酶檢測技術的製作方法

2023-06-17 19:24:31

專利名稱：酶檢測技術的製作方法
背景技術：
常常需要確定試驗樣品內特定的酶的存在或數量。在一些情況中，僅僅是酶的存在就可以，例如，指示組織或器官損傷的存在。同樣地，異常的酶濃度也可指示其它病症，如細菌或病毒的感染。舉例來說，認為蛋白酶(例如，天冬氨酸蛋白酶)和金屬肽酶會增加白色念珠菌的致病性，白色念珠菌是可以引起念珠菌性陰道炎(「酵母菌感染」)的微生物。試驗樣品中酶的存在或濃度還可以作為一些類型的癌症和其它病症的診斷標誌。舉例來說，前列腺-特異性的抗原(PSA)是一種公知的前列腺癌的標誌。其它診斷標誌的例子包括組織蛋白酶B(癌症)、組織蛋白酶G(肺氣腫、類風溼性關節炎、炎症)、纖溶酶原激活物(血栓形成、慢性炎症、癌症)和尿激酶(癌症)。
一種用於檢測酶的存在的常規方法描述於Braach-Maksvvtis等人的美國專利No.6,348,319。Braach-Maksvvtis等人通過檢測由酶消化的底物而發揮作用。例如，Braach-Maksvvtis等人的

圖1說明了包括第一區域11和第二區域12的裝置10。第一區域11具有聚合物珠粒13(載體)，它經由肽接頭15與鏈黴抗生物素蛋白14(報導分子)相連，該肽接頭15可被蛋白酶16裂解。當加入蛋白酶16時，鏈黴抗生物素蛋白14被釋放出來並傳到第二區域12，第二區域12包括生物傳感器膜17，它通過膜阻抗的變化來檢測鏈黴抗生物素蛋白的存在(第5欄，II.25-30)。可是，不幸地，由Braach-Maksvvtis等人描述的技術極其複雜並且對於一些類型的應用成本過高，例如需要通過患者(自診斷或藉助於醫務人員)的相對快速的診斷。
因而，目前需要存在一種簡單和便宜的技術來精確地檢測試驗樣品內酶的存在。
發明概述根據本發明的一個實施方案，公開了一種用於檢測試驗樣品內的酶或其抑制劑的診斷試劑盒。所述試劑盒包含許多種反應性複合物，每種反應性複合物包含與報導分子和特異性結合構件連接的底物。所述底物可被酶(例如，水解酶)裂解。在一個實施方案中，例如，所述報導分子包括用可檢測的物質標記的顆粒。該試劑盒還包含層析介質(例如，多孔膜)，它能被置於與試驗樣品連通中。層析介質限定第一檢測區域，在該第一檢測區域內能夠俘獲所述的特異性結合構件。能夠在第一檢測區域內產生第一檢測信號，例如通過固定在其中的報導分子來產生第一檢測信號。所述第一檢測信號的強度可以與試驗樣品內酶的數量成反比，並且也可以與試驗樣品內酶抑制劑的數量成正比。
在某些實施方案中，層析介質還可以包含第二檢測區域，在該第二檢測區域能夠俘獲報導分子。例如，在一個實施方案中，在對報導分子具有親和性的第二檢測區域內接收材料。能夠在第二檢測區域內第二檢測信號，例如通過固定在其中的報導分子來產生。第二檢測信號的強度可以與試驗樣品內酶的數量成正比，並且也可以與試驗樣品內酶抑制劑的數量成反比。
根據本發明的另一實施方案，公開了一種用於檢測試驗樣品內的酶或其抑制劑的方法。所述方法包括試驗樣品與許多種反應性複合物接觸以形成培養混合物，每種反應性複合物包含與報導分子和特異性結合構件連接的底物。所述底物可被酶裂解以釋放所述報導分子和特異性結合構件，所述報導分子能夠直接或間接地產生檢測信號。所述方法還包括向層析介質施加培養混合物，該層析介質限定第一檢測區域，在該第一檢測區域內能夠俘獲特異性結合構件。確定在第一檢測區域內檢測信號的存在或強度。以下更詳細地論述本發明的其它特徵和方面。
附圖簡述在本說明書的剩餘部分中引用以下附圖，對本領域的普通技術人員更具體地闡述本發明的全部和能夠公開的內容，包括其最佳方式圖1是一個可用於本發明的診斷試驗試劑盒的測定裝置的實施方案的透視圖；圖2是一個對於報導分子共價鍵合到底物上的實施方案的圖解說明；和圖3是一種可用於本發明的一個實施方案來檢測試驗樣品內酶的存在或數量的測定技術的簡圖。
在本說明書和附圖中引用符號的重複使用意在表示本發明的相同或相似的特徵或元件。
代表性實施方案的詳細說明定義如在此使用，術語「試驗樣品」泛指懷疑包含酶和/或酶抑制劑的材料。例如，所述試驗樣品可以得到或來源於生物來源，例如生理性液體，包括血液、組織液、唾液、眼睛晶狀體、腦脊液、汗、尿、乳汁、腹水液、粘液、滑液、腹膜液、陰道液、羊水，等等。除生理性液體之外，還可以使用其它液體樣品(例如，水、食品、等等)用於環境或食品生產的測定。此外，固體材料可用作試驗樣品。所述試驗樣品可以以從來源獲得的方式直接使用或在修飾樣品特性的預處理之後使用。例如，此類預處理可包括從血液製備的血漿、稀釋的粘性流體，等等。預處理的方法還可包括過濾、沉澱、稀釋、蒸餾、混合、濃縮、幹擾組分的失活、試劑的加入，等等。而且，還可以有益地修飾固體試驗樣品以形成液體介質、釋放酶和/或酶抑制劑，等等。
詳細說明現在將詳細地參照本發明的多種實施方案，在下文中闡述其中的一個或多個實施例。提供各個實施例作為本發明的說明，但不是對本發明的限制。事實上，顯然本領域技術人員可以對本發明作出不脫離本發明的範圍或精神的各種修飾和改變。舉例來說，說明或描述為一個實施方案的一部分的特徵可以用在另一實施方案中以產生更進一步的實施方案。因此，本發明意在包括這樣的改進和變更，並將它們歸入所附的權利要求和它們的同等物的範圍之內。
本發明通常涉及用於檢測酶或酶抑制劑的存在或數量的診斷試驗試劑盒。所述診斷試劑盒利用反應性複合物來方便酶或酶抑制劑的檢測。所述反應性複合物包括與報導分子和特異性結合構件連接(例如，共價鍵合、物理吸附，等等)的底物。在一個實施方案中，例如，肽、蛋白質或糖蛋白底物與報導分子(例如，染色膠乳顆粒)和特異性結合構件(例如，生物素化的化合物)連接起來。在此實施方案中，底物為蛋白水解酶提供裂解目標。具體地，在與反應性複合物接觸時，蛋白水解酶裂解底物並釋放報導分子和/或特異性結合構件。然後可以將由釋放的報導分子直接或間接地產生的信號來顯示試驗樣品內酶或酶抑制劑的存在或數量。
可根據本發明檢測各種類型的酶。例如，可以檢測轉移酶、水解酶、裂合酶，等等。在一些實施方案中，研究的酶是「水解酶」或「水解作用酶」，其是指促進水解反應的酶。此類水解酶的例子包括，但不限於蛋白酶、肽酶、脂肪酶、核酸酶、同-或雜-低聚糖酶、同-或雜-多糖酶、磷酸酯酶、硫酸酯酶、神經氨酸苷酶和酯酶。在一個實施方案中，例如，可以檢測肽酶。「肽酶」是裂解存在於短肽中的肽鍵的水解酶。肽酶的例子包括，但不限於金屬肽酶、二肽基肽酶I、II或IV；等等。在另一實施方案中，可以檢測蛋白酶。「蛋白酶」是裂解比較長的肽和蛋白質中的肽鍵的水解酶。可根據本發明檢測的蛋白酶的例子包括，但不限於絲氨酸蛋白酶(例如，胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、彈性蛋白酶、PSA，等等)、天冬氨酸蛋白酶(例如，胃蛋白酶)、巰基蛋白酶(例如，促激素巰基蛋白酶)、金屬蛋白酶、酸性蛋白酶和鹼性蛋白酶。還有其它的酶描述於Bronstein等人的美國專利No.6,243,980和Yue等人的2004/0081971，在此以它們的全部內容引入作為參考用於所有目的。
同樣地，也可以根據本發明檢測任何各種已知的酶抑制劑。例如，已知的水解酶抑制劑包括，但不限於蛋白酶、肽酶、脂肪酶、核酸酶、同-或雜-低聚糖酶、同-或雜-多糖酶、磷酸酯酶、硫酸酯酶、神經氨酸苷酶和酯酶的抑制劑。蛋白酶抑制劑可以包括，例如，天冬氨酸蛋白酶抑制劑、絲氨酸蛋白酶抑制劑、巰基蛋白酶抑制劑、金屬蛋白酶抑制劑，酸性或鹼性蛋白酶抑制劑，等等。一些具體的蛋白酶抑制劑的例子包括benzamideine、吲哚、胃蛋白酶抑制劑、卵巨球蛋白、氟哌啶醇、過渡態模擬物，等等。
