免疫佐劑的製作方法

2023-06-06 01:42:51 1

>佐劑[mg/ml]n抗NDV抗體的滴度佐劑2-log的平均值SEM反對數增加％PAA[40]20NTC8-PAA[8]2012.41.1540436C8-PAA[40]20NTC8-PAA[8]2012.31.5504231C8-PAA[40]2012.41.2540436C8-PAA[8]2012.51.0579336C8-PAA[40]2012.01.9409625實驗IIIw/o4013.11.38780100PBS408.21.82940PAA[8]20NTPAA[24]20NTC8-PAA[8]2013.51.011585133C8-PAA[8]2012.81.1713281C8-PAA[24]2013.51.311585133C8-PAA[8]2013.70.613308153C8-PAA[8]2012.51.1579365C8-PAA[24]20NTC8-PAA[8]2013.71.213308158C8-PAA[24]2014.20.818820218C8-PAA[8]20NTC8-PAA[24]20NT實驗IVw/o4012.91.0388100PBS407.51.1370PAA[1]20NTPAA[2]20NTPAA[4]20NTPAA[8]20NTPAA[16]20NTC4-PAA[1]20NTn＝每組母雞數SEM＝平均值的標準偏差(平均值的標準誤)NT＝未經試驗*＝C4叔在四個實驗中，陰性對照組平均值之間的差很小。在四個實驗中，陽性對照的平均值的差也很小。修飾的PAA佐劑為23-218％、丁基-PAA和辛基-PAA佐劑比甲基-PAA或癸基-PAA的更有效。該方法所得的結果證實了第一種方法的分析結果，它是這些試驗的特定發展。實施例4在96孔板上，抗血清一系列呈級數的稀釋液與106KimberNDV株的感染顆粒(PFU)一起在37℃下培養18小時。向每個孔中加入105予鳥QT35系細胞，並把板放好。覆蓋這些板並在37℃下再培養48小時。使感染顆粒數減少50％的血清稀釋液被認為是抗體滴度。這些實驗的結果如表IV所示。表III通過病毒中和(VN)對母雞進行不同PAA製品對於抗-iNDV抗體滴度的作用的測量佐劑[mg/ml]n抗NDV抗體的滴度佐劑2-log的平均值SEM反對數增加％實驗Iw/o4016.32.180684100PBS408.11.82740PAA[8]2011.62.031044C8-PAA[8]2015.12.43512043C6-PAA[40]2014.02.31638420實驗IIw/o4016.02.065536100PBS4011.12.021940PAA[8]2011.51.828961PAA[40]2013.02.281929C8-PAA[8]2015.21.83764156C8-PAA[40]2011.42.927021C8-PAA[8]2013.82.21426319C8-PAA[40]2014.72.02661638C8-PAA[8]2015.61.64966775C8-PAA[40]2013.73.01330818實驗IIIw/o4016.21.075281100PBS4010.41.913510PAA[8]2012.62.262088PAA[24]2014.81.22852637C8-PAA[8]2015.41.74323757C8-PAA[8]2014.61.42483432C8-PAA[24]2015.90.86114781C8-PAA[8]2016.00.66553687C8-PAA[8]2015.51.44634161C8-PAA[24]2015.90.86114781C8-PAA[8]2016.10.67024093C8-PAA[24]2016.22.475281100C8-PAA[8]2013.31.71008612n＝每組母雞數SEM＝平均值的標準偏差(平均值的標準誤)*＝C4叔陰性和陽性對照組的動物在四個獨立實驗中有重現的抗體滴度。