同步檢測肝炎、愛滋病毒和梅毒螺旋體核酸的試劑盒的製作方法

2023-06-06 03:31:16 2

專利名稱：同步檢測肝炎、愛滋病毒和梅毒螺旋體核酸的試劑盒的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因診斷試劑盒，具體涉及一種靈敏度高、特異性強、適合於常規血液安全核酸篩査的同步提取和同步實時檢測肝炎(包括B型肝炎和C型肝炎)、愛滋病毒以及梅毒螺旋體核酸的試劑盒。
背景技術：
愛滋病、C型肝炎、B型肝炎以及梅毒都是通過血液傳播的重大傳染性疾病，輸血一直是上述疾病的主要傳播途徑之一。我國第一例臨床報導的愛滋病病人就是通過輸入不健康血液製品感染愛滋病毒的。世界衛生組織最新統計顯示，全球每年有近百萬人因輸入不健康血液或血液製品感染愛滋病、病毒型肝炎等傳染病；每年新增的愛滋病病毒攜帶者中，有5%至10%是經輸血或血液製品感染。由於目前尚沒有針對愛滋病和慢性B型肝炎和C型肝炎的有效根治手段，梅毒雖然在感染早期能夠通過抗生素治療，但若診斷不及時也會造成神經梅毒等器質性病變，因而預防這幾種重大傳染性疾病的傳播顯得非常重要。
衛生部和國家藥品監督管理局要求單採漿站和生物製品企業必須依據《血液製品管理條例》、《單採血漿站基本標準》、《藥品生產質量管理規範》和《中國生物製品規程》採集原料血漿和生產血液製品。原料血漿必須經兩種不同的ELISA試劑初檢、復檢抗-HIV、抗-HCV、 HBsAg、梅毒和ALT合格後，方可用於生產。也就是說，為保障血液安全，必須進行愛滋、C肝、B肝病毒以及梅毒螺旋體四種病原的檢測。因為愛滋病、C型肝炎、B型肝炎以及梅毒都是通過血液傳播的重大傳染性疾病，輸血一直是上述疾病的主要傳染途徑之一。我國是臨床用血大國，據國家衛生行政部門初步統計，2007年全國各主要血站採集的血液樣本超過800多萬份，為2百多萬病人提供了輸血治療。另外我國每年血液製品(如人血白蛋白，靜注丙種球蛋白等)生產所需的人血漿在3000噸，約需採集500多萬
4人份的人血漿，血源的質量安全至關重要。但到目前為止，國內仍主要通過酶聯免疫法產品來進行血液的篩査。免疫學診斷法儘管隨著第三代單克隆診斷抗體的出現，提高了檢測的靈敏度，並在一定程度上減少了血源傳播病毒性疾病的機率；但由於受免疫學診斷方法的限制，依然不能完全杜絕陽性病毒血樣(血漿)的漏檢，其主要原因在於免疫學診斷主要依賴抗原/抗體的免疫反應，而病毒感染機體後，機體產生可供檢出的抗體滴度需要一段相對較長的時間；另外，由於個體免疫應
答的不同,其中有少數感染者感染病毒後機體所產生的抗體滴度很低,很難用免疫學方法檢測出來,甚至有些人無免疫應答反應，不產生抗體。因此，免疫學診斷方法不能檢測出處於"窗口期"和新近感染病毒的獻血員，勢必造成漏檢。因而無法確保用血的安全，每年各地都會發生相當數量因輸血和使用血液製品而導致感染的病例，血液安全的快速確認檢測是避免這幾種重大傳染性疾病的經血液傳播的行之有效的手段，但由於目前使用血液安全檢測技術有一定缺陷，存在較大的漏檢隱患，必須研究新的先進的血液安全替代檢測方法。
國外研究證實，採用核酸檢測方法(NAT)後，HBV、 HCV、 HIV病毒的窗口期較抗體檢測分別提前9天、25天和14天。目前歐美血液製品生產企業已普遍採用NAT篩査血漿，冊0生物標準化委員會也有專門會議討論並認定NAT在血液和血液製品病毒安全性檢測方面的使用，迄今為止正式通過美國FDA認證可用於血液篩檢的試劑僅有2種，即Roche C0BAS AmpliScreen HBV/HCV/ HIV和Chiron Procleix TMAHIV21/HCV檢測系統，FDA評判這些試劑是否能用於血液篩檢的標準之一為必須對50 cp/ ml的病毒核酸的檢出率〉95 %。
然而，儘管NAT方法在保障血液安全方面的優勢顯而易見，到目前為止，國內還沒有推廣和普及該項技術。並且，國外的情況並不完全適用於國內，國外的NAT方法針對的病源主要是HIV、 HBV、 HCV三種病毒，這三種病毒是影響國外血液安全的最大禍患；國內的情況是除了這三種病毒外，必須進行梅毒檢測，因為隨著改革開放和國內性觀念的變化，梅毒的發病率呈上升趨勢，也是影響血液安全的罪魁禍首。目前，儘管國外已研製和開發了針對三種病毒的NAT方法和試劑，也有企業正在報批相關產品，但國內外都還沒有針對這四種病原體核酸同步定量檢測的技術和產品。因此，開展血液安全高通量的多重(四重)PCR核酸檢測方法
