酶，磷酸甲羥戊酸激酶，二磷酸甲羥戊酸脫羧酶和IPP異構酶的過量表達，它們分別由ERG12，ERG8，ERG19和IDI1基因編碼。該質粒被稱為pSW78-68，其構建方法如下。通過PCR擴增IDI1基因以用於克隆。用於擴增IDI1基因的寡核苷酸含有對應於GeneBank登記號為#U43503之序列的鹼基#19577至#19604的序列和反向互補#17477至#17502的序列。這兩個寡核苷酸的序列如下。
SEQ ID NO36ISO SACI5 5』-AAGAGctcATCTGATAATAGATCAAGCG-3』(SacI)SEQ ID NO37ISO SACI3 5』-AGGAGCTCAACGACAATAAATGGCTG-3』(SacI)使用兩個寡核苷酸ISO SACI5和ISO SACI3和菌株ATCC28383的基因組DNA擴增IDI1基因。將所得DNA克隆至pCR-Script的SfrI位點，產生pSW73。用SacI消化質粒pSW73，將所得的含有IDI1基因的2117bp片段與經SacI消化的pSW77-69連接，產生pSW78-68。該質粒含有ERG12，ERG8，ERG19和IDI1，提供了甲羥戊酸激酶，磷酸甲羥戊酸激酶，二磷酸甲羥戊酸脫羧酶和IPP異構酶的過量表達。
另一個質粒提供了分別由ERG10和ERG13基因編碼的乙醯乙醯CoA硫解酶和HMG CoA合酶的過量表達。該質粒被稱為pSW79-29，其構建方法如下。
使用PCR擴增ERG13和ERG10基因以用於克隆。用於擴增ERG13基因的寡核苷酸含有對應於GeneBank登記號為#Z50178之序列的鹼基#21104至#21127的反向互補序列和鹼基#18270至#18292的序列。這兩個寡核苷酸的序列如下。
SEQ ID NO38E13 XBAI5 5』-GTCCTctAGATCTTGAATGAAATC-3』(XbaI)SEQ ID NO39E13 SACI3 5』-CTTTGAGCtcGTACAAGAAGCAG-3』(SacI)使用兩個寡核苷酸E13 XBAI5和E13 SACI3和菌株ATCC28383的基因組DNA擴增ERG13基因。將所得DNA克隆至pCR-Script的SfrI位點，產生pSW72。
用於擴增ERG10基因的寡核苷酸含有對應於GeneBank登記號為#U36624之序列的鹼基#4073至#4093的序列和反向互補#6542至#6565的序列。這兩個寡核苷酸的序列如下。
SEQ ID NO40E10 HIND5 5』-CTAAGCttTGCGCCCGTGAAG-3』(HindIII)SEQ ID NO41E10 XBAI3-2 5』-GTTCTAGAAGTTTTCAAAGCAGAG-3』(XbaI)使用兩個寡核苷酸E10 HIND5和E10 XBAI3-2和菌株ATCC28383的基因組DNA擴增ERG10基因。將所得DNA克隆至pCR-Script的Sfr位點，產生pSW70。
用XbaI和HindIII消化質粒pSW70，純化所得的含有ERG10基因的2482bp片段。用XbaI和SacI消化質粒pSW72-4，純化含有ERG13基因的2850bp片段。然後將兩個純化的DNA片段與經SacI和HindIII消化的YEp351(含有LEU2選擇標記)連接在一起，產生pSW79-30。該質粒含有ERG13和ERG10基因，可以過量表達乙醯乙醯CoA硫解酶和HMG CoA合酶。
用pSW77-69和pSW78-68轉化菌株SW23B#74(含有8個HMG2 cat基因整合拷貝，見實施例14)，在SCE-ura培養基上選擇轉化子。所得菌株分別被稱為SW23B#74/pSW77-69和SW23B#74/pSW78-68。因為存在leu2突變，這些菌株的生長需要添加亮氨酸。為了避免在發酵實驗的過程中往這些菌株中添加亮氨酸，用含有功能性LEU2基因的線性DNA片段轉化這些菌株，分離LEU＋轉化子。這些菌株分別被稱為SW23B#74L/pSW77-69和SW23B#74L/pSW78-68。
用pSW79-30轉化菌株SW23B#74，在SCE-leu培養基上選擇轉化子。因為SW23B#74/pSW79-30存在ura3基因突變，其生長需要添加尿嘧啶。為了避免在發酵實驗的過程中往這些菌株中添加尿嘧啶，用含有功能性URA3基因的線性DNA片段轉化此菌株，分離URA＋轉化子。此菌株被稱為SW23B#74U/pSW79-30。
