一種多重基因表達的分析方法

2023-06-06 06:02:06 3

專利名稱：一種多重基因表達的分析方法
技術領域：
本發明涉及一種多重基因表達分析方法，特別涉及多個樣本中多個基因表達的檢 測方法。
背景技術：
隨著DNA高通量測序技術的發展，以人類基因組計劃為代表的一大批基因組計劃 相繼完成，功能基因組學的研究越來越受到人們的關注。其中，功能基因組學分析的一個 重要方面就是了解基因在生物體發育過程中的時空表達特徵，以及在生物體發育過程中的 作用。從整體出發對生物體的全部基因表達的時續性和空間性進行分析，了解基因組的功 能活動和相互作用。因此，多基因表達譜分析對於闡明一系列複雜的生命科學基本問題和 重大醫學問題等均具有重要的意義。目前，多基因表達分析在藥物靶標篩選，疾病診斷， 病原物的侵染致病分子機理研究等方面均得到了廣泛應用。多基因表達譜研究已逐漸成 為尋找生命過程中重要基因和蛋白的最為重要手段之一。目前，主要的多基因表達譜分 析方 ^去主要有基 13 晶片(gene chip), MPSS (Massive parallel signature sequencing), SAGE (serial analysis of gene expression)禾口多重定量 PCR (Multiplex real-time RT-PCR)等方法。利用基因晶片(又稱DNA晶片)分析基因表達開始於1995年，其基本原理是，將 大量探針分子固定於支持物上，然後與標記的樣品cDNA雜交，雜交信號陽性的探針分子就 是在組織或細胞中表達的基因，若同時將兩組或多組有表達差異的組織或細胞cDNA分別 與晶片雜交，晶片上信號分子的分布和強度就會有所不同，根據信號分布和強度就可以判 斷基因差異表達的情況。DNA microarray是非PCR技術基礎的新方法，具有如下優點①高 度並行性。利用DNA晶片技術獲得大量並行數據並進行分析。並行性使實驗速度加快，同 時晶片上代表基因的可比性加強。DNA晶片的一次反應幾乎能夠分析整個人的基因。②微 量化。晶片技術減少了實驗消耗，最小化了反應體積，但增加了樣品濃度，加速了反應動力 學。③多樣性。晶片技術能夠在一次反應中分析多個樣本。新的標記和檢測方法的採用， 如多色螢光標記，使一塊晶片能比較多個樣本。這樣就使得比較分析非常精確而避免了芯 片間的變異造成的誤差；④自動化。先進的製造技術使得晶片的製造自動化，計算機的引入 使得數據的採集和分析自動化。這也是DNA microarray的最突出特點。但是，該技術同 時存在一些缺點①價格昂貴，使用該方法的成本與其他方法相比要高的多；②需要大量 的RNA，每次需50mg 200mg總RNA，對於低拷貝數的mRNA需要量更大，所以分析少量的臨 床標本存在困難；③需要完善的基因數據信息，無法獲得未知基因，需要一系列克隆或已知 基因的寡核苷酸，對於未完成測序工作的生物樣本不適用該方法；④與其他方法相比，靈敏 度較低，定量特性較差。MPSS (Massive parallel signature sequencing)技術是由美國禾鬥學家 Brenner 等於2000年發明了一種新的基因表達分析技術。該技術是利用限制性內切酶和螢光檢測 知識，發展出的一種辨認和測定細胞每一個cDNA克隆片段末端16 20bp序列的方法，從而查明細胞內所有基因的表達情況。MPSS技術的主要優點是操作簡便，速度快，時間短。 MPSS分析系統自動化程度較高，諸如微球體陣列的製作，反應液的供排、各種反應條件的控 制，圖像的處理和數據的分析已經完全自動化，可同時分析數以萬計的基因數目，甚至超過 了 SAGE的一次性分析能力(SAGE的一次性可分析上千個基因)，同時不需要耗費時間做大 量的PCR實驗，不需要對cDNA模板做特殊的處理，也不用對探針序列進行提前選擇。更為重 要的是MPSS可根據螢光信號對基因表達水平做定量的分析，能提供基因末端序列信息，這 一點MPSS與RT-PCR、SAGE等常規方法不同。另外，MPSS對基因末端序列與常規測序不同 的是，它不需要進行基因片段的分離、克隆再逐一測序，而是具備了 DNA晶片、cDNA微陣列 螢光分析法直接讀出序列的優點，可同時獲得大量cDNA末端序列，從而簡化了測序過程， 這符合後基因組時代基因功能分析的高通量、自動化、微型化的要求。當然該技術同DNA芯 片技術一樣，需要較為昂貴的硬體和相配套的軟體的協同運做，因此目前還亟需降低儀器 檢測的成本，加強推廣和普及工作。SAGE是1995年由Velculesce等建立的一種新的基因表達模式研究技術，是一個 非常有效的分析基因表達的方法。SAGE技術的基本原理是第一，在一個轉錄體系中，每種 轉錄本都可以用一個特異的固定長度寡核苷酸序列(9 14bp)來代表，這些短序列稱為 SAGE標籤(SAGE tag)。第二，通過一定的實驗步驟，將這些SAGE標籤從cDNA中分離出來 製備成一個SAGE標籤庫，然後連接成標籤多聚體進行克隆測序，並將得到的短序列核苷酸 順序以連續的數據形式進行處理，就能對數以千計的mRNA轉錄物進行分析，每種標籤在全 部標籤中所佔的比例可以反映它所代表的轉錄本在整個轉錄體系中的表達豐度。SAGE方法 的主要優點是SAGE的數據是定量的，累積的。只要足夠的測序工作的完成，SAGE就可以精 確地定量地分析整個細胞或組織的基因表達的變化。另外，SAGE數據具有可比性。SAGE數 據可以和現有的和將來按類似的方式建立的SAGE文庫中的數據進行比較。隨著SAGE數 據庫中數據的增多，該法的優勢越來越顯現出來。SAGE另一特點是，它的數據可以和由均一 化的EST文庫或差減文庫的EST數據相互補充。雖然，SAGE要求高通量的測序能力，但是 測定同樣數量的SAGE序列所代表的基因數量是測定同樣數量的EST序列的20倍。但是， SAGE技術也存在一些不足1、用SAGE標籤來代表一個基因不是十分可靠，由於標籤太短有 可能會導致基因識別錯誤。2、由於一些用於構建SAGE文庫的內切酶的局限性，某些轉錄本 不能被SAGE標籤所代表。另外，由於存在單核苷酸多態性和剪切位點的可選擇性，一個轉 錄本可能由多個SAGE標籤所表示。以上這些問題儘管只佔SAGE標籤所代表的基因的很小 部分，但在進行數據分析時，需加以考慮。Multiplex real-time RT-PCR技術根據螢光能量傳遞原理，融合了 PCR技術的高 效擴增、探針技術的高特異性、光譜技術的高敏感性和高精確性等優點，可直接探測PCR過 程中螢光信號的變化獲得定量結果。根據螢光定量PCR多通道激發光源，多個濾光片的檢 測體系以及標記不同螢光染料的探針，可達到同時檢測多個基因的目的。但是，該技術也存 在一些不足1、其檢測通量受到濾光片種類的限制。2、在一個反應體系中進行多對引物的 PCR擴增檢測並且得到較為準確的結果，擴增反應條件的優化和確定是該技術應用成功與 否關鍵。3、當反應體系中不同基因的表達量差異很大的情況下，表達量較高的基因會在前 幾個循環就會消耗大量原料，使PCR反應很快達到平臺期，而此時一些表達量很低的基因 還沒有達到螢光可以檢測到的水平，這樣就導致PCR結果無法真實的反應基因表達的實際