如上所述，將反應性複合物用於本發明來檢測酶或酶抑制劑的存在或數量。所述反應性複合物包括與報導分子和特異性結合構件連接的底物。術語「底物」泛指通過酶在其上的化學作用以形成產物的物質。所述底物可以是天然存在或是合成的。一些合適的水解酶的底物包括，例如，酯、醯胺、肽、醚或其它具有可被酶水解的鍵的化合物。酶催化水解反應可以，例如，產生作為主產物的羥基或胺化合物和作為副產物的游離磷酸鹽、乙酸鹽，等等。具體的底物類型可以包括，例如，蛋白質或糖蛋白、肽、核酸(例如，DNA和RNA)、碳水化合物、脂類、酯、其衍生物，等等。舉例來說，一些合適的肽酶和/或蛋白酶的底物可以包括肽、蛋白質和/或糖蛋白，例如酪蛋白(例如，β-酪蛋白、偶氮酪蛋白，等等)、白蛋白(例如，牛血清白蛋白(BSA))、血紅蛋白、肌紅蛋白、角蛋白、明膠、胰島素、蛋白聚糖、纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原、彈性蛋白，等等。還有其它合適的底物描述於Simonsson等人的美國專利No.4,748,116；Diamond等人的美國專利No.5,786.137；Rao等人的美國專利No.6,197,537；和Henderson等人的美國專利No.6,235,464；Nemori等人的美國專利No.6,485,926，在此以它們的全部內容引入作為參考用於所有目的。
特異性結合構件通常可以是任何特異性的結合對的單元，即兩個不同的分子，其中一個分子化學和/或物理地與第二個分子結合起來。舉例來說，免疫活性的特異性結合構件可以包括抗原、半抗原、抗體(初級或次級)及其複合物，包括由重組DNA方法或肽合成形成的抗原、半抗原、抗體(初級或次級)及其複合物。抗體可以是單克隆或多克隆抗體、重組蛋白質或其混合物或片段，以及抗體和其它特異性結合單元的混合物。此類抗體的製備方法和它們用作特異性結合構件的適合性的詳細情況是本領域技術人員所熟知的。其它常見的特異性結合構件包括，但不限於生物素和抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白(neutravidin)、captavidin、或抗生物素抗體；蛋白A和G；碳水化合物和植物凝血素、互補的核苷酸序列(包括用於檢測目標核苷酸序列的DNA雜交試驗的探針和俘獲的核苷酸序列)；互補的肽序列包括由重組方法形成的肽序列；效應物和受體分子；激素和激素結合蛋白；酶輔助因子和酶、酶抑制劑和酶；其衍生物，等等。此外，特異性的結合對可以包括所述原始的特異性結合構件的類似物、衍生物和/或片段。
除了被連接到特異性結合構件外，如上面描述，底物還連接到報導分子以形成所述的反應性複合物。所述報導分子可包含任何能直接或間接地產生可檢測信號的物質。合適的可檢測的物質可包括，例如，色原；發光的化合物(例如，螢光，磷光，等等)；放射性化合物；可見的化合物(例如，膠乳或金屬的顆粒，如金)；脂質體或其它含有產生信號的物質的囊泡；酶和/或底物，等等。例如，一些適於用作可檢測的物質的酶描述於Litman等人的美國專利No.4,275,149，在此以其全部內容引入作為參考用於所有目的。酶/底物體系的一個例子是酶是鹼性磷酸酯酶並且底物是硝基藍四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯或其衍生物或類似物，或底物是4-甲基傘形花基(umbelliferyl)-磷酸酯。其它合適的報導分子描述於Jou等人的美國專利No.5,670,381和Tarcha等人的No.5,252,459，在此以它們的全部內容引入作為參考用於所有目的。
在一些實施方案中，報導分子可含有產生光學上可檢測信號的發光化合物。所述發光化合物可以是分子、聚合物、樹枝狀物、顆粒，等等。例如，合適的螢光分子可包括，但不限於螢光素、銪螯合物、藻膽蛋白、若丹明和它們的衍生物和類似物。其它合適的螢光化合物是通常被稱為「量子點」的半導體納米晶體。例如，此類納米晶體可含有通式CdX的核，其中X是Se、Te、S，等。所述納米晶體還可以用通式YZ的覆蓋殼鈍化，其中Y是Cd或Zn，和Z是S或Se。其它合適的半導體納米晶體的例子還描述於Barbera-Guillem等人的美國專利No.6,261,779和Dapprich等人的No.6,585,939，在此以它們的全部內容引入作為參考用於所有目的。
此外，合適的發磷光的化合物可包括一種或多種金屬的金屬複合物，所述一種或多種金屬為例如釕、鋨、錸、銥、銠，鉑、銦、鈀、鉬、鎝、銅、鐵、鉻、鎢、鋅，等等。特別優選的是釕、錸、鋨、鉑和鈀。所述金屬配合物可含有一個或多個促進複合物在水溶液或非水環境中的溶解度的配體。例如，一些合適的配體的例子包括，但不限於吡啶；吡嗪；異煙醯胺；咪唑；聯吡啶；三聯吡啶；菲咯啉；聯吡啶並吩嗪；卟啉、卟吩，及其衍生物。此類配體可以，例如，被烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基、取代的芳烷基、羧酸酯、醛、羧醯胺、氰基、氨基、羥基、亞氨基、羥羰基、氨羰基、脒、胍鹽、醯脲、含硫基團、含磷基團，和N-羥基-琥珀醯亞胺的羧酸酯所取代。
卟啉和卟吩金屬複合物含有與亞甲橋偶聯在一起的吡咯基團以形成帶有金屬螯合內腔的環狀結構。這些分子中有許多分子都在室溫下在合適的溶劑中(例如，水)和無氧環境下表現出強烈的磷光性質。一些合適的能顯示出磷光性質的卟啉複合物包括，但不限於鉑(II)糞卟啉-I和III、鈀(II)糞卟啉、釕糞卟啉、鋅(II)-糞卟啉-I，其衍生物，等等。類似地，一些合適的能顯示出磷光性質的卟吩複合物包括，但不限於鉑(II)四-內消旋-氟苯基卟吩和鈀(II)四-內消旋-氟苯基卟吩。還有其它合適的卟啉和/或卟吩複合物描述於Schmidt等人的美國專利No.4,614,723；Hendrix的No.5,464,741；Soini的No.5,518,883；Ewart等人的No.5,922,537；Saqner等人的No.6,004,530；和Ponomarev等人的No.6,582,930，在此以它們的全部內容引入作為參考用於所有目的。
聯吡啶金屬複合物也可被用作發磷光的化合物。一些合適的聯吡啶複合物的例子包括，但不限於二[(4，4′-甲氧甲醯)-2，2′-聯吡啶]2-[3-(4-甲基-2，2′-聯吡啶-4-基)丙基]-1，3-二氧戊環釕(II)；雙(2，2′-聯吡啶)[4-(丁-1-醛)-4′-甲基-2，2′-聯吡啶]釕(II)；二(2，2′-聯吡啶)[4-(4′-甲基-2，2′-聯吡啶]-4′-基)-丁酸]釕(II)；三(2，2′-聯吡啶)釕(II)；(2，2′-聯吡啶)[二-二(1，2-二苯基膦基)亞乙基]2-[3-(4-甲基-2，2′-聯吡啶-4′-基)丙基]-1，3-二氧戊環鋨(II)；二(2，2′-聯吡啶)[4-(4′-甲基-2，2′-聯吡啶)-丁胺]釕(II)；二(2，2′-聯吡啶)[1-溴-4(4′-甲基-2，2′-聯吡啶-4-基)丁烷]釕(II)；二(2，2′-聯吡啶)馬來醯亞胺己酸，4-甲基-2，2′-聯吡啶-4′-丁醯胺釕(II)，等等。還有其它合適的可以顯示出磷光性質的金屬複合物描述於Richter等人的美國專利No.6,613,583；Massev等人的No.6,468,741；Meade等人的No.6,444,423；Massev等人的No.6,362,011；Bard等人的No.5,731,147；和Massev等人的No.5,591,581，以它們的全部內容在此引入作為參考用於所有目的。
在一些情況中，利用「時間-分辨的」發光檢測技術。時間-分辨的檢測包括用一個或多個光的短脈衝激發發光化合物，然後在測量剩餘發光信號前的激發之後通常等待一定的時間(例如，大約1-100微秒之間)。用這樣的方式除去任何短暫的磷光或螢光本底信號以及分散的激發輻射。這種除去許多種本底信號的能力可導致敏感性比常規的螢光或磷光大2-4個數量級。因此，通過利用某些發光材料的特徵，將時間-分辨的檢測用來減少來自發射源或散射作用(由激發輻射的散射所產生)的本底信號。
