拮抗多種病原真菌的小麥根際固氮菌及其用途的製作方法

2023-06-17 20:08:56 1

專利名稱：拮抗多種病原真菌的小麥根際固氮菌及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及拮抗多種病原真菌的小麥根際固氮菌及其用途，特別涉及一種可以拮抗作物赤黴病菌、菌核病菌和黃萎病菌，並具有在小麥根際進行高效固氮功能的細菌。
背景技術：
氮肥是農業生產中最重要的生產資料之一。生產化學氮肥消耗大量能源，佔生產總成本的70% 80%。近年來能源日趨緊張，我國化肥生產用煤價格飈升導致化學氮肥價格上漲，農民難以承受，反響強烈。此外，化學氮肥在提高作物產量、保障我國糧食安全方面發揮了巨大作用，但是不合理施氮已經形成了嚴重的面源汙染，造成一系列的嚴重危害，如太湖藍藻事件令人觸目驚心。城市地下水硝酸鹽汙染已經對飲用水安全造成了威脅。大氣中含有78%的氮素，但其存在形式是分子態氮氣，動植物不能直接利用，自然界只有某些原核微生物具有直接利用大氣中氮氣的能力，將其還原成氨，這就是生物固氮作用。選用高效固氮微生物菌種工廠化生產製成菌劑，或進一步與其它富含植物營養的物料複合加工成生物製品，應用於農業生產，可以提供作物氮素營養，改善作物根際生態環境，提高土壤生物肥力性狀，這就是通常所說的固氮微生物菌劑或固氮微生物肥料。生物氮肥具有多種優勢①生物氮肥由可再生的生化製劑和活體微生物組成，可以再生，不存在資源枯竭問題，是可持續發展農資產品。②生物氮肥是環境友好型肥料，其生產和使用過程均不產生三廢等汙染性物質，而且能改善土壤理化性質，提高土壤肥力，是生態農業農資產品。③生物氮肥生產耗能少、成本低，其成本僅為等效化學氮肥的20% 40%，可以為國家節省大量的煤炭和石油等能源戰略物資。④使用生物氮肥可以顯著降低農業生產成本，提高農產品品質，提升土壤肥力，使農民受益，促進社會和諧發展。作物赤黴病的病原菌為玉米赤黴菌(Gibberella zeae)無性世代為禾穀鐮刀菌 (Fusarium graminearum)，是糧食作物的重要致病菌。我國小麥赤黴病有95 %是麥類赤黴病菌引起的，是長江中下遊冬麥區和東北春麥區的重要病害，發病時經常造成20% 30%的產量損失。此外，該菌還侵染玉米、水稻、大麥等作物，引起苗枯、莖腐、基腐、穗腐等。菌核病的病原菌是核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)，其形態特徵表現為子囊盤小，呈小杯狀，淺肉色至褐色，單個或幾個從菌核上生出，直徑0. 5-lcm,柄褐色細長，彎曲， 長3-5cm，向下漸細，與菌核相連。菌絲體可以形成菌核，長柄的褐色子囊盤產生在菌核上。 菌核形狀多樣，長3-15 μ m。子囊圓柱形，120-140 μ mX 11 μ m，孢子通常8個，單行排列，橢圓形，8-14 μ mX 4-8 μ m，側絲細長，線形，無色，頂部較粗。該菌是一種危害作物和蔬菜的世界性的重要的植物病原菌，廣泛地侵染、危害十字花科、豆科、茄科、芸香科等植物，如造成油菜、大豆、向日葵、黃瓜、辣椒等經濟作物和蔬菜菌核病。棉花黃萎病菌(大麗輪枝菌 Verticillium dahliae)以土壤傳播為主，寄主範圍很廣，除侵染棉花引起黃萎病外，還侵染經濟作物菸草、油料作物大豆、花生、向日葵、芝麻、蔬菜作物馬鈴薯、茄子、辣椒、番茄、黃瓜、西瓜，以及林木、花卉等，危害嚴重，造成巨大經濟損失。目前對上述真菌病害的防治主要依靠化學農藥，然而化學防治不僅成本高、汙染環境，而且防效也不理想，同時食品的安全性也受到嚴重影響。菌種是微生物肥料生產應用的基礎。目前，限制我國微生物肥料行業發展的瓶頸就是高效菌種的選育問題。農業生產迫切需求固氮效能高、拮抗病原真菌、抗逆性強、貨架期長的微生物肥料生產用菌種。

發明內容
本發明的目的是提供一株可以在作物根際進行高效固氮，並且拮抗作物赤黴病菌(Gibberella zeae)、菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)禾口棉花黃萎病菌 (Verticillium dahliae)的細菌。本發明所提供的根際固氮菌，是類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)⑶641，該菌株已於2011年7月6日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC， 地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCC No. 5042。本發明的另一個目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為所述的類芽孢桿菌 (Paenibacillus sp.)GD641 CGMCC No. 5042。該菌劑除包含作為活性成分的類芽孢桿菌(Paenikicillus sp.)⑶641 CGMCC No. 5042外，還可包括輔料，如草炭、動物的糞便、各類作物的秸稈、松殼、稻草、花生皮等。該菌劑可用於抑制病原真菌、防治植物真菌病害、固氮、產生固氮酶等。所述類芽孢桿菌(Paenibacillussp. )GD641 CGMCC No. 5042 在製備下述 1)-4) 中任一菌劑中的應用也屬於本發明的保護範圍1)用於抑制病原真菌的菌劑；2)用於防治植物真菌病害的菌劑；3)用於固氮的菌劑；4)產生固氮酶的菌劑。