一種瘤菌根真菌及其在促進環草石斛生長中的應用的製作方法

2023-06-18 02:52:01 1

專利名稱：一種瘤菌根真菌及其在促進環草石斛生長中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種瘤菌根真菌及其在促進環草石斛生長中的應用。
背景技術：
蘭科植物與其菌根真菌存在著密切關係，在自然狀態下蘭科植物種子萌發成原球莖(根狀莖)到第一片真葉長出階段都需要菌根真菌，甚至有些有葉幼苗的生長發育完全依賴或部分依賴菌根真菌，菌根真菌可為蘭科植物提供N源、C源和礦物質。研究表明同種真菌可與多種蘭科植物共生，研究報導蘭科菌根真菌分泌B族維生素和赤黴素，對植物生長有影響。環草石斛(Dendrobium loddigesii Rolfe)為蘭科石斛屬多年生草本植物，為貴州地道藥材，是我國傳統名貴中藥。環草石斛生長緩慢，自然繁殖係數低，但需求量卻日益增多，雖然環草石斛組培已經成功，但組培苗移栽成活率低且生長緩慢，這阻礙著環草石斛的產業化發展。目前未見用外源蘭科植物菌根真菌對環草石斛生長方面的研究。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有環草石斛生長緩慢，繁殖係數低、成活率低的缺陷，提供一種瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株及其在促進環草石斛生長中的應用。為了解決上述技術問題，本發明利用蘭科植物與其內生真菌專一性低的特點，用春蘭(JJymbidium georingii Rchb. f.)菌根真菌與環草石斛接種共生，篩選出促進環草石斛組培苗生長的菌株，以期提高環草石斛組培苗移栽成活率和提高產量，為生產促進環草石斛生長的微生物肥料打下基礎。本發明瘤菌根真菌Epulorhiza repens CGO!35菌株。將貴州春蘭( georingii Rchb. f.)的根洗淨，參照單菌絲團分離法(專利號ZL200610051196. 2)，接種在PDA培養基上，純化，保存於4°C備用，培養後與環草石斛共生，經系列生長指標評價試驗篩選獲得。該CG035菌株已保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC，地址湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學生科院保藏中心；郵編430072)，其保藏編號是CCTCC NO. M 2010370， 保藏日期為2010年12月觀日，分類命名為瘤菌根真菌，拉丁文學名為劭WorAi擬 repens。上述瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株的生物學形態特徵描述為在標準BDPDA培養基上生長，早期菌絲貼培養基生長，菌絲乳白色，蠟質，菌落邊緣整齊，厚度均勻，菌落邊緣侵入培養基生長，後期產生稀疏白色蛛網狀氣生菌絲，菌絲生長速度0. 088mm/ h,菌絲直徑2. 27 5. 37 μ m,細胞長13. 05 98. 65 μ m,念珠狀細胞球形，常形成長鏈，大小6. 17 18. 25X7. 47 16. 35 μ m，菌絲有隔，細胞核為雙核，菌絲隔為桶孔隔膜，桶孔覆墊無穿孔，弧形。
前述瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1。前述瘤菌根真菌Epulorhiza repens CGO!35 菌株 CCTCC NO. M2010370 在促進環草石斛生長中的應用。本發明還提供了一種瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO. M2010370與環草石斛共生培養的方法將在PDA培養基上活化的瘤菌根真菌 Epulorhiza repens CG035菌株用孔徑為5. Omm的打孔器打取菌片，接種在共生培養基上， 培養15天，在無菌條件下將3 4葉組培苗接入共生培養基中，自然條件下的溫度和光照培養。上述方法中所述的共生培養基是由蛭石、鋸木屑和苔鮮組成，其體積比為1:1:1。前述共生培養基在121°C滅菌1小時，1天後同樣方法再滅菌一次。上述技術方案中的瘤菌根真菌Epulorhiza repens CG035菌株CCTCC NO. M2010370的微生物學特徵如下