為了有效地作用，時間-分辨的技術通常需要相對長的發射持續時間用於發光化合物。這就期望所述化合物在任何短暫的本底信號消散以後發射它的信號。此外，長的螢光持續時間使採用廉價的電路用於時間門測定成為可能。例如，所述可檢測的化合物可以有大於大約1微秒的螢光持續時間，在一些實施方案中大於大約10微秒，在一些實施方案中大於大約50微秒，以及在一些實施方案中從大約100微秒到大約1000微秒。此外，所述化合物還可以具有相對大的「斯託克斯頻移」。術語「斯託克斯頻移」通常被定義為與激發線或帶相比，發光輻射到比較長的發射波長的譜線或帶的位移。相對大的斯託克斯頻移讓發光化合物的激發波長與它的發射波長保持很遠並且是合乎需要的，因為激發和發射波長之間的巨大差異使除去來自發射信號的反射激發輻射變得容易。此外，巨大的斯託克斯頻移還能最小化來自樣品中的發光分子和/或由於蛋白質或膠體的光散射的幹擾，所述蛋白質或膠體與一些體液(例如，血液)一起存在。另外，巨大的斯託克斯頻移還能將對於為除去本底幹擾的昂貴、高精度的過濾器的需求最小化。例如，在一些實施方案中，所述發光化合物具有大於大約50納米的斯託克斯頻移，在一些實施方案中大於大約100納米，以及在一些實施方案中從大約100到大約350納米。
例如，一種合適的用於時間-分辨的檢測技術的螢光化合物類型包括釤(Sm(III))、鏑(Dy(III))、銪(Eu(III))和鋱(Tb(III))的鑭系元素螯合物。在所述螯合物在基本上較短的波長的激發之後，此類螯合物可以顯示出強烈地紅外移動、窄帶、長期的發射。通常，由於位於分子中鑭系元素附近的發色團，所述螯合物具有強烈的紫外激髮帶。在通過所述發色團的激發之後，激發能量可以從激發的發色團轉到鑭系元素。這遵循鑭系元素螢光發射特性。例如，與螢光素的僅僅大約28納米相比，銪螯合物具有大約250到大約350納米的特別大的斯託克斯頻移。並且，與其它螢光化合物的大約1到大約100毫微秒相比，銪螯合物的螢光是長期的，具有大約100大約1000微秒的持續時間。此外，這些螯合物具有窄的發射光譜，通常在大約50％發射時具有小於大約10納米的帶寬。一種合適的銪螯合物是N-(對-異硫氰醯苄基)-二亞乙基三胺四乙酸-Eu+3。
另外，還可將在水溶液或懸浮液中惰性、穩定和固有地螢光的鑭系元素螯合物用於本發明以取消對分子團-形成試劑的需要，分子團-形成試劑常常用於保護具有有限溶解度和在水溶液或懸浮液中有猝滅問題的螯合物。一個此類螯合物的例子是4-[2-(4-異硫氰醯苯基)乙炔基]-2，6-二{[N，N-二(羧甲基)氨基]甲基}-吡啶[參考Lovgren，T.等人，Clin.Chem.42，1196-1201(1996)]。一些鑭系元素螯合物還顯示出特別高的信噪比。例如，一種此類螯合物是四配位基的β-二酮酯-銪螯合物[參考Yuan，J.和Matsumoto，K.；Anal.Chem.70，596-601(1998)]。除了上面描述的螢光化合物之外，其它適用於本發明的化合物描述於Mullinax等人的美國專利No.6,030,840；Davidson的No.5,585,279；Singer等人的No.5,573,909；Wieder等人的No.6,242,268；和Hemmila等人的No.5,637,509，在此以它們的全部內容引入作為參考用於所有目的。
按照規定，在本發明的一些實施方案中報導分子可間接地產生可檢測信號。在這種情況中，報導分子可以不必特異性地含有可檢測的物質，而是反而能對可檢測的物質有影響以產生檢測信號。例如，在一些實施方案中，報導分子可以是特異性的結合對的一個單元，例如上面描述的。例如，可以將作為特異性結合對的一個單元的報導分子放入並與探針接觸，所述探針與特異性結合對的另一個單元共軛。因此，釋放的報導分子將與共軛的探針結合起來，然後使用本領域的技術人員所熟知的技術容易地檢測(直接或間接地)。在下文將更詳細解釋，當報導分子含有特異性結合構件時，通常期望特異性結合構件不同於連接到底物的另一個特異性結合構件並且對另一個特異性結合構件沒有特定的結合親和性。
不管報導分子是直接或是間接地產生信號，它可能含有顆粒(有時稱為「珠」或「微珠」。尤其是，顆粒提高了報導分子穿過層析介質並且固定在檢測區域內的能力，例如如下所述。例如，可以使用天然存在的顆粒，如核、支原體、質粒、質體、哺乳動物細胞(例如，紅細胞影)、單細胞的微生物(例如，細菌)、多糖(例如，瓊脂糖)，等等。此外，也可以利用合成的顆粒。例如，在一個實施方案中，用螢光或有色染料標記的膠乳粒子。雖然可以使用任何的膠乳顆粒，但是膠乳粒子通常是由聚苯乙烯、丁二烯苯乙烯、苯乙烯丙烯酸-乙烯基三元共聚物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、苯乙烯-馬來酸酐共聚物、聚乙酸乙烯基酯、聚乙烯基吡啶、聚二乙烯基苯、聚對苯二甲酸亞丁基酯、丙烯腈、乙烯氯丙烯酸酯等，或其醛、羧基、氨基、羥基或醯肼衍生物形成的。其它合適的顆粒描述於Jou等人的美國專利No.5,670,381和Tarcha等人的No.5,252,459。市場上可買到的合適的螢光顆粒的例子包括由Molecular Probes，Inc.以商品名「FluoSphere」(Red 580/605)和「TransfluoSphere」(543/620)出售的螢光羧化物微球，以及也是由Eugene，Oregon.的MolecularProbes，Inc.出售的「Texas Red」和5-和6-羧四甲基若丹明。另外，市場上可買到的合適的染色膠乳微粒的例子包括由Fishers，Indiana的Bangs Laboratories，Inc.出售的羧基膠乳珠。
使用時，所述顆粒的形狀常常可以變化。舉例來說，在一個具體的實施方案中，顆粒是球形的。但是，應當清楚其它形狀也是本發明所考慮的，如板、棒、圓片、條、管、不規則的形狀，等等。此外，所述顆粒的尺寸也可以變化。例如，所述顆粒的平均尺寸(例如，直徑)可以從大約0.1納米到大約1,000微米，在一些實施方案中，從大約0.1納米到大約100微米，以及在一些實施方案中，從大約1納米到大約10微米。例如，「微米級」的顆粒是通常所期望的。使用時，此類「微米級」的顆粒可具有大約索梅微米到大約1,000微米的平均尺寸，在一些實施方案中，從大約1微米到大約100微米，以及在一些實施方案中，從大約1微米到大約10微米。同樣地，也可以使用「納米級」的顆粒。此類「納米級」的顆粒可具有大約0.1納米到大約10納米的平均尺寸，在一些實施方案中，從大約0.1納米到大約5納米，以及在一些實施方案中，從大約1納米到大約5納米。
使用任何各種公知的技術，通常將所述的特異性結合構件與報導分子連接於所述底物。例如，可以使用羧基、氨基、醛、溴乙醯基、碘乙醯基、巰基、環氧和其它活性官能團來實現特異性結合構件和/或報導分子到底物的共價連接，以及通過殘餘的游離基和自由基的偶合反應可以實現。表面官能團也可以作為官能化的共同單體被引入，因為所述報導分子的表面可含有比較高的極性基團表面濃度。在某些情況下，所述特異性結合構件和/或報導分子能直接共價鍵合到底物，而不需要進一步的修飾。同樣應該理解，除了共價鍵合以外，其它的連接技術(如物理吸附)也可以用於本發明。還有其它的非共價鍵合技術可使用抗體和/或抗原，如次級抗體(例如，抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白和/或生物素)。
現在將更詳細地描述一種具體的用於將報導分子和特異性結合構件共價鍵合到底物的技術。在這個具體實施方案中，底物是β-酪蛋白，報導分子是染色顆粒，而特異性結合構件是生物素衍生物。例如，報導分子可以是從Molecular Probes，Inc.中獲得的名為「FiuoSphere」的紅色羧基膠乳顆粒。同樣地，特異性結合構件可以是磺酸基琥珀醯亞胺基-6-(生物素-醯胺基)己酸酯，其是從Rockford，Illinois的Pierce Biotechnology，Inc.得到的，名為EZ-Link磺酸基-NHS-LC-生物素。認為用於製備此類NHS-活化的生物素的技術描述於Bremmer等人的美國專利No.5,872,261，以其全部內容在此引入作為參考用於所有目的。