(MNAT)對有效防止輸血感染、保障血液安全有著十分重要和實際的意義。本發
5明及其產品的推廣應用將會極大地提供我國血液安全檢測的技術水平，從傳染源 頭上減少和控制愛滋、肝炎等重大傳染病的傳播，必將產生無可估量的經濟和社 會效益。

發明內容
本發明的目的就在於克服現有技術存在的缺點和不足，提供一種同步檢測 肝炎、愛滋病毒和梅毒螺旋體核酸的試劑盒(簡稱本試劑盒)。 本發明的目的是這樣實現的
本試劑盒是一種多重螢光定量PCR檢測試劑盒，包括
1) 病原體濃縮液和DNA、 RNA核酸同步提取液
所述的病原體濃縮液是基於有機絮凝沉澱原理使用濃度為20%PEG6000的生 理鹽水溶液對病原體進行濃縮；
所述的DNA、 RNA同步提取液由終濃度為4 mol/L異硫氰酸胍，0. 5%十二垸 基肌氨酸鈉，0.1腿ol/L 3巰基乙醇，25 mmol/L檸檬酸鈉，0.20 g/L糖原組 成，其優點是既避免了漏檢又不會干擾後續的螢光定量PCR檢測，以此作為對 《以Taq酶對DNA和RNA病原進行同步PCR檢測的方法》專利技術(專利號ZL 01133528. 9)中血清中提取病原體核酸方法的補充。
2) 含有四種病原體檢測序列的陽性質粒
四種病原體包括B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、愛滋病毒以及梅毒螺旋體。 陽性質粒含有這四種病原體PCR檢測擴增片段的所有序列，其構建方法如下
a) 利用T載體pTA-2構建分別含有四種病原體擴增片段的質粒(pT-HBV， pT-HCV， pT-HIV， pT-TP);
b) 利用pTA-2(見附圖l)多克隆位點兩邊最接近連接的擴增片段處都含有 EcoR I酶切位點，利用EcoR I酶單酶切回收得到分別含有四段酶切片段的小 片段；
c) 將含有HIV、 HCV、 HBV和TP的小片段兩兩之間進行酶連(HIV與HCV， HBV與TP)，再分別以IR， 5， - GCA GCT TCC TCA TTG ATG GTC TC-3，
(SEQ. ID.NO. 2)和CR:5， - CCT GGC AAT TCC GGT GTA CTC -3， ( SEQ. ID. NO. 5)， BF: 5， - GCG GCG TTT TAT CAT CTT CCT C —3， ( SEQ. ID. NO. 7)和TR: 5，-TCT TGC ACA CAA GCA CGA TAT TG_3， ( SEQ.ID.NO.il)為上下遊引物，用上海申能博彩公司的Taq plus DNA聚合酶(高保真，擴增產物帶有A尾)分別 對HIV&HCV,朋V&TP小片段的酶連產物進行特異性PCR擴增(分別用引物IR&CR 和BF&TR)放大並分別進行回收；
d) 將回收的片段分別與pTA-2載體進行連接，測序並將形成的質粒分別轉 化到大腸桿菌Top IO細胞中；
e) 利用pTA-2載體多克隆位點僅僅含有一個Pst I酶酶切位點且緊挨其中一 個EcoR I酶切位點，對兩種分別含有兩種病原體擴增片段的質粒進行Pst I單 酶切，並對形成的直鏈DNA片段進行回收；
f) 將這兩段DNA片段進行連接，根據測序結果分別以BF&IR為上下遊引物， 用上海申能博彩公司的Taq plus DNA聚合酶(高保真，擴增產物帶有A尾)對 酶連產物進行特異性擴增放大並分別進行回收；
g) 將回收的片段與T載體PTA-2進行連接，測序，即得到含四種病原體PCR 檢測擴增片段的所有序列的陽性質粒pT-multy (序列見附圖2)。因為每段病原 體檢測擴增片段兩邊都是EcoR I酶切位點，故在使用前很容易被NEB的EcoR I快速酶(濃度為20， 000U/ml室溫或者37"C下5分鐘)進行單酶切切成分別 含有一種病原體擴增序列的小片段(因帶有酶切位點，其長度又大於擴增片段)， 不但更貼切實際應用時的模板形態，也避免了質粒作為標準品時容易形成氣溶 膠而引起的實驗室大面積假陽性汙染現象。