4情況。以 ± ii IHI 白勺力 中，DNA microarray, Massive parallel signature sequencing (MPSS), serial analysis of gene expression (SAGE)檢測通量高,通常可以 同時檢測上千個甚至上萬個基因的轉錄水平，因此上述幾種技術常用於全基因表達譜的分 析。但是，我們在研究過程中常常會對一些重要的信號轉導途徑或某些重要的代謝途徑感 興趣。而且，目前的大量的研究表明，一些與某種特定的疾病相關的基因個數通常只有幾十 個。在針對某些特定的疾病進行大量藥物篩選時，由於藥物種類很多，會導致樣本數量很 大，但所要分析的基因的數目卻不多，一般只有幾十個基因。在這種情況下，用以上提到的 高通量方法進行某些特定的基因表達水平分析，會導致成本較高，而且數據量過大直接影 響分析結果，很難滿足我們的實際需要。Multiplex real-time RT-PCR技術由於其檢測通 量過小，擴增條件優化較為困難，檢測限等因素也不適合在上述情況下應用。最近，Beckman 公司建立了基於毛細管電泳和螢光檢測相結合的方法(GeXP quantitative analysis method)進行多基因表達分析，取得了較好的效果；但是該方法需要毛細管電泳和螢光檢 測等較為昂貴的專用設備，直接影響該方法的廣泛使用。因此，建立一種具有較高檢測通 量、成本低、操作簡便的多基因表達的分析方法十分必要。

發明內容
本發明的目的在於提供一種多重基因表達的分析方法，本發明方法成本低、操作 簡便快捷。本發明是這樣實現的一種多重基因的表達分析方法，其特徵在於首先提取總RNA，利用各個基因相對 應的嵌合引物，在同一反應管中反轉錄獲得各個基因的cDNA混合物，所述嵌合引物由含特 定酶切位點的通用引物和各基因特異引物組成；然後利用包括所述含有特定酶切位點的通 用引物進行PCR擴增得到各個基因表達標籤的PCR產物；通過包括酶切、連接將代表各個基 因的表達標籤串聯到一起，再將串聯子克隆到載體上進行測序、分析；所述嵌合引物中通用 引物的特定酶切位點與PCR擴增出的各基因表達標籤的酶切位點不相重合。在此，操作者 可根據實際情況變更上述嵌合引物中通用引物的特定酶切位點，只要滿足該特定酶切位點 與PCR擴增出的各基因表達標籤的酶切位點不一致即可。本發明嵌合引物的5'端為含特定酶切位點的通用引物，本發明嵌合引物的3' 端為各基因特異引物。為了減少引物的非特異性，本發明含特定酶切位點的通用引物含17個以上的鹼 基，為了降低成本，本發明含特定酶切位點的通用引物含鹼基數量優選為18-25個。本發明各基因特異引物含16個以上的鹼基，為了使反應過程中各引物Tm值儘量 保持一致，本發明各基因特異引物含鹼基數量優選為16-25個。本發明利用包括所述含有特定酶切位點的通用引物進行PCR擴增具體是，先以本 發明反轉錄得到的cDNA為模板，利用各基因相對應的嵌合引物，在PCR前1-2或1_3或1_4 或1-5個循環富集各個基因的表達標籤；然後在以後的PCR循環中利用本發明含有特定酶 切位點的通用引物進行擴增。上述富集各個基因的表達標籤的PCR循環優選為PCR前1-3個循環；上述PCR循環共為25-35個，優選為28個。本發明PCR前面富集各個基因表達標籤的循環所用嵌合引物與剩餘的循環所用 的通用引物的摩爾比為1 50。具體地說，一種多重基因表達的分析方法，包括以下步驟(1)提取待分析樣本的總RNA，利用各個基因相對應的嵌合引物，反轉錄獲得各個 基因的cDNA混合物；所述嵌合引物由位於5'端的含有17個以上鹼基的含特定酶切位點 的通用引物和位於3'端的含有16個以上鹼基的各基因特異引物組成；(2)利用上述的各個基因相對應的嵌合引物，以上述反轉錄獲得的cDNA為模板， 在PCR的前1-3個循環富集各個基因的表達標籤，在各表達標籤的末端均含有特定的限制 性酶切位點；(3)在接下來的PCR的4-28個循環中，利用上述通用引物進行擴增，得到末端均含 有特定的限制性酶切位點的各個基因的表達標籤的PCR產物；上述嵌合引物中通用引物的 特定酶切位點與PCR擴增出的各基因表達標籤的酶切位點不相重合；所述PCR前1-3個循 環所用嵌合引物與接下來的PCR4-28個循環所用的通用引物的摩爾比為1 50;(4)沉澱回收上述(3)步驟所得的PCR產物，並利用各個標籤末端含有的酶切位 點，對所述PCR產物進行酶切，回收得到酶切產物；(5)利用連接酶將上述酶切後的PCR產物串聯起來，形成串聯子，電泳回收500bp 以上的串聯子，再將串聯子連接到製備好的用相同的限制性內切酶酶切克隆載體上；為 了測定信息量更大、便於統計分析，同時為了降低成本，所述電泳回收的串聯子優選為 500-1200bp。(6)挑取上述多個克隆進行測序，利用Blast軟體對測序結果進行分析，確定個基 因表達標籤的數量和比例，明確各基因的相對表達水平。本發明方法具有如下的有益效果(1)整個過程操作簡便，常規儀器即可滿足本發明方法的實施，不需要特殊儀器， 成本低。(2)本發明方法通量較高，可同時對至少20個基因進行表達分析。(3)本發明方法是基於PCR的一種基因定量方法，靈敏度較高，對於一些表達量較 低基因的檢測效果好；(4)本發明方法的檢測是利用測序後的結果統計得出個基因的表達水平，對於一 些核酸序列較為相似的基因之間的表達分析具有明顯的優勢。(5)本發明多重基因表達的分析方法操作簡便，成本低廉，適用範圍廣，可同時對 至少20個基因進行表達分析。本發明方法的建立將為多基因的表達分析提供了有力工具。


圖1 本發明多重基因表達分析方法(MgC-GEP method)的主要流程圖。圖2A本發明實施例1中的擴增標籤酶切效果檢測電泳圖 1為酶切前、2為酶切後。圖2B本發明實施例1中的酶切擴增標籤串聯子檢測電泳圖1為連接後的串聯子。圖2C本發明實施例1中克隆串聯子長度檢測電泳圖 1-15為隨機挑選的15個陽性克隆。圖3利用本發明實施例1中的多重基因表達分析方法和定量PCR分析酵母中多個 基因在弱酸誘導條件下的相對表達量圖。圖4 利用定量PCR分析受到真菌侵染的東亞飛蝗不同組織中多個基因的表達水 平圖。
具體實施例方式下面通過實施例對本發明進行具體的描述，有必要在此指出的是以下實施例只用 於對本發明進行進一步說明，不能理解為對本發明保護範圍的限制，該領域的技術人員可 以根據上述本發明內容對本發明作出一些非本質的改進和調整。實施例1在弱酸誘導條件下酵母中多個基因表達水平的分析方法1.菌株和載體釀酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae W303-1A購於江南大學菌種保藏中心。大腸桿菌菌株JM109購於北京鼎國生物公司。pUC19-T載體購於大連寶生(TaKaRa)生物公司。2.釀酒酵母總RNA的提取酵母細胞接種於新鮮的YPD液體培養基中，接種終濃度為0D600為0. 1，30°C， 250rpm培養至OD6tltl為1-1. 1之間。將培養的菌液平均分成2份，在其中一份中加入終濃 度為8mM的山梨酸鉀(BBI公司)，30°C，250rpm誘導培養20min後，室溫4000g，2min同 時收集誘導和非誘導的酵母菌體，冰水洗滌，液氮速凍後，保存於-80°C。利用SV Total RNAIsolation System(Promega 公司)提取酵母的總 RNA，再用無 RNA 酶的 DNA 酶(TaKaRa 公司)37°C處理提取的RNA 30min,再加入終濃度為2mM的EDTA，65°C IOmin終止反應。3.利用串聯子同時分析酵母中多個基因的表達在NCBI的GenBank中查找到酵母中與弱酸條件相關的部分基因(20個)，利用 BeaconDesigner 2. O軟體(Bio-Rad公司)設計引物序列，所設計引物均為嵌合引物，引物 中3'端為加入的與個基因對應的16-20鹼基的特異序列，5'端上遊引物中為18鹼基的通 用引物序列，下遊引物中為19鹼基的通用引物序列(如表1所示)，在上下引物的通用序 列中分別加有不同的酶切位點，其中上遊引物中加有BamHI位點，下遊引物中加有HindIII 位點。以上所有嵌合引物的平均Tm值67. 3士 1. 8°C，各引物之間的Tm值最大相差不超過 5°C。所有擴增產物長度為85士7鹼基。表1.利用串聯子方法分析酵母基因表達所用引物 *下劃線部分為所加入的酶切位點；斜體部分為通用引物序列。利用所設計的嵌合引物，以提取的酵母在不同培養條件夏的總RNA作為模板，進 行反轉錄。