一種二甲氧基磷酸酯類農藥通用半抗原的合成方法

2023-06-06 03:38:41 3

專利名稱：一種二甲氧基磷酸酯類農藥通用半抗原的合成方法
技術領域：
一種二甲氧基磷酸酯類農藥通用半抗原的合成方法，屬於生物化工技術領域。
背景技術：
有機磷農藥的基本化學結構為
二甲氧基磷酸酯是R和RZ均為甲基、Y為氧的一種結構，針對具有這種結 構的一類農藥來合成通用半抗原O， O-二甲基-O- (4-丙酸基苯基)磷酸酯。有 機磷農藥由於其殺蟲廣譜，藥效高，在我國的農業生產實踐中得到了廣泛的應 用，由於其使用量大，應用面廣，在環境保護和食品安全方面受到了普遍關注。 免疫檢測方法在農藥殘留檢測上的發展非常迅速，目前已經有十幾種常用的有 機磷農藥建立了免疫檢測方法，但都是針對一種農藥。而進出口貿易中，對一 種產品往往規定若干個農藥殘留標準，再加上農藥的混配生產和使用劇增，因 此開展農藥的多殘留免疫分析具有更新的現實意義。多殘留免疫分析的原理就 是針對一組或一類化合物的共性結構特徵來設計和合成半抗原，從而得到對於 特定的一組或一類化合物都具有識別和檢測能力的抗體，即具有寬譜特異性 (broad specificity)，這種抗體有望用於某一類化合物的多殘留ELISA分析。對 於有機磷農藥的多殘留ELISA研究，國內外都進行了一些嘗試，但到目前為止， 對於久效磷、磷胺、速滅磷、百治磷、敵敵畏等幾種高毒磷酸酯類農藥國內外 尚未見其多殘留分析研究的報導。而合成針對該類物質的通用半抗原是建立多 殘留免疫分析的前提。

發明內容
本發明的目的是合成一種針對二甲氧基磷酸酯類農藥的通用半抗原，該物 質與蛋白偶聯之後可以作為此類農藥酶聯免疫檢測過程中的包被抗原，利用包 被抗原與免疫原結構上的差異來進一步提高檢測靈敏度，降低檢測限。
本發明的技術方案 一種二甲氧基磷酸酯類農藥通用半抗原的合成方法， 合成過程分酯化、醯化、水解三個步驟，首先將對羥基苯丙酸與甲醇發生酯化 反應，使羧基甲酯化；然後所得的對羥基苯丙酸甲酯再與二甲氧基磷醯氯反應， 得到二甲氧基磷酸酯；最後是將第一步酯化形成的甲酯再水解，將羧基還原出 來得O， O-二甲基-O- (4-丙酸基苯基)磷酸酯；此磷酸酯與卵清蛋白偶聯，作 為二甲氧基磷酸酯類農藥多殘留ELISA分析的包被抗原；第一步以對羥基苯丙
酸為原料進行甲酯化先將羧基保護；第二步是用前一步的產物對羥基苯丙酸甲
酯與二甲氧基磷醯氯發生醯化，形成磷酸酯；第三步是將甲酯水解羧基脫保護。 其反應方程式為
HO-
-CH2CH2COOH
CH30H 濃硫酸
120'C回流2h
ho'
(ch2)2cooch3
合成步驟為 O)酯化
在50mL燒瓶中加入對羥基苯丙酸3.5g和甲醇14mL，對羥基苯丙酸與甲醇 的質量/體積比為1 : 4，和加lmL濃硫酸，120'C加熱回流2h，之後先蒸出5mL 的甲醇，加入碳酸鈉飽和溶液直到無氣體產生；然後用二氯甲烷萃取，萃取液 經35'C旋轉蒸發除去溶劑，再真空乾燥得的紅棕色油狀物對羥基苯丙酸甲酯， 純度達99%以上。 (2)醯化
在50mL的圓底燒瓶中加入10 15mL乙腈作溶劑，加入第一步產物對羥基 苯丙酸甲酯和二甲氧基磷醯氯，兩者為等摩爾配比，對羥基苯丙酸甲酯lOmmol、 二甲氧基磷醯氯10mmo1、 2.5g碳酸鉀，常溫下磁力攪拌2h，反應過程中不斷用 薄層層析監測反應進度，直到醯氯完全反應；然後靜置一段時間，上層液體再 經0.5pm的濾膜過濾得澄清液體，旋轉蒸發將溶劑除去後得黃色油狀物，再經 矽膠柱色譜分離得到目標產物二甲氧基磷酸酯，純度大於90%;
分離過程
①展開劑的選擇取一塊2cmx5cm大小的矽膠板，在距矽膠板下邊緣0.8cm 處用鉛筆作一水平線。將樣品溶於甲醇配成1%左右的溶液，用內徑lmm管口 平齊的毛細管點樣，垂直輕輕地點在起始線上，吹乾。然後將薄板放入層析液 中層析，層析液是石油醚/乙酸乙酯=7 : 3(v/v)，當溶劑前沿距薄板上邊緣0.8cm
