一種體外誘導人骨髓基質幹細胞構建軟骨的方法
2023-06-06 14:28:01 2
專利名稱：一種體外誘導人骨髓基質幹細胞構建軟骨的方法
技術領域：
本發明涉及醫學和生物醫學工程領域，更具體地涉及利用人骨髓基質幹細胞(hBMSCs)構建組織工程化軟骨及其製備方法和用途。
背景技術：
外傷、感染、腫瘤或骨軟骨炎等疾病均可以導致軟骨的損傷，由於軟骨組織中缺少幹細胞和血供，損傷後自我修復能力很低，即使在某些區域存在少量自身修復的現象(如小面積關節軟骨損傷後可以再生)，但修復的組織往往是纖維組織和軟骨組織並存的複合物，缺少完整的化學組分和足夠的力學特性，無法發揮正常軟骨的功能。而某些支架性軟骨如耳廓軟骨，在損傷或感染後更是完全喪失修復能力，導致器官外形嚴重畸形。因此，軟骨損傷性或缺損性疾病的治療向臨床醫生提出了巨大的挑戰。
到目前為止，較為多用的治療手段包括自體軟骨的游離或帶蒂移植(主要取自肋軟骨)、異體軟骨的游離移植、自體和異體的軟骨細胞注射移植、骨膜或軟骨膜移植、體內應用IGF等生長因子促再生治療、關節軟骨下骨鑽孔法等。尚有應用贗復體治療方法，如使用膨體聚四氟乙烯等高分子材料製成的耳廓支架，或固體矽橡膠製成的鼻背形支架來進行局部支撐或充填。
但這些方法均存在明顯的缺點，如自體軟骨移植是以犧牲正常組織為代價的，植入後軟骨在體內會發生一定程度的縮小和變形。患者不但要在取材時遭受另外一次手術的痛苦，還容易出現氣胸、胸廓塌陷和瘢痕等供區併發症。此外，更為關鍵的是自體軟骨來源非常有限。異體和異種移植物不但具有免疫原性可引起受體的免疫排斥反應，而且有傳播愛滋病、肝炎等病原體的危險。
雖然人工合成的軟骨組織代用品具有製作簡單，使用方便的優點，但是替代材料只具備充填、支持及維持美觀的作用，缺少軟骨生物學功能，不是真正意義上的結構與功能重建，而且，作為異物，它的組織相容性差，經常出現移植部位疼痛、人工代用品外露等問題，無法滿足患者的治療要求。
組織工程技術綜合了細胞生物學、工程學、材料學和外科學等學科，在體外或體內應用有活力的種子細胞、可降解的生物材料和信號分子等來獲得有活力有功能的組織。它的優點在於從病人損傷相對輕微的部位獲取少量標本，分離出其中的細胞，進行體外培養及大規模擴增。再將擴增後的活細胞接種到具有合適的化學成分和物理構型的，天然或人工合成的可降解、生物相容性良好的高分子材料上，通過體外培養或同時加入各類生物活性因子及生物力學刺激，構建出組織工程化移植物，並用於組織或器官缺損的功能重建。它為軟骨損傷性或缺損性疾病的治療帶來了新的希望。
按照組織工程的原則，Vacanti等已經用牛軟骨細胞和聚乙酸、聚乳酸複合支架成功構建出透明軟骨組織。曹誼林等應用組織工程技術在裸鼠的背上成功地再造了精確人耳形態的軟骨，之後的大量研究表明，在高等大型哺乳動物甚至人體內也可以利用組織工程技術再生軟骨組織，但這些研究所應用的種子細胞均為軟骨細胞，在臨床的應用受到了很大的限制，主要是因為自體或異體軟骨細胞來源有限取材創傷大，體外大量擴增又會發生老化與去分化，失去軟骨細胞的表型。生長因子雖可在一定程度上擴增軟骨細胞，但其費用昂貴，所形成組織在體內的長期效果尚不肯定。
許多作者嘗試應用外源性生長因子誘導動物BMSCs向軟骨細胞分化進行，動物包括兔、馬、大鼠、豬、羊等，應用的生長因子主要為TGF-β1、IGF-I、PDGF、TGF-β3、BMP-6、地塞米松等。文獻報導中大多應用三維立體的條件培養，包括micromass微團塊培養或者不同工藝材料的三維支架培養。經6周以上時間的誘導培養後形成了具有典型的軟骨組織結構，同時具備一定含量軟骨特異性基質成分和一定力學強度的軟骨組織，說明了利用外源性生長因子誘導BMSCs構建軟骨組織是完全可行的。我們採用豬BMSCs為種子細胞，首次建立了包括TGF-β1、IGF-I和地塞米松等誘導因子的組合誘導劑，體外成功構建出結構和力學特性良好的軟骨組織，並進一步通過體內實驗驗證了體外構建軟骨移植體內後可以進一步成熟，證實了豬BMSCs構建軟骨完全可行。