3) —步法單管單酶多項聯合檢測的TaqMan PCR擴增體系 一步法單管單酶多項聯合檢測的TaqMan PCR擴增體系基於TaqMan探針和 Taq酶自身具有逆轉錄活性的DNA和RNA核酸同步擴增的方法，其特點是使用單 管的單酶體系試劑，多項檢測的項目既含DNA，又含RNA,既有病毒也有螺旋體， 所選用的抗汙染體系為經典的UNG-dUTP系統，主要適用於血液篩查，。所使用 基於專利《以Taq酶對DNA和RNA病原進行同步PCR檢測的方法》(專利號ZL 01133528.9)的技術，不需要逆轉錄酶，無專門的逆轉錄過程。常規檢測RNA 病原體時候都是使用逆轉錄酶和熱啟動DNA酶的雙酶體系，而逆轉錄酶不耐熱， RT溫度最優為45-55。C，而在此溫度下，常規的基因工程製備的UNG (如目前市 售的絕大多數的UNG)具有降解逆轉錄出來的含U的DNA (稱為U-DNA)，故同步 檢測DNA和RNA病原體核酸時不能使用抗汙染的UNG-dUTP經典系統。我們發明 的一個突出特點就是無需專門的逆轉錄酶和逆轉錄過程，故可以如同普通的DNA病原體檢測螢光定量試劑盒一樣使用抗汙染的UNG-dUTP經典系統。經檢索國內 有一家公司使用雙酶單管RT-PCR體系引入抗汙染方案並且能成功用於多項對靈 敏度有要求的同步檢測(既有DNA又有RNA)，但使用的是不耐熱的UNG，因其 市場使用率不高，價格相對昂貴。而使用單酶體系(比如日本羅氏公司關於自 動化多項Z05酶單酶單管RT-PCR TaqMan體系用於血篩的初步應用報導)，不但 價格昂貴，且一般單酶體系為公司專利所有，難以推廣應用。現有的雙酶和單 酶體系不是價格昂貴就是生產和使用步驟繁瑣，使用本發明的方法不但可以降 低試劑盒的成本還能簡化生產的步驟。本發明的同步多項檢測試劑最突出的優 點在於該檢測試劑的優秀的靈敏度和其特異性及在中國甚至亞太出現的各亞型 的覆蓋率(在NCBI上對迄今為止所有中國源的病原體序列進行比對，選取檢測 的探針序列與95%以上的病原體核酸序列完全匹配)並且不同亞型擴增效率近似 等效。
所述引物査看有關愛滋、C肝B肝病毒和梅毒病原體國內外文獻，確定 以gag基因作為愛滋病毒的螢光定量PCR檢測靶點，IF: 5' -TCA GCC CAG AAG TAA TAC CCA TG -3， (SEQ. ID. NO. 1)， IR: 5， - GCA GCT TCC TCA TTG ATG GTC TC-3' (SEQ. ID. NO. 2)。 5' UTR序列作為C肝病毒的螢光定量PCR檢測靶點， CF: 5' - CAT GGC GTT AGT ATG AGT GTC G-3' ( SEQ. ID. NO. 4)， CR: 5， - CCT GGC AAT TCC GGT GTA CTC -3， ( SEQ. ID. NO. 5)。 Pre-S基因作為B肝病毒的 螢光定量PCR檢測耙點，BF: 5， - GCG GCG TTT TAT CAT CTT CCT C -3，
(SEQ. ID. NO. 7)， BR: 5， - AGG ACA AAC GGG CAA CAT ACC-3， ( SEQ. ID. NO. 8)。 以polA基因作為梅毒(TP)的螢光定量PCR檢測耙點，TF: 5， - TGC GTG ACG ATG TAC CAT GTG -3， ( SEQ. ID. NO. 10)， TR: 5' - TCT TGC ACA CAA GCA CGA TAT TG-3' ( SEQ. ID羞11)。
所述探針為TaqMan探針，分別由不同的螢光基因標記或相同的螢光基因標 記，但是至少用於校正加樣誤差內標的螢光基團不能同於檢測探針的螢光基團