用pSW78-68和pSW79-30轉化SW23B#74，分離在SCE-ura，-leu培養基上都能生長的轉化子，這表明轉化子含有這兩種質粒。所得菌株被稱為SW23B#74/pSW78-68/pSW79-30。
用上述菌株進行發酵實驗以檢查這些基因的擴增對法尼醇生產的影響。使用實施例1.H.所述方法，在1升發酵罐中檢測菌株，這些實驗的數據示於表24。
表24
這些數據表明過量表達HMGCoA還原酶的菌株在培養基中積累了類異戊二烯途徑中間體甲羥戊酸。由於在具有正常水平HMG CoA還原酶的菌株中未觀察到甲羥戊酸積累，這說明HMG CoA還原酶的增加使類異戊二烯途徑的碳流動增加到一定限度，此時HMG CoA還原酶之後的另一個步驟限制了該途徑中間體的轉變。另外，類異戊二烯途徑前3個酶，即乙醯乙醯CoA硫解酶，HMG CoA合酶和HMG CoA還原酶(分別由ERG13，ERG10和HMG2cat編碼)的過量表達甚至導致培養基中積累更多的甲羥戊酸。這表明前3個步驟酶的增加進一步增加了進入類異戊二烯途徑的碳流量，更重要的是，HMG CoA還原酶下遊的一個酶限制了類異戊二烯途徑中間體的轉變。由於甲羥戊酸用作法尼醇和GG的前體，可使用上述修飾增加進入類異戊二烯途徑的碳流量，如果甲羥戊酸能被更有效地代謝，即可導致增加的法尼醇和GG積累。
關於最後一點，可在過量表達HMG CoA還原酶的菌株中倍增HMGCoA還原酶下遊的酶。增加的酶是HMG CoA還原酶，甲羥戊酸激酶，磷酸甲羥戊酸激酶，二磷酸甲羥戊酸脫羧酶和IPP異構酶(分別由HMG2cat，ERG12，ERG8，ERG19和IDI1編碼)。與僅過量表達HMG CoA還原酶的菌株相比，這些菌株積累了較少的甲羥戊酸，這說明因HMG CoA還原酶過量表達引起的類異戊二烯途徑的碳流量增加是由提高水平的下遊酶提供的。儘管在上述實驗中未觀察到提高的法尼醇水平，這可能是用於轉變的甲羥戊酸水平低的緣故。然而，這些數據表明在具有增加水平的前3個途徑酶的菌株中，HMG CoA還原酶下遊的一個或多個酶的增加可導致法尼醇和GG的積累增加，因為這些菌株中流向甲羥戊酸的碳流量大大增加。在過量表達乙醯乙醯CoA硫解酶，HMG CoA合酶和HMG CoA還原酶的菌株中過量表達HMGCoA還原酶下遊的一個或多個基因可能會導致法尼醇和GG積累的顯著增加。
實施例16本實施例描述了一個實驗，其中具有完整的和功能性的固醇途徑，包括功能性的ERG9基因的菌株中，角鯊烯合酶被zaragozic acid阻斷，並且觀察到該角鯊烯合酶抑制劑對法尼醇和GG積累的影響。
Zaragozic acid是用作角鯊烯合酶有效抑制劑的化合物家族(Bergstrom，J.D.，Dufresne，C.，Bills，G.F.，Nallin-Omstead，M和Byme，K，1995，角鯊烯合酶有效抑制劑Zaragozic acid的發現，生物合成和作用機制，微生物學年鑑，49607-639)。它們能抑制哺乳動物中的膽固醇生物合成和真菌中的麥角固醇生物合成。由於麥角固醇是真菌細胞生長所必需的，故Zaragozic acid是有效的殺真菌化合物。
在此實驗中使用菌株SWE23-E9(ura3，sue；見實施例1.G)，因為它含有sue突變，可在需氧條件下攝取固醇。這使得當角鯊烯合酶被Zaragozic acid阻斷時，酵母能在添加麥角固醇的培養基中生長。不具有sue突變的菌株將不能從培養基中攝取固醇，包括麥角固醇，因此不能在存在Zaragozic acid時生長。
通過首先在SCE-ura培養基中培養菌株48小時以選擇質粒，從而在搖瓶中檢測SWE23-E9，其中SWE23-E9含有空載體(Yep352)或能過量表達HMG CoA還原酶(pRH124-31)，GGPP合酶(pSW4A)或HMG CoA還原酶和GGPP合酶的質粒(pSW46-1)。然後用這些培養物樣品接種YPDE培養基或含有100μg/ml Zaragozic acid的YPDE培養基。於30℃將YPDE(+/-Zaragozicacid)培養物保溫48小時，然後分析細胞乾重和法尼醇積累。此實驗的數據示於表25。相對於未經處理的培養物而言，所有用Zaragozic acid處理的培養物表現出法尼醇的積累增加。此實驗未測定GG積累。