但是，人BMSCs與動物細胞具有本質上的區別，包括細胞的增殖能力、分化能力、細胞表面抗原、對外源性誘導劑的反應能力等等，雖然許多作者嘗試應用人BMSCs構建軟骨組織，但是存在以下幾方面關鍵性問題1、生長因子的誘導效能不佳；2、生長因子的誘導作用缺乏特異性；3、軟骨特異性的基質合成和分泌量少；4、體外構建組織力學強度不佳；5、構建組織內外分布不均勻；6、構建特殊形狀(如耳廓、鼻翼等)軟骨較困難。這些困難嚴重影響了人BMSCs的體外軟骨構建和臨床應用。
因此本領域迫切需要開發安全性高、組織相容性好、具有生物學功能的組織工程化人軟骨移植物。
發明內容
本發明的目的就是提供一種使用安全、製備簡便的組織工程化軟骨。
本發明的另一目的就是提供所述組織工程化軟骨的製法方法和用途。
在本發明的第一個方面，提供了一種組織工程化軟骨移植物，它包括(a)人骨髓基質幹細胞hBMSCs；(b)藥學上可接受的生物可降解材料。
其中所述的hBMSCs是自體細胞，來源於髂骨、胸骨、肋骨等松質骨。
在另一優選例中，所述的移植物為固態細胞材料複合物，且hBMSCs在複合物中的濃度為1×106個細胞/cm3-5×108個細胞/cm3，優選2×107個細胞/cm3-7×107個細胞/cm3。hBMSCs在複合物中的含量為1×106個細胞/克-5×108個細胞/克，優選2×107個細胞/克-7×107個細胞/克。
在本發明所述的移植物中，所述的藥學上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、PLGA、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚胺基酸、假聚胺基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環氧乙烷、聚對二氧六環酮、膠原、明膠、透明質酸、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、脫細胞基質，及其共聚物或混合物。
其中所述的移植物外形為人耳廓、鼻背、鼻翼、下頦、顴弓、眉弓、管狀、菱形、片狀、圓柱等多種形狀但不僅限於此。
在本發明的第二個方面，提供了一種如上所述的組織工程化軟骨移植物的製備方法，包括步驟將hBMSCs與藥學上可接受的生物可降解材料混合，形成複合物，其中hBMSCs在複合物中的濃度為2×107-5×107個細胞/cm3。
所述的製備方法中聯合應用體外誘導劑，所述的體外誘導劑包含TGF-β1、IGF-I和地塞米松。
在另一優選例中，所述的體外誘導劑中TGF-β1的濃度為20-50ng/ml、IGF-I的濃度為100-500ng/ml、地塞米松的濃度為10-60ng/ml。
在另一優選例中，所述的體外誘導劑的應用時間為細胞接種到材料上之後24-148小時，體外誘導時間為4-10周。