反轉錄體系為500ng總RNA，混合的0. 16 μ M下遊嵌合引物，200U反轉錄酶 (Promega 公司)，25U RNA 酶抑制劑(TaKaRa 公司)，5μ 1 M-MLV 5 X 反應緩衝液，0. 5mM dNTP，反應體系為25μ 1。反應條件為70°C 5min，42°C 60min,72°C IOmin0再利用反轉 錄產物作為模板進行擴增。擴增反應體系為2μ 1反轉錄產物，0.02μΜ混合的上遊嵌合 引物，2.5U Taq 酶(Bioflux 公司)，0. 2mM dNTP, 5 μ 1 IOXPCR 反應緩衝液(Bioflux 公 司)，1μΜ通用上遊引物，IyM通用下遊引物。擴增條件為95°C 5min ;94°C 30s, 53 °C 30s, 72°C for 35s，28個循環；70°C IOmin0利用酚氯仿抽提擴增產物，加入等體積異丙 醇_20°C靜置lOmin，12000rpm IOmin離心，去上清，70%乙醇漂洗沉澱2次，將沉澱溶於Lo TE 緩衝液中(3mM Tris-HCl, pH 7. 5 ；0. 2mM EDTA, pH 7. 5)。利用 BamHI 和 HindIII 酶切 擴增產物，3%瓊脂糖凝膠電泳酶切產物並回收(圖2A)，再利用T4 DNA連接酶連接回收的 酶切產物，將各個基因的標籤序列串聯起來，將連接產物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，回收 長度範圍在500-1200鹼基之間的串聯子(圖2B)，並將串聯子克隆到用BamHI和HindIII 酶切的PUC19-T的載體上。最後，將連接產物轉化大腸桿菌。隨機挑選15個克隆進行擴增 檢測，發現所挑取克隆均為陽性克隆，並且插入片段均在500鹼基以上(圖2C)。挑取300個大腸桿菌的陽性克隆送上海生工公司進行測序，測序引物為 M13-47(5' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3『)和 RV-M (5 『 -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3 『)。根據測序結果利用本地BLAST統計各基因 標籤的數量、比例，在統計結果過程中，以Actl基因的標籤作為內標，得到各個基因的相對 表達水平。結果表明，在這些基因中有7個基因(YNR030W，YDR343C, YGR088W, YBR054W, YNROO1C, YDR533C, YDL222C)在弱酸誘導條件下上調表達，有11個基因(YML123C， YEL046C, YLR180W, YLR355C, YLR419W, YLR300W, YNL300W, YLR372W, YAL059W, YPL122C, YPR149W)的表達受到弱酸的抑制。為了進一步驗證以上結果，將以上基因進行定量PCR分析。利用Beacon Designer 2. 0軟體(Bio-Rad公司)設計所用引物(表2)。以提取的各樣品的總RNA，利用oligo-dT 引物進行反轉錄合成cDNA，以該cDNA為模板進行定量PCR，所用試劑為SYBR-GreenPCR Master Mix 試劑盒(Bio-Rad 公司)。反應條件為95°C 15 sec ；95°C 15 sec, 53. 5°C 15 sec, 72°C 15seC，40個循環。以Actl基因作為內標，雙Delta法計算各個基因的表達水平。結果如圖3所示，定量PCR結果與本發明利用串聯子分析各個基因的表達結果基本一致，說 明利用串聯子可以有效地對多個基因同時進行表達水平分析。表2.利用定量PCR分析酵母中基因表達所用引物 實施例2東亞飛蝗在綠僵菌感染後不同組織中多個基因表達的分析方法為了驗證本發明提供的方法可以同時檢測多個基因的表達譜，發明人作了如下實 驗1.菌株和昆蟲金龜子綠僵菌菌體CQMal02 為殺蝗專一菌株，分離自重慶縉雲山自然感病的黃 脊竹蝗，購於重慶大學基因工程中心。該菌株由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生 物中心保存，CGMCC菌株號0877，於中國科學院微生物研究所也可購買。將活化的CQMal02 用滅菌水配成濃度為1 X IO5個孢子/ml的孢子懸浮液，均勻塗在直徑為9cm的1/4SDAY平 板上(10(^1/皿)，261培養15(1，完全產孢。將孢子刮下後放在乾燥器中乾燥後用棉籽油 渦旋分散，靜置10-15min，吸取中層孢子油懸浮液，採用新鮮煤油(透明)稀釋測定濃度，根 據濃度將配好的孢子油懸浮液用棉籽油稀釋至1 X IO8個孢子/ml備用。大腸桿菌菌株JM109購於北京鼎國生物公司。pUC19-T載體購於大連寶生(TaKaRa)生物公司。東亞飛蝗新羽化雄成蟲，購於重慶大學基因中心昆蟲室。2.東亞飛蝗不同組織總RNA的提取選取羽化後4天的東亞飛蝗健康雄蟲，隨機分成12組，每組20頭蟲，其中6組分 別於背板接種濃度為IXlO8的綠僵菌孢子懸液5 μ 1，蝗蟲接種後放入生測籠中，調節溫度 26-28°C，相對溼度40-70%，每天更換新鮮麥苗或人工飼料，以棉籽油接種為陰性對照。分
別於處理後4h、8h、12h、24h、48h和72h提取脂肪體，中腸和血淋巴的總RNA，共36組。另取羽化後4天的東亞飛蝗健康雄蟲，隨機分成12組，每組20頭蟲，其中6組分 別於翅膀上用毛刷刷上濃度為IXlO8的綠僵菌孢子懸液，對照組翅膀上僅刷棉籽油，分別 於處理後4h、8h、12h、24h、48h和72h提取翅膀的總RNA，共12組。用無RNA酶的DNA酶(TaKaRa公司)37°C處理提取的RNA 30min,再加入終濃度為 2mM 的 EDTA，65°C IOmin 終止反應。3.利用串聯子同時分析綠僵菌感染東亞飛蝗後多個組織中多個基因的表達譜在NCBI的GenBank中查找到東亞飛蝗中與真菌感染免疫相關的基因(9個，其中 包含一個內參基因armadillo)，利用Beacon Designer 2. 0軟體(Bio-Rad公司)設計引物 序列，所設計引物均為嵌合引物，引物中3'端為加入的與個基因對應的16-20鹼基的特異 序列，5'端上遊引物中為18鹼基的通用引物序列，下遊引物中為19鹼基的通用引物序列 (如表3所示)，在上下引物的通用序列中分別加有不同的酶切位點，其中上遊引物中加有 BamHI位點，下遊引物中加有HindIII位點。以上所有嵌合弓丨物的平均Tm值66. 8士 1. 9°C， 各引物之間的Tm值最大相差不超過5°C。所有擴增產物長度為77士5鹼基。表3利用串聯子方法分析東亞飛蝗中基因表達所用引物
產度} 切長時 酶物C
61
11