表25
在另一實驗中，通過首先在SCE-ura培養基中培養菌株48小時以選擇質粒，從而在搖瓶中檢測SWE23-E9，其中SWE23-E9含有空載體(Yep352)或能過量表達HMG CoA還原酶和GGPP合酶的質粒(pSW46-1)。然後用這些培養物樣品接種YPDE培養基或含有100mg/ml Zaragozic acid的YPDE培養基。於30℃將YPDE(+/-Zaragozic acid)培養物保溫72小時，然後分析細胞乾重和GG。數據示於表26。相對於在缺乏Zaragozic acid時生長的相同菌株而言，用Zaragozic acid處理的SWE23-E9/pSW46-1培養物表現出較高水平的GG。這些實驗表明通過使用角鯊烯合酶抑制劑阻斷固醇生物合成途徑，該途徑中不具有突變的菌株可被誘導積累法尼醇。經Zaragozic acid處理的培養物所積累的法尼醇或GG的量比完全缺損erg9基因的菌株所積累的量少得多，這表明角鯊烯合酶的基因阻斷比角鯊烯合酶抑制劑所誘導的阻斷更有效。
表26
實施例17已描述了多種細菌和植物中導致生成FPP的另一個途徑，稱之為非-甲羥戊酸或Rohmer途徑(Eisenreich，W.，Schwarz，M.，Cartayrade，A.，Arigoni，D.，Zenk，M.H和Bacher，A.，1998，植物和微生物中類萜生物合成的脫氧木酮糖磷酸酯途徑，Chem.Biol，5R221-233，Paseshnichenko，V.A.，1998，真細菌和植物中類異戊二烯生物合成的新的另一種非-甲羥戊酸途徑，生物化學(Mosc) 63139-148)。已鑑定和研究了大腸桿菌中的一些非-甲羥戊酸途徑酶及其基因，所述酶包括脫氧木酮糖-5-磷酸合酶，脫氧木酮糖-5-磷酸還原酶，IPP異構酶和FPP合酶，它們分別由dxr，dxs，idi和ispA基因編碼。
為了構建能積累提高水平的法尼醇的大腸桿菌菌株，構建質粒以在大腸桿菌中過量表達上述基因。在某些情況下，克隆的DNA中包括與已知類異戊二烯途徑基因鄰接的其它基因。
使用下列兩個寡核苷酸和分離自大腸桿菌菌株W3110的基因組DNAPCR擴增編碼IPP異構酶的idi基因。用於擴增idi基因的寡核苷酸含有對應於GeneBank登記號為#U28375之序列的鹼基#42309至#42335的序列和反向互補#43699至#43726的序列。小寫字母用於表示已改變以產生限制性內切核酸酶識別位點的鹼基，寡核苷酸序列之後的括號中標明了所述位點。VE145-5中使用了天然EcoRI位點。
SEQ ID NO42VE145-5 5』-GGGATTCGAATTCTGTCGCGCTGTAAC-3』(EcoRI)SEQ ID NO43VE146-3 5』-TGggATCcGTAACGGCTTTAGCGAGCTG-3』(BamHI)用EcoRI和BamHI消化idi PCR產物，連接至經EcoRI，BamHI消化的pUC19。所得克隆被稱為pHS-O182。
使用下列兩個寡核苷酸和分離自大腸桿菌菌株W3110的基因組DNAPCR擴增dxr基因。用於擴增包括.frr，dxr和yaeS基因的DNA區域的寡核苷酸含有對應於GeneBank登記號為#D83536之序列的鹼基#2131至#2150的序列和反向互補#5297至#5315的序列。
SEQ ID NO44DXR17.SN 5』-GATTCCGCGTAAGgATCcCG-3』(BamHI)SEQ ID NO45DXR3179.ASN 5』-CCAGCATctAGACCACCAG-3』(XbaI)用BamHI和XbaI消化所得PCR產物，連接至經BamHI和XbaI消化的pHS-O182，產生pHS-O182R。
ispA和dxs基因似乎是操縱子的一部分，所述操縱子可能還包括兩個其它基因xseB和yajO。使用下列寡核苷酸和分離自大腸桿菌菌株W3110的基因組DNA PCR擴增包括xseB，ispA，dxs和yajO的DNA區域。寡核苷酸含有對應於GeneBank登記號為#AE000148之序列的鹼基#4157至#4183的序列和反向互補#8938至#48956的序列。
