一種區分草魚和青魚的pcr-rflp方法

2023-06-05 20:24:46 1

一種區分草魚和青魚的pcr-rflp方法
【專利摘要】本發明屬於分子標記領域，具體公開了一段區分草魚和青魚的DNA片段和一組引物及PCR-RFLP鑑別方法。使用該引物進行PCR反應，草魚和青魚都可以擴增出長度為1140bp的Cyt?b片段，該PCR產物使用限制性內切酶Bgl?I進行酶切，電泳圖譜出現2條條帶的為草魚，只有1條條帶的為青魚。因此可根據PCR產物酶切後有無條帶的變化實現物種的準確快速鑑別。
【專利說明】一種區分草魚和青魚的PCR-RFLP方法
[0001]所屬【技術領域】本發明屬於分子標記【技術領域】具體說是一組區分草魚和青魚的引物、片段、內切酶和方法。
[0002]【背景技術】草魚(Ctenopharyngodon idellus)和青魚(MylopharyngodonPiceus)是我國淡水養殖的傳統經濟品種，是四大家魚之二。二者都屬於鯉科雅羅魚亞科，外觀形態十分相似，很難區分。成魚體色以青魚較深而草魚較淺，常被用作兩者區分的重要標誌。然而，顏色信息並不穩定，例如經固定液浸泡的標本會失去其本來顏色，即便是活魚其體色也往往隨生長環境的顏色變化而變化，因此，在類似情況下，依靠體色來鑑別二者顯然是不可靠的。另外，在仔稚魚等早期發育階段，無論根據形態還是體色都很難將二者準確區分。物種難以準確鑑別，無疑給種質保存、養殖生產以及科學研究等工作增加了難度和失敗的風險。 [0003]利用RAPD、AFLP、SSR等分子標記技術對研究對象的核基因組進行篩查，可以從分子水平直接尋找兩者的核基因組差異，但是這些方法大都需要經過大量測序或複雜的技術操作後進行比較做出判斷，費時費力。本發明利用線粒體DNA Cyt b基因PCR-RFLP方法，可以快速準確簡便的區分草魚和青魚。
[0004]目前國內外尚無有關利用PCR-RFLP方法區分草魚和青魚的報導，本發明填補了該領域的空白。
[0005]
【發明內容】