在另一優選例中，將體外誘導劑以直接脈衝的方式滴加在複合物上在另一優選例中，直接脈衝方式滴加在複合物上的間隔時間為24-96小時，更佳地24-48小時在另一優選例中，體外誘導劑的應用時間為細胞接種到材料上之後24-48小時，體外誘導時間為6-8周在上述的製備方法中，所述的藥學上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、PLGA、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚胺基酸、假聚胺基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環氧乙烷、聚對二氧六環酮、膠原、明膠、透明質酸、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、脫細胞基質，及其共聚物或混合物，但不僅限於此。
由此本發明獲得了一種安全、製備簡便的組織工程化軟骨，並可將它用於軟骨移植中。
圖1顯示了體外誘導培養8周的大體標本。
圖2顯示了體外誘導培養8周的HE染色結果。
圖3顯示了體外誘導培養8周的Safranin-O染色結果。
圖4顯示了體外誘導培養8周的甲苯胺藍染色結果。
圖5顯示了體外誘導培養8周的II型膠原免疫組化染色結果。
圖6顯示了軟骨特異性胞外基質均染均勻而豐富。
圖7顯示了軟骨特異性胞外基質均染均勻而豐富。
具體實施例方式
本發明人在嚴謹的實驗工作中發現，hBMSCs獲取容易，可以通過密度梯度離心或者貼壁法分離出骨髓中的hBMSCs，經體外的擴增後細胞數量明顯增加，在第2代時可達到原細胞量的30-100萬倍，對細胞進行特性鑑定發現細胞仍能夠保持幹細胞特性，具有自我更新的能力，更為重要的是細胞能夠在TGF-β1、地塞米松和IGF-I等生長因子聯合誘導下分化為軟骨樣細胞，並能夠分泌II型膠原和蛋白聚糖。說明這種細胞具備作為軟骨構建種子細胞的條件，進而將細胞接種到PGA為主要材料做成的三維多孔支架上，再進行三維誘導培養，發現細胞能夠很好地與材料粘附並分泌蛋白聚糖和II型膠原等軟骨特異性細胞外基質，在基質逐漸增多包埋細胞和支架的同時，PGA纖維等支架逐步降解消失，最終在體外形成了成熟的軟骨組織，這完全符合組織工程技術的基本原理。為了解這種成體幹細胞構建的軟骨能否在皮下環境中長期存留，我們將體外構建4周的軟骨植入裸鼠皮下，4周後發現植入的軟骨仍能夠保持原有的大小和形狀，而且生物力學性質有了明顯改進。最近，體外構建較大的片狀軟骨(30mm×20mm)也獲得成功。
人們注意到骨髓基質中有一類被稱為是「骨髓間充質幹細胞(BMSCs)」的非造血細胞亞群，這些細胞能夠在體內或體外進行擴增和誘導，最終分化為成骨細胞、脂肪細胞、肌腱細胞、神經細胞和生血基質等。在有地塞米松、TGF-β1、TGF-β3等誘導因子存在下，BMSCs亦能在體外直接被誘導成為軟骨樣細胞。相比軟骨細胞，BMSCs具有更多的優點，它們來源廣泛，取材時供區損傷輕微，在體外又能夠大量擴增，最終可得到活力好、數量充足的細胞。這為我們構建自體或同種異體軟骨提供了一個新的種子細胞來源。
術語本發明所用的術語「骨髓間充質幹細胞(BMSCs)」和「骨髓基質幹細胞」可相互替換使用。
術語「hBMSCs的分離」指將存在於動物骨髓中的基質幹細胞由骨髓的多種細胞群體中選取出來的過程。
術語「hBMSCs的擴增」指為了獲取大量hBMSCs而在體外環境中大量增殖的過程。
術語「誘導」指提供特殊的生化環境，將具有多向分化能力的幹細胞等細胞群體轉變為另一種功能特性不同的細胞群體的過程。
術語「接種」指將細胞均勻分布於三維支架材料上的過程。
術語「自體移植」指將所需生物活體材料(如骨髓基質幹細胞)從某個體中取出並再施用於同一個體的過程。
術語「直接脈衝式滴加」指將生長因子按著要求劑量配製好之後直接滴加在細胞材料複合物上，然後後添加培養液，間隔一段時間後重複滴加生長因子。
hBMSCs本發明中hBMSCs的來源沒有特別限制，一種優選的來源是來自自體的骨髓。