(若使用Bio-Rad公司的Bio-rad chromo4四通道實時定量PCR儀以及升級產 品或者CFX96 Real-Time PCR Detection System具有獨特的開放性加樣誤差 校正技術，不依賴於用於校正加樣誤差內標的螢光基團，避免人為加樣誤差， 保證定量結果的準確性，可以考慮省略作為內標的螢光基團，但不推崇)，而優 選的TaqMan探針為3端為非螢光淬滅基團的TaqMan探針，如BHQ或者Eclipse等。本發明中採用的探針序列為HIV探針為5， J0E(VIC/CY-3)-AGCATTATC AGA AGG AGC CAC CCC ACA AG-Eclipse3， ( SEQ. ID. NO. 3); HCV探針為 5， FAM-CCG GTT CCG CAG ACC ACT ATG GCT-Eclipse3， ( SEQ. ID. NO. 6); HBV 探針為5' TAMARA-AGGACAAACGGGCAACATACC-Eclipse3， ( SEQ. ID.N0.9); 梅毒(TP)探針為5， CY-5- TCG CTC GAA GAT TCC TGT TGT ATT CCG CT -Eclipse3， (SEQ. ID. NO. 12)，內標校正基團選用的是ROX。上述探針標記的發光基團參考 的是ABI 7500螢光定量PCR儀的螢光檢測通道，由於使用不同型號的儀器所標 記的探針發光基團可以進行微調。如果不需要確定所檢測的樣品中含有具體哪 一種病原體核酸，而是僅僅依據有無對樣品進行合格不合格鑑定，可以對4種 病原體的探針標記相同的發光基團。
螢光定量PCR反應液包含lOxPCR buffer (含有MgS04 20. Ommol/L) 5. 0 U 1, 25mmol/L MgCl2 3.0ul， 1Ommol/L dNTPs mix (each) l.Oyl， lOumol/L 的HIV、 HCV、 HBV、 TP上下遊引物各為2. 0、 2.25、 1.75、 2. Oul， lOumol/L 的HIV、 HCV、 HBV、 TP的探針分別為0. 9、 0. 8、 0. 85、 0. 95 u 1， 5U/ u 1 Taq DNA 聚合酶0. 5 P 1，加入ROX染料後用雙蒸水補充體積使反應液總體積為30 y 1。
綜上所述，本發明在於提出一種測定HBV，HCV,HIV病毒以及梅毒螺旋體核 酸的試劑盒，包括同步提取HBV，HCV，HIV病毒以及梅毒螺旋體核酸的濃縮和提 取試劑，其中含有病原體濃縮液、異硫氰酸胍一步法DNA、 RNA同步提取液，和 HBV，HCV，HIV病毒以及梅毒螺旋體核酸擴增試劑，其中含有螢光定量反應液、探 針、Taq酶、陽性對照等。匹配儀器可使用美國ABI公司的ABI7500螢光定量 PCR儀、Bio-Rad公司的Bio-rad chromo4四通道實時定量PCR儀或CFX96 Real-Time PCR Detection System、 Roche的LightCycler 480及以上級別定量 PCR儀等，但不局限於這些。本試劑盒優秀的品質很大程度上取決於所選用的 HBV, HCV， HIV病毒以及梅毒螺旋體的引物和TaqMan探針序列。因此，本試劑盒 所公布的引物、探針、陽性質粒中含四種病原體PCR檢測擴增片段的序列以及 起互補序列毫無疑問應當受到所申請要求的權利保護之內。
本試劑盒的工作原理
本發明提供的同步擴增檢測肝炎、愛滋病毒以及梅毒螺旋體核酸的螢光定 量PCR試劑盒中，有標記了螢光基團的特異性螢光探針，在探針完整時，兩基 團在空間結構上距離相互靠近，5'端報告基團產生的螢光因為螢光共振能量轉
9移(FRET)而被3'端非螢光淬滅基團淬滅，故體系中沒有螢光信號的變化且本 底低。在PCR退火和延伸過程中，探針與模板特異性結合，隨著引物的延伸， TaqDNA聚合酶利用其5'端到3'端外切活性對探針進行切割釋放出報告基團， 這樣破壞了兩基團之間的螢光共振能量轉移(FRET)，報告基團所釋放的螢光可 以被內置在定量檢測儀內的螢光計檢測，螢光量的增加與PCR產物的積累量呈 比例關係。對肝炎、愛滋病毒以及梅毒螺旋體的定量可通過與標準品的循環域 值(Ct， Threshold Cycle)相比較得出。Ct值是PCR過程中，螢光量的積累超 過基底螢光量的循環個數，Ct值與起始模板數呈一定比例關係，Ct值越小，起 始模板數越多，相反，Ct值越大，起始模板數越少。利用陽性梯度標準模板的 Ct值製成標準曲線，再根據待測樣品的Ct值可準確測出該樣品的起始拷貝數。 