利用泡囊假單胞菌促進植物修復土壤鎳汙染的方法
2023-06-06 12:08:41
專利名稱：利用泡囊假單胞菌促進植物修復土壤鎳汙染的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用泡囊假單胞菌(Pseudomanas vesicularis)促進植物修復土壤鎳汙染的方法。
背景技術：
上壤重金屬汙染來源面廣、形式多種多樣。如工業生產過程中排放的廢水、廢氣和廢渣，也有農業生產上大量施用的化肥、農藥和除草劑等。當土壤接納這些汙染物質的量超過自身的淨化能力時，則導致土壤汙染。據資料，全球每年釋放到環境中的有毒重金屬高達數百萬噸，其中鎳為38.1萬噸。至1998年我國農田受重金屬汙染的面積達到2000萬公頃，給農業生產、環境安全和人類健康造成了不可忽視的影響。
當前，可供治理土壤重金屬汙染的方法主要有理化修復法和生物修復法。
理化修復法有客土(換土)法、沉澱法、淋洗法、電化法、磁化法。這些物理或化學方法各有其優點，但一般都存在花費高、工程量較大、易造成二次汙染等問題。
以植物修復技術為核心的生態恢復技術是以植物耐受和富集某種或某些有機或無機汙染物為基礎，利用植物與微生物的共生體系，清除環境中汙染物的一種環境汙染治理技術。植物修復技術是通過植物的吸收、揮發、根濾、穩定等作用，淨化和固定環境中的汙染物，達到淨化環境的目的。植物修復是一種新興的重金屬汙染原位綠色修復技術，作為其核心技術之一的植物提取技術，已發展成為環境科學領域的研究與應用熱點，並引起政府、學術界和企業界的高度重視。
利用超積累植物進行重金屬汙染土壤的治理工作雖然取得了一些成功的案例，但由於這種植物是在長期受重金屬脅迫的土壤條件、氣候條件下產生的突變體，絕大多數生長慢、生物量小，這在一定程度上限制了土壤淨化的效率。這些因素使得超積累植物要大規模商業化利用還有一定的差距。由於國內對這一技術的研究起步較晚，在種質資源、修復技術的研究、開發和應用等方面，都亟需提高。
已知的鎳超積累植物有300多種，主要集中在北美洲、大洋洲和歐洲等國家。庭薺屬的Alyssumcorsicum和Alyssum murale已在土壤商業修復中使用[Li YM，et al.PLANT AND SOIL.2003，249(1)107-115]。
發明內容
本發明的目的是提供一種利用泡囊假單胞菌(Pseudomanas vesicularis)促進植物修復土壤鎳汙染的方法。
本發明通過將泡囊假單胞菌接種到修復土壤的植物的根部，建立根際細菌與植物的共生關係，利用泡囊假單胞菌具有分泌鐵載體和降低植物體內乙烯水平以及能利用1-氨基環丙烷-1-羧酸作為唯一氮源的特點，在不影響植物地上部分的重金屬鎳含量前提下，提高植物生長速度和增大植物生物量，進而提高了植物對重金屬鎳的富集效果。土壤經過這一菌株處理後，該細菌可以在鎳汙染土壤中定殖，可持續促進植物對重金屬鎳的富集，直到土壤中的鎳含量達環境安全標準。
本發明方法的具體步驟包括(1)將泡囊假單胞菌菌種進行擴種培養，製成菌液，菌液濃度為OD600≥0.8(通常為OD600＝0.8～1.5)；(2)控制土壤pH值於5.5～7之間；(3)以鎳超積累植物作為土壤修復植物；按以下方法之一用菌液處理(a).採用種子直接播種時，種子表面經70％乙醇消毒1～3min，1％次氯酸鈉浸泡10～15min，用無菌水將種子衝洗乾淨，再經菌液浸泡1～1.5h，然後播種(最好採用穴播，覆蓋一薄層土)；(b).採用幼苗移栽種植時，先將菌液直接施用到土壤穴中，用菌液量為10mL～20mL/穴，再將幼苗根部蘸上菌液後植入施用過菌液的土壤穴中；(c).按(a)方法處理種子並播種，長至幼苗時按(b)方法處理並移栽幼苗；(4)按常規管理，定期收割植物地上部，一年兩次，直到土壤鎳達到安全標準。