分離獲得hBMSCs的方法是文獻多次報導的公認方法。一種優選的方法是全麻下或局麻下骨髓穿刺抽取自體骨髓，以密度梯度離心法分離出其中的有核細胞，加入適合的培養液(如含有10％胎牛血清，L-穀氨醯胺300ug/ml，維生素C50ug/ml，青、鏈黴素各100U/ml的DMEM培養液)，製成細胞懸液，以約2×105/cm2的密度接種於培養皿，於37℃、5％CO2、100％飽和溼度的條件下培養。48小時後首次換液，以後隔日換液繼續培養。待細胞生長近匯合後，以0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA消化，以1×104/cm2的密度接種進行細胞傳代。優選第2～15代細胞用於製備人工軟骨。
一類優選的hBMSCs分離培養方法是全骨髓分離培養法，在抽取骨髓後進行多次洗滌，以約6×105個有核細胞/cm2的密度(但不僅限於此密度)經上述培養液稀釋後接種於培養皿中，靜態培養5天左右，使多數骨髓基質細胞(包括骨髓基質幹細胞)充分貼壁，再經多次衝洗和換液去除紅細胞及其它未貼壁的細胞，待細胞生長近匯合後常規消化、傳代，在培養擴增過程中可使hBMSCs逐步純化。優選體外培養的第2代～第9代hBMSCs進行軟骨構建，此時的hBMSCs有較強的增殖能力並具有多向分化的潛能，包括向軟骨細胞分化的潛能。
生物可降解材料可用於本發明的組織工程化軟骨的材料是醫學上可接受的生物可降解材料，包括(但並不限於)(a)可降解性合成高分子材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、PLGA、聚羥基丁酸(PHB)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮(polyphosphazenes)、聚胺基酸(polyamino acid)、假聚胺基酸(pesudo-polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷(polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、透明質酸、聚對二氧六環酮(polydioxanone)等；(b)天然可降解材料，例如膠原(collagen)、明膠(gelatin)、糖氨聚糖(glycosaminoglycan，GAGs)、殼聚糖(chitosan)、甲殼素(chitin)、海藻酸鹽以及各種脫細胞基質等；(c)上述材料的共聚物或複合型材料，尤其是高分子材料與天然材料的複合材料，以及固體材料與可注射性材料的複合材料。
優選的醫學上可接受的生物可降解材料是固體材料或固、液體複合材料，例如聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、膠原等。本發明中的材料可預製成各種精確的大小與形狀，以適應不同大小和形狀的軟骨組織構建。當材料為固體型材料時，可以直接將材料預製成需要的大小與形狀，也可以通過計算機輔助及快速成型技術定製的模型對材料進行精確的塑性。
hBMSCs-生物材料複合物本發明中hBMSCs-生物材料複合物的細胞接種濃度通常約為2×107/ml至7×107/ml或更高。材料為固體性材料或者固、液體複合材料，以培養液調整細胞濃度，然後與固體性材料混合，其中混合時培養液與固體性材料的比例沒有特別限制，但是以該固體材料所能夠吸附培養液的最大量為準。當支架材料為特殊三維形狀時，如耳廓或鼻背形，按實際體積的大小來進行計算。
製備方法本發明的組織工程化軟骨的製備方法簡便，將一定數量的所述hBMSCs與藥學上可接受的生物可降解材料混合，再經體外誘導即可。