所述病原真菌可為通過土壤、施入土壤中的肥料、和/或種子傳播的真菌，具體可為引起赤黴病的真菌、或為引起菌核病的真菌、或為引起黃萎病的真菌；所述植物真菌病害可為赤黴病、菌核病或黃萎病。所述引起赤黴病的真菌可為玉米赤黴菌(Gibberella zeae)或禾穀鐮刀菌(Fusarium grammearum)；所述弓I起菌核病的真菌可為核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)；所述引起黃萎病的真菌可為棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)。所述的類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. )GD641 CGMCC No. 5042或以該類芽孢桿菌(PaenikiciIlus sp.)⑶641 CGMCC No. 5042為活性成分的菌劑在生產固氮酶中的應用以及在製備生物有機肥中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明的再一個目的是提供一種含有所述類芽孢桿菌(Paenikicillus sp.) GD641 CGMCC No. 5042或以所述類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. )GD641 CGMCC No. 5042為活性成分的菌劑的生物有機肥。本發明的又一目的是提供一種培養類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)⑶641 CGMCCNo. 5042的方法，該方法包括將類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.) GD641 CGMCC No. 5042在用於培養類芽孢桿菌的培養基中培養的步驟。本發明的又一目的是提供一種製備所述菌劑的方法，該方法包括如下步驟將所述的類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)⑶641 CGMCC No. 5042作為活性成分，得到所述菌劑。實驗證明，本發明是從土壤樣品中經過層層篩選，最終篩選出了類芽孢桿菌 (Paenibacillus sp.)⑶641 CGMCC No. 5042，該菌株具有很高的固氮酶活性，能夠拮抗作物赤黴病病原菌玉米赤黴菌(Gibberella zeae)、菌核病病原菌核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)和棉花黃萎病菌(大麗輪枝菌Verticillium dahliae)，競爭適應能力強， 接種效果好，在固氮微生物菌劑和生物有機肥生產中具有廣闊的應用前景。保藏說明菌種名稱類芽孢桿菌拉丁名(Paenibacillus sp.)菌株編號⑶641保藏機構中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構簡稱CGMCC地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號保藏日期2011年7月6日保藏中心登記入冊編號CGMCC No. 504

圖 1 為類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. )GD641 CGMCC No. 5042 的固氮酶活性。圖2為類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. )GD641 CGMCC No. 5042拮抗赤黴病菌玉米赤黴菌(Gibberella zeae)。左側菌落為類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. )GD641 CGMCC No. 5042，右側菌落為赤黴病菌玉米赤黴菌(Gibberella zeae)。圖 3 為類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. )GD641 CGMCC No. 5042 拮抗菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum)。左側菌落為類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)GD641 CGMCC No. (Sclerotinia sclerotiorum)。圖4為類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. )GD641 CGMCC No. 5042拮抗棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)。左側菌落為類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)GD641 CGMCC No. 5042，右側菌落為棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。