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時將板取出，吹乾。將薄板放入紫外分析儀中觀察，可發現板上有兩個點，其
中上方的點為過量的對羥基苯丙酸甲酯Rf=0.647、下方的點為目標物其 Rf=0.162。
② 裝柱將2cmx30cm的空柱洗淨乾燥，垂直固定在鐵架上，在柱底鋪一 層脫脂棉，再在上面覆蓋一層厚0.5 lcm的石英砂。按溼法裝柱裝入約2/3高 度的矽膠，再在上方蓋一層0.5 lcm的石英砂。
③ 加樣及洗脫將配成適當濃度的樣品沿管壁加入色譜柱，並用少量溶劑 洗滌柱壁上所沾的樣品。加樣完畢後，首先用石油醚/乙酸乙酯=7 : 3 (v/v)的 洗脫液進行洗脫，收集過程中通過在矽膠板上不斷的點樣來確定分離組分的流 出。當過量的對羥基苯丙酸甲酯全部被洗脫下來之後，換用乙酸乙酯進行洗脫， 並收集目標產物。
(3)水解
在20mL的乙醇溶液中加入lmmol純化後的第二步產物二甲氧基磷酸酯， 然後加入7mLlM的氫氧化鉀，室溫下攪拌45min，然後用1M的鹽酸酸化，再 用乙酸乙酯來萃取，萃取液經旋轉蒸發除去溶劑得淺黃色油狀物，再經矽膠柱 色譜分離，得到最終目標產物0， O-二甲基-O- (4-丙酸基苯基)磷酸酯，純度 大於97%。
分析經LC-MS分析得到的產物不純，含有一種主要雜質。需要過矽膠柱 進行分離。
分離過程
1. 分離條件選擇取一塊2cmx5cm大小的矽膠板，在距矽膠板下邊緣0.8cm 處用鉛筆作一水平線。將所得樣品溶於甲醇配成1%左右的溶液，用內徑lmm 管口平齊的毛細管點樣，垂直輕輕地點在起始線上，吹乾。然後將薄板放入層 析液中層析，層析液是氯仿/乙酸乙酯/乙酸=65 : 35 : 1 (v/v/v)，當溶劑前沿距 薄板上邊緣0.8cm時將板取出，吹乾。將薄板放入紫外分析儀中觀察，可發現 板上有兩個點，其中上方的點RfN).428、下方的點R—0.328。
2. 裝柱同上(略)。
3. 加樣及洗脫將配成適當濃度的樣品沿管壁加入色譜柱，並用少量溶劑洗 滌柱壁上所沾的樣品。加樣完畢後，用氯仿/乙酸乙酯/乙酸=65 : 35 : 1 (v/v/v) 的洗脫液進行洗脫，收集過程中通過不斷的點樣確定分離組分的流出，將兩種 物質分離開來，並收集。
經LC-MS測試，確定下方的點Rf=0.328為要合成的目標物0， O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯。
本發明的有益效果該物質與蛋白偶聯之後可以作為此類農藥酶聯免疫檢 測過程中的包被抗原，因為此結構中含有苯環，利用包被抗原與免疫原結構上
的差異來進一步提高檢測靈敏度，降低檢測限。


圖l O， O-二甲基-O- (4-丙酸基苯基)磷酸酯的液相色譜圖。 圖2 O， O-二甲基-O- (4-丙酸基苯基)磷酸酯的質譜圖。
具體實施例方式
(1) 酯化
在50mL燒瓶中加入對羥基苯丙酸3.5g (21mmo1 )、 14mL甲醇和lmL濃 硫酸，12(TC加熱回流2h。之後先蒸出5mL左右的甲醇，加入碳酸鈉飽和溶液 直到無氣體產生。然後用二氯甲烷萃取，萃取液經35'C旋轉蒸發除去溶劑，再 真空乾燥得的紅棕色油狀物，此產物純度達99°/。以上。
(2) 醯化
在50mL的圓底燒瓶中加入10 15mL乙腈作溶劑，加入第一步產物對羥基 苯丙酸甲酯1.9280g (10mmoL)、 二甲氧基磷醯氯10mmoL、 2.5g碳酸鉀，常溫 下磁力攪拌大約2h，反應過程中不斷用TLC監測反應進度，直到醯氯完全反應。 然後靜置一段時間，上層液體再經0.5pm的濾膜過濾得澄清液體。將溶劑旋轉 蒸發掉後得黃色油狀物。
