一種篩選豬抗病育種的方法及其應用的製作方法

2023-06-06 16:34:11

專利名稱：一種篩選豬抗病育種的方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及分子遺傳學領域，具體涉及了一種篩選豬抗病育種的方法，通過判斷豬ifr7基因5'調控區的突變位點的多態性來進行選種，並人為的應用該突變位點實現優良育種。
背景技術：
1^ A (Myxovirus resistance protein 1， Mx 1) Mi^JtM (IFN) 導蛋白之一，該蛋白具有抗多種病毒的活性。Mxl是由I型幹擾素(IFNci/β)誘導細胞所產生的78000 u的抗病毒蛋白，是繼發現由IFN誘導細胞產生2. 5 A寡腺苷酸合酶和蛋白酶之後發現的新型抗病毒蛋白。哺乳動物中，Mx家族中具有抗病毒作用的稱為JfrJ或ifr7， 分布於細胞的胞漿內，這種胞漿蛋白可直接發揮對流感病毒和濾泡性口腔炎病毒(VSV)的抗病毒效應，而Mx2或ifri 未發現有抗病毒活性。研究證明，ifr7蛋白在體內外均能獨立發揮抗病毒活性，並且無需IFN的誘導和協同。體外實驗表明，哺乳動物單核細胞在受到人類免疫缺陷病毒(HIV)感染後ifr7表達不依賴於IFN的存在。Mxl蛋白屬於大分子GTP酶發動蛋白超家族。U蛋白在氨基末端是GIPase功能區域，中段是中心活性區域(CID)，羧基末端的亮氨酸拉鏈序列(LZ)是效應區，LZ與GTP酶效應區的活化和功能協調有關。胺基酸末端區域包含的三聯GTP結合區域高度保守，但羧基端區域的變異多。亮氨酸拉鏈區(LZ) 近端第612位的突變(由亮氨酸一賴氨酸)，使得ifr7(L612K)突變體喪失了自聚集和水解 GTP的能力，證明寡聚體是GTP酶活性的重要調節因子。通過突變發現，三聯GTP結合區域是ifr7發揮抗病毒作用所必須的結構。對人MrJ蛋白進一步研究發現位於羧基末端附近的胺基酸決定了其抗病毒的特異性，當U蛋白的第645位的胺基酸由穀氨酸變為精氨酸時，表達ifr7蛋白的小鼠3T3細胞失去了對VSV的抵抗力，但卻繼續保持了對流感病毒和 Thogoto病毒的抵抗力。ifr7基因的表達與IFN mRNA水平相一致。IFN處理可劑量依賴性地抑制流感病毒在PBMCs中的複製，IFNY沒有此效果，同時這種抑制效果與ifr7蛋白的水平增高相關。在持續表達ifr7的轉基因細胞中，流感病毒的複製也受到抑制。結果顯示
蛋白在IFN介導的宿主防禦流感病毒A機制中起到重要作用。ifr7基因在抗病毒防禦中的重要作用已經在小鼠模型中得以充分研究。敲除ifr7基因可導致小鼠對流感病毒的天然免疫完全喪失，引起過度感染和快速死亡。誘導ifr7表達足以使該易感小鼠獲得抵抗力。 更重要的是，在對IFN無反應的動物中，持續表達ifr7可具有完全的抗病毒能力。通過分子標記確定ifr7高表達對於提高動物抗病性具有重要的育種意義。

發明內容
基於上述的原因，本發明為了篩選出豬抗病相關的基因標記，建立豬分子標記輔助育種方法，為豬抗病品種培育提供基因標記和技術方法。根據現有技術，發明人通過進一步的實驗發現豬ifr7 5'調控區-567位點的275bp插入突變與其連鎖的其它位點的突變在體外試驗中改變了 ifr7啟動子的活性，兩者差異極顯著，可見檢測與突變相關聯的分子標記不僅方法簡便快速，而且不受環境影響，並可實現早期選種。本發明提供的一種篩選豬抗病育種的方法，該方法通過測定從該動物獲得的DNA 樣品中ifr7基因的多態性來實現；通過多態性的測定結果，選出具有與所需特徵相關的豬進行育種；
所述的多態性是與抗病毒蛋白相關的多態性。其具體方法如下
(1)豬基因組DNA的獲得；
(2)以上述豬基因組DNA為模板，擴增ifr7基因5'調控區序列；
(3)鑑定ifr7基因5'調控區-567處的多態性；
其中步驟(3)中所述ifr7基因的5'調控區-567處的多態性是指此處有無一個27^p 的插入，其基因序列如SEQ ID N0:5所示的插入突變。具體的標記方法為 採用標記引物ifr7 P，包括
Mxl PF 5' -ACTGAGGTCCACTGAGGTTGTG-3『其序列如 kq ID No 1 所示； Mxl PR 5' -CGTTGTAGGAGAAAGGTGATTT-3『其序列如 kq ID No :2 所示； 擴增豬育種材料的基因組DNA，PCR擴增產物得到大小不同的兩個片段，長度相差約 275bp, PCR產物在1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測分出三種不同的帶型，有片段插入的記為BB 型，有片段缺失的記為AA型，雜合子記為AB型，通過實驗發現基因型為BB型的豬能提高豬抗某些病毒的能力，可見有片段插入的BB型基因型的豬具有抗病的能力，可以根據克隆得到的豬ifr7基因5 『調控區的DNA片段，該DNA片段是否存在一個275bp的插入突變來進行早期育種。綜上所述，本發明發明人通過進一步的實驗發現豬ifr7 5'調控區-567位點的 275bp插入突變與其連鎖的其他位點的突變在體外試驗中改變了 ifr7啟動子的活性，兩者差異極顯著，可見檢測與突變相關聯的分子標記不僅方法簡便快速，而且不受環境影響，並可實現早期選種。