固氮菌富集培養液ACCC55 成份蔗糖 10g、K2HPO4 · 3H20 0. 5g、NaCl 0. 2g、CaCO3 lg、MgSO4 · 7H20 0. 2g、蒸餾水 IOOOmUpH 7. 0 7. 2。改良的ACCC55固氮菌固體培養基成份蔗糖10g、K2HP04 · 3H20 0. 5g、NaCl 0. 2g、 CaCO3 lg、MgSO4 · 7H20 0. 2g、酵母膏 0. 5g、蒸餾水 1000ml、瓊脂 1. 5% 2· 0%, pH 7· 0 7. 2。無氮培養基蔗糖10g, NaCl 0. 12g，K2HPO4 · 3H20 0. 5g，CaCO3 lg, MgSO4 · 7H20 0. 2g，蒸餾水 lOOOmL，pH7. 2。
圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum) ACCCl 1103 (參見「孫建光等.高效固氮芽孢桿菌篩選及其生物學特性.中國農業科學，2009，42 (6) :2043-2051」)。赤黴病菌-玉蜀黍赤黴菌(Gibberella zeae)(中國農業微生物菌種保藏管理中心，ACCC31053)。菌核病菌-核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)(中國農業微生物菌種保藏管理中心，ACCC30046)。棉花黃萎病菌-大麗花輪枝孢(Verticillium dahliae)(中國農業微生物菌種保藏管理中心，ACCC30308)。實施例1、小麥根際固氮菌⑶641的分離與鑑定—、小麥根際固氮菌⑶641的富集與分離取IOg 土樣(採自中國內蒙古)放入90ml無菌水中搖床振蕩20min製成混濁液， 吸取5ml放入30ml固氮菌富集培養液ACCC55中，lOOrpm，28°C進行搖床振蕩培養，72h後換新鮮培養液繼續培養。重複培養3次後進行固氮芽孢菌分離。吸取Iml上述固氮菌富集培養物放到9ml無菌水中製成ICT1稀釋度，繼續稀釋製成10_2、10_3、10_4、10_5稀釋度的菌懸液，在100°C沸水中加熱lOmin，冷卻後每個稀釋度取0. Iml塗布在固氮菌分離培養基平板上，29°C靜置培養。2 3d待菌落形成後，在改良的ACCC55固氮菌培養基平板上用平板劃線法進行菌種純化。將分離純化所得的其中一個菌株命名為小麥根際固氮菌GD641。二、小麥根際固氮菌⑶641的鑑定從以下幾個方面鑑定步驟一分離並純化得到的小麥根際固氮菌1、形態學鑑定將處於對數生長期，且菌落大小穩定，上述步驟一分離並純化得到的固氮菌⑶641 進行單菌落狀態描述，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、溼潤度、菌落表面狀態(是否平坦、突起、褶皺、凹陷等)、菌落邊緣狀態(是否整齊、不規則、放射狀等)。對於處於對數生長期的所述固氮菌⑶641，經塗片染色後採用光學顯微鏡觀察菌體的形態。結果表明，上述步驟一分離並純化得到的固氮菌⑶641菌落圓形凸起，水滴狀，透明，有光澤，表面溼潤光滑，邊緣暈圈；菌體杆狀，0.5 1.0X0. 5 1.0 μ m，無芽孢。2、生理生化特徵分析參考《常見細菌系統鑑定手冊》(東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統鑑定手冊.北京科學出版社，2011.)和《微生物學實驗》(沈萍，範秀容，李廣武.微生物學實驗(第三版).北京高等教育出版社，1999.)測定上述固氮菌⑶641的生理生化特徵。所述固氮菌⑶641的生理生化特徵測定結果如下接觸酶反應陽性氧化酶反應陰性生長溫度4°C不生長，28°C生長，37°C生長，60°C不生長耐鹽性試驗:2% NaCl生長，5% NaCl不生長，7% NaCl不生長，10% NaCl不生長苯丙氨酸脫氨酶試驗陰性利用檸檬酸鹽陰性水解澱粉陽性
卵黃卵磷脂酶陽性甲基紅試驗陰性

V. P試驗陰性PH 5. 7生長陽性糖醇發酵產酸葡萄糖陽性，甘露醇陽性，乳糖陽性，蔗糖陽性3、16s rDNA序列同源性分析常規方法培養上述步驟一分離純化得到的固氮菌GD641，提取菌株的總DNA作為基因擴增模板，以細菌 16s rDNA 通用引物，27f 5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 『，1492r 5' -TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3『進行PCR反應。反應體系採用上海生物工程有限公司 PCR擴增試劑盒。反應程序為951變性308、551退火lmin、72°C延伸2min，共30個循環。 DNA測序由北京三博遠志生物技術公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAStar軟體完成，序列比對通過美國國家生物技術信息中心NCBI資料庫(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov)在線完成。固氮菌⑶641菌株16s rDNA的序列詳見序列表中序列1。4、生長特性分析進行了菌株最適溫度和最適pH生長實驗。