*下劃線部分為所加入的酶切位點；斜體部分為通用引物序列。利用所設計的嵌合引物，以提取的感病前後東亞飛蝗不同組織的總RNA作為模 板，進行反轉錄。反轉錄體系為500ng總RNA，混合的0. 16 μ M下遊嵌合引物，200U反轉 錄酶(Promega公司)，25U RNA酶抑制劑(TaKaRa公司)，5μ 1 M-MLV 5Χ反應緩衝液， 0. 5mM dNTP，反應體系為 25μ 1。反應條件為 70°C 5min,42°C 60min,72°C IOmin0 再利用 反轉錄產物作為模板進行擴增。擴增反應體系為2μ 1反轉錄產物，0.02 μ M混合的上遊 嵌合引物，2. 5U Taq 酶(Bioflux 公司)，0. 2mM dNTP, 5 μ 1 10XPCR 反應緩衝液(Bioflux 公司)，1μΜ通用上遊引物，IyM通用下遊引物。擴增條件為95°C 5min ;94°C 30s, 53 °C 30s, 72°C for 35s，28個循環；70°C IOmin0利用酚氯仿抽提擴增產物，加入等體積異丙 醇_20°C靜置lOmin，12000rpm IOmin離心，去上清，70 %乙醇漂洗沉澱2次，將沉澱溶於Lo TE 緩衝液中(3mM Tris-HCl,pH 7. 5 ；0. 2mM EDTA，pH 7. 5)。利用 BamHI 和 HindIII 酶切擴 增產物，3%瓊脂糖凝膠電泳酶切產物並回收，再利用T4DNA連接酶連接回收的酶切產物， 將各個基因的標籤序列串聯起來，將連接產物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，回收長度範圍在 500-1200鹼基之間的串聯子，並將串聯子克隆到用BamHI和HindIII酶切的pUC19_T的載 體上。最後，將連接產物轉化大腸桿菌。隨機挑選15個克隆進行擴增檢測，發現所挑取克 隆均為陽性克隆，並且插入片段均在500鹼基以上。每個樣品挑取40個大腸桿菌的陽性克隆送上海生工公司進行測序，測序引物為 Ml3-47(5' -C GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3『)和RV-M(5『 -GAGCGGATAACAATTTCACACAGG -3')。根據測序結果利用本地BLAST統計各基因標籤的數量、比例，在統計結果過程中，以 Actl基因的標籤作為內標，得到各個基因的相對表達水平。結果表明(見表4)，在脂肪體中，Gnbp-like、Spatzle、Toll9、Myd88、Tube 和 Cactus的表達量在綠僵菌感染後8h上調表達，其表達量分別上調3. 9,14,5. 5,3. 4,2. 1和 3. 9倍。同時，我們還利用多基因表達譜檢測方法獲得了 8個基因在中腸、血淋巴和翅膀中 的表達情況，結果顯示，在綠僵菌侵染東亞飛蝗以後72小時內，8個基因在血淋巴和翅膀均 發生了不同程度的上調表達改變；而中腸中8個基因則表現為與對照組無明顯差別。表4綠僵菌感染東亞飛蝗後不同組織中多個基因的表達譜 a 差異極顯著；b 差異顯著；-無顯著性差異為了進一步驗證以上結果，將以上基因進行定量PCR分析。利用Beacon Designer 2.0軟體(Bio-Rad公司)設計所用引物(見表5)。以提取的各樣品的總RNA，利用oligo-dT 引物進行反轉錄合成cDNA，以該cDNA為模板進行定量PCR，所用試劑為SYBR-GreenPCR Master Mix試劑盒(Bio-Rad公司)。反應條件為95°C 15sec ；95°C 15sec,54. 0°C 15sec, 72°C 15sec，40個循環。以armadillo基因作為內標，雙Delta法計算各個基因的表達水 平。結果如圖4所示，定量PCR結果與利用串聯子分析各個基因的表達結果基本一致，
說明利用串聯子可以有效地對多個基因同時進行表達水平分析。表5利用定量PCR引物檢測東亞飛蝗感病前後脂肪體中各基因的表達引物 結果表明(見圖 4)，Gnbp-like、Spatzle、Toll9、Myd88、Tube 和 Cactus 的表達量 在仍舊是在綠僵菌侵染後8h上調表達，其表達量分別上調4、19、8、4和5倍。由此可見，我 們用定量PCR檢測得到的上述基因的表達變化與本發明的多基因表達譜檢測方法得到的 結果是基本一致的，說明利用串聯子可以有效地對多個基因同時進行表達水平分析。 序列表
重慶大學
一種多重基因表達的分析方法
201010232000. 6
2010-07-20
114
1
35
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YPL122C基因的5』端特異性引物序列 1
AGGTGACAGG ATCCAATACG GTGTGGTTGT AGAGG 35 2 37 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YPL122C基因的3』端特異性引物序列 2
GTACGACTCA AAGCTTGGAC CAACAAGTCC AGGCTAA 37
3
36
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YNR030W基因的5』端特異性引物序列 3AGGTGACAGG ATCCAATATT CGGTATCTTT GGCTTG 36
4
37
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YNR030W基因的3』端特異性引物序列 4
GTACGACTCA AAGCTTGGAT GATACTGATG GCGGAAC 37
5
36
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YDR343C基因的5 』端特異性引物序列 5
AGGTGACAGG ATCCAATAGA GGTGCCAACT ACGACG 36 6 38 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YDR343C基因的3 』端特異性引物序列 6
GTACGACTCA AAGCTTGGAT ATCATCGTGA GCCATTTC 38
7
38
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YGR088W基因的5』端特異性引物序列 7
AGGTGACAGG ATCCAATACG GATACTGGTT TTGAA 35 8 37 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YGR088W基因的3』端特異性引物序列 8
GTACGACTCA AAGCTTGGAT TCAGCAGCCT TATCTCC 37
9
36
DNA人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YPR149W基因的5』端特異性引物序列 9
AGGTGACAGG ATCCAATAAC CCTGATGTCT GTTTTC 36 10 36 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YPR149W基因的3』端特異性引物序列 10
GTACGACTCA AAGCTTGGAC AGAACCAAAG GCACCA 36 11 37 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YCL040W基因的5』端特異性引物序列 11
AGGTGACAGG ATCCAATAAC CTTTCCAGTT GTCATCC 37 12 39 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YCL040W基因的3』端特異性引物序列 12
GTACGACTCA AAGCTTGGAG TCAATTTCAA TATGCGACA 39
13
39
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YBR054W基因的5』端特異性引物序列 13
AGGTGACAGG ATCCAATAAA ATTTTTTACG CTAGATACG 39
14
36
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YBR054W基因的3』端特異性引物序列 14
GTACGACTCA AAGCTTGGAT GGGAAAGCCA AAAACC 36
1615 38 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YNR001C基因的5』端特異性引物序列 15