分離純化將2cmx30cm的空柱洗淨乾燥，垂直固定在鐵架上，在柱底鋪 一層脫脂棉，再在上面覆蓋一層厚0.5 lcm的石英砂。按溼法裝柱裝入約2/3 高度的矽膠，再在上方蓋一層0.5 lcm的石英砂。將配成適當濃度的樣品，沿 管壁加入色譜柱，並用少量溶劑洗滌柱壁上所沾的樣品。加樣完畢後，首先用 石油醚/乙酸乙酯=7 : 3 (v/v)的洗脫液進行洗脫，收集過程中通過不斷的點樣 確定分離組分的流出。當過量的對羥基苯丙酸甲酯全部被洗脫下來之後，換用 乙酸乙酯進行洗脫，並收集目標產物。
(3) 水解
在20mL的乙醇溶液中加入0.288g (lmmoL)純化後的第二步產物，然後 加入7mLlM的氫氧化鉀，室溫下攪拌45min，然後用1M的鹽酸酸化，再用乙 酸乙酯來萃取，萃取液經旋轉蒸發除去溶劑得淺黃色油狀物。
分離純化溼法裝柱之後，加樣、用氯仿/乙酸乙酯/乙酸=65 : 35 : 1 (v/v/v) 的洗脫液進行洗脫，收集目標組分物。
權利要求
1、一種二甲氧基磷酸酯類農藥通用半抗原的合成方法，其特徵是合成過程分酯化、醯化、水解三個步驟，首先將對羥基苯丙酸與甲醇發生酯化反應，使羧基甲酯化；然後所得的對羥基苯丙酸甲酯再與二甲氧基磷醯氯反應，得到二甲氧基磷酸酯；最後是將第一步酯化形成的甲酯再水解，將羧基還原出來得O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯；此磷酸酯與卵清蛋白偶聯，作為二甲氧基磷酸酯類農藥多殘留ELISA分析的包被抗原；合成步驟為(1)酯化在50mL燒瓶中加入對羥基苯丙酸3.5g和甲醇14mL，對羥基苯丙酸與甲醇的質量/體積比為1∶4，和加1mL濃硫酸，120℃加熱回流2h，之後先蒸出5mL的甲醇，加入碳酸鈉飽和溶液直到無氣體產生；然後用二氯甲烷萃取，萃取液經35℃旋轉蒸發除去溶劑，再真空乾燥得的紅棕色油狀物對羥基苯丙酸甲酯，純度達99％以上；(2)醯化在50mL的圓底燒瓶中加入10～15mL乙腈作溶劑，加入第一步產物對羥基苯丙酸甲酯和二甲氧基磷醯氯，兩者為等摩爾配比，對羥基苯丙酸甲酯10mmol、二甲氧基磷醯氯10mmol、2.5g碳酸鉀，常溫下磁力攪拌2h，反應過程中不斷用薄層層析監測反應進度，直到醯氯完全反應；然後靜置一段時間，上層液體再經0.5μm的濾膜過濾得澄清液體，旋轉蒸發將溶劑除去後得黃色油狀物，再經矽膠柱色譜分離得到目標產物二甲氧基磷酸酯，純度大於90％；(3)水解在20mL的乙醇溶液中加入1mmol純化後的第二步產物二甲氧基磷酸酯，然後加入7mL 1M的氫氧化鉀，室溫下攪拌45min，然後用1M的鹽酸酸化，再用乙酸乙酯來萃取，萃取液經旋轉蒸發除去溶劑得淺黃色油狀物，再經矽膠柱色譜分離，得到最終目標產物O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯，純度大幹97％。
全文摘要
一種二甲氧基磷酸酯類農藥通用半抗原的合成方法，屬於生物化工技術領域。本發明的合成過程分酯化、醯化、水解三個步驟，首先將對羥基苯丙酸與甲醇發生酯化反應，使羧基甲酯化；然後所得的對羥基苯丙酸甲酯再與二甲氧基磷醯氯反應，得到二甲氧基磷酸酯；最後是將第一步酯化形成的甲酯再水解，將羧基還原出來得O，O-二甲基-O-(4-丙酸基苯基)磷酸酯；此磷酸酯與卵清蛋白偶聯，作為二甲氧基磷酸酯類農藥多殘留ELISA分析的包被抗原。該物質與蛋白偶聯之後作為此類農藥酶聯免疫檢測過程中的包被抗原，因為此結構中含有苯環，利用包被抗原與免疫原結構上的差異來進一步提高檢測靈敏度，降低檢測限。
文檔編號C07F9/12GK101172984SQ200710134520
公開日2008年5月7日 申請日期2007年10月31日 優先權日2007年10月31日
發明者尹麗梅, 彭池方, 李雅麗, 昉 秦, 胥傳來, 媛 袁, 偉 陳, 陶冠軍 申請人:江南大學