採用無氮培養基，分別在4°C、28°C、 37°C、60°C培養、觀察、記錄菌株的溫度適應性，每個處理3次重複。調整酸度分別為pH3、 pH4、pH5、pH6、pH7、pH8、pH9、pHIO、pHll，每個處理3次重複，培養、觀察、記錄菌株生長的最適pHo結果表明，所述小麥根際固氮菌⑶641的最適生長溫度為28°C，最適生長pH為 pH7 8。鑑於上述形態、生理生化特徵分析和16s rDNA序列同源性分析結果，將步驟一分離並純化得到的小麥根際固氮菌GD641鑑定為變型細菌α亞群類芽孢桿菌科類芽孢桿菌屬(Paenibacillus sp.)。該小麥根際固氮菌⑶641已於2011年7月6日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCC No. 5042。實施例2、類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. )GD641 CGMCC No. 5042 固氮酶活性測
定對實施例1 所得到的類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)GD641 CGMCC No. 5042 it 行固氮酶活性測定，具體方法如下所述在15X 150mm螺口玻璃管中加入5ml改良固氮培養基製成斜面，接種固氮菌，28°C培養。以微生物肥料常用生產菌種圓褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)ACCCl 1103為陽性對照，不接種空白斜面為陰性對照，設3個重複。培養72h 後，換橡膠塞，注入乙炔氣體使終濃度為10%，用醫用膠布密封，繼續培養72h，取100 μ 1 反應氣體，用氣相色譜儀測定乙烯生成量，根據以下公式計算類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. )GD641 CGMCC No. 5042 的固氮酶活性。固氮酶活性(nmol/mg · h) =C2H4nmol/[菌體蛋白量(mg) X 反應時間(h)]，其中 C2H4nmol = IOOOXC2H4 體積(μ 1) X273XP/ [22.4X(273+t)X760]，其中P為氣壓(mm汞柱)，t為反應溫度(V)。其中，菌體蛋白含量測定方法如下所述用5ml生理鹽水將試管斜面上的菌苔洗入離心管中，收集菌體，向沉澱中加入3ml 0. 5M的NaOH沸水煮沸5min，加入3ml 0. 5M的HCl混合，離心後取上清1. Oml，加入5ml考馬斯亮藍溶液，在漩渦混合器上混合，顯色3min， 測定595nm處的吸光值A595，根據牛血清白蛋白標準曲線計算菌體蛋白含量。結 果顯示，篩選到的類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. )GD641 CGMCC No. 5042的固氮酶活性為27. 357nmol C2H4/h ^g蛋白，統計分析與微生物肥料常用生產菌種圓褐固氮菌 ACCCl 1103的固氮酶活性25. IOOnmol C2H4/h mg蛋白無差異，如圖1所示。這一結果表明， 本發明的類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. )GD641 CGMCC No. 5042能高效固氮。實施例3、類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)GD641 CGMCC No. 5042 拮抗病原真菌抑菌率測定 採用兩點對峙法對實施例1所得到的類芽孢桿菌(Paenibaci 1 Ius sp.) GD641 CGMCC No. 5042進行拮抗病原真菌抑菌率測定，具體操作如下所述在PDA平板上距離中心2cm的兩點上分別接種作物赤黴病菌(Gibberella zeae)(或者菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum),或者棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae))禾口類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. )GD641 CGMCC No. 5042，每個篩選處理3個重複，以只接病原真菌不接固氮菌的平板為對照。28°C恆溫培養，15d後用毫米刻度尺測量對峙平板上病原真菌沿被測類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. )GD641 CGMCC No. 5042方向的菌落半徑T1、及對照平板上病原真菌的菌落半徑4。病原真菌生長抑制率(％)=(對照半徑對峙培養病原真菌菌落半徑巧)/對照半徑rQ X 100 %。 結果顯示，赤黴病菌(Gibberella zeae)的r。是63. 3士2. Smnur1 是26· 6士0. 8mm ； 菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的 r0 是 63. 0士2. Imm,巧是 27. 3士 1. 5mm ；棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)的 r。是 41. 