AGGTGACAGG ATCCAATAAC TGAGGCTTCG TTCTACAC 38 16 36 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YNR001C基因的3』端特異性引物序列 16
GTACGACTCA AAGCTTGGAT AGCTCTGGCA ACACCA 36
17
38
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YDR533C基因的5 』端特異性引物序列 17
AGGTGACAGG ATCCAATAAC TGGTAACAGG TGTGAATC 38 18 37 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YDR533C基因的3 』端特異性引物序列 18
GTACGACTCA AAGCTTGGAT CTTACGGCAG TGGAGTG 37
19
37
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YDL222C基因的5 』端特異性引物序列 19
AGGTGACAGG ATCCAATAAG CCTCAACCTA CAACCAC 37 20 37 DNA 人工序列
17用於擴增利用串聯子方法分析酵母YDL222C基因的3 』端特異性引物序列 20
GTACGACTCA AAGCTTGGAG AAAGAACTTG CCATTGC 37 21 37 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YML123C基因的5』端特異性引物序列 21
AGGTGACAGG ATCCAATACC GCACAAGAAC AAGATGG 37 22 37 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YML123C基因的3』端特異性引物序列 22
GTACGACTCA AAGCTTGGAT CTTCATCACT GGTGTCG 37
23
36
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YEL046C基因的5 』端特異性引物序列 23
AGGTGACAGG ATCCAATATG TCTCAAGCGA TGGTGG 36
24
38
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YEL046C基因的3 』端特異性引物序列 24
GTACGACTCA AAGCTTGGAT AGTCACCGTT GGAAGGAA 38
25
37
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YLR180W基因的5』端特異性引物序列 25
AGGTGACAGG ATCCAATAAG AGCGCAACTA AAGTCCG 37 2639 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YLR180W基因的3』端特異性引物序列 26
GTACGACTCA AAGCTTGGAT GTCTCTTGGG ATGACTTTT 39
27
37
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YLR355C基因的5 』端特異性引物序列 27
AGGTGACAGG ATCCAATACG ATGCCGCTCA ATCAGAA 37 28 37 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YLR355C基因的3 』端特異性引物序列 28
GTACGACTCA AAGCTTGGAC CTTGGTCAAC AATGGCT 37
29
36
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YLR419W基因的5』端特異性引物序列 29
AGGTGACAGG ATCCAATACT CGGCTATTGG GCTTGC 36
30
38
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YLR419W基因的3』端特異性引物序列 30
GTACGACTCA AAGCTTGGAC CCACAAGTTA CACAGCGT 38
31
37
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YLR300W基因的5』端特異性引物序列31
AGGTGACAGG ATCCAATATA TGACCACGGT TCCCTCG 37
32
38
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YLR300W基因的3』端特異性引物序列 32
GTACGACTCA AAGCTTGGAC CACCAATGTT GACACCAC 38
33
38
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YNL300W基因的5』端特異性引物序列 33
AGGTGACAGG ATCCAATAGT AGATGTTACC ACCACCCC 38
34
39
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YNL300W基因的3』端特異性引物序列 34
GTACGACTCA AAGCTTGGAT GGAGACCATA GATGTAGTA 39
35
37
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YLR372W基因的5』端特異性引物序列 35
AGGTGACAGG ATCCAATAAC TGGTGTCAAG ACCTCTA 37
36
38
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YLR372W基因的3』端特異性引物序列 36
GTACGACTCA AAGCTTGGAG CTTTCCTGGA AGAGACCT 38
37
38
20DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YAL059W基因的5』端特異性引物序列 37
AGGTGACAGG ATCCAATACC ATTTCTCGTG CCAAGTAC 38
38
37
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母YAL059W基因的3』端特異性引物序列 38
GTACGACTCA AAGCTTGGAT ATCCCAGCCA GCCTTTC 37
39
37
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母Actl基因的5』端特異性引物序列 39
AGGTGACAGG ATCCAATAGT GGTTACTCTT TCTCCAC 37
40
38
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母Actl基因的3』端特異性引物序列 40
GTACGACTCA AAGCTTGGAC GGACAATTTC TCTTTCAG 38
41
18
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母基因表達的5』端引物中的通用引物序列 41
AGGTGACAGG ATCCAATA 18
42
19