在本發明的組織工程化軟骨移植物構建軟骨過程中，主要以TGF-β1、IGF-I和地塞米松等生長因子進行體外誘導，也可優選添加或複合其它各種細胞因子或生長因子，如BMP-2、CDMP等，從而加速誘導過程及提高細胞外基質合成能力等。
一定劑量的TGF-β1、IGF-I和地塞米松誘導組合可以高效誘導hBMSCs成軟骨分化，但是誘導豬BMSCs的劑量應用於hBMSCs無法達到良好的誘導效能，必須要加大生長因子的應用劑量。在一個優選例中，TGF-β1的濃度為20-50ng/ml、IGF-I的濃度為100-500ng/ml、地塞米松的濃度為10-60ng/ml可以達到穩定高效的誘導效能。
既往在豬BMSCs接種到材料上7天後開始誘導，但應用於hBMSCs後發現細胞外基質合成量明顯低下，在一個優選例中，細胞接種到材料上之後24-48小時開始誘導明顯促進胞外基質合成量，增加組織成熟度。
既往對豬BMSCs採取持續性體外誘導劑刺激，但是該誘導方法對hBMSCs的誘導效能不強，優選地，採用直接脈衝式滴加在複合物上的方法，間隔時間為24-48小時，明顯增強誘導效能。
本發明的組織工程化軟骨移植物構建軟骨過程中，主要為靜態培養，或者以離心或振蕩的方式加入力學刺激，也可以通過軟骨生物反應器模擬體內軟骨的力學環境，對體外構建的軟骨施加類似的力學刺激，促進軟骨的成熟與力學性質的改進。
用本發明方法形成的組織工程化軟骨，即hBMSCs與固體性生物材料構成的複合物，該複合物經體外充分誘導後可植入體內皮下或軟骨缺損部位。
一例用hBMSCs與培養液製成濃度為5×107/ml的細胞懸液(不僅限於此濃度)，然後與聚羥基乙酸(PGA)為主的生物支架材料形成複合物(複合物大小、形狀依照軟骨缺損的大小及形狀確定)。該複合物經體外誘導培養6周至8周(不僅限於此時間，期間每3至4天換液一次，以保證細胞營養)，當體外組織工程化軟骨初步形成時植入體內皮下或相應的軟骨缺損部位。亦可將材料製作成具有精細結構外形的三維支架，再接種hBMSCs進行體外誘導，經6-8周(不僅限於此時間)後植入體內軟骨缺損部位。
應用本發明確定的方法，可以成功誘導hBMSCs構建出了具有良好組織學結構、生物化學組成和力學強度的軟骨組織，這種組織能夠滿足皮下移植不變形的要求。通過這些條件優化組合，取得的誘導效果相當穩定而特異，這為軟骨缺損的修復重建提供了堅實的實驗基礎和技術基礎。
應用方法hBMSCs與可降解固態生物材料形成複合物後，在體外進行誘導培養，當適合軟骨缺損大小和形狀的組織工程化軟骨形成後，再植入體內軟骨缺損部位。
本發明的主要優點在於(1)應用自體細胞，且一次取材既可獲得足夠的細胞量；
(2)骨髓穿刺操作簡單，對病人損傷極小，無需住院，且可以重複取材；(3)體外培養方法簡單易學，便於推廣應用；(4)體外誘導方法操作簡便，誘導效果確切可靠；(5)可按軟骨缺損大小和形狀預製移植物的大小和形狀，以達到精確的修復；(6)培養過程便於標準化，易於形成產業化產品。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1hBMSCs的獲取和培養細胞取自人胸骨或者髂骨，供體年齡8-36歲，身體健康，無惡性腫瘤、傳染性疾病及血液系統疾病。
(1)取材麻醉滿意後，常規消毒鋪巾，16號穿刺針於胸骨或者髂骨部位穿刺，抽取骨髓6～8ml，置於肝素化的離心管中。
