防治蔬菜土傳病害的複合生防菌劑ps合劑的製作方法

2023-06-06 01:18:56 4

專利名稱：：防治蔬菜土傳病害的複合生防菌劑ps合劑的製作方法
技術領域：
：本發明涉及防治蔬菜土傳病害的複合生防菌劑，屬於農作物防病治病
技術領域：
，專用於多種蔬菜土傳病害的無公害防治。二
背景技術：
：植物土傳病害的病原物多為土壤習居菌，如引起茄科作物青枯病的青枯勞爾氏菌ia/Wom'aso/wxacearaOT,弓l起多禾中植物枯、黃萎病的尖孢鐮刀菌Fraan'ww。ww/ww，大麗輪枝菌d"/z/ae/，以及近年來在各地危害越來越嚴重的根結線蟲Me/o/cfogy脫spp.等。茄科作物青枯病屬世界性病害，病原細菌可侵染50多科200多種植物，全球範圍內造成的經濟損失多達120億美元；辣椒疫黴P/^o;/z"&orac/n7/在我國蔬菜生產上常年造成巨大損失；根結線蟲(Me/o/c/ogy"espp.)侵染保護地蔬菜，致使寄主常年減產15-25%，有時達70%以上，嚴重地制約了蔬菜的生產和出口創匯。而生產上，這些病害往往同時發生，如番茄大棚中根結線蟲、細菌性青枯和真菌性枯黃萎常同時發生，形成複合侵染，造成的損失非常嚴重。這些土傳病害都有寄主範圍廣、抗逆性強、難以根除等特點，對複合侵染防治尤其困難。生產中往往既缺乏優良的抗病品種，又缺乏有效的化學防治藥劑。而過多施用化學農藥會帶來一系列生態和社會問題，如病蟲草產生的抗性，對非靶標生物的直接危害，對土壤、水、大氣的汙染，生物富集作用對人健康的影響，國際貿易對農藥殘留農產品的限制等。早在1992年世界環境與發展大會就要求"在全球範圍內控制化學農藥的銷售和使用"，不能過分依賴化學農藥已成為人類的共識。隨著經濟的發展，人們生活水平的提高，人們越來越注重食品安全問題，綠色蔬菜、有機農產品等也越來越受人青睞。無公害蔬菜早己成為世界蔬菜生產的主流。我國無公害蔬菜的研究和生產始於1982年，該年召開全國生物防治會議，江蘇省率先提出用生物防治代替化學農藥防治。1983年，在全國植保總站的大力支持下，全國23個省、市開展了無公害蔬菜的研究、示範與推廣工作。社會對安全、健康食品的需求促進了利用無公害方法來控制有害生物的研究。生防菌株通過空間位點競爭和營養的競爭，直接分泌胞外酶降解作用，產生抗生素抑制病原，誘導植物產生抗病性等機制，既可以減少化學農藥使用帶來的環境汙染，提高農產品的價值，又可以改善土壤微生態環境，壓低有害生物的種群數量，利於農作物的可持續生產，為我國無公害綠色蔬菜的生產提供有力保障。通過幾年的研究實踐，人們探索出一套綜合防治病蟲害、減少農藥汙染的無公害蔬菜生產術，也開發了一些生物殺菌劑，如農用鏈黴素、井崗黴素，前者可以配成200mg/L液灌根防治蔬菜軟腐病、青枯病，後者配成1000-1500倍液防治蔬菜炭疽病、霜黴病。但目前尚未有能同時防治多種土傳病害的生防製劑產品。現有技術中按照本實驗室的菌體保藏液專利(公開專利號CN1358838，公開日2002年7月17日)方法，菌體可室溫保存23年。三
發明內容技術問題本發明的目的是針對當前防治植物土傳病害使用的化學農藥汙染嚴重、使用成本過高的缺陷，且對蔬菜多種土傳病害混發沒有較高防效的生防菌製劑現狀，開發一種防治蔬菜多種土傳病害的複合菌劑，專用於防治蔬菜青枯病、疫病、根結線蟲病等，菌劑的防效高，並且有增產功能。技術方案本發明為一種防治多種蔬菜土傳病害的複合生防菌劑PS合劑，含兩種細菌成分PX35和SM21。PX35和SM21，兩個菌株均為芽孢桿菌屬(5ac/〃iwspp.)，均保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，PX35菌種保藏號為CGMCCNO.1930，SM21菌種保藏號分別為CGMCCN0.2058。該生防製劑的製備方法為1)同時將兩菌分別接種到PM培養液中，37t:i80rpm下培養24小時後在超淨工作檯中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養液來調零；2)將兩菌培養至OD值均在O.1—1之間時，開始混菌取0D值最大的菌1毫升，則另一個菌的量(ml)=最大0D值X該菌與最大0D值菌的配比值/該菌的0D值；3)將兩菌混合後加到250mlPDA培養液中30°C180rpm搖36小時，然後4000g離心，每1000ml培養液獲得13—16g溼菌，每克溼菌含4X1(T—10'5個菌體。