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析酵母基因表達的3』端引物中的通用引物序列 42GTACGACTCA AAGCTTGGA 19
43
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YPL122C基因的5』端特異性引物序列 43
CGCATTGGAA GTTGGCAAAG 20
44
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YPL122C基因的3』端特異性引物序列 44
TCGGAAGTCA GCATCAAAGC 20
45
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YNR030W基因的5』端特異性引物序列 45
CAGGAGCAGC ACATCTATGG 20
46
19
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YNR030W基因的3』端特異性引物序列 46
CTCGCCGCCT GGATAATTC 19
47
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YDR343C基因的5』端特異性引物序列 47
TCATGGGCTG TTTGGTCTTC 20
48
20
DNA
22人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YDR343C基因的3』端特異性引物序列 48
GTCGTAGTTG GCACCTCTTC 20
49
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YGR088W基因的5』端特異性引物序列 49
CCACGTCTTG TCGGATACTG 20
50
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YGR088W基因的3』端特異性引物序列 50
GTTCGGGTGT CATTGTTTGC 20
51
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YPR149W基因的5』端特異性引物序列 51
AACACCCAAC ATAGGCACAG 20
52
19
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YPR149W基因的3』端特異性引物序列 52
TGATACCAAC GGCCAACAC 19
53
18
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YCL040W基因的5』端特異性引物序列 53
TCAGACTGCC CACCACTC 18
2354 20 DNA 人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YCL040W基因的3』端特異性引物序列 54
CACAACGGAA CCATCACAAC 20
55
19
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YBR054W基因的5，端特異性引物序列 55
AGGAGCACCC AGGTTACAG 19
56
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YBR054W基因的3，端特異性引物序列 56
AGCAATCAAC CAGCAGACAG 20
57
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YNR001C基因的5』端特異性引物序列 57
TGGTCGTGCC AATCAAGAAG 20
58
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YNR001C基因的3』端特異性引物序列 58
AACTCTCCCT GCGTTCAAAG 20
59
20
DNA
人工序列
24用於擴增利用定量PCR分析酵母中YDR533C基因的5』端特異性引物序列 59
TGGGATGAGC ATTCCTTAGC 20 60 20 DNA 人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YDR533C基因的3』端特異性引物序列 60
TCGGCATTCA CCTCTTTTGG 20 61 20 DNA 人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YDL222C基因的5』端特異性引物序列 61
ACAGGTTGCT ATGTGAAGGC 20 62 20 DNA 人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YDL222C基因的3』端特異性引物序列 62
TGGTCCGAGT AGGTAGAGTG 20
63
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YML123C基因的5』端特異性引物序列 63
GCTGGTGTTG GTTTCTTGAC 20
64
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YML123C基因的3』端特異性引物序列 64
TTGACTTGGA CCTGGCATAC 20 65
2520 DNA 人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YEL046C基因的5』端特異性引物序列 65
TGTCCAACCA GATTGCCATC 20 66 19 DNA 人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YEL046C基因的3』端特異性引物序列 66
GGAACCACCA TCGCTTGAG 19
67
18
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YLR180W基因的5』端特異性引物序列 67
TCGTCATCGG TGGTCCTC 18 68 18 DNA 人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YLR180W基因的3』端特異性引物序列 68
CGGCATAAGC GGCAGAAC 18
69
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YLR355C基因的5』端特異性引物序列 69
TTACGGTTCC CAAGGTTACG 20
70
17
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YLR355C基因的3』端特異性引物序列
2670
GAGCGGCATC GGACAAC 17
71
18
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YLR419W基因的5』端特異性引物序列 71
CAACTGCCTG CCTGGAAG 18
72
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YLR419W基因的3』端特異性引物序列 72
CGACCTGAGT GGATTTACCC 20
73
18