對於與β-酪蛋白共價結合的染色顆粒，用碳化二亞胺(例如，乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC))首次活化顆粒表面上的羧基，如圖2所示。因為蛋白和糖蛋白底物(例如，β-酪蛋白)通常具有伯胺基團(NH2)，例如在賴氨酸(K)殘餘物的側鏈和/或各個多肽的N-末端，然後所述活化的羧基可與底物的伯胺(-NH2)基團反應以形成醯胺鍵。這個反應可以在緩衝液，如磷酸緩衝鹽水(PBS)(例如，pH值7.2)、2-(N-嗎啉代)乙烷磺酸(MES)(例如，pH值5.3)或硼酸鹽緩衝液(例如，pH值8.5)中發生。如果需要，然後可將產生的反應性複合物用乙醇胺保護，例如，來保護任何其餘的活性部位。
在有些相似的方法中，基於生物素的特異性結合構件也可以被共價鍵合到β-酪蛋白。例如，NHS-活化的生物素可以與底物上存在的伯胺基團(任選地在緩衝液的存在下)形成共價醯胺鍵。將一個此類反應的例子顯示在下面
一旦形成，使用者可以讓試驗樣品與反應性複合物一起培養一段時間。例如，本領域的技術人員依靠所研究的酶的活性能容易地確定出用於酶-催化反應的培養時間，其依次部分地取決於溫度、pH值、底物濃度、抑制劑(競爭性的(與酶結合)、無競爭性的(與酶-底物複合物結合)或非競爭性的(與酶和/或酶-底物複合物結合))的存在。可根據需要有選擇地控制這些因素以增加或減少培養時間。例如，培養時間可以大於大約1分鐘，在一些實施方案中從大約5分鐘到大約50分鐘，在一些實施方案中從大約10分鐘到大約25分鐘。同樣地，可以有選擇地控制pH值以促進酶的活性。例如，試驗樣品內鹼性物質的高水平會導致pH值對於一些酶的最佳活性而言過高，例如大於8。具體地，酶可在pH值從大約3到大約8的水平具有最佳活性，以及在一些實施方案中，pH值從大約4到大約7。因此，如果需要，可以使用緩衝液或其它的改變pH值的化合物來保持所需要的pH值。
在培養之後，試驗樣品內存在的任何酶通常將裂解至少一部分反應性複合物的底物。結果，可以形成各種物種，包括釋放的報導分子、釋放的特異性結合構件、部分裂解的複合物(例如，酶-報導分子-底物-特異性結合構件)，以及未反應的複合物(例如，報導分子-底物-特異性結合構件)。較長的培養時間和較大的酶濃度可導致得到的培養混合物中釋放的報導分子和特異性結合構件的濃度更大。此外，應當清楚，根據底物和酶的性質，「釋放的」報導分子和特異性結合構件可以含有或可不必含有複合物的片段。例如，當使用較長鏈的底物(例如，蛋白質)時，釋放的報導分子和特異性結合構件可含有來自蛋白質底物的肽片段。相反，當使用較短鏈的底物(例如，肽)時，釋放的報導分子和特異性結合構件相對地不含這樣的片段。
根據本發明，診斷試驗試劑盒還包含用於指示報導分子的存在或缺少的測定裝置。所述測定裝置使用層析介質用於從培養混合物內存在的其它物種中化學分離釋放的報導分子。與其它分離技術(如，離心)對比，本發明人發現層析介質可簡化並降低產生的眾多消費者應用的診斷試驗試劑盒的成本，所述診斷試驗試劑盒包括所需的一次性試劑盒。
參照圖1，例如，現在將更詳細地描述根據本發明的測定裝置20的一個實施方案，測定裝置20可以用來指示酶的存在或數量。如圖所示，測定裝置20包含任選地由載體21支持的層析介質23。層析介質23可由任何種類的液體能夠通過的材料製成，例如流體性的通道、多孔膜，等等。例如，層析介質23可以是由以下材料形成的多孔膜，所述材料例如是，但不限於天然的、合成的或合成修飾的天然存在材料，例如多糖(例如，纖維素材料(如，紙)和纖維素衍生物(如，醋酸纖維素和硝化纖維素))；聚醚碸；聚乙烯；尼龍；聚偏二氟乙烯(PVDF)；聚酯；聚丙烯；矽石；無機材料，例如減活礬土、硅藻土、MgSO4或其它的與聚合物(如，氯乙烯、氯乙烯-丙烯共聚物和氯乙烯-醋酸乙烯基酯共聚物)一起均勻地分散在多孔聚合物基質中的無機的精細粉碎的材料；布、天然存在的(例如，棉花)和合成的(例如，尼龍或人造絲)；多孔的凝膠，如矽膠、瓊脂糖、葡聚糖和明膠；聚合膜，如聚丙烯醯胺；等等。在一個具體的實施方案中，層析介質由硝化纖維素和/或聚醚碸材料形成。應該理解術語「硝化纖維素」是指纖維素的硝酸酯，其可以是單獨的硝化纖維素，或硝酸和其它酸的混合酯，其它酸例如是具有1-7個碳原子的脂肪族羧酸。
所述載體21可以由任何能夠支持層析介質23的材料形成。雖然不要求，但載體21可以是透明的，以便光能容易地從中穿過。另外，通常期望載體21是液體-不能滲透的，以便流過介質的液體不會滲漏過載體21。用於載體的合適的材料的例子包括，但不限於玻璃；聚合材料，如聚苯乙烯、聚丙烯、聚酯(例如，Mylar膜)、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚醯胺、聚碳酸酯、環氧化物、甲基丙烯酸酯和聚三聚氰胺；等等。如本領域所熟知的，可將層析介質23澆鑄到載體21上，將其中產生的薄片模切成所需的大小和形狀。或者，可將層析介質23簡單地用例如粘合劑層壓到載體21上。在一些實施方案中，將硝化纖維素或尼龍多孔膜粘附到Mylar膜上。粘合劑用於將多孔膜粘合到Mylar膜上，例如是壓敏粘合劑。認為這種類型的片狀結構是可以從Millipore Corp.(Bedford，Massachusetts)購買到的。其它合適的片狀結構的例子描述於Durlev，III等人的美國專利No.5,075,077，以它的全部內容在此引入作為參考用於所有目的。
測定裝置20還可以利用吸收性材料28。吸收性材料28常常接收從整個層析介質23流過的液體。如本領域所熟知的，吸收性材料28可以幫助促進毛細管作用和液體流過介質23。
以上描述的培養方法可在試驗樣品施加到層析介質23之前進行，或作為測定步驟的一部分引入(即，在施加試驗樣品之後進行培養，例如將試驗樣品施加到培養孔內)。例如，可將培養混合物直接施加到部分層析介質上，培養混合物可沿著圖1中箭頭「L」說明的方向通過層析介質23。或者，可將混合物首先施加到樣品襯墊22或其它與層析介質23液體連通的材料上。一些合適的可以用於形成樣品襯墊22的材料包括，但不限於硝化纖維素、纖維素、多孔聚乙烯襯墊和玻璃纖維過濾紙。如果需要，樣品襯墊22還可以包含一種或多種擴散或非擴散地附在其上的測定預處理試劑。
無論如何，層析介質23限定第一檢測區域31，在第一檢測區域31內能夠俘獲和檢測(例如，間接地)特異性結合構件。例如，在一個實施方案中，將第一接收材料固定在第一檢測區域31內，作為用於釋放特異性結合構件的固定結合位點，特異性結合構件存在於未反應的複合物上，或特異性結合構件存在於部分裂解的複合物上。例如，在一些實施方案中，第一接收材料可以是生物接收材料。此類生物接收材料是本領域所熟知的並且可以包括，但不限於抗體、抗原、半抗原、生物素、抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、captavidin、蛋白質A、蛋白質G、碳水化合物、植物凝血素、核苷酸序列、肽序列、效應物和受體分子、激素和激素結合蛋白、酶輔助因子和酶、酶抑制劑和酶以及其衍生物。當試驗樣品中酶的濃度開始增加時，釋放出更多的報導分子，所述報導分子對在第一檢測區域31的接收材料很少或沒有特定的結合親和性。減少的第一檢測區域31內報導分子的數量導致信號強度下降。根據信號強度的減少，可以容易地確定酶的存在或濃度。例如，在一個實施方案中，酶的數量與第一檢測區域31的信號強度I1成反比。如果需要，可以將信號強度I1對已知的酶濃度範圍的酶濃度繪圖，以產生強度曲線。根據該強度曲線可將信號強度轉變為酶的濃度，以確定未知試驗樣品中酶的數量。