在本發明提供的同步擴增檢測乙型、C型肝炎、愛滋病毒及梅毒螺旋體核 酸的螢光定量PCR試劑盒中，針對乙型、C型肝炎、愛滋病毒以及梅毒螺旋體 檢測中的特殊性，對不同的靶片段進行反應體系，如引物和探針濃度、Mg2+濃度、 退火溫度等的優化，並將螢光定量PCR技術和定量檢測系統相結合，將其用於 乙型、C型肝炎、愛滋病毒以及梅毒螺旋體同步定量檢測。通過優化方案，反 複試驗，建立了同步檢測乙型、C型肝炎、愛滋病毒以及梅毒螺旋體螢光定量 PCR方法，並研製出同步檢測肝炎、愛滋病毒以及梅毒螺旋體螢光定量PCR試劑 盒，可以滿足快速同步診斷乙型、C型肝炎、愛滋病毒以及梅毒螺旋體的要求。
本試劑盒需配合螢光定量PCR儀使用。 本試劑盒的使用方法包括下列步驟
a) 對濃度為1(T拷貝/ P 1標準陽性模板進行10倍的系列稀釋，製備陽性標
準品，用紫外分光光度計測定A260對標準品定量；
b) 用DNA、 RNA同步提取的方法或者基於專利《以Taq酶對DNA和RNA病原
進行同步PCR檢測的方法》(專利號ZL 01133528.9)中血清中提取病原體核酸 方法從待測標本中提取核酸；
c) 分別取b)步中的核酸和同樣量的系列稀釋的a)步中的兩種陽性標準品加 入到含有Taq DNA聚合酶和螢光定量反應液的PCR反應體系中用螢光定量PCR 儀進行PCR檢測；
d) 通過比較待測樣品和相應標準品的循環域值Ct值，對待測樣品的起始拷 貝數進行定量。本試劑盒的功能
我國愛滋病毒攜帶者超過100萬人，B肝病毒攜帶者1.2億人、C肝病毒 攜帶者4000萬人。由於目前尚沒有針對愛滋病和慢性B型肝炎和C型肝炎的有 效根治手段，預防這幾種重大傳染性疾病的傳播顯得非常重要。梅毒在感染早 期雖然能夠治療，但由於早期症狀較輕，不易發現，目前一般情況下，很少人 主動進行梅毒檢測，到了晚期造成器質性損傷特別是神經損傷後很難治癒和恢 復。由於這幾種重大傳染源都是經血傳播，故血液安全的快速確認檢測是避免 這幾種重大傳染性疾病的經血液傳播的行之有效的手段。本試劑盒是血液安全 檢測領域的升級產品，可對乙型、C型肝炎、愛滋病毒及梅毒螺旋體進行同步 定量檢測，可檢出標本中極微量的核酸，在病毒感染後數天即能檢出，大大縮短 "窗口期"，儘管從理論上並不能完全消除感染"窗口期"，但病毒核酸轉陽之 前的血液傳染性極低，可以有效地預防經輸血傳播病毒性疾病，使輸血傳播疾病 的危險性降到最低。
本發明與現有技術相比具有以下優點和效果
工、病毒和螺旋體兩種病原體，DNA、 RNA兩種核酸同步提取，同步實時檢測，
並且提供了一種濃縮液，可以富集體液中的病毒；
2、 整個流程時間短，能效高，96個測試僅僅3個小時就快速完成並報告可
信度極高的結果；
3、 操作簡單，封閉性檢測，避免了可能的汙染和人為誤差；
4、 靈敏度高(每個體系最低檢測限達到l拷貝)；
5、 適用於大規模高通量的血液篩查，如血液中心和生物製品生產企業開展 核酸篩査，也可適用於大容量高效率的臨床核酸檢驗。
本試劑盒用途驗證
美國羅氏分子系統公司開發出商業化檢測外周血單核細胞，血漿，或其它體 液中數種病毒的檢測及量化的分析方法Roche COBAS AmpliScreen HBV/HCV/ HIV， 與核酸提取儀聯用其靈敏度可以達到檢測被處理樣品中廣100個靶DNA或RNA分 子，而本試劑盒在基於長期工作積累和擁有發明專利基礎上，其靈敏度達到了每 ml樣品20個耙DNA或RNA分子，重複性達到95%，且沒有運用核酸提取儀。試 劑盒中四種檢測探針和引物都可以單獨組成針對一種病原體(HCV, HIV， HBV, TP) 的檢測試劑盒，組裝成四重螢光定量試劑盒後分別檢測四種病原體(100人份單獨血樣)，比單一檢測試劑盒檢測時檢測20拷貝/ml時的Ct值分別延後 1.67,0.85， 0.92和1.08。


圖1是pTA2 Vector序列信息；
圖2是標準陽性模板中連接進pTA2 Vector載體的序列。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
應當理解，這些實施實例僅用於說明本發明而不用於限制本發明要求保護
的範圍，下列實施例中未註明具體實驗條件和方法，通常按照常規條件如J.
