聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林-替莫唑胺緩釋微球及製備方法

2023-06-06 08:04:56 1

專利名稱：聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林-替莫唑胺緩釋微球及製備方法
技術領域：
本發明涉及醫藥領域，特別是涉及聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林-替莫唑胺緩釋微球及製備方法。
背景技術：
目前，通過利用生物可降解載體在局部進行雙藥投遞是組織學工程中的一項重要技術。多種可降解的高分子聚合物可作為投遞載體，其中聚乳酸羥基乙酸(PLGA);由於具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應用於製藥、醫用工程 材料和現代化工業領域。在美國PLGA已通過食品藥物管理局認證，被正式作為藥用輔料收錄進美國藥典。阿司匹林是一種傳統的非留體抗炎藥物，它可以通過抑制環氧化物酶l，2(C0X-l，C0X-2)活性進而阻斷前列腺素類，血栓烷類等炎症介質的生成。近年來有研究證實阿司匹林具有顯著的抗腫瘤效果，在乳腺癌及結腸癌中具有輔助性治療作用，並且我們的前期研究表明，阿司匹林具有抑制膠質瘤細胞增殖，及促進細胞凋亡的效果。因而，通過應用生物可降解材料實現阿司匹林與替莫唑胺同載，從而使阿司匹林增敏替莫唑胺治療效果具有一定的可行性。我們利用噴霧乾燥法，製備了阿司匹林-替莫唑胺緩釋微球。膠質母細胞瘤是最常見的顱內原發性惡性腫瘤，具有高度的侵襲性，目前其治療方式包括手術切除，及輔助性術後放射及替莫唑胺化學治療，但生存期通常不足15個月。替莫唑胺是一類新型烷化劑，由於其可以通透血腦屏障並誘發腫瘤細胞DNA結構斷裂誘導凋亡，因而是目前治療膠質瘤的常用化療藥物。替莫唑胺口服後迅速吸收，血藥濃度峰值出現在lh，消除速度快，平均半衰期只有1. 7-1. 9h，且在有限的治療劑量範圍內呈現線性動力學。此外，由於DNA修復酶O6甲基鳥嘌呤DNA甲基轉移酶(MGMT)高表達，P53基因的突變，及抗凋亡蛋白Bcl-2及Bcl-XL過度表達都限制了替莫唑胺的療效。因此，為了提高其治療效果及避免高劑量造成的毒性反應，我們採取了阿司匹林與替莫唑胺的聯合應用並通過緩釋作用降低了替莫唑胺的治療劑量。

發明內容
本發明立足於解決當前膠質瘤化療藥物替莫唑胺血藥半衰期短，消除迅速，具有劑量限制性毒性，及耐藥造成的治療敏感性低的局限性，通過噴霧乾燥法製備了具有緩釋效應的阿司匹林-替莫唑胺微球，實現了二者的同時投遞，並利用阿司匹林具有的一定抗腫瘤作用提高了替莫唑胺治療膠質母細胞瘤的治療效果。噴霧乾燥法是一種傳統的微球製備方法。基本原理是首先將囊心物質分散在預先液化的包裹材料的溶液中，然後此混合液通過熱氣流進行霧化，使得溶解包裹材料的溶劑迅速液化，最終使囊膜固化，囊心物質微膠囊化。利用噴霧乾燥法製備微球成本較低，操作簡單，易於實現大規模工業化生產，因而具有重要的現實意義而在製藥業中廣泛應用。本發明的技術方案如下
本發明的聚乳酸羥基乙酸(PLGA)包載的阿司匹林-替莫唑胺緩釋微球，大小均一，表面圓滑，粒徑(Pm)為2. 36±0. 65，載藥率(%)為26±0. 45，包封率(%)為86. 69±1. 51，且毒副作用小，緩釋效果好，持續釋放時間為500h。聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林-替莫唑胺共載微球(PLGA-A-T)的製備方法是稱取一定質量的聚乳酸羥基乙酸，阿司匹林，替莫唑胺，各組分摩爾質量比為，聚乳酸羥基乙酸阿司匹林替莫唑胺=3:1:2，將上述微球的各組分溶於乙酸乙酯中製成混合溶液(濃度範圍為30-60M/L)，並通過噴霧乾燥機進行噴霧乾燥製備微球，其中進風溫度為43-45° C，出風溫度為38-40° C，待進風口溫度顯示與設置溫度顯示相同時即可進行微球的製備。