第一檢測區域31通常提供許多不同的檢測區域以便使用者能更好地確定試驗樣品內酶的濃度。每個區域可包含相同或不同的接收材料。例如，檢測區域31可以包括兩個或多個不同的檢測區域(例如，線、點，等等)。使用兩個或多個不同的檢測區域可以提供一些好處，例如便於半定量和/或抑制由於反應性複合物或其它材料的超限造成的潛在的假陽性。所述檢測區域可以以基本上垂直於試驗樣品流經層析介質23的方向線性排列。同樣地，在一些實施方案中，所述檢測區域可以以基本上平行於試驗樣品流經層析介質23的方向線性排列。應該理解第一檢測區域31的一個或多個不同的區域可以顯示出上述信號強度和酶濃度之間的關係；但是，每個不同的區域不必都顯示出這樣的關係。例如，在一些實施方案中，多個不同的區域中僅有一個區域顯示出信號強度與酶的濃度成反比。其它不同區域的信號強度，例如那些用於減少假陽性的區域，則保持恆定，或顯示出信號強度的增加和/或減少。只要檢測區域31的至少一個不同的區域滿足所述的反比關係，就認為由第一檢測區域31顯示的信號強度與酶的濃度成反比。
根據本發明，可以根據需要的應用有選擇地控制對於所研究酶的檢測靈敏度水平。一種具體的用於控制所述檢測靈敏度的技術包括控制用於第一檢測區域31的第一接收材料的數量。例如，當分析懷疑含有很大濃度的酶的試樣時，第一接收材料的數量可以等於或大於需要俘獲所用的全部反應性複合物的最小量。因此，如果沒有酶存在於試驗樣品中，則所有反應性複合物將固定在檢測區域31和所有報導分子將存在在第一檢測區域31內。俘獲所有反應性複合物需要的最小數量可以用實驗方法來確定，並且通常取決於使用的反應性複合物的數量以及第一接收材料和特異性結合構件之間的結合親和性。
在需要提高的檢測靈敏度的應用(例如，低的懷疑的酶濃度或短的培養時間)中，第一接收材料的數量可以小於俘獲所需要使用的全部反應性複合物的最小量。使用這樣有限數量的第一接收材料可以提供許多好處，包括降低任何部分裂解的複合物在第一檢測區域31被俘獲的可能性，否則會導致測定的酶濃度略低於實際的濃度。也就是說，當酶濃度增加時，從反應性複合物釋放出更多的特異性結合構件。由於它們的分子尺寸較小，這些釋放的特異性結合構件通常比部分裂解的複合物和未反應的複合物更快地到達第一檢測區域31，並且因此具有更高的有效結合位點的佔據概率。此外，部分裂解的複合物通常還比完全未反應的複合物含有較少的特異性結合構件。這種特異性結合構件數量的減少在統計上減少了部分裂解的複合物與第一檢測區域31結合的可能性。
正如以上的討論，酶濃度和信號強度之間的反比關係可以與試驗樣品中的實際的酶濃度相關聯。但是，因為並不總是需要使用酶濃度「增加」與信號強度「減少」相互關聯的測定形式(例如，消費者應用)，所以本發明還提供酶濃度「增加」與信號強度「增加」直接相關聯的實施方案。在此類情況下，可以利用另外的檢測區域。例如，再次參照圖1，層析介質23還可限定位於第一檢測區域31下遊的第二檢測區域35。第二檢測區域35可以提供一個或多個不同的區域(例如，線、點，等等)，並且可以位於任何相對於試驗樣品流動的方向。
在第二檢測區域35內，可以俘獲和檢測任何在檢測區域31沒有與第一接收材料結合的釋放的報導分子、部分裂解的複合物或未反應的複合物。俘獲釋放的報導分子的方法可取決於所用報導分子的性質。在一些實施方案中，可將第二接收材料固定在用於俘獲報導分子的第二檢測區域35內。例如，第二接收材料可以是生物接收材料，例如，但不限於抗體、抗原、半抗原、生物素、抗生物素蛋白、鏈黴抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、captavidin、蛋白質A、蛋白質G、碳水化合物、植物凝血素、核苷酸序列、肽序列、效應物和受體分子、激素和激素結合蛋白、酶輔助因子和酶、酶抑制劑和酶，以及其衍生物。因為期望第二接收材料特定地結合到報導分子，所以第二接收材料通常不同於第一接收材料。
例如，釋放的報導分子可以與選擇的對第二檢測區域35內的第二接收材料有親和性的特異性結合構件結合。可以使用任何公知的技術將特異性結合構件結合到報導分子，例如通過如上所述的共價鍵合和/或物理吸附。在一個具體的實施方案中，將所述報導分子的羧基活化並與抗體的氨基反應形成醯胺鍵。在這種情況下，釋放的報導分子可通過抗體和接收材料之間的結合而被固定在第二檢測區域35內，以便檢測由可檢測的物質產生的信號。例如，第一接收材料可以是次級抗體(如抗生物素抗體，例如山羊抗小鼠IgG抗體)、抗生物素蛋白(高陽離子的66,000道爾頓糖蛋白)、鏈黴抗生物素蛋白(非糖基化的52,800道爾頓蛋白質)、中性抗生物素蛋白(去糖基的抗生物素蛋白衍生物)或captavidin(硝化的抗生物素蛋白衍生物)。在這個實施方案中，第一接收材料可以與生物素(小鼠IgG抗體)的特異性結合構件結合起來。例如，所述報導分子可以是與C反應蛋白結合的螢光染色顆粒，其可以與單克隆抗體第二接收材料(例如，抗C反應蛋白(CRP)單克隆抗體)結合起來。
當然，也可以使用任何其它的用於俘獲和檢測釋放的報導分子的適用技術。例如，在一些實施方案中，可將非生物接收材料固定在用於俘獲釋放的報導分子的第二檢測區域35內。此類非生物接收材料在俘獲，例如包含標記顆粒的釋放的報導分子中是特別有用的。例如，在一個實施方案中，所述接收材料是聚電解質。聚電解質可以有正或負電荷，以及通常為中性的淨電荷。一些合適的具有淨正電荷的聚電解質的例子包括，但不限於聚賴氨酸(可從Sigma-Aldrich ChemicalCo.Inc.(St.Louis，Missouri)購買到)、聚乙烯亞胺；環氧氯丙烷-官能化的聚胺和/或聚醯氨基胺，如(二甲胺-環氧氯丙烷)共聚物；聚二烯丙基二甲基-氯化銨；陽離子纖維素衍生物，如纖維素共聚物或用季銨水溶性單體接枝的纖維素衍生物；等等。在一個具體的實施方案中，可以利用CelQuatSC-230M或H-100(可從National Starch Chemical，Inc.獲得)，它們是含有季銨水溶性單體的纖維素衍生物。此外，一些合適的具有淨負電荷的聚電解質的例子包括，但不限於聚丙烯酸，如(乙烯-甲基丙烯酸鈉鹽)共聚物，等等。同樣應該理解其它聚電解質也可以用於本發明，如兩親的聚電解質即，具有極性和非極性的部分)。例如，一些合適的兩親的聚電解質的例子包括，但不限於聚(苯乙烯基-嵌段-N-甲基2-乙烯基吡啶碘化物)和聚(苯乙烯基-嵌段-丙烯酸)，二者都可從Polymer Souree，Inc.(Dorval，Canada)獲得。其它的聚電解質的例子更詳細地描述於Song等人的美國專利申請公布No.2003/0124739，以它全部內容在此引入作為參考用於所有目的。
雖然通常可以利用任何聚電解質，但是選擇用於具體應用的聚電解質可以取決於釋放的報導分子的性質而變化。特別地，聚電解質分布電荷讓其結合到具有相反電荷的物質上。因此，例如，具有淨正電荷的聚電解質常常會較好地與帶陰電荷的釋放的報導分子(例如，染色顆粒)結合，而具有淨負電荷的聚電解質常常會較好地結合到帶陽電荷的釋放的報導分子。因此，在這種情況中，這些分子間的離子相互作用讓所需要的結合發生在第二檢測區域35內。然而，雖然主要是利用離子相互作用來達到所需要的結合，但是也發現聚電解質可以與具有相似電荷的報導分子結合。
除了使用接收材料之外，還可以利用其它的俘獲技術。例如，在一個實施方案中，報導分子可以含有能夠被磁性裝置俘獲的磁性物質。通常，如果材料受施加磁場的影響，例如，如果一種材料被吸引或排斥或者具有可檢測的磁化率或感應，則認為該材料是「磁性的」或「有磁力感應的」。例如，一些合適的可以用來給予磁性的有磁力感應的物質的例子包括但不限於順磁性物質、超順磁性物質、鐵磁體物質、亞鐵磁性材料和變磁性材料。具體的例子是金屬，例如鐵、鎳、鈷、鉻和錳；鑭系元素，例如釹、鉺；合金，例如鋁、鎳、鈷或銅的磁性合金；氧化物，例如氧化鐵(Fe3O4)、氧化亞鐵(Fe2O3)、氧化鉻(CrO2)、氧化鈷(CoO)，氧化鎳(NiO2)或氧化錳(Mn2O3)；複合材料，例如鐵酸鹽；以及固態溶液，例如帶有氧化鐵的磁鐵礦。在一些實施方案中，報導分子含有用如上所述的可檢測的物質染色的磁性顆粒。