薩姆布魯克等主編，科學出版社，1992，分子克隆實驗指南(第二版)D.L.斯 佩克特等，科學出版社，2001，細胞實驗指南呂鴻聲，科學出版社，1982，或 按照製造廠商所建議的條件。
一、實施例1:試劑盒組成與配製
1、 病原體濃縮液與DNA、脂A同步提取液
為自己配製，病原體濃縮液PEG6000體積分數為20%的生理鹽水溶液。DNA、 RNA同步提取液終濃度為4mol/L異硫氰酸胍，體積分數為0. 5%十二垸基肌氨 酸鈉，0.1腿ol/L e巰基乙醇，25 mmol/L檸檬酸鈉，0.20 g/L糖原。
2、 螢光PCR反應液
10xPCR buffer (含有MgS04 2 0. 0ramol/L) 5. 0 P 1, 25mmol/L MgCl2 3. 0 u 1， 10腸1/L dNTPs mix (each) l.Oul， 10umol/L的HIV、 HCV、 HBV、 TP上下遊 引物各為2. 0、 2.25、 1.75、 2. Oiil， 10ixmol/L的HIV、 HCV、 HBV、 TP的探 針分別為0.9、 0.8、 0.85、 0. 95ixl， 5U/P 1 Taq DNA聚合酶0. 5 y 1，加入ROX 染料後用雙蒸水補充體積使反應液總體積為30 u 1。
3、 標準陽性模板貯存液
濃度為101拷貝/ u 1標準陽性模板pT-multy在使用前很用NEB的EcoR I 快速酶(室溫下5分鐘)酶切成分別含有一種病原體擴增序列的小片段，再進行 10倍系列稀釋；或者將pT-HBV， pT-HCV, pT-HIV以及pT-TP直接分別進行10
12倍系列稀釋。
4、陰性質控標準品為無菌雙蒸水
二、實施例2:使用試劑盒同步檢測乙型、C型肝炎、愛滋病毒及梅毒螺旋
體
1、 將100 w 1體液標本放入1. 5ml離心管中，加入等體積的病原體濃縮液充 分震蕩搖勻，10 000g離心15min，沉澱直接加50 u 1DNA、 RNA同步提取液充分 混勻，37。C或室溫放置15min;再加入100ul -20。C預冷的異丙醇，4'C沉澱15min， 10 OOOg離心15min，棄去上清；往沉澱中加500ul 75%乙醇，顛倒數次以洗滌 殘存異丙醇，13000rpm離心15min，輕輕倒去上清；3 OOOrpm離心10sec，將管 壁殘存液體甩到底部，用微量槍頭吸乾，室溫乾燥2 — 3min (不可過分乾燥，防 止下一步核酸不溶解)；加入40ul DEPC水(加入DEPC的純水高壓後的水即為DEPC 水)，輕輕混勻溶解核酸。3000g離心5sec，冰上保存，使用時取20ul (最好2 小時內使用，以免核酸特別是RNA降解)
2、 將陽性標準模板質pT-multy用NEB公司的EcoR I快速內切酶處理後(酶 切體系所用雙蒸水必須是DEPC處理過的)快速加熱到9(TC滅活內切酶的活力， 再進行10倍系列稀釋到1(f拷貝/ul， 1C)7拷貝/Pl， K)6拷貝/ul， 105拷貝/" 1， 104拷貝/111， 103拷貝/111， 102拷貝/111， 10'拷貝/iil， 10"拷貝/ul。或 者將pT-HBV， pT-HCV， pT-HIV以及pT-TP分別進行10倍系列稀釋到108拷貝/ "1， 107拷貝/"1， 16拷貝/ul， 15拷貝/ul， 14拷貝/iil， 13拷貝/txl, 102 拷貝/ul， 1(y拷貝/pl， 10-拷貝/ul。
3、 分別取螢光定量PCR反應液各30 P 1，取第a)步提取的核酸20 P 1和第 b)步稀釋的陽性標準模板1 u 1以及19 u 1雙蒸水，並設陰性對照，分別加入不 同的PCR反應管，對應於樣品其濃度分別是2X109拷貝/ml ， 2X108拷貝/ml ， 2Xl(f拷貝/ml ， 2Xl6拷貝/ml ， 2Xl5拷貝/ml ， 2Xl4拷貝/ml ， 2X103 拷貝/ml ， 2Xl2拷貝/ml， 20拷貝/ml在螢光定量PCR儀上平行做PCR檢測。 循環條件為94。C預變性3min， 58。C退火3min, 65。C延伸15min (Taq DNA聚 合酶逆轉錄活性最大)；循環過程使用兩步法94。C 30s， 58°C lmin, 45個循環。 把螢光檢測的程序設置在每個循環的第二步結束時進行，同步檢測 F扁,JOE， TAMARA， CY-5以及用於校正加樣誤差的螢光基團ROX。循環結束後，運用儀器自帶軟體，讀取待檢樣品拷貝數，結果為HBV、 TP、 HCV、 HlV在2Xl5拷貝/ml ，2Xl4拷貝/ml ，2Xl3拷貝/ml ，2Xl2拷貝/ml 和20拷貝/ml的模板濃度時平均Ct值分別是