SEQ ID NO46DXS.5619P 5』-gactgcagCTGGCCGCTGGGTATTCTGTCGTAGTT-3』(PstI)SEQ ID NO47DXS.820X 5』-gatctagaTCACGCGTACGCAGAAGGTTTTGC-3』(XbaI)用XbaI和PstI消化所得PCR產物，連接至經XbaI和PstI消化的pUC19，產生pHS-dxs。
使用XbaI和PstI從pHS-dxs上切下含有dxs基因的DNA片段，連接至用XbaI和PstI消化的pHS-O182R，產生含有dxs，dxr，ispA和idi的質粒。用所得質粒轉化大腸桿菌，在搖瓶和發酵實驗中檢測含有質粒的轉化菌株的法尼醇生產。
為了構建積累提高水平的GG的大腸桿菌菌株，構建質粒以在大腸桿菌中過量表達草生歐文氏菌的GGPP合酶。使用分離自草生歐文氏菌菌株Eho10的基因組DNA和下列兩個寡核苷酸，經PCR擴增編碼GGPP合酶的crrE基因。寡核苷酸含有對應於GeneBank登記號為#M87280之序列的鹼基#3513至#3531的序列和反向互補#4459至#4481的序列。
SEQ ID NO48Eho10E Up 5』-gaattcCAATTCAGCGGGTAACCTT-3』(EcoRI)
SEQ ID NO49Eho10E Lo 5』-aagcttTGCTTGAACCCAAAAGGGCGGTA-3』(HindIII)用EcoRI和HindIII消化所得PCR產物，連接至pET24d(+)(Novagen)以使crtE基因的表達受控於T7啟動子。所得質粒被稱為pKL19-63。用該質粒轉化大腸桿菌菌株，如BL21(DE3)(可得自Novagen)，該菌株含有編碼T7聚合酶的IPTG誘導型基因。可以用IPTG誘導該菌株中的crtE基因。使用BglII和HindIII從pKL19-63上切下T7啟動子/crtE基因融合物，連接至經BamHI，HindIII消化的pACYC184(登記號為#X06403)以構建依靠氯黴素抗性進行選擇的質粒。該質粒含有p15A複製起點，能與含有ColE1複製起點的質粒(例如攜有上述大腸桿菌類異戊二烯途徑基因的克隆)相容。後一種質粒賦予氨苄青黴素抗性，因此通過用兩種質粒轉化大腸桿菌並選擇氯黴素和氨苄青黴素抗性可得到大腸桿菌轉化子，其攜有crtE質粒和含有dxs，dxr，idi和ispA基因的質粒。因此，可得到大腸桿菌BL21(DE3)菌株，其含有過量表達脫氧木酮糖-5-磷酸合酶，脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構酶，IPP異構酶，FPP合酶和GGPP合酶的質粒。在搖瓶和發酵實驗中檢測這些菌株的GG生產。
實施例18下列實施例描述了釀酒酵母菌株的構建，該菌株經改造後能通過表達對應於非-甲羥戊酸途徑酶的酶來產生提高水平的法尼醇和GG。
IPP的生物合成出現在很多細菌和植物中，從丙酮酸和甘油醛-3-末端開始，經過一系列酶促步驟(已知為非-甲羥戊酸途徑)，並包括下列酶脫氧木酮糖-5-磷酸合酶和脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構酶。由這兩個酶促步驟產生的化合物是2-C-甲基-D-赤蘚醇4-磷酸酯(也稱為MEP)，它被未知酶進一步代謝，產生IPP。構建在酵母中表達大腸桿菌dxs和dxr基因的質粒，構建方法包括將所述基因的編碼區與允許在酵母中進行表達的啟動子元件融合。用寡核苷酸經PCR擴增dxs和dxr基因，所述寡核苷酸中包括允許克隆至酵母表達載體的限制性位點，所述載體含有啟動子，如ADH1啟動子，PGK啟動子或GPD啟動子。然後通過將一個基因融合物亞克隆至另一質粒而將兩個基因融合物連接至單個質粒中。再將所得的含有這兩個基因的質粒轉化至酵母的erg9突變體。所得菌株能合成MEP，通過能進行生成IPP的所需反應的內源性酶能將MEP進一步代謝為IPP。這種能力導致IPP的積累增加，從而使細胞通過內源性IPP異構酶和FPP合酶的作用，積累提高水平的法尼醇。如果這一切發生在也過量表達GGPP合酶的菌株中，這些菌株中也會積累提高水平的GG。