4)取溼菌與菌體保藏液按l:40(g/ml)配成菌劑，再按l:l比例混勻。即得複合生防菌劑PS合劑，成品中活菌總濃度為lX109—lX1014Cfu/ml，用於防治蔬菜土傳病害。菌體保藏液為0.01mol/L磷酸鹽緩衝液，還含有濃度為0.001mol/L的Tween20(非離子型表面活性劑)。其中所用PDA培養液配製方法為用200克土豆削皮後切成小塊放入水中，沸騰後至少煮20分鐘以上，用四層醫用紗布過濾，濾液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，PH值調至7.2-7.4，然後12rC15個大氣壓滅菌20分鐘。有益效果本發明的優點和積極效果表現在本發明是專門針對蔬菜土傳病害混合發生而開發的生防製劑，在防治蔬菜土傳病害方面與目前其他抗菌譜單一的生物殺菌劑相比防治效果顯著提高。由於是生物製劑，完全沒有因化學農藥的使用所帶來的一系列問題，因而有利於蔬菜的無公害生產，農民可以不用或減少化學農藥的用量，這不僅可為農民節省開支，而且有利於蔬菜的出口。同時，該菌劑還有增產功能，可為農民增加收入。該菌劑用溼菌與菌體保藏液按1:40(g/ml)配成菌劑，可室溫保存23年。菌體保藏液為0.Olmol/L磷酸鹽緩衝液，還含有非離子型表面活性劑濃度為0.001mol/L的Tween20。該菌劑可以在溫室移栽前倒入有機肥中製成堆肥或於移栽前噴在有有機肥的田塊，然後隨肥料在整地過程中埋到土裡，也可以在移栽時灌根使用。栽苗後，製劑通過多種生防機制起作用，從而達到防治青枯病土傳病害的效果。試驗表明，在溫室中使用PS複合菌劑對不同土傳病害(主要是青枯、疫病和根結線蟲)均有防治效果(58~77%不等)且其促生作用也能達到50%以上，均要優於單劑和化學藥劑；田間施用PS複合菌劑對混合發生的兩或三種土傳病害防效達60%86%，病田增產53%81%。四具體實施例方式PS複合菌劑製備一種防治蔬菜土傳病害的複合菌劑，成分為菌株PX35和SM21，兩個菌株均為芽孢桿菌屬(5^///^spp.)，均保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。PX35菌種保藏號為CGMCCNO.1930，保藏日期2007年1月26日；SM21菌種保藏號為CGMCCNO.2058,保藏日期2007年5月24日。該菌劑採用常規細菌培養法獲得，用PDA培養液30°C180rpm搖36小時，然後4000g離心，每1000ml培養液獲得13—16g溼菌，每克溼菌含4X101—1015個菌體。取溼菌與菌體保藏液按l:40(g/ml)配成菌劑，成品中活菌總濃度為1X109—1X1014cfu/ml。菌體保藏液為0.01mol/L磷酸鹽緩衝液(稱取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HP04和0.24gKH2P04,溶於800ml蒸餾水中，用HC1調節溶液的pH值至7.4，最後加蒸餾水定容至1L即可。在151bf/in2(1034xl05Pa)高壓下蒸氣滅菌至少20分鐘，保存存於室溫或4。C冰箱中)，還含有濃度為0.001mol/L的Tween20(非離子型表面活性劑)。將菌接種到PDA培養液中分別培養3(TC180rpm，約24小時後在超淨工作檯中分別取樣測600nm處的0D值，測定過程中以未接菌的培養液來調零。當有0D值不在0.1一l之間時將各菌繼續培養，每隔3小時測一次，直到各OD值均在此範圍內。實施效果(一)溫室試驗辣椒種子播種於育苗盤中，播種後21d進行移栽，每盆1株，每處理共24株盆栽辣椒，3次重複。栽培土為育苗基質(淮安柴米河基質肥有限公司生產)，無任何病原。移栽辣椒苗的同時每盆澆108CFU/ml的菌液40ml，溫室條件為28-32。C，40%溼度，自然光照。