1、形態特徵在標準BDPDA培養基上生長，早期菌絲貼培養基生長，菌絲乳白色，蠟質， 菌落邊緣整齊，厚度均勻，菌落邊緣侵入培養基生長，後期產生稀疏白色蛛網狀氣生菌絲， 菌絲生長速度0. 088mm/h,菌絲直徑2. 27 5. 37 μ m,細胞長13. 05 98. 65 μ m,念珠狀細胞球形，常形成長鏈，大小6. 17 18. 25 X 7. 47 16. 35 μ m，菌絲有隔，細胞核為雙核，菌絲隔為桶孔隔膜，桶孔覆墊無穿孔，弧形。2、生理生化特徵纖維素酶活陽性，多酚氧化酶活陰性。3、菌絲體所含物質菌絲體含有B族維生素和赤黴素。具有上述特徵的菌株，參照(Currah R. S. et al.，1997)等資料，綜合生理生化特徵，ITS序列結果，鑑定為瘤菌根真菌(^OThrAiza repens),命名為CG035。與現有技術相比，本發明是一種新的瘤菌根真菌，鑑定為CG035菌株，保藏編號為 CCTCC N0.M2010370，發明人對其促進環草石斛生長的作用進行了驗證
1、瘤菌根真菌^oWorAiza repens CG035菌株的分離
將貴州春蘭的根洗淨，參照單菌絲團分離法(專利號ZL200610051196. 2)，接種在PDA 培養基上，純化，得瘤菌根真菌處WorAiza repens CG035菌株，保存於4°C備用。2、將在PDA培養基上活化的CG035菌株用孔徑為5. Omm的打孔器打取菌片， 接種在共生培養基質(蛭石鋸木屑苔鮮的體積比為1 :1 :1，在121°C滅菌1小時，1天後同樣方法再滅菌一次)上，培養15天，在無菌條件下將3 4葉的組培苗接入共生培養基中，每瓶接種3顆苗，簇擁，重複5瓶，每瓶苗根數、莖長、莖粗細大致一致。自然條件下的溫度和光照，培養80天。3、環草石斛組培苗的生長和重量測定
接種前，在無菌情況下洗去祖培苗上的瓊脂，再用濾紙吸乾表面水分，用電子天平準確稱量環草石斛組培苗的重量，並記錄根的數量和長度，莖高和莖寬。培養80天後，將苗從組培瓶(罐頭瓶)中取出，小心洗去培養基及附著於根上的菌絲，用濾紙吸乾表面水分，稱重， 與接種真菌前的苗重、苗高、根數、根長、莖粗相減即得苗重、苗高、根數、根長、莖粗增加；利用SPSS軟體進行單因素方差分析。結果如表1所示。表1共培養80天瘤菌根真菌處WorAiza repens CG035菌株對環草石斛生長效應
權利要求
1.瘤菌根真菌^OThrAizarepens CG035菌株，其保藏編號為CCTCC NO. M2010370。
2.按照權利要求1所述瘤菌根真菌Epulorhizarepens CG035菌株CCTCC N0.M2010370，其特徵在於生物學形態特徵描述為在標準BDPDA培養基上生長，早期菌絲貼培養基生長，菌絲乳白色，蠟質，菌落邊緣整齊，厚度均勻，菌落邊緣侵入培養基生長， 後期產生稀疏白色蛛網狀氣生菌絲，菌絲生長速度0. 088mm/h，菌絲直徑2. 27 5. 37 μ m, 細胞長13. 05 98. 65 μ m,念珠狀細胞球形，常形成長鏈，大小6. 17 18. 25X7. 47 16. 35 μ m,菌絲有隔，細胞核為雙核，菌絲隔為桶孔隔膜，桶孔覆墊無穿孔，弧形。
3.按照權利要求1所述瘤菌根真菌Epulorhizarepens CG035菌株CCTCC NO. M2010370，其核苷酸序列如 SEQ ID NO :1。
4.瘤菌根真菌Epulorhizarepens CGO；35菌株CCTCC NO. M2010370在促進環草石斛生長中的應用。
5.瘤菌根真菌Epulorhizarepens CGOIB5菌株CCTCC NO. M2010370與環草石斛共生培養的方法，其特徵在於將在PDA培養基上活化的瘤菌根真菌處WorAiza repens CG035 菌株用孔徑為5. Omm的打孔器打取菌片，接種在共生培養基上，培養15天，在無菌條件下將 3 4葉組培苗接入共生培養基中，自然條件下的溫度和光照培養。
6.按照權利要求5所述瘤菌根真菌Epulorhizarepens CG035菌株CCTCC NO. M2010370與環草石斛共生培養的方法，其特徵在於所述共生培養基是由蛭石、鋸木屑和苔鮮組成，其體積比為1:1:1。
7.按照權利要求6所述瘤菌根真菌Epulorhizarepens CG035菌株CCTCC NO. M2010370與環草石斛共生培養的方法，其特徵在於所述的共生培養基在121°C滅菌1 小時，1天後同樣方法再滅菌一次。
全文摘要
本發明公開了一種瘤菌根真菌EpulorhizarepensCG035菌株及其在促進環草石斛生長中的應用，CG035菌株的保藏編號為CCTCC NO.M2010370，可用於與環草石斛共生培養以促進環草石斛的生長。
文檔編號C12N1/14GK102154122SQ20111002307
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月21日 優先權日2011年1月21日
發明者劉作易, 朱國勝, 桂陽 申請人:貴州省果樹科學研究所