實施例19本實施例描述了釀酒酵母菌株的構建，該菌株過量表達突變的ERG20基因，該基因編碼的FPP合酶表現出有所改變的產物特異性。與過量表達野生型FPP合酶的菌株不同的是，表達突變的FPP合酶的菌株積累的GG比法尼醇多。比較多種生物體的FPP合酶胺基酸序列，結果顯示出幾個高度保守的結構域，包括兩個富含天冬氨酸的結構域，它們是催化活性所必需的。據研究人員報導，影響位於第一個富含天冬氨酸結構域前第5位的胺基酸的突變可改變酶的產物特異性，從而使酶易於催化GGPP以及FPP的形成。這一點已在禽類和嗜熱脂肪芽孢桿菌FPP合酶中有所顯示(Tarshis，L.C.，Proteau，P.J.，Kellogg，B.A.，Sacchettini，J.C.，Poulter，C.D.1996，通過異戊二烯二磷酸酯合酶調節產物鏈長度，美國國家科學院院報9315018-15023；Ohnuma，S.，Narita，K.，Nakazawa，T.，Ishida，C.，Takeuchi，Y.，Ohto，C和Nichino，T，1996，位於法尼基二磷酸酯合酶第一個富含天冬氨酸基元前第5位的胺基酸殘基對確定終產物的作用，生物化學雜誌，27130748-30754；美國專利5,766,911)。對芽孢桿菌酶而言，第一個富含天冬氨酸結構域前第5位的胺基酸由酪氨酸改變為絲氨酸。禽類酶的此位置含有苯丙氨酸。據認為該位置的芳香族胺基酸阻止異戊二烯鏈延伸至15個碳以上，用體積較小的胺基酸，如絲氨酸取代苯丙氨酸即可緩解這種限制。
至於上述芽孢桿菌FPP合酶，釀酒酵母FPP合酶第一個富含天冬氨酸基元前第5位為酪氨酸。使用定點誘變改變ERG20基因的序列以在此位置編碼絲氨酸而不是酪氨酸。用於導入突變的方法依靠使用能導入所需突變的誘變寡核苷酸PCR擴增整個pJMB19-31質粒，所述方法描述於QuikChange定點誘變試劑盒(Stratagene)的使用說明書。寡核苷酸含有對應於GeneBank登記號為#J05091之序列的鹼基#1063至#1097的序列和反向互補#1063至#1097的序列。寡核苷酸序列如下文所示，所作改變由小寫字母表示。第#1084位的A變為T以使編碼的胺基酸由酪氨酸轉變為絲氨酸。第#1074位的T變為C以產生新的PstI位點，從而快速鑑定突變基因。後一突變是沉默突變，不會改變所編碼的胺基酸。
SEQ ID NO50Y95S-SN 5』-GCATTGAGTTGcTGCAGGCTTcCTTCTTGGTCGCC-3』SEQ ID NO51Y95S-ASN 5』-GGCGACCAAGAAGgAAGCCTGCAgCAACTCAATGC-3』使用這兩個寡核苷酸擴增pJMB19-31，將所得PCR產物自身連接以重新形成環形質粒，不同的是此時的ERG20基因含有所需的突變。所得質粒被稱為pHS31.Y95S，將該質粒轉化至erg9突變菌株SWE23-ΔE91，形成SWE23-ΔE91/pHS31.Y95S。進行搖瓶實驗以比較過量表達野生型ERG20基因和突變ERG20基因之菌株的法尼醇和GG生產情況。在SCE-ura中將菌株培養過夜，然後接種含有YPDE培養基的燒瓶。於30℃將這些培養物培養72小時，然後收集細胞，分析細胞乾重和類異戊二烯。此實驗的結果示於表27。
表27
這些數據表明通過在erg9突變菌株中過量表達ERG20基因的tyr→ser突變體即可顯著改變法尼醇GG的比例。相對於過量表達野生型ERG20基因的菌株而言，過量表達突變ERG20基因的菌株產生比例更高的GG。另外，相對於過量表達野生型ERG20基因的菌株而言，過量表達突變ERG20基因的菌株產生的GG總量較高，而法尼醇總量較低。GG收集物中未完全反映出法尼醇水平的降低，這表明一些FPP可被轉變為除GG外的其它化合物。或者，反饋抑制在調節這些菌株中積累的GG量方面起作用。
本發明上述描述的目的是為了舉例說明和描述。另外，上述描述不願將本發明限制為本文公開的形式。因此，參照上述教導和相關領域的經驗或知識對本發明所作的改動和修飾也屬於本發明的範圍。上文所述實施方案想進一步解釋已知能實施本發明的最佳模式，以使本領域的其它技術人員能在這個或其它實施方案中利用本發明，並進行本發明特殊應用或使用所需的多種修飾。所附權利要求書欲包括現有技術所能允許的所有其它實施方案。
序列表110Millis，James R.