28. 16， 31. 29， 34. 75， 38.03， 41. 21; 27. 21， 31. 12， 34. 51， 37. 91， 41. 03;
28. 25， 30. 71， 34. 12, 37. 52， 40. 60;26. 97, 31. 16, 34. 51, 37. 74, 41. 27;陰性 對照為0;
反覆重複試驗三次，得到的Ct值進行統計學分析P>0. 05，數據差異無顯著 意義，說明其不同批次之間的檢測結果具有可比性，具有良好的重複性。
從上述實例可以說明，螢光定量PCR方法定量重複性好，定量準確，而且， 螢光定量PCR檢測試劑盒對樣品的檢測僅需約2. 5個小時就能完成，大大縮短了 時間。
試劑盒的操作只需1人即可完成整個定量操作過程， 一次可檢測32—384個 (由定量儀器型號決定)樣品，這樣也減少了人力資源的浪費。
序列表
〈110〉武漢大學
〈120〉同步檢測肝炎、愛滋病毒和梅毒螺旋體核酸的試劑盒
〈140〉
〈141〉
〈160〉 4
〈210〉 1
〈211〉 94
薩
〈213〉B型肝炎病毒(〃印a"'"s 5 "'孺，HBV)— 〈400>
GCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTGCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCT 60 TCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCT 94
〈210〉 2 〈211〉 98
14〈212〉腿
〈213〉C型肝炎病毒(^印a"'fis C !^r〃s， HCV) 〈400〉
CCTGGCAATTCCGGTGTACTCACCGGTTCCGCAGACCACTATGGCTCTCCCGGGAGGGGG 60 GGTCCTGGAGGCTGCACGACACTCATACTAACGCCATG 98 〈210〉 3
<211〉 139
薩
<213〉愛滋病毒(力腿朋i歷廁/7oJe/Ycie/7C7 "'riAs， HIV) 〈400〉
TAAATACCATGCTAAACACAGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAATGTTAAAAGAGA 120 CCATCAATGAGGAAGCTGC 139
〈210〉 4 <211〉 136 <212〉 DNA
〈213〉梅毒螺旋體(trepo/7e/i7a ; aJ7jVi/叫TP) 〈400〉
GTGCTTGTGTGCAAGA
權利要求
1、一種同步檢測肝炎、愛滋病毒和梅毒螺旋體核酸的試劑盒，其特徵在於1)病原體濃縮液和DNA、RNA核酸同步提取液；2)含有四種病原體檢測序列的陽性質粒，四種病原體包括B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、愛滋病毒以及梅毒螺旋體；3)一步法單管單酶多項聯合檢測的TaqMan PCR擴增體系，由含有20.0mmol/L MgSO4的10×buffer，10μmol/L的B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、愛滋病毒以及梅毒螺旋體上下遊引物，10μmol/L的B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、愛滋病毒以及梅毒螺旋體的螢光探針，25mmol/L