(2)分離有核細胞(以密度梯度離心法為例)將抽取的骨髓先後用5ml和1ml空針反覆抽吸數次，轉移至另一離心管內，加入少量的無血清DMEM培養液，混勻，3000rpm離心10分鐘，輕輕吸除脂肪及大部分上清液，注意不要攪動下方的沉澱物，重新振蕩混勻，在另一15ml離心管內加入新鮮配製的Percol分離液(購自Pharmacia公司)，分離液表面輕輕加入上述的骨髓細胞懸液(體積為分離液的一半)，900g離心30分鐘，此時離心管內液體分為四層第一層主要是血清和少量的培養液，第二層為有核細胞層，第三層為Percol分離液，第四層主要是沉澱下來的紅細胞。輕輕吸取第二層的有核細胞轉移至另一離心管內，加入適量的無血清DMEM培養液洗滌離心二次。
(3)接種棄上清，細胞以含有10％胎牛血清，L-穀氨醯胺300ug/ml，維生素C50ug/ml，青、鏈黴素各100U/ml的DMEM(購自Gibco，Gland Island，NY，USA)培養液製成細胞懸液，取少量細胞懸液用4％乙酸等體積稀釋破壞殘存的紅細胞，常規計數有核細胞數，以2.5×105/cm2的密度接種於培養皿，常用的100mm塑料培養皿接種有核細胞1.5×107左右，加入細胞懸液9～10ml既可。
(4)培養與傳代將接種好的培養皿置於37℃、5％CO2、100％飽和溼度的條件下，培養48小時後首次換液，此時在低倍鏡下可清楚地見到多個克隆形成，吸除舊培養液，PBS洗滌2～3次，加入新鮮培養液，繼續在相同的條件下培養，隔日更換三分之二量的培養液，一般4～5天後可達到融合狀態，可繼續傳代培養。傳代時吸除培養液，以少量PBS洗滌一次，加入1.5-2.0ml的消化液(含0.02％EDTA及0.25％胰蛋白酶的PBS)，鏡下見大部分細胞胞質回縮、形態變圓後，輕輕吸除消化液，加入適量的含血清的DMEM條件培養液中止消化，收集細胞懸液、計數，以1.5×104/cm2細胞密度接種於新的培養皿內，繼續在相同的條件下培養。隔日更換三分之二量的培養液，一般4～5天後又可達到融合狀態，可繼續傳代培養。以第2～6代細用於實驗效果較佳。
倒置顯微鏡下觀察，hBMSCs呈長梭形或多角形，原代細胞多呈克隆樣生長，傳代後可形成單層，細胞接近會合時排列呈旋渦形。
實施例2PGA三維支架的製作無紡PGA纖維購自Albany公司(Albany，NY，USA)，真空保存。纖維直徑13-15μm。將PGA纖維精確稱量為6mg/塊，用特製的模具壓製成直徑5mm、厚2mm的圓柱體小塊，待形狀固定後，將材料支架完全浸入到75％乙醇中消毒30分鐘。PBS衝洗3遍，再用含10％胎牛血清的DMEM培養基浸泡10分鐘，吸乾後準備接種細胞。
實施例3細胞接種、複合物誘導培養單層培養的第二代hBMSCs達到90％匯合時，應用0.25％胰酶+0.02％EDTA消化。細胞收集後用細胞計數儀計數，臺盼藍染色顯示活細胞數多於95％，1500rpm離心5min使細胞沉澱，棄去上清液，振蕩分散細胞，按5×107個細胞/cm3的密度將細胞懸液接種到圓柱形支架上。共製作24塊hBMSCs-PGA複合物，均於接種後在37℃、5％CO2、100％溼度的環境中靜態培養24小時。其中20塊複合物培養液應用軟骨誘導液直接脈衝式滴加誘導刺激，具體成分包括高糖DMEM，10％FBS，50ng/ml TGF-β1，100ng/ml IGF-I和40ng/ml地塞米松。其餘4塊複合物繼續應用DMEM培養基。所有構建複合物在體外培養8周後取材檢測。