Saucy，Gabriel G.
Maurina-Brunker，JulieMcMullin.Thomas W.
Hyatt，John A.120維生素的生產方法1303161-17-PCT140PCT/US99/152621411999-07-0615060/091,8681511998-07-0616051170PatentIn Ver.2.0210121123212DNA213人工序列220221misc_特徵222(1)..(23)223引物220223人工序列的描述引物4001ctcagtacgc tggtacccgt cac210221127212DNA213人工序列220221misc_特徵222(1)..(27)223引物220223人工序列的描述引物4002gatggatccc aatatgtgta gctcagg210321122212DNA213人工序列220221misc_特徵222(1)..(22)223引物220223人工序列的描述引物4003gcgcatccac gggctatata aa22210421126212DNA213人工序列220221misc_特徵222(1)..(26)223引物220223人工序列的描述引物4004gcggatccta ttatgtaagt acttag26210521122212DNA213人工序列220221misc_特徵222(1)..(22)223引物220223人工序列的描述引物4005gagcatccac gggctatata aa22210621126212DNA213人工序列220221misc_特徵222(1)..(26)223引物220223人工序列的描述引物4006tccccccggg cgcagacttc acgctc 26210721131212DNA213人工序列220221misc_特徵222(1)..(31)223引物220223人工序列的描述引物4007gatccgcggc tcaagctagc ggtattatgc c31210821129212DNA213人工序列220221misc_特徵222(1)..(29)223引物220223人工序列的描述引物4008gactctagag tttacgagtc tggaaaatc 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1.生產α-生育酚或α-生育酯的方法，包括(a)用生物學方法生產香葉基香葉醇；和(b)通過包括如下的方法將所述香葉基香葉醇以化學方法轉化為α-生育酚或α-生育酯(i)選擇性地氧化香葉基香葉醇中的2，3-碳-碳雙鍵而產生香葉基香葉醇-2，3-環氧化物；(ii)使所述環氧化物中其餘三個碳-碳雙鍵氫化，產生環氧植醇；(iii)通過與氧受體反應使所述環氧植醇脫氧，產生植醇和異植醇的混合物；和(iv)使所述植醇和異植醇混合物與三甲基氫醌反應，產生α-生育酚。
2.如權利要求1的方法，其中所述選擇性氧化步驟在惰性溶劑中，用釩或鉬存在下的叔丁基氫過氧化物作為氧化劑進行。
3.如權利要求2的方法，其中所述惰性溶劑選自芳香烴，脂肪烴，脂環烴和脂族酯或其混合物。
4.如權利要求1的方法，其中所述氫化步驟在惰性溶劑中，在選自Raney鎳，鈀/碳和鉑/碳的催化劑存在下進行。
5.如權利要求4的方法，其中所述惰性溶劑選自脂族酯，烷醇，芳香烴，脂肪烴和醚，或其混合物，其中所述氫化步驟在約1大氣壓至約200大氣壓，在約0℃至約150℃的溫度下進行。
6.如權利要求4的方法，其中所述催化劑以基於香葉基香葉醇-2，3-環氧化物起始重量約0.001至約0.5重量百分數的水平存在。
7.如權利要求1的方法，其中所述脫氧步驟在取代的三氧化錸催化劑存在下進行。
8.如權利要求1的方法，其中所述脫氧步驟在惰性溶劑中，用選自三芳基膦，三-C1-C18烷基膦，三芳基亞磷酸酯，三-C1-C18烷亞磷酸酯，鹼金屬次磷酸鹽，次磷酸，C1-C6烷基硫化物和C1-C6烷基嗎啉的氧受體，並在取代的三氧化錸催化劑存在下進行。
