有用微生物和目標物質的製備方法
2023-06-05 22:40:01
有用微生物和目標物質的製備方法
【專利摘要】本發明的課題在於提供一種菌株，所述菌株可以減少由作為中間代謝物的化合物P向代謝物M的轉換量，而且在未添加代謝物M或由代謝物M生成的最終產物的培養基中可以高效率地蓄積化合物P。根據本發明，提供一種原核生物，所述原核生物具有本說明書中規定的(a)～(d)所述的所有性質，以調節將由碳源生成生長所必須的代謝物M的生物合成途徑中作為中間代謝物的化合物P轉換成代謝物M的酶X的表達量，從而使化合物P蓄積。
【專利說明】有用微生物和目標物質的製備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及用於高效率地製備有機酸或胺基酸等有用物質的微生物和使用了該 微生物的有用物質的製備方法。
【背景技術】
[0002] 有人開發了通過導入營養需求突變或代謝調節突變、或利用重組DNA技術等，獲 得高效率地製備有機酸、胺基酸、核酸、維生素等有用化合物的微生物的方法。如圖1所示， 在由碳源經由作為中間代謝物的化合物P生成生長所必須的代謝物M的生物合成途徑或代 謝途徑中，為了高效率地生產化合物P，經常採用獲得營養需求突變株的方法，所述營養需 求突變株使將化合物P轉換成代謝物M的酶X的活性缺損。但是，使用該突變株來生產目 標化合物P時，需要向培養基中添加代謝物M或由代謝物M生成的最終產物，存在著製造成 本升高的問題。
[0003] 例如，有報導稱；使用缺損了莽草酸激酶活性的大腸桿菌肢cAericAiaCO")，可 W高效率地生產作為圖2所示的莽草酸途徑的中間代謝物的莽草酸（專利文獻1、非專利文 獻1)。但是，使用該微生物時，除了產生色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的需求性W外，還產生對 輕基苯甲酸、對氨基苯甲酸和2, 3-二輕基苯甲酸的需求性，所W存在著需要在培養基中添 加該6種化合物的問題。另外，還有報導稱：使用缺損了莽草酸脫氨活性的大腸桿菌，可W 高效率地生產作為莽草酸途徑的中間代謝物的3-脫氨莽草酸，但該微生物也存在著產生 上述6種化合物的需求性的問題（專利文獻2、非專利文獻2)。
[0004] 還可W通過使用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基脈或己基甲賴酸等突變劑的處理 或UV或放射線的照射等突變處理、或自然突變等導入突變，從而導入減少由化合物P轉換 成代謝物M的酶X的量的突變，W減少代謝物M的生成量，由此增加化合物P的量。該種情 況下，因殘留酶X的活性，使得一部分化合物P常常會轉換成代謝物M，所W不易找到使化合 物P的生產量最大化的條件。
[0005] 在本發明中，公開了下述方法；通過人為地將編碼酶X的基因X的轉錄置於抑制物 的控制下W控制代謝物M的生成量，不用在培養基中添加代謝物M或由代謝物M生成的最 終產物，而高效率地生產化合物P，但尚未報導通過利用不是基因X的本來的啟動子、而是 通過抑制物進行轉錄抑制的其他啟動子來控制基因X的轉錄量，來提高化合物P的生產量 的事例。
[0006] 使用微生物來製備有用化合物時，在由碳源經由作為中間代謝物的化合物P生成 生長所必須的代謝物M的生物合成途徑或代謝途徑中，往往採用由該途徑上的化合物P通 過分支的途徑生產該有用化合物的方法。採用該方法時，也經常採用獲得缺損了上述酶X 的活性的營養需求突變株的方法，但需要在培養基中添加代謝物M或由代謝物M生成的最 終產物，存在著製造成本升高的問題。