MgCl2，10mmol/L dNTPs mix和無菌雙蒸水組成，其中引物和標記探針如下①B型肝炎病毒正向引物為5′-GCGGCGTTTTATCATCTTCCTC-3′，反向引物為5′-AGGACAAACGGGCAACATACC-3′；螢光探針序列為5′-CCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGG-3′；螢光探針5′端標記報告螢光基團TAMRA，3′端標記不發光的淬滅基團Eclipse標記，標準陽性模板pT-HBV是含有B型肝炎病毒的Pre-S基因的98個鹼基對的核苷酸片段構成的pTA-2載體，該載體在大腸桿菌Top10中增殖；②C型肝炎病毒正向引物為5′-TCAGCCCAGAAGTAATACCCATG-3′，反向引物為5′-CCTGGCAATTCCGGTGTACTC-3′；螢光探針序列為5′-CCGGTTCCGCAGACCACTATGGCT-3′；螢光探針5′端標記報告螢光基團FAM，3′端標記不發光的淬滅基團Eclipse標記，標準陽性模板pT-HCV是含有C型肝炎病毒的5』UTR序列的98個鹼基對的核苷酸片段構成的pTA-2載體，該載體在大腸桿菌Top10中增殖；③愛滋病毒正向引物為5′-CATGGCGTTAGTATGAGTGTCG-3′，反向引物為5′-GCAGCTTCCTCATTGATGGTCTC-3′；螢光探針序列為5′-AGCATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAG-3′；螢光探針5′端標記報告螢光基團JOE/VIC/Cy-3，3′端標記不發光的淬滅基團Eclipse標記，標準陽性模板pT-HIV是含有愛滋病毒的gag基因139個鹼基對的核苷酸片段構成的pTA-2載體，該載體在大腸桿菌Top10中增殖；④梅毒螺旋體正向引物為5′-TGCGTGACGATGTACCATGTG-3′，反向引物為5′-TCTTGCACACAAGCACGATATTG-3′；螢光探針序列為5′-TCGCT CGAAG ATTCC TGTTG TATTC CGCT -3′；螢光探針5′端標記報告螢光基團Cy-5，3′端標記不發光的淬滅基團Eclipse標記，標準陽性模板pT-TP是含有梅毒螺旋體的poly A基因136個鹼基對的核苷酸片段構成的pTA-2載體，該載體在大腸桿菌Top10中增殖。
2、 按權利要求1所述的一種同步檢測肝炎、愛滋病毒和梅毒螺旋體核酸的 試劑盒，其特徵在於標準陽性模板包括B型肝炎病毒標準陽性模板pT-HBV包含的Pre-S基因的核苷酸序列為NO. 1; C型肝炎病毒標準陽性模板pT-HCV包含的5' UTR序列的核苷酸序列為NO. 2; 愛滋病毒標準陽性模板pT-HIV包含的gag基因的核苷酸序列為NO. 3; 梅毒螺旋體標準陽性模板pT-TP包含的poly A基因的核苷酸序列為NO. 4。
3、 按權利要求1所述的一種同步檢測肝炎、愛滋病毒和梅毒螺旋體核酸的 試劑盒，其特徵在於標準陽性模板包括同時含有四種病原體檢測序列的質粒序列為圖2。
全文摘要
本發明公開了一種同步檢測肝炎、愛滋病毒和梅毒螺旋體核酸的試劑盒，涉及一種基因診斷試劑盒。本發明包括1)病原體濃縮液和DNA、RNA核酸同步提取液；2)含有四種病原體檢測序列的陽性質粒，四種病原體包括B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、愛滋病毒以及梅毒螺旋體；3)一步法單管單酶多項聯合檢測的TaqMan PCR擴增體系。本發明同步實時檢測；整個流程時間短，能效高；操作簡單，封閉性檢測，避免了可能的汙染和人為誤差；靈敏度高；適用於大規模高通量的血液篩查，如血液中心和生物製品生產企業開展核酸篩查，也可適用於大容量高效率的臨床核酸檢驗。
文檔編號C12Q1/70GK101487062SQ20081019748
公開日2009年7月22日 申請日期2008年10月31日 優先權日2008年10月31日
發明者立 周, 唐景峰, 王業富, 龔路路 申請人:武漢大學