9.如權利要求8的方法，其中所述惰性溶劑選自芳香烴，脂肪烴，脂環烴，脂族酯，醇和水，或其混合物；其中氧受體是三芳基膦；其中催化劑是C1-C10烷基三氧化錸。
10.如權利要求8的方法，其中三苯膦是氧受體，並以每摩爾環氧植醇原料約1.0至約3.0摩爾的水平存在，並且其中甲基三氧化錸是催化劑，並以基於環氧植醇原料約0.01至約5.0重量百分數的水平存在。
11.如權利要求1的方法，其中所述反應步驟在Lewis酸存在下進行。
12.如權利要求11的方法，其中所述Lewis酸催化劑是氯化鋅。
13.從香葉基香葉醇生產α-生育酚的方法，包括(a)選擇性地氧化香葉基香葉醇中的2，3-碳-碳雙鍵而產生香葉基香葉醇-2，3-環氧化物；(b)使所述環氧化物中的其餘三個碳-碳雙鍵氫化，產生環氧植醇；(c)通過與氧受體反應使所述環氧植醇脫氧，產生植醇和異植醇的混合物；和(d)使所述植醇和異植醇混合物與三甲基氫醌反應，產生α-生育酚。
14.如權利要求13的方法，其中所述選擇性氧化步驟在惰性溶劑中，用釩或鉬存在下的叔丁基氫過氧化物作為氧化劑進行。
15.如權利要求13的方法，其中所述惰性溶劑選自芳香烴，脂肪烴，脂環烴和脂族酯或其混合物。
16.如權利要求13的方法，其中所述氫化步驟在惰性溶劑中，在選自Raney鎳，鈀/碳和鉑/碳的催化劑存在下進行。
17.如權利要求16的方法，其中所述惰性溶劑選自脂族酯，烷醇，芳香烴，脂肪烴和醚，或其混合物，其中所述氫化步驟在約1大氣壓至約200大氣壓，在約0℃至約150℃的溫度下進行。
18.如權利要求16的方法，其中所述催化劑以基於香葉基香葉醇-2，3-環氧化物起始重量約0.001至約0.5重量百分數的水平存在。
19.如權利要求13的方法，其中所述脫氧步驟在取代的三氧化錸催化劑存在下進行。
20.如權利要求13的方法，其中所述脫氧步驟在惰性溶劑中，用選自三芳基膦，三-C1-C18烷基膦，三芳基亞磷酸酯，三-C1-C18烷亞磷酸酯，鹼金屬次磷酸鹽，次磷酸，C1-C6烷基硫化物和C1-C6烷基嗎啉的氧受體，並在取代的三氧化錸催化劑存在下進行。
21.如權利要求20的方法，其中所述惰性溶劑選自芳香烴，脂肪烴，脂環烴，脂族酯，醇和水，或其混合物；其中氧受體是三芳基膦；其中催化劑是C1-C10烷基三氧化錸。
22.如權利要求20的方法，其中三苯膦是氧受體，並以每摩爾環氧植醇原料約1.0至約3.0摩爾的水平存在，並且其中甲基三氧化錸是催化劑，並以基於環氧植醇原料約0.01至約5.0重量百分數的水平存在。
23.如權利要求13的方法，其中所述反應步驟在Lewis酸催化劑存在下進行。
24.如權利要求23的方法，其中所述Lewis酸催化劑是氯化鋅。
25.如權利要求1的方法，其中所述生物學生產步驟包括(a)在發酵培養基中培養微生物，其中所述微生物的角鯊烯合酶的作用被降低，其中所述培養步驟產生選自香葉基香葉基磷酸酯和香葉基香葉醇的產物；和(b)回收所述產物。
26.權利要求25的方法，其中所述發酵培養基含有角鯊烯合成酶抑制劑。
27.權利要求25的方法，其中所述微生物經基因工程改造降低了角鯊烯合酶的作用。
28.權利要求27的方法，其中所述微生物進一步經基因工程改造增加了HMG-CoA還原酶的作用。
29.權利要求28的方法，其中通過在微生物中過量表達HMG-CoA還原酶或其催化結構域而增加HMG-CoA還原酶的作用。
30.權利要求29的方法，其中所述微生物進一步經基因工程改造增加了選自下列的蛋白質的作用乙醯乙醯CoA硫解酶，HMG-CoA合酶，甲羥戊酸激酶，磷酸甲羥戊酸激酶，磷酸甲羥戊酸脫羧酶，異戊烯焦磷酸異構酶，法尼基焦磷酸酯合酶，D-1-脫氧木酮糖5-磷酸合酶和1-脫氧-D-木酮糖5-磷酸還原異構酶。
31.權利要求30的方法，其中所述微生物經基因工程改造增加了法尼基焦磷酸酯合酶的作用。