[0007] 關於採用具有多個分支途徑的莽草酸途徑（圖2)的目標物質的生產，例如，已知 為了使作為中間代謝物的分支酸不流入酪氨酸或苯丙氨酸的合成途徑，大多數的色氨酸生 產菌株具有酪氨酸和苯丙氨酸的需求性（專利文獻3、非專利文獻3和4)。另外，已知苯丙 氨酸生產菌具有酪氨酸的需求性（專利文獻4和5、非專利文獻5)。因此，製備目標芳族氨 基酸時，需要在培養基中添加其他的芳族胺基酸。
[0008] 還有報導稱；通過製作使由3-脫氨莽草酸（W下簡記為D服）轉換成莽草酸（代 謝物M)的酶缺損、而且使作為莽草酸途徑的起始物質的3-脫氧-D-阿糖基庚糖麗酸-7-磯 酸（W下簡記為DAHP)的生成量增加的突變株，可W生產約40g/L的原兒茶酸（非專利文 獻6)。但是，使用該突變株時，除了產生色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的需求性W外，還產生對 輕基苯甲酸、對氨基苯甲酸和2, 3-二輕基苯甲酸的需求性，因此存在著需要在培養基中添 加該6種化合物的問題。另外，通過向棒狀桿菌似知屬細菌（專利文獻6) 或短桿菌脈'Wi知C妃riw?)屬細菌（專利文獻7和8)中導入突變，也獲得了原兒茶酸生 產菌，但對於原兒茶酸的生產，該些突變株需要酪氨酸等營養源。而且，該些突變株的原兒 茶酸生產量的最高值為約13g/l，低於上述的芳族胺基酸營養需求突變株的生產量（專利 文獻8)。
[0009] 現有技術文獻 專利文獻 專利文獻1 ;美國專利6, 472, 169 ; 專利文獻2 ;美國專利5, 821，266 ; 專利文獻3 ;日本專利第4, 305, 184號公報； 專利文獻4 ;日本特開平5-49489號公報； 專利文獻5 ;日本特開平5-304971號公報； 專利文獻6 ;日本特公昭45-39036號公報； 專利文獻7 ;日本特開昭50-89592號公報； 專利文獻8 ;日本特開昭60-98989號公報； 非專利文獻 非專利文獻 1 ;Biotechnol.Prog. 19, 808 (2003); 非專利文獻 2 ;Biotechol.Bioeng. 64，61 (1999); 非專利文獻 3 ;Agric.Biol.Chem. 39，343 (1975); 非專利文獻 4;ApplEnvironMicrobiol. 65，2497 (1999); 非專利文獻 5 ;Agric.Biol.Chem. 37，2013 (1973); 非專利文獻 6J.Am.Chem.Soc. 127，2874 (2005)。
【發明內容】
[0010] 發明所要解決的課題 本發明的課題在於：提供一種獲得菌株的方法，在使用具有由碳源經由作為中間代謝 物的化合物P生成生長所必須的代謝物M的生物合成途徑或代謝途徑的微生物來生產化合 物P時，所述菌株可減少由化合物P向代謝物M的轉換量、而且在未添加代謝物M或由代謝 物M生成的最終產物的培養基中可W高效率地蓄積化合物P(圖1) ;W及提供根據蓄積的 化合物P通過酶Y生產化合物Q的方法（圖3)。
[0011] 用於解決課題的手段 本發明人在使用穀氨酸棒狀桿菌似3T網e/?<3c妃ri"?知ATCC13032株（W下簡記為ATCC13032株）製作高效率地生產作為目標物質的D服的菌株的研究中，嘗試著 解決上述課題。首先，增強參與從葡萄糖到DHS(化合物巧的生物合成途徑的多種酶的表 達，再根據將編碼促進從DHS向原兒茶酸轉換的DHS脫水酶（酶Y)的基因qsuB(cg0502)基 因的轉錄置於tuf(cg0587)基因的啟動子（W下簡記為化啟動子）的控制下的NSH株，制 作在編碼促進從D服向莽草酸（代謝物M)轉換的莽草酸脫氨酶（酶幻的aroE3(cgl835) 基因中導入了缺失突變的NSH A aroE3株時，確認到若不添加3種芳族胺基酸（色氨酸、苯 丙氨酸和酪氨酸），則NSHAaroE3株的增殖變得極慢。