作為所用的PAA劑量的函數，未經修飾的PAA的增加百分數是4-37％。所有烷基-PAA引發的反應比未經修飾的PAA的反應高。烷基-PAA引發的反應的數量根據所用的烷基鏈的類型和PAA的酯化程度而異。對於丁基-PAA，觀察到佐劑的劑量和體液反應之間有密切的關係(實驗IV)，而對於辛基-PAA，40毫克/毫升劑量的反應並不總是比低劑量的反應高，這表明，辛基-PAA的最佳用量為24-40毫克/毫升。用病毒中和(VN)試驗評價的抗體的生物功能，結果顯示ELISA試驗和VN試驗之間有密切的相關關係。實施例5對小鼠進行PAA佐劑的試驗。用25微升包括1體積抗原溶液和1體積佐劑的疫苗對每組6隻小鼠的幾組小鼠進行接種，每毫升抗原溶液由10微克滅活的流感病毒(MRC-11株)和1毫克卵白蛋白(OVA)(SIGMA，美國)組成。注射後三周用如實施例1所述的間接的ELISA法測定抗體滴度。鼠的血清在5％脫脂奶的PBS溶液(PBS/SKM)預稀釋。在96孔板上，用相同的溶液將血清樣本兩倍稀釋成-系列溶液，將板在37℃下培養1-2小時。加入由山羊產生並經與過氧化物酶偶合的抗小鼠IgG的抗體在PBS/BSA中的1/300稀釋液，將板在37℃下培養1-2小時。用ABTS+H2O2的底物溶液(KirkegaardPerryLabs.，美國)定量板上的過氧化物酶的量，用multiscanTitertek在405nm處測量吸光度。這些實驗的結果如表V所示。表V給小鼠使用烷基-PAA的佐劑n＝每組母雞(病人，小鼠)的數目SEM＝平均值的標準偏離(平均值的標準誤)在小鼠中只是部分證實了通過加入脂族鏈可增加PAA的佐劑功能，因為2個獨立的實驗產生了不同的效果。實施例6除了佐劑功能之外，其它性質在評價疫苗中也是重要的這包括局部反應，這也是重要的方面，雖然一般來說一些動物種類可接受注射部位的一定水平的反應。通過將疫苗注入小鼠爪墊後監測小鼠爪的腫脹試驗了體內的局部毒性。現已顯示該方法極為敏感。將25微升+/-5微升含1體積佐劑的疫苗(皮下)注入每組6個小鼠的左後足內，該佐劑已被在每毫升0.9％(w/v)NaCl中含10微克MRC-11和1mg卵白蛋白的抗原溶液1體積稀釋。用荷蘭的StateUniversityofUtrecht特別為本目的設計的半電子設備在注射前一天和注射後不同的間隔時間測量爪的厚度。現顯示該設備的準確性幾乎接近0.02mm。通過得到的處理前後爪的厚度差別來計算爪的腫脹，以0.01mm表示。這些實驗的結果如表VI所示。表VI小鼠中PAA和烷基-PAA的反應性實驗I實驗IIPAA對小鼠僅有中度局部毒性；在數天後小鼠爪的腫脹達到最大，然後在2或3周後逐漸減少。給PAA加上烷基鏈增加了局部反應，但根據注射量在2-5周後消失。辛基的局部反應比丁基的強。可類比的是，注射基於油和水的佐劑產生的腫脹更厲害，它要持續8周以上。權利要求1.一種疫苗用佐劑，包括一種具有陰離子組成重複單元和疏水性組成重複單元的聚合物的水溶液。2.根據權利要求1所述的佐劑，其特徵在於形成陰離子組成重複單元的單體單元選自丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來酸、富馬酸、亞乙基二磺酸、乙烯基硫酸、苯乙烯磺酸、乙烯基苯基硫酸、2-甲基丙烯醯氧基乙烷磺酸、3-甲基丙烯醯氧基-2-羥基丙烷磺酸、2-丙烯醯-2-甲基丙烷磺酸、3-丙烯醯胺基-3-甲基丁酸、3-甲基丙烯醯胺基-3-甲基丁酸、乙烯基磷酸、4-乙烯基苯甲酸、3-乙烯基氧基丙烷-1-磺酸和N-乙烯基丁二亞胺酸。