(a)、大體觀察體外誘導培養4周時，誘導組細胞-材料複合物能夠保持原有的大小和形狀，外觀已類似軟骨組織，質地柔韌並有一定彈性；未誘導組細胞-材料複合物明顯縮小變形，暗褐色，質地柔軟無彈性。8周後，複合物仍能夠維持原大小與形狀，外觀上與正常軟骨更為接近，硬度與彈性均有所提高。見圖1(b)、組織學檢查HE染色體外誘導4周時即可見軟骨陷窩樣結構，但成熟的軟骨陷窩數量少，PGA纖維仍較多見，中央部位無細胞和基質沉積，未誘導組含有大量纖維組織和支架材料，極少見到成熟的軟骨陷窩樣結構。8周後，成熟軟骨陷窩數量明顯增多，胞外基質染色加深。見圖2Safranin-O染色本發明培養組新生軟骨均有陽性染色。見圖3甲苯胺藍染色體外誘導培養組細胞外基質中均有大量膠原沉積，而未誘導組染色明顯偏淡。見圖4II型膠原免疫組化體外誘導培養組細胞外基質中較強陽性表達，表明有大量軟骨特異性II型膠原沉積，而未誘導組為陰性。見圖5實施例4細胞-生物支架複合物形成及體內植入與取材單層培養的第二代hBMSCs達到90％匯合時，應用0.25％胰酶+0.02％EDTA消化。細胞收集後用細胞計數儀計數，臺盼藍染色顯示活細胞數多於95％，1500rpm離心5min使細胞沉澱，棄去上清液，振蕩分散細胞，按5×107個細胞/cm3的密度將細胞懸液接種到圓柱形支架上。共製作24塊hBMSCs-PGA複合物，均於接種後在37℃、5％CO2、100％溼度的環境中靜態培養24小時。其中20塊複合物培養液應用軟骨誘導液直接脈衝式滴加誘導刺激，具體成分包括高糖DMEM，10％FBS，50ng/mlTGF-β1，100ng/mlIGF-I和40ng/ml地塞米松。其餘4塊複合物繼續應用DMEM培養基。4周後所有構建複合物行裸鼠皮下移植，體內培養4周後取材，對所形成的軟骨組織進行評價。
大體觀察及組織學檢查體內植入4周後，誘導後的細胞材料複合物可在裸鼠皮下形成組織工程化軟骨，新生軟骨均呈乳白色，質實，有一定的彈性，周圍包繞軟組織膜，未見明顯的血管長入軟骨內。並且構建組織與正常軟骨組織學形態相近，均有成熟的軟骨陷窩形成，軟骨特異性胞外基質均染均勻而豐富(圖6，7)。
討論通過上述實例可以證實，hBMSCs與PGA三維支架材料製成的細胞-材料複合物，在體外培養過程中持續性給予TGFβ1、IGF-I等外源性生長因子以及甾體類激素的刺激與誘導，8周時能夠形成結構完整的成熟軟骨組織，並在軟骨組織形成過程中PGA逐漸被降解；未誘導組細胞-材料複合物在培養過程中逐漸收縮，組織學及免疫組化結果只見到及少量的軟骨樣組織形成。這表明接種在三維支架上的hBMSCs在TGFβ1等誘導因子作用下可以被誘導成為軟骨樣細胞，並且分泌軟骨的細胞外基質成分，最終在體外形成成熟的軟骨組織。
為觀察hBMSCs構建的組織工程化軟骨能否在體內皮下環境中較長期存留且保持一定的外形，我們將體外誘導培養4周時構建的軟骨樣組織植入裸鼠皮下，體內4周後發現所形成的組織更加接近於體內正常軟骨組織，說明體外構建的軟骨完全可以用於體內移植及軟骨缺損的修復。這些結果充分證實了體外應用生長因子誘導hBMSCs構建軟骨組織是可行的。當然，這些實例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。如果再結合轉基因技術與生物反應器技術，則體外構建的軟骨會更加成熟，而且成本也會大大降低，並有可能形成產業化的組織工程化軟骨產品。
本發明為應用hBMSCs構建軟骨提供了一個確實可行的技術體系，使用這種技術提供的簡便方法，可以有效地體外誘導hBMSCs形成軟骨組織並能夠在體內進一步成熟。本發明人認為TGF-β1、IGF-I和地塞米松等誘導因子均可能在不同程度上啟動和維持了hBMSCs向軟骨細胞分化的過程，而IGF-I更可能體現在對軟骨樣細胞功能表達的促進作用上，本發明確定的生長因子應用劑量和方法恰恰能夠充分發揮各誘導劑對hBMSCs的促分化作用。而今後在本研究的基礎上，應用轉染TGF-β1和/或IGF-I基因的hBMSCs作為種子細胞，不但克服了外源性細胞因子分布不均的缺點，而且節約成本，更加具有實際的應用意義。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