0士 1. 9mm，巧是 21. 7士 1. 1mm。將平均值代人上述公式計算得所述類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)⑶641 CGMCC No. 5042對赤黴病菌(Gibberella zeae)的抑菌率為57. 98%，如圖2所示；對菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)的抑菌率為56. 67 %，如圖3所示；對棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)的抑菌率為47. 07%，如圖4所示。這一結果表明所述類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)GD641 CGMCC No. 5042可以有效拮抗作物赤黴病菌(Gibberella zeae)、菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum)禾口棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)。
權利要求
1.類芽孢桿菌(Paenikicillussp.)⑶641，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的保藏編號為CGMCC No. 5042。
2.一種菌劑，它的活性成分為權利要求1所述的類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.) GD641 CGMCC No. 5042。
3.根據權利要求2所述的菌劑，其特徵在於所述菌劑為下述1)-4)中任一的菌劑1)用於抑制病原真菌的菌劑；2)用於防治植物真菌病害的菌劑；3)用於固氮的菌劑；4)產生固氮酶的菌劑。
4.根據權利要求1所述的類芽孢桿菌(Paenibacillussp. )GD641 CGMCC No. 5042在製備下述1)-4)中任一的菌劑中的應用1)用於抑制病原真菌的菌劑；2)用於防治植物真菌病害的菌劑；3)用於固氮的菌劑；4)產生固氮酶的菌劑。
5.根據權利要求3所述的菌劑或權利要求4所述的應用，其特徵在於所述病原真菌為引起赤黴病的真菌、或為引起菌核病的真菌、或為引起黃萎病的真菌；所述植物真菌病害為赤黴病、菌核病或黃萎病。
6.根據權利要求5所述的菌劑或應用，其特徵在於所述引起赤黴病的真菌為玉米赤黴菌(Gibberella zeae)或禾穀鐮刀菌(Fusarium graminearum)；所述引起菌核病的真菌為核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)；所述引起黃萎病的真菌為棉花黃萎病菌 (Verticillium dahliae)。
7.權利要求1所述的類芽孢桿菌(Paenibacillussp. )GD641 CGMCC No. 5042、或權利要求2、3、5或6所述菌劑在生產固氮酶中應用；或，權利要求1所述的類芽孢桿菌(Paenibacillus sp. )GD641 CGMCC No. 5042、或權利要求2、3、5或6所述菌劑在製備生物有機肥中應用。
8.含有權利要求1所述類芽孢桿菌(Paenibacillussp. )GD641 CGMCC No. 5042、或權利要求2、3、5或6所述菌劑的生物有機肥。
9.培養權利要求1所述類芽孢桿菌(Paenibacillussp. )GD641 CGMCC No. 5042的方法，包括將類芽孢桿菌(Paenikicillus sp.)⑶641 CGMCC No. 5042在用於培養類芽孢桿菌的培養基中培養的步驟。
10.權利要求2、3、5或6所述菌劑的製備方法，包括如下步驟將權利要求1所述的類芽孢桿菌(PaenikiciIlus sp.)⑶641 CGMCC No. 5042作為活性成分，得到所述菌劑。
全文摘要
本發明公開了拮抗多種病原真菌的小麥根際固氮菌及其用途。該小麥根際固氮菌是類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)GD641，其在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心的藏編號為CGMCC No.5042。本發明所提供的類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)GD641 CGMCC No.5042具有較高的固氮活性，可以有效拮抗作物赤黴病菌(Gibberella zeae)、菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和棉花黃萎病菌(Verticillium dahliae)，在固氮微生物菌劑和生物有機肥生產中具有廣闊的應用前景。
文檔編號C05F11/08GK102250809SQ20111019765
公開日2011年11月23日 申請日期2011年7月15日 優先權日2011年7月15日
發明者孫建光, 徐晶, 胡海燕, 高淼 申請人:中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所