1、對辣椒青枯病的溫室防治試驗辣椒苗移栽36h後按2x105CFU/g土的濃度澆4xl05CFU/ml青枯菌JS55的菌液(實際每盆80g土，澆4xl05CFU/ml的青枯病菌JS55的菌液40ml);對照1先用清水處理，後澆青枯菌液；對照2用50ml/株的200ppm的農用鏈黴素(產自華北製藥公司，石家莊)處理，36h後澆青枯菌菌液，濃度同上。辣椒移栽35d後統計病害嚴重度與防效。青枯病病情指數(diseaseindex)0-4級分級依據KempeandSequeira(1983)。青枯病病害嚴重度[DiseaseseverityofRalstoniawilt(DSR)]=[Z(各病級株數x青枯病各病情指數y(調査總株數x青枯病最高病情指數)]xioo%2、對辣椒疫病的溫室防治試驗辣椒苗移栽3d後按每盆2><100%試驗結果用SPSS13.0軟體統計結果，計算平均值與標準差；作單因素方差分析，經Doncan(戶=0.05)檢驗差異顯著與否。溫室實驗表明，PS合劑在溫室內對青枯病防效為67.40%(表l)，對辣椒疫病的防效達77.32%(表2)，對根結線蟲防效也能達到58.59%(表3);對植株的促生作用明顯，辣椒苗的鮮重增加52.80%(表4)。表lPS複合菌劑對辣椒細菌性青枯病防治作用溫室實驗tableseeoriginaldocumentpage7—*Control1:用農用鏈黴素200ppm灌根.**Control2:清水處理表2PS複合菌劑對辣椒疫病防治作用溫室實驗tableseeoriginaldocumentpage7表3tableseeoriginaldocumentpage7Control2**89.31±l,01a*Control:阿維菌素50ppm灌根兩次，間隔10天."Control2:清水對照表4PS複合菌劑對辣椒促生作用溫室實驗處理鮮重(g)鮮重增加(％)PX35+SM213.287±0.11c52,90PX352.910±0.17b35,36SM212.798±0.03b30.14Control1*2.150士0.14a—-*Control1:清水對照(二)田間試驗PS複合菌劑在2007、2008年在江蘇淮安和河北藁城進行田間多種土傳病害防效試驗示範。在作物移栽前噴霧使用，也可以做成堆肥使用，或稀釋後在移栽時灌根使用。病害調査與溫室試驗相同。總病害嚴重度=青枯病病害嚴重度+疫病病害嚴重度+根結線蟲病害嚴重度防治效果=[(總對照組病害嚴重度-總處理組病害嚴重度)/總對照組病害嚴重度]xl00%增產效果=[(各處理組平均產量一對照平均產量)/對照平均產量]xioo%田間實驗結果表明，PS合劑對多種土傳病害複合侵染的田塊起到了很好地抗病增產效果。兩年兩地的結果顯示，在河北藁城對春季辣椒混合病害(疫病和根結線蟲)防效達61.77%，同時產量增加55%(表5)，在秋季辣椒上對兩種病害防效為77.07%，產量增加79.15%(表6)，明顯優於化學農藥和單劑的防效。在江蘇淮安，對春季辣椒混合病害(青枯、疫病和根結線蟲)的防效是67.33%，產量增加54%(表7);秋季對以上三種病害的防效為86.27%，防效穩定，產量平均增加81.39%(表8)，大大優於單劑和化學農藥組合。表52007年秋季PS合劑及化學農藥對河北藁城辣椒產量及土傳病害防效的影響處理產量(Kg/plot)增產率(％)混合病害發病率(％)防效(％)PX35+SM2121,02土1.98c55.377.40土1.66c61.77PX3519.46士l,79bc43.848.97士1.99c53.65SM2118.32士2.32b35.3910.02士2.84bc48.24甲霜靈猛鋅+阿維菌素17.22士2.04b27,2611.98土2.43b38.12對照13.53土1.98a—19.36士255a—表62008年春季PS合劑及化學農藥對河北藁城辣椒產量及土傳病害防效的影響處理產量(Kg/plot)增產率(％)混合病害發病率(％)防效(％)PX35+SM2120.37士2.64c79.156.13土2.14d77.07PX3516.98士2.33bc49.3810.67士1.95c60.09SM2115.91士2.58b39.9711,95土2.58c55.30甲霜靈錳鋅+阿維菌素15.26±2.58b34.2015.39士2,45b42.46對照11.37士2.91a——26.74土2.59a—-表72007年秋季PS合劑及化學農藥對江蘇淮安辣椒產量及土傳病害防效的影響處理產量(Kg/plot)增產率C5/。)