權利要求
1.一種組織工程化軟骨移植物，其特徵在於，它包括(a)人骨髓基質幹細胞hBMSCs；(b)藥學上可接受的生物可降解材料。
2.如權利要求1所述的移植物，其特徵在於，所述的hBMSCs是自體細胞，來源於髂骨、胸骨、肋骨等松質骨。
3.如權利要求1所述的移植物，其特徵在於，所述的移植物為固態細胞材料複合物，且hBMSCs在複合物中的濃度為1×106個細胞/cm3-5×108個細胞/cm3。
4.如權利要求1所述的移植物，其特徵在於，所述的藥學上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、PLGA、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚胺基酸、假聚胺基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環氧乙烷、聚對二氧六環酮、膠原、明膠、透明質酸、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、脫細胞基質，及其共聚物或混合物。
5.如權利要求1所述的移植物，其特徵在於，移植物外形為人耳廓、鼻背、鼻翼、下頦、顴弓、眉弓、管狀、菱形、片狀、圓柱等多種形狀但不僅限於此。
6.一種如權利要求1所述的組織工程化軟骨移植物的製備方法，其特徵在於，包括步驟將hBMSCs與藥學上可接受的生物可降解材料混合，形成複合物，其中hBMSCs在複合物中的濃度為1×106個細胞/cm3-5×108個細胞/cm3。
7.如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，聯合應用體外誘導劑，所述的體外誘導劑包含TGF-β1、IGF-I和地塞米松。
8.如權利要求7所述的製備方法，其特徵在於，所述的體外誘導劑中TGF-β1的濃度為20-50ng/ml、IGF-I的濃度為100-500ng/ml、地塞米松的濃度為10-60ng/ml。
9.如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，體外誘導劑的應用時間為細胞接種到材料上之後24-148小時，體外誘導時間為4-10周。
10.如權利要求6所述的製備方法，其特徵在於，所述的藥學上可接受的生物可降解材料選自下組聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)、PLGA、聚羥基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚胺基酸、假聚胺基酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚環氧乙烷、聚對二氧六環酮、膠原、明膠、透明質酸、糖氨聚糖、殼聚糖、甲殼素、海藻酸鹽、脫細胞基質，及其共聚物或混合物，但不僅限於此。
全文摘要
本發明公開了一種組織工程化軟骨移植物，它包括(a)人骨髓基質幹細胞(human bone marrow stem cells，hBMSCs)；(b)藥學上可接受的，生物相容性良好的可降解材料。本發明的組織工程化軟骨可有效地進行軟骨缺損的移植治療。本發明還提供了該組織工程化軟骨的具體構建方法和多種用途。
文檔編號C12N5/08GK1990054SQ200510112068
公開日2007年7月4日 申請日期2005年12月27日 優先權日2005年12月27日
發明者曹誼林, 周廣東, 劉天一, 劉偉, 崔磊 申請人:上海國睿生命科技有限公司