圖1為ifr7 PF和Mxl PR引物PCR擴增豬Mxl啟動子片段電泳圖； 圖2為豬ifr7 5'調控區A與B兩種基因型比較結果；
由圖可知通過採用本發明所述的方法進行檢測後，發現各個豬種在基因5'調控區-567處的多態性不同，而通過調查和統計可知，BB基因型較多的豬種抗病能力強。圖3為不同豬種ifr7 5'調控區基因型檢測結果；
由圖可知此ifr7 5'調控區除27^p插入缺失不同外還存在多處其他差異，導致ifr7表達差異的突變之間存在遺傳連鎖，故可通過檢測275bp插入缺失快速鑑別ifr7基因型； 圖4為轉染人肝細胞後螢光素酶檢測結果；
由圖可知ifr7 5'調控區A與B的啟動活性並不相同，B等位基因的啟動效率大於A等位基因啟動效率；
圖5為轉染豬內皮細胞後螢光素酶檢測結果， 由圖同樣證實了B等位基因的啟動效率大於A等位基因啟動效率。
具體實施例方式在本說明書的上下文中，除非特別指明否則本說明書所用的任何術語具有本領域技術人員在本領域中通常理解的含義，而未註明詳細條件的實驗方法是按照常規試驗方法或按照供應商所建議的操作說明書進行的。實施例1豬ifr7 5'調控區序列的克隆測序及突變位點分析
基因組提取取豬耳組織，按照TIANamp genomic DNA (天根)試劑盒說明書進行基因組DNA提取。跟據NCBI(NCBI Reference Sequence: NC_010455. 3)設計如下引物，Jfr7 AF 基因序列如^^ ID No:3所示，Jfr7 AR基因序列如kq ID No4所示，它包含了從轉錄起始位點下遊18bp到上遊M53bp的範圍，以獲得序列全長後進行序列比較，尋找調控序列的差
異
權利要求
1.一種篩選豬抗病育種的方法，其特徵在於該方法通過測定從該動物獲得的DNA樣品中ifr7基因中多態性來實現的；通過多態性的測定結果，選出具有與所需特徵相關的豬進行育種；所述的多態性是與抗病毒蛋白相關的多態性。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於具體方法如下(1)豬基因組DNA的獲得；(2)以上述豬基因組DNA為模板，擴增ifr7基因5'調控區序列；(3)鑑定ifr7基因5'調控區-567處的多態性；其中步驟(3)中所述ifr7基因的5'調控區-567處的多態性是指此處有無一個27^p 的插入，其基因序列如SEQ ID N0:5所示的插入突變。
3.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於所述步驟(2)中用於擴增ifr75'調控區序列的引物為ifr7 PF其基因序列如SEQ ID N0:1所示和ifr7 PR其基因序列如SEQ ID N0:2所示。
4.應用如權利要求1和2所述育種方法，通過選取ifr7基因的5'調控區-567處有一個27^p，其基因序列如SEQ ID N0:5所示的插入突變的豬進行早期選種。
全文摘要
本發明涉及分子遺傳學領域，具體涉及了一種豬MX1基因5′調控區突變位點的分子標記方法及其在豬抗病育種中的應用，發明人發現不同品種豬MX15′調控區存在多處差異，其中中國地方豬種中以275bp片段插入為優勢基因型，西方豬種中此種基因型頻率很低。通過螢光素酶報告基因系統發現，有一段275bp插入並伴隨多處突變的啟動子活性顯著大於另外一種啟動子，可見通過檢測豬基因組中Mx1調控區該275bp有無可以作為與豬抗病性狀相關聯的分子標記，不僅方法簡便快速，而且不受環境影響，並可實現早期選種。
文檔編號C12Q1/68GK102304580SQ20111025519
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月31日 優先權日2011年8月31日
發明者姜運良, 康麗, 梁森 申請人:山東農業大學