在一個實施方案中，磁性裝置靠近(例如，在下面)由層析介質23限定的第二檢測區域35。用這樣的方式，磁性裝置可以將釋放的報導分子，以及任何部分裂解的或未反應的複合物固定在第二檢測區域35內。任何磁性裝置可以用於本發明。例如，磁場發生器可以用來產生引起磁性物質反應的磁場。合適的磁場發生器包括，但不限於永磁體和電磁體。一些市場上可買到的合適的磁性分離裝置的例子包括由Dynal，Inc.(Lake Success，New York)生產的Dynal M PC系列的分離器，其使用位於容納試驗介質的容器外部的永磁體。其它的磁性設備描述於Liberti等人的美國專利No.5,200,084；Tuunanen等人的美國專利No.5,647,994；Wang等人的美國專利No.5,795,470；以及Siddiqi的美國專利No.6,033,574，以它們的全部內容在此引入作為參考用於所有目的。
當報導分子含有直接可檢測的物質時，由於釋放的報導分子和/或部分裂解的複合物的存在，酶濃度的增加導致第二檢測區域35的信號強度I2增加。根據信號強度的增加，可以容易地確定酶的存在或濃度。例如，在一個實施方案中，酶的數量與第二檢測區域35的信號強度I2成正比，如果需要，可將信號強度I2對已知酶濃度範圍的酶濃度繪圖以產生強度曲線。根據該強度曲線可將信號強度轉變為酶的濃度，以確定未知試驗樣品中酶的數量。應該理解，正如以上對於第一檢測區域31的討論，只要第二檢測區域35的至少一個不同的區域滿足所述正比關係，就認為由第二檢測區域35顯示的信號強度與酶的濃度成正比。
並且，在第一檢測區域31的信號強度(I1)和第二檢測區域35(I2)之間也可存在反比關係。例如，因為存在預定量的報導分子，所以在第二檢測區域35俘獲的數量與在第一檢測區域31俘獲的數量成反比。這種反比關係的結果是在一些情況中通過比較兩個檢測區域的信號強度可以在擴大範圍更有效地測定酶的濃度。例如，在一個實施方案中，酶的數量正比於信號強度「I2」與信號強度「I1」的比值。基於該比值落入的範圍，可以確定出酶的一般濃度範圍。如果需要，可以將I2與I1的比值對已知範圍酶濃度的酶濃度繪圖，以產生強度曲線。根據該強度曲線可將信號強度比值轉變為酶的濃度，以確定未知試驗樣品中酶的數量。應該注意到可將I1和I2之間的另一種數學關係對酶濃度繪圖以產生強度曲線。例如，在一個實施方案中，可將I2/(I2+I1)的值對酶濃度繪圖以產生強度曲線。
如上所述，本發明的某些實施方案可以利用不可直接檢測的報導分子。因此，在釋放時，通常期望報導分子與用於隨後的檢測的物質以一些方式相互作用。例如，可以使用能產生可檢測信號的探針，將探針裝配起來與釋放的報導分子結合。例如，探針可以含有用可檢測的物質標記或以別的方式施加的顆粒。在一些情況下，希望以一些方式來修飾探針。例如，可以用特異性結合構件來修飾探針以形成對釋放的報導分子有特異性親和性的結合的探針。通常可以使用任何公知的技術將特異性結合構件結合到探針，例如通過如上所述的共價鍵合和/或物理吸附。在一個具體的實施方案中，將在探針表面的羧基活化並與特異性結合構件的氨基反應形成醯胺鍵。在利用時，通常期望用於探針和報導分子的特異性結合對不同於用於第一接收材料和另一個連接到底物的特異性結合構件的特異性結合對。這有助於保證探針和報導分子基本上與上面描述的結合機理不牴觸。
所述探針可以在酶探測過程的任何階段與釋放的報導分子接觸。例如，在一些實施方案中，可將探針施加到位於期望檢測的區域上遊位置的測定裝置20。例如，在一個實施方案中，可將探針施加到結合襯墊(未顯示)，所述襯墊位於檢測區域31和35的上遊，但在樣品襯墊22的下遊。
在此類實施方案中，各種測定形式可以用來檢測所釋放的報導分子。在一個實施方案中，例如，利用「三明治」測定形式，選擇其中釋放的報導分子來吸引結合探針的特異性結合構件。所述釋放的報導分子(例如抗體、抗原，等等)通常具有兩個或多個結合位點(例如，抗原表位)。通過結合探針的特異性結合構件來佔據這些結合位點中的一個結合位點。但是，釋放的報導分子的游離結合位點隨後可以與固定在第二檢測區域35內的接收材料結合以形成新的三重的三明治複合物。或者，可以使用直接或間接的「競爭性的」測定形式來檢測釋放的報導分子。在這種情況中，結合探針的特異性結合構件可以與釋放的報導分子相同或是釋放的報導分子的類似物。因此，在到達第二檢測區域35時，結合的檢測探針和釋放的報導分子競爭固定接收材料的有效結合位點。當然，任何其它的測定形式也適用於本發明。
對於上面描述的實施方案，其中的報導分子是可間接地檢測的，在試驗樣品內酶濃度的增加會導致釋放出更許多種報導分子。因此，如果使用三明治測定形式，更多釋放的報導分子與結合探針結合起來以使酶的數量與第二檢測區域35的信號強度成正比。另一方面，如果使用競爭測定形式，酶的數量與第二檢測區域35的信號強度成反比。在任何情況下，可以將信號強度對已知酶濃度範圍的酶濃度繪圖，以產生強度曲線。根據該強度曲線可將信號強度轉變為酶的濃度，以確定未知試驗樣品中酶的數量。
參照圖3，現在將更詳細地描述使用螢光來檢測蛋白酶存在的方法的一種具體實施方案。最初，將含有蛋白酶P的試驗樣品與反應性複合物41混合，每個反應性複合物41包括連接到底物47(例如，蛋白質或糖蛋白)的螢光顆粒43和特異性結合構件45(例如，生物素化物質)。讓所述複合物41培養足夠的時間以形成培養混合物(在圖3中標明為數字65)，所述培養混合物包括釋放的螢光顆粒43和特異性結合構件45以及未反應的複合物41、部分裂解的複合物49、蛋白酶P和由酶-催化反應產生的任何產品(未顯示)。將培養混合物65施加在樣品襯墊22上，如圖示的指向箭頭所示，然後移動到第一檢測區域31。由於它們的尺寸較小，釋放的特異性結合構件45流動更快並且具有更高的被第一檢測區域31內第一接收材料90俘獲的概率。第一檢測區域31內的有效結合位點也可以被一些未反應的複合物41和部分裂解的複合物49佔據。但是，沒有被第一檢測區域31俘獲的任何未反應的複合物41和部分裂解的複合物49移動到第二檢測區域35並與含在其中的第二接收材料(未顯示)結合起來。因為釋放的螢光顆粒43對於第一接收材料90沒有親和性，所以它們也移動到第二檢測區域35並與第二接收材料結合起來。
一旦被俘獲，可以在第一檢測區域31和/或第二檢測區域35測量所述螢光顆粒43的信號強度。螢光檢測通常利用波長過濾器以從激發光子中分離發射光子和利用檢測器來記錄發射光子並產生可記錄的輸出，通常以電信號或攝影圖象的方式。一種合適的用於本發明的螢光檢測器是由SPEX Industries，Inc.(Edison，New Jersey)出售的FluoroLog III分光螢光計。合適的螢光檢測器的另一個例子描述於Song等人的美國專利申請公布No.2004/0043502，以它的全部內容在此引入作為參考用於所有目的。雖然在這個具體的實施方案中利用螢光，但是應該理解任何其它已知的檢測技術也可以用在本發明中。例如，其它合適的光檢測技術可以包括但不限於磷光、衍射、反射率、透光度，等等。光讀出器能夠發射光並且還能記錄檢測信號(例如，傳送或反射的光、發射的螢光或磷光，等等)。例如，在一個實施方案中，可以利用反射分光光度計或讀出器來檢測報導分子的存在，所述報導分子顯示可見的顏色(例如染色膠乳微粒)。一種合適的反射率讀數器描述於Kaylor等人的美國專利申請公布No.2003/0119202，以它的全部內容在此引入作為參考用於所有目的。
與用於測定信號強度的技術無關，蛋白酶P的絕對量可以通過比較第一檢測區域31的信號強度與第二檢測區域35的信號強度來確定。例如，如上所述，蛋白酶P的數量可以通過I2/I1的比值並使用先前確定的強度曲線將這個比值轉化成酶濃度來確定。或者，也可以獨立地使用信號強度I1或I2以標明酶的存在或濃度。當然，本發明還預期定性的實施方案，在定性的實施方案中僅僅通過信號強度確認酶的存在，沒有具體的相互關係來確定實際的酶濃度。