混合病害發病率(％)防效(％)PX35+SM2122.07士2.13d53.476.06士1.48c67.33PX3520.22士1.69c40.618.52士1.81bc54.07SM2119.07土1.69bc32.599.65士2.43bc47，94農用鏈黴素+甲霜靈錳鋅+阿維菌素17.95士2.69b24.8311.46士1.64b38.19對照14.38士2.40a——18.54士2.94a—表82008年春季PS合劑及化學農藥對江蘇淮安辣椒產量及土傳病害防效的影響處理產量(Kg/plot)增產率(％)混合病害發病率(％)防效(％)PX35+SM2122.98土1.79d81.393.39±2.33d86.27PX3520.64士2.04c62.898.41士1.78c65.92SM2119.06士1.98c50.4110.39土2.33bc57.90農用鏈黴素+甲霜靈錳鋅+阿維菌素16.81士2.43b32.7013,85士2.72b43.92對照12.67士2.83a—-24.69±3.80a——數據用SPSS統計軟體在LSDtest(屍=0.05)水平上檢測差異顯著性.所有處理都是4次重複，表中數據取4次重複的平均值和標準偏差權利要求1、一種防治多種蔬菜土傳病害的複合生防菌劑PS合劑，含兩種細菌成分PX35和SM21，兩個菌株均為芽孢桿菌屬(Bacillusspp.)，均保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，PX35菌種保藏號為CGMCCNO.1930，保藏日期2007年1月26日；SM21菌種保藏號為CGMCCNO.2058，保藏日期2007年5月24日。2、權利要求1所述的一種防治多種蔬菜土傳病害的複合生防菌劑PS合劑的製備方法，其特徵在於，1)分別將權利要求1所述兩菌株接種到PDA培養液中分別培養37。C180rpm，16_20小時後在超淨工作檯中分別取樣測600nm處的OD值，測定過程中以未接菌的培養液來調零；所用PDA培養液配製方法為用200克土豆削皮後切成小塊放到水裡煮，沸騰後至少煮20分鐘以上，接著用四層醫用紗布過濾，濾液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，pH值調至7.2-7.4，然後121。C滅菌20分鐘；2)當培養至0D值在0.5—0.8之間時，將種子菌液以l:IOO體積比加入PDA培養液中，30°C180rpm振蕩培養20—24小時，然後4000g離心10min，每1000ml培養液獲得13—16g溼菌，每克溼菌含4X10"—10"個菌體；3)分別取溼菌與菌體保藏液按1g:40ml配成菌劑，菌體保藏液為0.01mol/L磷酸鹽緩衝液，還含有濃度為0.001mol/L的Tween20;再將權利要求1所述兩菌株菌劑按體積比l:l混合均勻，得複合生防菌劑PS合劑，成品中活菌總濃度為1X109—1X1012cfu/ml，3、權利要求1或2所述一種防治多種蔬菜土傳病害的複合生防菌劑PS合劑在防治溫室及大田蔬菜青枯病、疫病、和根結線蟲土傳病害方面的應用。全文摘要一種防治多種蔬菜土傳病害的生防複合菌劑PS合劑，屬於農作物防病治病
技術領域：
。PS複合菌劑由兩種生防細菌組成，分別是PX35和SM21。兩種細菌分別在PDA培養液37℃180rpm振蕩培養20～24小時，然後4000g離心10min，取溼菌菌體保藏液按1∶40配成菌劑，再按1∶1比例混勻，成品中活菌總濃度為1×109～1×1012cfu/ml。在溫室條件下，PS合劑對茄科作物青枯病防效為67.40％，對茄科作物疫病防效為77％以上，對蔬菜根結線蟲病的防效為58.59％，促生作用明顯；在田間，防效穩定，增產可達50％～80％；同時還可以改善土壤板結現象。文檔編號A01P5/00GK101595892SQ20091002686公開日2009年12月9日申請日期2009年5月27日優先權日2009年5月27日發明者徐劉平,李師默,薛慶雲,郭堅華申請人:南京農業大學