本發明的優點和積極效果可降解生物材料聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林-替莫唑胺微球，具有一定的緩釋效應(持續釋放時間為500h)，極大改善了替莫唑胺血漿消除率低的缺陷(半衰期1.7-1. 9h);並實現了阿司匹林與替莫唑胺的同時投遞。一定劑量的阿司匹林聯合應用可提高替莫唑胺的治療效果，從而避免了可能發生的替莫唑胺劑量限制性毒性。為膠質母細胞瘤的化學藥物治療提供了一種可行的手段。


圖1 :阿司匹林微球(A)，替莫唑胺微球⑶及阿司匹林-替莫唑胺共載微球(C)表面形態掃描電鏡圖。圖2 :阿司匹林微球，替莫唑胺微球及共載微球釋放曲線。可見各微球在前20h釋放迅速，隨後釋放變緩，在500h時，釋放率達到100%，且3種微球釋放趨勢一致。圖3 :未處理組，空載微球,阿司匹林微球，替莫唑胺微球及共載微球對LN229和U87膠質瘤細胞克隆形成能力的檢測。圖4 :未處理組，空載微球，阿司匹林微球，替莫唑胺微球及共載微球對LN229和U87膠質瘤細胞凋亡能力的檢測。圖5 :空載微球,阿司匹林微球,替莫唑胺微球及共載微球對LN229膠質瘤皮下荷瘤模型治療效果評價。
具體實施例方式以下通過實施例對本發明做進一步的闡述。實施例1 :阿司匹林-替莫唑胺共載微球的製備及表徵聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林-替莫唑胺共載微球(PLGA-A-T):按照摩爾質量比為，聚乳酸羥基乙酸阿司匹林替莫唑胺=3:1:2稱取，各組分分別溶於乙酸乙酯中，製成混合溶液(濃度範圍為30-60M/L)並通過噴霧乾燥機進行噴霧乾燥製備微球，其中進風溫度為43-45° C，出風溫度為38-40° C，待進風口溫度顯示與設置溫度顯示相同時即可進行微球的製備。I)將載有樣品的燒杯置於噴霧乾燥機載物臺上，開啟攪拌；打開空氣壓縮機，並調整出氣壓力在5Kg-10Kg之間；打開高壓氣體流量計，使出氣量在10-12L/min左右；將上樣蠕動泵的輸液管插入液體中，開啟上樣蠕動泵，開始進樣；觀察乾燥塔上端噴嘴處的霧化狀態及乾燥塔內的乾燥情況，同使觀察出風口的溫度顯示情況(維持在38-40° C)；2)液料噴幹完畢關斷加熱開關、溶液泵、高壓氣體流量開關和空氣壓縮機開關，將主收料瓶從旋風分離器下口處旋下，進行物料收集；所得產物即為製備的阿司匹林-替莫唑胺共載微球，如附圖1、圖2，阿司匹林微球(A)，替莫唑胺微球(B)及阿司匹林-替莫唑胺共載微球(C)表面形態掃描電鏡圖，可見各微球表面圓滑，粒徑均一，粒徑(ym)為
2.36±0. 65，載藥率(%)為26±0. 45，包封率(%)為86. 69±1. 51，且毒副作用小，緩釋效果好，持續釋放時間為500h。實施例2 :阿司匹林替莫唑胺共載微球抑制膠質瘤細胞的增殖
稱取一定質量的空載微球,阿司匹林微球，替莫唑胺微球及共載微球溶於2ml無血清的培養基中配置成一定濃度的藥物母液。用含10%胎牛血清的培養基培養LN229和U87膠質瘤細胞到融合度為60%時，更換為1%胎牛血清培養基，並加入空載微球，阿司匹林微球，替莫唑胺微球及共載微球母液使各組終濃度分別為O. 02 μ M，5 μ Μ, 10 μ Μ, 10 μ Μ,繼續培養12h後，用胰酶消化各組細胞，並以2X IO3每皿接種到直徑為IOcm的大皿中，含10%胎牛血清的培養基培養2周後，棄培養基，PBS清洗3次，加入結晶紫染液使克隆著色，以此計數各皿的克隆形成數，並以未處理組的平均克隆數(重複3次取平均值，下同)為參照，其它各處理組平均克隆數分別除以未處理組克隆數，所得比值即為各組的相對克隆形成率，如圖3所示。與對照組相比，空載組克隆形成率無改變，阿司匹林微球組與替莫唑胺微球組略微降低，而共載組克隆形成率顯著降低。