32.權利要求31的方法，其中所述微生物經基因工程改造過量表達了法尼基焦磷酸酯合酶。
33.權利要求30的方法，其中所述微生物經基因工程改造增加了香葉基香葉基焦磷酸酯合酶的作用。
34.權利要求33的方法，其中所述微生物經基因工程改造過量表達了香葉基香葉基焦磷酸酯合酶。
35.權利要求25的方法，其中所述微生物是erg9突變體。
36.權利要求35的方法，其中所述微生物含有erg9Δ∷HIS3缺失/插入等位基因。
37.權利要求25的方法，其中所述回收步驟包括從所述微生物中回收所述產物。
38.權利要求25的方法，其中所述產物被所述微生物分泌至所述發酵培養基中，其中所述回收步驟包括從所述發酵培養基中純化所述產物。
39.權利要求25的方法，其中所述產物是胞內的香葉基香葉基磷酸酯和香葉基香葉醇，所述回收步驟包括從所述微生物中分離所述香葉基香葉基磷酸酯和香葉基香葉醇。
40.權利要求25的方法，其中所述產物是胞內的香葉基香葉基磷酸酯，所述回收步驟進一步包括使所述香葉基香葉基磷酸酯去磷酸化以產生香葉基香葉醇。
41.權利要求25的方法，其中所述微生物選自真菌，細菌和微藻類。
42.權利要求25的方法，其中所述微生物是酵母。
43.權利要求42的方法，其中所述酵母的麥角固醇途徑被阻斷，該酵母經基因工程改造能在需氧條件下攝取外源固醇。
44.權利要求25的方法，其中所述微生物經基因工程改造增加了磷酸酶作用。
45.生產植醇和異植醇混合物的方法，包括使環氧植醇與氧受體在取代的三氧化錸催化劑存在下反應。
46.如權利要求45的方法，其中所述反應步驟在惰性溶劑中，用選自三芳基膦，三-C1-C18烷基膦，三芳基亞磷酸酯，三-C1-C18烷亞磷酸酯，鹼金屬次磷酸鹽，次磷酸，C1-C6烷基硫化物和C1-C6烷基嗎啉的氧受體，並在取代的三氧化錸催化劑存在下進行。
47.如權利要求46的方法，其中所述惰性溶劑選自芳香烴，脂肪烴，脂環烴，脂族酯，醇和水，或其混合物；其中氧受體是三芳基膦；而其中所述催化劑是C1-C10烷基三氧化錸。
48.如權利要求47的方法，其中氧受體是三苯膦，而C1-C10烷基三氧化錸催化劑是甲基三氧化錸。
49.權利要求47的方法，其中氧受體以每摩爾環氧植醇原料約1.0至約3.0摩爾的水平存在，並且催化劑以基於環氧植醇原料約0.01至約5.0重量百分數的水平存在。
50.製備γ-生育酚的方法，該方法包括4-苯並二氫吡喃酮生育三烯酚的催化氫化。
51.如權利要求50的方法，其中所述氫化在選自Raney鎳，Raney鈷，銅鉻鐵礦，和貴金屬非均相或均相催化劑的一種催化劑存在下進行。
52.如權利要求50的方法，其中所述氫化在選自Raney鎳，銅鉻鐵礦和其混合物的一種催化劑存在下進行。
53.如權利要求50的方法，其中所述氫化在Raney鎳催化劑存在下進行。
54.如權利要求50的方法，其中所述氫化在選自甲醇，乙醇，異丙醇和乙酸乙酯的溶劑中進行。
55.如權利要求50的方法，其中所述氫化在乙醇溶劑中進行。
56.如權利要求55的方法，其中所述氫化在約100psi氫氣至約3000psi氫氣的壓力下進行。
57.如權利要求55的方法，其中所述氫化在約400psi氫氣至約750psi氫氣的壓力下進行。
58.如權利要求57的方法，其中所述氫化在約50℃至約250℃的溫度下進行。
59.如權利要求50的方法，其中所述氫化在約135℃至約175℃的溫度下進行。
全文摘要
本發明提供了生產α－生育酚和α－生育酯的方法。所述方法包括使用生物系統生產法尼醇或香葉基香葉醇,然後將法尼醇或香葉基香葉醇化學轉變為α－生育酚或α－生育酯。
文檔編號C07D303/16GK1339020SQ99810552
公開日2002年3月6日 申請日期1999年7月6日 優先權日1998年7月6日
發明者詹姆斯·R·米利斯, 加布裡埃爾·G·索西, 朱莉·莫利納－布倫克爾, 託馬斯·W·麥克馬林, 約翰·A·海厄特 申請人:以生物技術資源的名義經營的Dcv公司, 伊斯特曼化學公司