3.根據權利要求2所述的佐劑，其特徵在於形成陰離子組成重複單元的單體單元選自丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來酸、富馬酸、亞乙基二磺酸、乙烯基硫酸和苯乙烯磺酸。4.根據權利要求3所述的佐劑，其特徵在於形成陰離子組成重複單元的單體單元選自丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來酸和富馬酸。5.根據權利要求4所述的佐劑，其特徵在於形成陰離子組成重複單元的單體單元是丙烯酸單元。6.根據權利要求1所述的佐劑，其特徵在於形成疏水性組成重複單元的單體單元選自丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來酸、富馬酸、亞乙基二磺酸、乙烯基硫酸、苯乙烯磺酸、乙烯基苯基硫酸、3-甲基丙烯醯氧基-2-羥基丙烷磺酸、2-甲基丙烯醯氧基乙烷磺酸、2-丙烯基-2-甲基丙烷磺酸、3-丙烯醯胺基-3-甲基丁酸、3-甲基丙烯醯胺基-3-甲基丁酸、乙烯基磷酸、4-乙烯基苯甲酸、3-乙烯基氧基丙烷-1-磺酸或N-乙烯基丁二亞胺酸的烷基酯、環烷基酯和羥基烷基酯和醚類。7.根據權利要求6所述的佐劑，其特徵在於形成疏水性組成重複單元的單體單元選自丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來酸、富馬酸、亞乙基二磺酸、乙烯基硫酸或苯乙烯磺酸的烷基酯。8.根據權利要求7所述的佐劑，其特徵在於形成疏水性組成重複單元的單體單元選自丙烯酸、甲基丙烯酸、馬來酸或富馬酸的烷基酯，其中烷基含4-8個碳原子。9.根據權利要求8所述的佐劑，其特徵在於形成疏水性組成重複單元的單體單元選自丙烯酸的線型烷基酯，其中烷基含4-8個碳原子。10.根據權利要求1-9之一所述的佐劑，其特徵在於疏水性組成重複單元與陰離子組成重複單元的摩爾比為0.05-1.00。11.根據權利要求1-10之一所述的佐劑，其特徵在於疏水構成重複單元與陰離子構成重複單元的摩爾比為0.10-0.40。12.根據權利要求1所述的佐劑，其特徵在於，聚合物的分子量為10-10,000千道爾頓。13.根據權利要求1-12之一所述的佐劑，其特徵在於液體介質是水性溶液、懸浮液或乳劑。14.根據權利要求1-13之一所述的佐劑，其特徵在於聚合物是水溶性的。15.一種疫苗，包括致免疫的量的抗原和前述權利要求之一所述的佐劑。16.根據權利要求15所述的疫苗，其特徵在於佐劑的濃度為1-40mg/ml，較好的是4-24mg/ml。17.根據權利要求15所述的疫苗，其特徵在於除了佐劑外，它還包括滅活的新城疫病毒(NDV)和/或傳染性支氣管炎病毒(IBV)供家畜接種。18.具有疏水性組成重複單元和陰離子組成重複單元的聚合物在疫苗中用作佐劑的應用。19.根據權利要求18所述的應用，其特徵在於聚合物具有如權利要求2-5所述的疏水性組成重複單元，和如權利要求6-9所述的陰離子組成重複單元。20.一種製備溶液型疫苗的方法，其特徵在於使抗原水性混合物和一種具有疏水性組成重複單元和陰離子組成重複單元的聚合物進行混合。全文摘要一種疫苗佐劑,包括具有陰離子組成重複單元和疏水性組成重複單元的聚合物的一種液體介質。有利的是,所述的佐劑是部分酯化的聚丙烯酸的水溶液。新穎的佐劑極為穩定、有效,且局部毒性相對較低。此外,本發明也揭示了包括這類佐劑的疫苗和製備這類佐劑的方法。文檔編號A61K39/39GK1171053SQ95197100公開日1998年1月21日申請日期1995年12月21日優先權日1994年12月27日發明者L·希爾格斯,M·斯特雷貝爾申請人:迪米那科股份有限公司