收割的植物地上部分可進行統一處理，如在垃圾填埋區安全填埋或焚燒。
本發明方法所用的泡囊假單胞菌優選為泡囊假單胞菌GIM 1.0006(購自廣東省菌種保藏選育實驗室)，該菌種由廣東省菌種保藏選育實驗室保藏並對公眾公開發放，保藏編號為GIM 1.0006。
上述本發明的方法所用的鎳超積累植物優選為庭薺屬Alyssum corsicum或庭薺屬Alyssum murale。
按照上述本發明的方法，其中用菌液浸泡種子時，種子與菌液的用量比例通常為種子∶菌液＝1∶(2～3)體積比。
本發明的方法所用的泡囊假單胞菌還可以通過如下方法得到採用植物根際土壤製備土壤懸液，土壤懸液接種到PAF培養基(蛋白腖10g、酪氨酸10g、MgSO41.5g、H2PO41.5g、甘油10mL，H2O 1000mL，pH7.0)後，在100r/min 25℃培養5d後，將0.5mL菌液塗布於固體平面培養基上，置培養箱內37℃培養，待平面培養基上長出菌落後，將菌落分別接種到新的PAF固體培養基上培養，經過2～3次的分離後，得到純化的泡囊假單胞菌(Pseudomanas vesicularis)菌株，再轉移到PAF固體斜面培養基上保存。
本發明所用的泡囊假單胞菌(Pseudomanas vesicularis)菌株的分類學特徵如下(1)為革蘭氏陰性好氧桿菌，分類上屬於假單胞菌科(Pseudomonadaceae)假單胞菌屬(Pseudomanas)泡囊假單胞菌。
(2)桿菌，0.5×1.0～4.0微米，鞭毛單極生，菌落的色素為黃色，氧化酶反應為弱陽性。
(3)能分泌鐵載體，銨鹽能作為主要氮源，而硝酸鹽不能成為主要氮源。
(4)專性好氧，最適生長溫度為30℃，能在37℃生長，41℃不生長，4℃也不能生長。
本發明方法具有以下突出效果1.本發明所選用的泡囊假單胞菌，通過根際細菌與植物的共生關係，可促進植物生長，提高植物生物量，從而提高植物對重金屬汙染土壤的修復效果，潛在經濟效益可觀。
2.本發明所選用的泡囊假單胞菌，為本土的微生物菌種資源，容易在土壤中繁殖和定居，對植物修復有持續的促進作用，也可提高植物抗病蟲害的能力。
3.本發明所用菌種提高了目前綠色原位修復效果，所收穫的植物地上部分進行集中安全填埋或焚燒，不會造成二次汙染，同時修復進程不會破壞土壤結構，並對土壤因重金屬汙染而引起的土壤退化和生產力下降有改善作用。
具體實施例方式
以下通過實施例對本發明作進一步說明。
實施例土壤修復(1)種苗準備供試植物為鎳超積累植物——庭薺屬Alyssum corsicum，分菌液處理和對照2組。種子用70％乙醇消毒1min，1％次氯酸鈉浸泡10min，後用無菌水衝洗乾淨(一般衝洗3次)；再用5mL菌液(OD6000.8～1.5)浸泡1h。對照用種子直接用去離子水浸泡。隨後轉入營養土中發芽和育苗，等幼苗長到4-5片葉後移栽。
(2)試驗土壤瀦育型水稻土、雲南元江土和雲南墨江土；土壤重金屬鎳含量水稻土＞400mg/kg，雲南元江土＞3500mg/kg，雲南墨江土＞5400mg/kg。