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YLR300W基因的5』端特異性引物序列 73
GTTTGCTGCC GCTTTGAC 18
74
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YLR300W基因的3』端特異性引物序列 74
TGCCTCCACA TAACGTCTTG 20
75
17
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YNL300W基因的5』端特異性引物序列 75
ACCGTTGCTG CCATTGC 17
76
19
27DNA 人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YNL300W基因的3』端特異性引物序列 76
GGTGGTGGTG TTAGCTTGG 19
77
18
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YLR372W基因的5』端特異性引物序列 77
CAGTTGCCGA CCAGTTCC 18
78
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YLR372W基因的3』端特異性引物序列 78
ACCCGTTAGC CAAGAAAGTC 20
79
20
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YAL059W基因的5』端特異性引物序列 79
ATCGGATGCT CTTGAACCAG 20 80 20 DNA 人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中YAL059W基因的3』端特異性引物序列 80
CTCATTCTTG GCTGCTGTTC 20 81 19 DNA 人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中Actl基因的5』端特異性引物序列 81
28列
列
TCTGAGGTTG CTGCTTTGG19
82 20 DNA 人工序列
用於擴增利用定量PCR分析酵母中Actl基因的3』端特異性引物序列 82
CCGACGATAG ATGGGAAGAC20
83
35
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中Gnbp-Iike基因的5』端特異性引物序 83
AGGTGACAGG ATCCAATAAC AGCACCGTCA CCACT35
84
39
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中Gnbp-Iike基因的3』端特異性引物序 84
GTACGACTCA AAGCTTGGAA TACAGGCAGG CTTTCCATT39
85
34
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中Gnbp2基因的5』端特異性引物序列 85
AGGTGACAGG ATCCAATAAG GCGGAGGGAA CTGG34
86 36 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中Gnbp2基因的3』端特異性引物序列 86
GTACGACTCA AAGCTTGGAT GGACCTGTTG TTCACG36
87
2936 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中Spatzle基因的5』端特異性引物序列 87
AGGTGACAGG ATCCAATAGC TTGTGGGTAC GGAGAC36
88 35 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中Spatzle基因的3』端特異性引物序列 88
GTACGACTCA AAGCTTGGAG CACTGGTTTG ATACA35
89
37
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中Toll9基因的5』端特異性引物序列 89
AGGTGACAGG ATCCAATATC GCAGTCAGTG GTGTCAA37
90
37
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中Toll9基因的3』端特異性引物序列 90
GTACGACTCA AAGCTTGGAG ATGTTGTGCC ATGTGTA37
91
37
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中ISWheeler基因的5』端特異性引物序 91
AGGTGACAGG ATCCAATAGC GGAACAACAC TCTTACC37
92
40
DNA
人工序列
30用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中ISWheeler基因的3』端特異性引物序 92
GTACGACTCA AAGCTTGGAA AAGGTGTTGT CTTCTATGTA 40
93
36
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中Myd88基因的5』端特異性引物序列 93
AGGTGACAGG ATCCAATAAG GACTGCAAGG GACTGG 36
94
38
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中Myd88基因的3』端特異性引物序列 94
GTACGACTCA AAGCTTGGAA ACCAACTGTG CCAGACCT 38
95
38
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中Tube基因的5』端特異性引物序列 95
AGGTGACAGG ATCCAATACA TTGCCTGCTG AACTGGAA 38
96
39
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中Tube基因的3』端特異性引物序列 96
GTACGACTCA AAGCTTGGAT TGAGGAGGCA ACTTTCTAA 39
97
37
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中Cactus基因的5』端特異性引物序列 97
AGGTGACAGG ATCCAATATC GGGTAACACT GCTCTGC 37
3198 39 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中Cactus基因的3』端特異性引物序列 98
GTACGACTCA AAGCTTGGAA TCTCCATTGA GGCACGCTA 39
99
38
DNA
人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中Armadillo基因的5』端特異性引物序
列
99
AGGTGACAGG ATCCAATACA CGAGGGACTT CTTATGAG 38 100 39 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中Armadillo基因的3，端特異性引物序
列
100