【發明內容】
分列如下:
[0006]1、一組區分草魚青魚的引物、片段、限制性內切酶及其方法，其特徵在於該引物的序列是由GenBank資料庫關於兩者的線粒體DNA Cytb基因序列(草魚JN673556.1)和(青魚AF051870.1)的保守區設計合成的。
[0007]2、如I所述的引物，其序列長度為15~22bp
[0008]3、如I~2所述的引物，其中一對引物序列為SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的序列。
[0009]4、一段鑑別草魚青魚的Cytb基因片段，其特徵在於該片段的序列包含SEQ ID NO:I和SEQ ID NO:2所示序列。
[0010]5、一種鑑別草魚青魚苗種的PCR-RFLP方法，其特徵在於該方法根據樣品PCR-RFLP反應產物的電泳結果鑑定樣品為草魚或是青魚。
[0011]6、如4和5所述的方法，其特徵在於該方法中PCR產物經經Bgl I酶切後，被切成256bp和884bp兩條帶的為草魚，PCR產物沒有被酶切的為青魚。
[0012]具體來說，本發明目的是提供快速鑑別草魚青魚的一對引物和一種限制性內切酶及一段DNA片段，以及一種區分草魚和青魚的方法。
[0013]本分明利用PCR-RFLP技術，首先根據GenBank資料庫關於兩者的線粒體DNACytb基因序列(草魚JN673556.1)和(青魚AF051870.1)的保守區設計了一對引物(引物序列:SEQ ID NO:3:5』-ATGGCAAGCCTACGAAAAACC-3』 ；SEQ ID NO:4:5』 -AGCTCATTTTAGTGCTTTAT-3』 )對草魚和青魚的基因組DNA進行擴增，兩者都可以擴增出一條約I IOObp的條帶，通過測序獲得了長度為1140bp的DNA序列，如SEQ ID N0:1(草魚)和SEQIDNO:2(青魚)所示，對此序列進行內切酶位點分析，並選擇出可用於區分草魚青魚的限制性內切酶Bgl I。[0014]本發明提供了一種區分草魚青魚的方法，其特徵在於根據樣品的PCR-RFLP反應產物的電泳結果鑑定樣品。該方法中PCR引物由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列間隔不少於1140bp的序列設計合成。RFLP所用內切酶根據SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的序列去掉含種類多態性位點後設計。該方法中，PCR產物經限制性內切酶Bgl I酶切後，在256bp處被切成兩條帶(256bp和884bp)的為草魚，沒有被酶切的為青魚。
[0015]PCR 反應體系為 25μ 1，含 10XBuffer2.5μ 1、MgCl22y 1、dNTP(各 2.5μπιο1 /L) 2 μ 1、上下遊引物(ΙΟμ--οΙ / L)各1μ 1、Taq DNA聚合酶1U、基因組DNA20ng。反應程序為 94°C 預變性 5min,之後進行 40 個循環(94 °C 45scc, 47.5°C 50sec, 72°C 50sec),最後72°C 延伸 8min ;4°C 保存。
[0016]1^1^反應體系為2(^1，含6 4 1?0?產物，2 4 110父811打(^，14 1881 I (10U / mL)，11 μ I滅菌雙蒸水。反應程序:混勻並瞬時離心，用封口膜封口後，置37°c水浴中消化5~8h，80°C處理25min以滅活內切酶。
[0017]用物種已準確知曉的30條草魚和30條青魚樣品的基因組DNA進行檢驗，PCR反應顯示所有樣品均可以擴增出一條約IlOObp的條帶(圖1)。經Bgl I酶切後，電泳結果顯示，草魚Cyt b被切成256bp和884bp兩條帶，而青魚PCR產物沒有被酶切(圖2)。因而，根據PCR產物酶切後呈現2條或I條電泳條帶可鑑別其為草魚或青魚。
[0018]綜上所述，本發明提供了一種快速準確區分草魚青魚的分子標記方法，該方法通過對細胞色素b基因的擴增，然後對其PCR產物進行限制性內切酶酶切，根據酶切後有無條帶的變化來判斷是草魚還是青魚。實施例證明了該方法鑑別草魚青魚準確可靠。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1、草魚青魚的Cyt b基因PCR反應結果，顯示用一對引物SEQ ID NO:3和SEQID NO:4對草魚青魚的基因組DNA進行PCR擴增，都可以擴增出一條約IlOObp的條帶。泳道I~12為草魚,泳道13~24為青魚,泳道25為分子量標準。
[0020]圖2、草魚青魚Cytb基因PCR擴增產物被Bgl I酶切後的效果。草魚Cyt b被切成256bp和884bp兩條帶，而青魚PCR產物沒有被酶切。泳道I~12為青魚，泳道13~24為草魚，泳道25為分子量標準。
【具體實施方式】
[0021]實施例:
[0022]用常規DNA提取方法分別提取草魚青魚各30尾的基因組DNA，稀釋到IOng / μ I以備PCR擴增使用；
[0023]PCR 引物根據 GenBank 中提交的草魚(JN673556.1)和青魚(AF051870.1) Cyt b 序列設計:
[0024]SEQ ID NO:3:5，-ATGGCAAGCCTACGAAAAACC-3』
[0025]SEQ ID NO:4:5』-AGCTCATTTTAGTGCTTTAT-3』
[0026]PCR 反應體系 25 μ I，含 10 X Buffer2.5 μ L、MgCl22 μ L、dNTP (各 2.5 μ mol /L)2yL、上下遊引物(10 μ mol / L)各 lyL、Taq 酶(5U / μ L) 0.25 μ L、基因組 DNAl.5 μ L。反應程序為94°C預變性5min，之後進行40個循環(94°C變性45s，47.5°C退火50s，72°C延伸50s)，最後72°C延伸8min ;4°C保存。反應設不含反應設不含模板DNA的空白對照。PCR產物用I %的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，溴化乙錠(EB)染色，凝膠成像系統觀察拍照，結果如圖1所示。
[0027]從圖1可以看出，所有草魚和青魚的PCR產物都擴出一條約IlOObp的條帶，空白對照沒有擴出條帶。
[0028]隨機選取草魚和青魚各8個樣本的PCR擴增產物送至上海生工生物工程有限公司純化，並進行雙向測序，測序反應採用和PCR反應一致的正、反向引物。根據所測得的序列，跳過種類多態性位點後設計得出可用於鑑定草魚青魚的限制性內切酶Bgl I。
[0029]酶切反應體系為20 μ 1，含 6 μ LPCR產物，2 μ LlOXBuffer，I μ LBgl I (10U / ML)，IluL滅菌雙蒸水。混勻並瞬時離心，用封口膜封口後，置37°C水浴中消化5~8h，80°C處理25min以滅活內切酶。酶切產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，照相，結果如圖2所示:
[0030]經Bgl I酶切後，電泳結果顯示,草魚Cyt b被切成256bp和884bp兩條帶,而青魚PCR產物沒有被酶切。
[0031]為了驗證結果的準確性，選取了青魚和草魚多個不同的個體進行重複實驗，驗證
結果都一致。
[0032]PCR-RFLP方法結果準確、操作簡便，同時對實驗設備要求也較低，只需剪取實驗用魚的小部分尾鰭提取基因組DNA，當天就可以出結果，實現對青魚和草魚的快速準確的鑑另O。本發明利用PCR-RFLP方法可以快速、準確地區分青魚和草魚。
【權利要求】
1.一對區分草魚和青魚mtDNA細胞色素b(Cyt b)基因的引物，其特徵在於序列為SEQIDNO:3 和 SEQIDN0:4 所示的序列。
2.一種根據樣品DNA的PCR-RFLP反應產物的電泳結果鑑定樣品所屬物種的快速鑑定方法，其特徵在於該方法採用的PCR引物其序列為SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:4所示的序列，PCR產物經過內切酶Bgl I酶切後，電泳圖譜出現大小為256bp和884bp兩個條帶的樣品為草魚，出現大小為1140bp —個條帶的樣品為青魚。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於PCR反應體系為25ul，含10XBuffcr2.5μ 1,25m mo I / L 的 MgCl22 μ 1、各 2.5 μ mol/L 的 dNTP2 μ 1、SEQ IDNO:2 和SEQ ID NO:3所示序列的引物各0.4 μ mol/L、Taq DNA聚合酶1U、基因組DNA20ng，PCR反應程序為 94°C預變性 5min,40 個循環的 94°C 45scc、47.5°C 50scc、72°C 50scc，接著 72°C延伸8min ;RFLP反應體系和程序為20 μ 1，含6 μ IPCR產物、2 μ 110XBuffcr、10U / ml的Bgl I I μ 1，37°C水浴消·化5~8h，80°C 25min滅活內切酶。
【文檔編號】C12Q1/68GK103525933SQ201310487351
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月17日 優先權日:2013年10月17日
【發明者】楊玲, 孟慶磊, 付佩勝, 張龍崗, 王錫榮, 安麗, 鍾君偉, 張志山 申請人:山東省淡水水產研究所