在酶的上下文中具體地描述了上述檢測技術。但是，正如所描述的，本發明同樣地適於檢測試驗樣品內酶抑制劑的存在或數量。為了檢測試驗樣品內酶抑制劑的存在，可以將預定量的相應的酶與所述試驗樣品混合併培養。在一定量的酶抑制劑存在下，酶-催化反應不能以可檢測的速度進行。因此，酶抑制劑濃度和信號強度之間的關係將與酶濃度和信號強度之間的關係相反。作為例證，酶-催化反應不會在一定量抑制劑的存在下發生。因此，所有的反應性複合物會在檢測區域31被俘獲，產生它的最大信號強度。另一方面，當酶抑制劑的數量減少時，酶會引起報導分子從如上所述的反應性複合物釋放。由於存在的釋放的報導分子相應的減少，因此在檢測區域31產生的信號強度開始減少。同樣地，在一些實施方案中，在檢測區域35產生的信號強度會由於存在的釋放的報導分子的相應增多而開始增加。因此，在這個具體實施方案中，試驗樣品內酶抑制劑的數量與檢測區域31的信號強度成反比以及與檢測區域35的信號強度成正比。
現已發現本發明的診斷試驗試劑盒提供了相對簡單和有成本效益的方法以快速地進行酶或它們的抑制劑的現場測試。所述試驗試劑盒提供可見的試驗結果，以便由進行所述試驗的人能以迅速的方式容易地觀察，以及在試驗條件下有助於導出高度可靠和一致的試驗結果。所述診斷試驗試劑盒還是一次性的，以便如果需要，可以在所述試驗結束時廢棄。
參考以下實施例可以更好地理解本發明。
實施例1最初將β-酪蛋白軛合到螢光顆粒上。具體地，將2毫升紅色羧化FluoroSphere顆粒(粒徑為0.5微米，2％固體含量，Molecular Probes，Inc.(Eugene Oregon))用磷酸緩衝鹽水(PBS)(Polysciences，Inc.(Warrington，Pennsylvania))洗滌一次，然後懸浮在1毫升PBS中。加入在1毫升PBS中的36毫克碳化二亞胺(Polysciences，Inc.)並將所得混合物搖動30分鐘。將所述顆粒用硼酸鹽緩衝液(Polysciences，Inc.)洗滌兩次，然後懸浮在1毫升硼酸鹽緩衝液中。加入1毫克β-酪蛋白(Sigma-Aldrich Chemical Co.Inc.(St.Louis，Missouri))並將混合物在室溫下搖動過夜。將所述顆粒用硼酸鹽緩衝液洗滌一次，然後再懸浮在500微升硼酸鹽緩衝液中。將1毫升乙醇胺溶液(0.1摩爾，Polysciences Inc.)加入到顆粒中並搖動30分鐘。然後將所述顆粒用水洗滌四次並懸浮在2毫升硼酸鹽緩衝液中。
在形成後，將軛合的顆粒(以下稱「FCM-酪蛋白」)生物素化。具體地，將在200微升硼酸鹽緩衝液中的4毫克FCM-酪蛋白顆粒與200微升硼酸鹽緩衝液中的1毫克EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素(Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，Illinois))混合。將混合物搖動過夜，然後用水洗滌五次。將洗滌的顆粒懸浮在1毫升三(羥甲基)氨基甲烷緩衝液中(pH值7.2，20毫摩爾)。將生物素化的軛合顆粒以下簡稱為「FCM-酪蛋白-B」。
實施例2最初將β-酪蛋白軛合到染色顆粒上。具體地，將2毫升藍色羧化的顆粒(粒徑為0.3微米，Bangs Laboratories Inc.(Fisher，Indiana))用磷酸緩衝鹽水(PBS，來自Polysciences，Inc.(Warrington，Pennsylvania))洗滌一次，然後懸浮在1毫升PBS中。加入在1毫升PBS中的36毫克碳化二亞胺(Polysciences，Inc.)並將混合物搖動30分鐘。所述顆粒用硼酸鹽緩衝液(Polysciences，Inc.)洗滌兩次，然後懸浮在1毫升硼酸鹽緩衝液中。加入1毫克β-酪蛋白(Sigma AldrichChemical Co.，Inc.(St.Louis，Missouri))並將混合物在室溫下搖動過夜。將所述顆粒用硼酸鹽緩衝液洗滌一次，然後再懸浮在500微升硼酸鹽緩衝液中。將1毫升乙醇胺溶液(0.1摩爾，Polysciences Inc.)加入到所述顆粒中並搖動30分鐘。然後將所述顆粒用水洗滌四次並懸浮在2毫升硼酸鹽緩衝液中。
在形成後，將軛合的顆粒(以下稱「BP-酪蛋白」)生物素化。具體地，將在200微升硼酸鹽緩衝液中的4毫克BP-酪蛋白顆粒與200微升硼酸鹽緩衝液中的1毫克EZ-Link磺基-NHS-LC-生物素(Pierce Biotechnology，Inc.(Rockford，Illinois))混合。將混合物搖動過夜，然後用水洗滌五次。將洗滌的顆粒懸浮在1毫升三(羥甲基)氨基甲烷緩衝液中(pH值7.2，20毫摩爾)。將生物素化的軛合顆粒以下簡稱為「BP-酪蛋白-B」。
實施例3證明根據本發明檢測酶的存在或缺少的能力。最初，將硝化纖維素多孔膜(來自Millipore，Inc.(Bedford，Massachusetts)的HF12002)的一端與纖維素性的燈芯材料襯墊(Millipore，Inc.)層疊起來。將鏈黴抗生物素蛋白(1毫克/毫升，Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.)成條紋狀施加到所述的膜上以形成第一檢測區域。將層狀卡片在37℃乾燥1小時，然後切成4毫米寬的測定裝置。
向微孔板上的兩個孔中各加入25微升實施例1中形成的「FCM-酪蛋白-B」(4毫克/毫升)和75微升三(羥甲基)氨基甲烷緩衝液(pH值7.4)(一個樣品孔和一個對照孔)。將5微升來自多粘芽胞桿菌的活性蛋白酶(20毫克/毫升)、可從Sigma-Aldrich Chemical Co.Inc.獲得的金屬酶加入樣品孔。另外，將5微升減活的蛋白酶加入到對照孔。所述減活的蛋白酶是通過將活性蛋白酶煮沸5分鐘而得到的。讓每個孔中的混合物反應20分鐘。然後將20微升各混合物轉入含有20微升吐溫20(2％，Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.)的孔中。
然後將測定裝置樣品插入各自的孔中以開始所述試驗。測定進行10分鐘之後，觀察各檢測區域的顏色強度。具體地，在插入對照孔中的測定裝置的檢測區域觀察到紅線，而在插入樣品孔中的測定裝置上沒有觀察到紅線。因此，通過檢測區域顯示的信號強度在酶存在時下降了。
實施例4證明根據本發明檢測酶的存在或缺少的能力。最初，將硝化纖維素多孔膜(HF12002，Millipore，Inc.)的一端與纖維素性的燈芯材料襯墊(Millipore，Inc.)層疊起來。將鏈黴抗生物素蛋白(1毫克/毫升，Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.)成條紋狀施加到所述的膜上以形成第一檢測區域。通過使GoldlineTM膜(可從British Biocell International獲得的聚賴氨酸溶液)成條狀來形成第二檢測區域。將層狀卡片在37℃乾燥1小時，然後切成4毫米寬的測定裝置。
然後提供六個含有25微升實施例1中形成的「FCM-酪蛋白-B」(4毫克/毫升)樣品(指定為樣品1-6)。將每個樣品用不同數量的來自多粘芽胞桿菌的活性蛋白酶(20毫克/毫升)和可從Sigma-AIdrich Chemical Co.，Inc獲得的金屬酶培養15分鐘。具體地，樣品1-6中活性蛋白酶的數量分別為0.0、0.2、1.0、2.0、10.0和20.0微克。對於樣品1(對照樣品)，還加入20微克減活的蛋白酶(通過煮沸30分鐘得到的)。在培養之後，然後將2微升各混合物轉入含有40微升吐溫20(1％，Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.)的孔中。
然後將測定裝置樣品插入各自的孔中以開始所述試驗。在測定進行10分鐘之後，觀察各檢測區域的顏色強度。定性結果在下面的表1中顯示。
表1檢測區域的定性顏色強度
如所顯示的，由第一檢測區域顯示的信號強度在酶的存在下減小了，而由第二檢測區域顯示的信號強度在酶的存在下增大了。