(3)移栽和管理植物移栽前，每穴施菌液(OD6000.8～1.5)20mL；移苗時，將植株根系蘸上菌液後才植入施用過菌液的土壤穴中。對照土壤中不施菌液，植株直接移植到土壤中。植株移栽後的生長期為70d，按常規管理。
(4)收穫後測定，水稻土中加菌處理後植株地上部分生物量為558mg株-1，較對照高29％；雲南元江土中，地上部分的生物量較對照高309％；雲南墨江土中，地上部分的生物量較對照高43％。
(5)收穫後測定，加菌液處理後，地上部分鎳含量分別為水稻土＞14000mg/kg，雲南元江土＞1400mg/kg，雲南墨江土＞1800mg/kg。
(6)修復效果比較水稻土加菌處理後地上部富集鎳為7.831mg株-1，較對照5.092mg株-1增加了54％；元江土加菌處理後為0.065mg株-1，較對照0.016mg株-1增加了306％，墨江土加菌處理後為0.037mg株-1，較對照0.028mg株-1增加了32％。
持續收割植物地上部，土壤中的鎳含量不斷減少，直到汙染土壤鎳含量減少到正常土壤水平，土壤鎳汙染消除。
權利要求
1.一種利用泡囊假單胞菌促進植物修復土壤鎳汙染的方法，具體步驟包括(1)將泡囊假單胞菌菌種進行擴種培養，製成菌液，菌液濃度為OD600≥0.8；(2)控制土壤pH值於5.5～7之間；(3)以鎳超積累植物作為土壤修復植物；按以下方法之一用菌液處理(a).採用種子直接播種時，種子表面經70％乙醇消毒1～3min，1％次氯酸鈉浸泡10～15min，用無菌水將種子衝洗乾淨，再經菌液浸泡1～1.5h，然後播種；(b).採用幼苗移栽種植時，先將菌液直接施用到土壤穴中，用菌液量為10mL～20mL/穴，再將幼苗根部蘸上菌液後植入施用過菌液的土壤穴中；(c).按(a)方法處理種子並播種，長至幼苗時按(b)方法處理並移栽幼苗；(4)按常規管理，定期收割植物地上部，一年兩次，直到土壤鎳達到安全標準。
2.按照權利要求1所述的方法，其特徵是步驟(1)所用的泡囊假單胞菌為泡囊假單胞菌GIM 1.0006菌株。
3.按照權利要求1所述的方法，其特徵是步驟(3)所用的鎳超積累植物為庭薺屬Alyssum corsicum或庭薺屬Alyssum murale。
4.按照權利要求1或2所述的方法，其特徵是步驟(3)方法(a)中用菌液浸泡種子時，種子∶菌液＝1∶(2～3)體積比。
5.按照權利要求1，2或3所述的方法，其特徵是步驟(1)中的菌液濃度為OD600＝0.8～1.5。
全文摘要
本發明涉及一種利用泡囊假單胞菌(Pseudomanasvesicularis)促進植物修復土壤鎳汙染的方法。本方法通過將泡囊假單胞菌接種到修復土壤的植物的根部，建立根際細菌與植物的共生關係，利用泡囊假單胞菌具有分泌鐵載體和降低植物體內乙烯水平以及能利用1－氨基環丙烷－1－羧酸作為唯一氮源的特點，在不影響植物地上部分的重金屬鎳含量前提下，提高植物生長速度和增大植物生物量，進而提高了植物對重金屬鎳的富集效果。土壤經過這一菌株處理後，該細菌可以在鎳汙染土壤中定殖，可持續促進植物對重金屬鎳的富集，直到土壤中的鎳含量達環境安全標準。
文檔編號B09C1/10GK1695836SQ200510034858
公開日2005年11月16日 申請日期2005年6月1日 優先權日2005年6月1日
發明者仇榮亮, 蔡信德 申請人:中山大學