GTACGACTCA AAGCTTGGAT CTGTGTATCC TGGAATGCT 39 101 18 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中基因表達的5』端引物中的通用引物
序列
101
AGGTGACAGG ATCCAATA 18 102 19 DNA 人工序列
用於擴增利用串聯子方法分析東亞飛蝗中基因表達的3』端引物中的通用引物
序列
102
GTACGACTCA AAGCTTGGA 19
32103 16 DNA 人工序列
用於擴增利用定量PCR引物檢測東亞飛蝗感病前後脂肪體中Gnbp-Iike基因的 5』端特異性引物序 列
103
GCTGCCTCCA CGACGG16
104
18
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR引物檢測東亞飛蝗感病前後脂肪體中Gnbp-Iike基因的 3』端特異性引物序 列
104
CTGCTGATGC TGCTGCTG18
105
22
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR引物檢測東亞飛蝗感病前後脂肪體中Spatzle基因的5』 端特異性引物序列 105
ACGGAGACCT GTGTATCAAA CC 22 106 22 DNA 人工序列
用於擴增利用定量PCR引物檢測東亞飛蝗感病前後脂肪體中Spatzle基因的3』 端特異性引物序列 106
CTGAGGCCAC CAATTTCTTC TG 22
107
24
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR引物檢測東亞飛蝗感病前後脂肪體中Toll9基因的5』端
33特異性引物序列 107
ATATGCTACT GGAAGTGGCG ATAC 24 108 25 DNA 人工序列
用於擴增利用定量PCR引物檢測東亞飛蝗感病前後脂肪體中Toll9基因的3』端 特異性引物序列 108
TGGATTCTGC TTTATTTGGC TTGTC 25
109
22
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR引物檢測東亞飛蝗感病前後脂肪體中Myd88基因的5』端 特異性引物序列 109
CTACTGATGA AGGACTGCCA AG 22 110 22 DNA 人工序列
用於擴增利用定量PCR引物檢測東亞飛蝗感病前後脂肪體中Myd88基因的3』端 特異性引物序列 110
AAACTTGTTC TGTGGGATTT GC 22 111 19 DNA 人工序列
用於擴增利用定量PCR引物檢測東亞飛蝗感病前後脂肪體中Cactus基因的5』 端特異性引物序列 111
CGCACGTACC AGCACCATG19
112 22 DNA 人工序列
34用於擴增利用定量PCR引物檢測東亞飛蝗感病前後脂肪體中Cactus基因的3』 端特異性引物序列 112
CACCACACCA GACAACCAGA TG 22
113
18
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR引物檢測東亞飛蝗感病前後脂肪體中Armadillo基因的 5』端特異性引物序 列
113
GCAGCCAGCA ACCAGGAG18
114
23
DNA
人工序列
用於擴增利用定量PCR引物檢測東亞飛蝗感病前後脂肪體中Armadillo基因的 3』端特異性引物序 列
114
ACCATCTGTC CACGGATAAT AGC 23
3權利要求
一種多重基因表達的分析方法，其特徵在於首先提取總RNA，利用各個基因相對應的嵌合引物，反轉錄獲得各個基因的cDNA混合物，所述嵌合引物由含特定酶切位點的通用引物和各基因特異引物組成；然後利用包括所述含有特定酶切位點的通用引物進行PCR擴增得到各個基因表達標籤的PCR產物；通過包括酶切、連接將代表各個基因的表達標籤串聯到一起，再將串聯子克隆到載體上進行測序、分析；所述嵌合引物中通用引物的特定酶切位點與PCR擴增出的各基因表達標籤的酶切位點不相重合。
2.如權利要求1所述的方法，其特徵在於所述嵌合引物的5'端為含特定酶切位點的 通用引物，所述嵌合引物的3'端為各基因特異引物。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於所述含特定酶切位點的通用引物含17個以 上的鹼基。
4.如權利要求2或3所述的方法，其特徵在於所述各基因特異引物含16個以上的鹼基。
5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於所述含特定酶切位點的通用引物含鹼基數 量為18-25個。
6.如權利要求4所述的方法，其特徵在於所述各基因特異引物含鹼基數量為16-25個。
7.如權利要求4所述的方法，其特徵在於利用包括所述含有特定酶切位點的通用引 物進行PCR擴增具體是，先以所述反轉錄得到的cDNA為模板，利用各基因相對應的嵌合引 物，在PCR前1-2或1-3或1-4或1-5個循環富集各個基因的表達標籤；然後在以後的PCR 循環中利用所述含有特定酶切位點的通用引物進行擴增。
8.如權利要求7所述的方法，其特徵在於所述PCR前面富集各個基因表達標籤的循 環所用嵌合引物與剩餘的循環所用的通用引物的摩爾比為1 50。
9.如權利要求8所述的方法，其特徵在於所述PCR循環共為25-35個；在所述PCR前 1-3個循環富集各個基因的表達標籤，然後在以後的PCR循環中利用所述含有特定酶切位 點的通用引物進行擴增。
10.如權利要求1所述的方法，包括如下步驟a.提取待分析樣本的總RNA，利用各個基因相對應的嵌合引物，在同一反應管中反轉 錄獲得各個基因的cDNA混合物；所述嵌合引物由位於5'端的含有17個以上鹼基的含特 定酶切位點的通用引物和位於3'端的含有16個以上鹼基的各基因特異引物組成；b.利用所述的各個基因相對應的嵌合弓丨物，以所述反轉錄獲得的cDNA為模板，在PCR的前 1-3個循環富集各個基因的表達標籤，在各表達標籤的末端均含有特定的限制性酶切位點；c.在接下來的PCR的4-28個循環中，利用所述通用引物進行擴增，得到末端均含有特 定的限制性酶切位點的各個基因的表達標籤的PCR產物；所述PCR前1-3個循環所用嵌合 引物與接下來的PCR4-28個循環所用的通用引物的摩爾比為1 50;d.沉澱回收所述c步驟所得的PCR產物，並利用各個表達標籤末端含有的酶切位點，對 所述PCR產物進行酶切，回收得到酶切產物；e.利用連接酶將所述酶切後的PCR產物串聯起來，形成串聯子，電泳回收500bp以上的 串聯子，再將串聯子連接到製備好的用相同的限制性內切酶酶切克隆載體上；f.挑取所述多個克隆進行測序，利用Blast軟體對測序結果進行分析。
全文摘要
一種多重基因表達的分析方法，其特徵在於首先提取總RNA，利用各個基因相對應的嵌合引物，反轉錄獲得各個基因的cDNA混合物，所述嵌合引物由含特定酶切位點的通用引物和各基因特異引物組成；然後利用包括所述含有特定酶切位點的通用引物進行PCR擴增得到各個基因表達標籤的PCR產物；通過包括酶切、連接將代表各個基因的表達標籤串聯到一起，再將串聯子克隆到載體上進行測序、分析；所述嵌合引物中通用引物的特定酶切位點與PCR擴增出的各基因表達標籤的酶切位點不相重合。本發明多重基因表達的分析方法操作簡便，成本低廉，適用範圍廣，可同時對至少20個基因進行表達分析。本發明方法的建立將為多基因的表達分析提供了有力工具。
文檔編號C12Q1/68GK101921846SQ201010232000
公開日2010年12月22日 申請日期2010年7月20日 優先權日2010年7月20日
發明者夏玉先, 鄭小莉, 金凱 申請人:重慶大學