實施例5證明根據本發明檢測酶的存在或缺少的能力。最初，將硝化纖維素多孔膜(HF12002，Millipore，Inc.)的一端與纖維素性的燈芯材料襯墊(Millipore，Inc.)層疊起來。將鏈黴抗生物素蛋白(1毫克/毫升，Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.)成條紋狀施加到所述的膜上以形成第一檢測區域。通過使GoldlineTM膜(可從British Biocell International獲得的聚賴氨酸溶液)成條狀來形成第二檢測區域。將層狀卡片在37℃乾燥1小時，然後切成4毫米寬的測定裝置。
然後提供六個含有50微克實施例2中形成的「BP-酪蛋白-B」的樣品(指定為樣品1-6)。將每個樣品用不同數量的來自多粘芽胞桿菌的活性蛋白酶(20毫克/毫升)和可從Sigma-AIdrich Chemical Co.，Inc獲得的金屬酶培養10分鐘。具體地，樣品1-6中活性蛋白酶的數量分別為0、5、10、20、40和200納克。對於樣品1(對照樣品)，還加入20微克減活蛋白酶(通過煮沸30分鐘得到的)。培養之後，然後將2微升各混合物轉入含有40微升吐溫20(1，Sigma-AldrichChemical Co.，Inc.)的孔中。
然後將測定裝置樣品插入各自的孔中以開始所述試驗。在測定進行10分鐘之後，使用反射率讀數器測定各檢測區域的反射率強度。定量結果在下面的表2中顯示。
表2檢測區域的定量顏色強度
如所顯示的，由第一檢測區域顯示的信號強度在酶的存在下減小了，而由第二檢測區域顯示的信號強度在酶的存在下增大了。並且，I2/I1的比值在酶的存在下增加了。
實施例6
證明根據本發明檢測酶的存在或缺少的能力。最初，將硝化纖維素多孔膜(HF 12002，Millipore，Inc.)的一端與纖維素性的燈芯材料襯墊(Millipore，Inc.)層疊起來。將兩個不同的鏈黴抗生物素蛋白線條(1毫克/毫升，Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.)成條紋狀施加到所述的膜上以形成第一檢測區域。通過使GoldlineTM膜(可從BritishBiocell International獲得的聚賴氨酸溶液)成條狀來形成第二檢測區域。將層狀卡片在37℃乾燥1小時，然後切成4毫米寬的測定裝置。
然後提供六個含有5微升實施例1中形成的「FCM-酪蛋白-B」(4毫克/毫升)的樣品(指定為樣品1-6)。將每個樣品用不同數量的來自多粘芽胞桿菌的活性蛋白酶(20毫克/毫升)和可從Sigma-AIdrich Chemical Co.，Inc獲得的金屬酶培養10分鐘。具體地，樣品1-6中活性蛋白酶的數量分別為0.0、0.1、0.2、1.0、2.0和10.0微克。對於樣品1(對照樣品)，還加入20微克減活蛋白酶(通過煮沸30分鐘得到的)。在培養之後，然後將2微升各混合物轉入含有40微升吐溫20(1，Sigma-Aldrich Chemical Co.，Inc.)的孔中。
然後將測定裝置樣品插入各自的孔中以開始所述試驗。在測定進行10分鐘之後，觀察各檢測區域的顏色強度。定性結果在下面的表3中顯示。
表3檢測區域的定性顏色強度
如所顯示的，由第一檢測區域的第一條線顯示的信號強度在酶的存在下減小了，而由第二檢測區域顯示的信號強度在酶的存在下增大了。雖然由第一檢測區域的第二條線顯示的信號強度在開始時增大了，但隨後在酶的存在下減小了。
雖然已經參照具體的實施方案詳細地描述了本發明，但是應該理解本領域的技術人員通過對上文的理解，可以容易地想到這些實施方案的變更、變化和同等的實施方案。因此，應將本發明的範圍確定為所附的權利要求和其任何同等物。
權利要求
1.一種用於檢測試驗樣品內的酶或其抑制劑的診斷試劑盒，所述試劑盒包括許多種反應性複合物，每種反應性複合物包括與報導分子和特異性結合構件連接的底物，所述底物可被酶裂解；以及限定第一檢測區域的層析介質，在該第一檢測區域內能夠俘獲所述的特異性結合構件，其中能夠在所述的第一檢測區域內產生第一檢測信號，其中從所述的第一檢測信號可確定酶或其抑制劑的存在或數量。
2.一種用於檢測試驗樣品內的酶或其抑制劑的方法，所述方法包括將試驗樣品與許多種反應性複合物接觸以形成培養混合物，所述的反應性複合物各自包括與報導分子和特異性結合構件連接的底物，其中所述的底物可被酶裂解以釋放出所述報導分子和所述特異性結合構件，所述報導分子能夠直接或間接地產生檢測信號；將所述培養混合物施加在層析介質上，所述的層析介質限定第一檢測區域，在該第一檢測區域內能夠俘獲所述的特異性結合構件；以及確定在所述第一檢測區域內的檢測信號的存在或強度。
3.權利要求1或2的診斷試驗試劑盒或方法，其中所述的酶是水解酶。
4.權利要求3的診斷試驗試劑盒或方法，其中所述的水解酶是蛋白酶或肽酶。
5.權利要求4的診斷試驗試劑盒或方法，其中所述的水解酶是絲氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、金屬蛋白酶、酸性蛋白酶或鹼性蛋白酶。
6.前述權利要求中任意一項的診斷試驗試劑盒或方法，其中所述的底物是蛋白質、糖蛋白、肽、核酸、碳水化合物、脂質、酯或其衍生物。
7.權利要求6的診斷試驗試劑盒或方法，其中所述的底物是酪蛋白、白蛋白、血紅蛋白、肌紅蛋白、角蛋白、明膠、胰島素、蛋白聚糖、纖連蛋白、層粘連蛋白、膠原、彈性蛋白或其衍生物。
8.前述權利要求中任意一項的診斷試驗試劑盒或方法，其中所述的報導分子包括能夠直接產生所述第一檢測信號的可檢測物質。
9.前述權利要求中任意一項的診斷試驗試劑盒或方法，其中所述的報導分子包括特異性結合構件。
10.權利要求9的診斷試驗試劑盒或方法，進一步地包括與特異性結合構件軛合的探針，所述探針還包括能夠直接產生所述的檢測信號的可檢測物質。
11.權利要求10的診斷試驗試劑盒或方法，其中所述探針的所述特異性結合構件對所述報導分子的所述特異性結合構件具有特異性的結合親和性。
12.權利要求10的診斷試驗試劑盒或方法，其中所述探針的所述特異性結合構件與所述報導分子的所述特異性結合構件相同或是所述報導分子的所述特異性結合構件的類似物。
13.前述權利要求中任意一項的診斷試驗試劑盒或方法，其中在所述的第一檢測區域內固定接收材料，所述第一檢測區域對所述的特異性結合構件具有親和性。
14.權利要求13的診斷試驗試劑盒或方法，其中所述接收材料的總數小於結合到所述反應性複合物的總數上所需要的數量。
15.權利要求13的診斷試驗試劑盒或方法，其中所述接收材料的總數等於或大於結合到所述反應性複合物的總數上所需要的數量。
16.前述權利要求中任意一項的診斷試驗試劑盒或方法，其中所述的層析介質進一步地包括第二檢測區域，在該第二檢測區域內能夠俘獲所述報導分子以產生第二檢測信號。
17.權利要求16的診斷試驗試劑盒或方法，其中在所述的第二檢測區域內固定第二接收材料，所述的第二接收材料對所述報導分子或其複合物具有親和性。
18.前述權利要求中任意一項的診斷試驗試劑盒或方法，其中在試驗樣品內酶的數量與所述第二檢測信號的強度成正比。
19.前述權利要求中任意一項的診斷試驗試劑盒或方法，其中在試驗樣品內酶的數量與所述第一檢測信號的強度成反比。
20.前述權利要求中任意一項的診斷試驗試劑盒或方法，其中在試驗樣品內酶抑制劑的數量與所述第一檢測信號的強度成正比。
全文摘要
提供一種用於檢測酶或酶抑制劑的存在或數量的診斷試驗試劑盒。所述診斷試劑盒利用反應性複合物來方便酶或酶抑制劑的檢測。所述反應性複合物包括與(例如，共價鍵合、物理吸附，等等)報導分子和特異性結合構件連接的底物。在一個實施方案中，例如，將肽、蛋白或糖蛋白底物連接到報導分子(例如染色的膠乳顆粒)和特異性結合構件(例如，生物素化的化合物)上。在這個實施方案中，底物為蛋白水解酶提供裂解目標。具體地，接觸反應性複合物時，蛋白水解酶裂解底物並釋放出報導分子和/或特異性結合構件。由釋放的報導分子所顯示的信號可用來指示試驗樣品內酶或酶抑制劑的存在或數量。
文檔編號G01N33/558GK1977167SQ200580022099
公開日2007年6月6日 申請日期2005年3月31日 優先權日2004年6月30日
發明者宋旭東 申請人:金伯利-克拉克環球有限公司