實施例3 :阿司匹林替莫唑胺共載微球促進膠質瘤細胞的凋亡用含10%胎牛血清的培養基培養LN229和U87膠質瘤細胞到融合度為60%時，更換為1%胎牛血清培養基，並加入空載微球，阿司匹林微球,替莫唑胺微球及共載微球母液使各組終濃度分別為O. 02 μ M, 5 μ M, 10 μ Μ, 10 μ Μ,培養12h後，更換為10%胎牛血清培養基繼續培養36h。然後棄培養基，用冷PBS洗滌細胞三次，用400ullX Binding Buffer懸浮細胞，加入5ul Annexin V-FITC，輕輕混勻後於2-8° C避光條件下孵育15分鐘，加入IOulPI後輕輕混勻於2-8° C避光條件下孵育5分鐘。用流式細胞儀檢測細胞凋亡，如圖4所示，可見與未處理組相比，空載組凋亡率無改變，阿司匹林微球組與替莫唑胺微球組凋亡率輕微增加，而共載組凋亡率明顯增加。實施例4 :阿司匹林替莫唑胺共載微球體內抑瘤功能檢測利用100 μ I微量進樣器將LN229膠質瘤細胞按5 X IO5每注射點接種於4周齡裸鼠皮下，從而建立瘤源。待皮下腫瘤達到長徑3cm時，取下瘤塊，均勻切碎，並植入各實驗組(n=6)裸鼠皮下，繼續餵養，當長徑達到5mm左右，各實驗組開始治療。治療方式為皮下瘤內多點注射，治療劑量分別為PLGA (O. 2 μ m/kg)，阿司匹林微球(50 μ m/kg)，替莫唑胺微球(100 μ m/kg)，共載微球(105 μ m/kg)，治療次數為一次。同時開始觀察治療效果，每兩天測量一次腫瘤長短徑,按公式腫瘤體積=0. 5 X長徑X短頸2計算腫瘤體積，持續監測3周，然後將各處理組裸鼠處死，剝下瘤塊，稱取瘤重，如圖5所示，與空載微球治療組相比，阿司匹林治療組腫瘤生長體積，瘤重略降低，替莫唑胺治療組也一定程度上抑制了腫瘤的生長能力，而兩藥共載組治療後腫瘤體積及質量明顯降低。
權利要求
1.一種聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林-替莫唑胺緩釋微球，其特徵是表面圓滑，粒徑2. 36 ±O. 65 μ m，載藥率為26 ±O. 45%，包封率為86. 69 ±1. 51%，緩釋時間為500h。
2.權利要求1微球的製備方法，其特徵是步驟如下聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林和替莫唑胺共載微球稱取聚乳酸羥基乙酸，阿司匹林，替莫唑胺，各組分摩爾比為，聚乳酸羥基乙酸阿司匹林替莫唑胺=3:1:2 ;將各組分溶於乙酸乙酯中(濃度範圍為30-60M/L)，製成混合溶液，通過噴霧乾燥機進行噴霧乾燥法製備微球，其中進風溫度為43-45° C，出風溫度為38-40° C，待進風口溫度顯示與設置溫度顯示相同時即可進行微球的製備。
全文摘要
本發明涉及聚乳酸羥基乙酸包載的阿司匹林-替莫唑胺緩釋微球及製備方法；稱取聚乳酸羥基乙酸、阿司匹林、替莫唑胺，溶於乙酸乙酯中製成混合溶液，並通過噴霧乾燥機進行噴霧乾燥製備微球，其中進風溫度為43-45°C，出風溫度為38-40°C，待進風口溫度顯示與設置溫度顯示相同時即可進行微球的製備。微球大小均一，表面圓滑，粒徑(μm)為2.36±0.65，載藥率(%)為26±0.45，包封率(%)為86.69±1.51，且毒副作用小，緩釋效果好,持續釋放時間為500h。一定劑量的阿司匹林聯合應用可提高替莫唑胺的治療效果，避免了可能發生的替莫唑胺劑量限制性毒性。為膠質母細胞瘤的化學藥物治療提供了一種手段。
文檔編號A61P35/00GK103006571SQ20121054482
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月13日 優先權日2012年12月13日
發明者康春生, 原續波, 史振東, 錢小敏, 韓磊, 浦佩玉 申請人:天津醫科大學總醫院