通過在添加了3種芳族胺基酸和莽 草酸的培養基中培養該N甜A aroE3株，確認到產生了0. 5g/L的原兒茶酸。接下來，為了通 過vanR(cg2615)基因所編碼的抑制物（W下簡記為VanR抑制物）控制活性型莽草酸脫氨 酶基因（aroE3基因）的表達，根據該N甜AaroE3株製作了在染色體中插入了將aroE3基 因與vanA(cg2616)基因的啟動子（W下簡記為VanA啟動子）連接的DNA的N甜AaroE3_ vanE3株。發現該N甜A aroE3_vanE3株可W在沒有添加3種芳族胺基酸和莽草酸的合成 培養基中生長，而且產生了16. 6g/L的原兒茶酸，從而解決了本發明的課題。另外還發現： 在根據該N甜AaroE3株製作通過rhcR(cgl308)基因所編碼的抑制物（W下簡記為化cR 抑制物）控制aroE3基因的表達的菌株時，確認到11. 2g/L的原兒茶酸的生產性，通過利用 VanR抑制物W外的抑制物，也獲得了優異的原兒茶酸的生產性。
[0012] 接下來，在製作除了導入N甜AaroE3株的aroE3基因缺失突變W外、還在編碼促 進從D服向莽草酸（代謝物M)轉換的莽草酸脫氨酶的qsuD (cg0504)基因和編碼D服脫水 酶的qsuB基因中導入了缺失突變的N甜A aroE3 AqsuB AqsuD株時，確認到若不添加3種 芳族胺基酸、維生素K2和對氨基苯甲酸，則N甜A aroE3 A qsuB A qsuD株無法增殖。通過在 加入了該些添加物的培養基中培養該N甜A aroE3 A qsuB A qsuD株，確認到產生了7. 7g/L 的D服。按照與N甜A aroE3 A qsuB A qsuD株的構建相同的順序，根據N甜A aroE3_va址3株， 製作了在qsuD基因和qsuB基因中導入了缺失突變的N甜A aroE3_va址3 A qsuB A qsuD株。 根據該N甜A aroE3_va址3 A qsuB A qsuD株製作在染色體中插入了連接有benA (cg2637)基 因的啟動子和編碼VanR抑制物的VanR基因的DNA的化en-vanR株時，發現化en-vanR株 可W在不含該些添加物的合成培養基中生長，而且可W生產15. 4g/L的DHS，從而解決了本 發明的課題。
[0013]目P，本發明涉及W下的（1)?（24)。
[0014] (1)原核生物，該原核生物具有下述的（a)?（d)所述的所有性質，W調節將由碳 源生成生長所必須的代謝物M的生物合成途徑中作為中間代謝物的化合物P轉換成代謝物 M的酶X的表達量，從而使化合物P蓄積， (a)在與從該原核生物所能利用的碳源到化合物P的生物合成有關的酶群中，任意一 個W上的酶的活性較該原核生物的野生株有所增強； 化）通過在編碼酶X的蛋白的野生型基因X的翻譯區、該基因的翻譯調節區或促進基 因X轉錄的啟動子區中具有1個W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突變，酶X的活性缺損 或降低； (C)利用與促進上述基因X轉錄的本來的啟動子不同、且轉錄被抑制物R的蛋白抑制 的啟動子A，控制編碼活性型酶X的DNA的轉錄； (d) 具有I拷貝W上的編碼抑制物R的蛋白的基因Z，該基因的轉錄被該基因的本來的 啟動子和/或不同於該啟動子的誘導啟動子B控制。
[0015] (2) (1)所述的原核生物，其特徵在於：性質化）所述的促進基因X轉錄的啟動子 區中的取代突變是將該啟動子的整個區域或一部分區域取代成性質（C)所述的啟動子A的 DNA的突變。
[0016] (3) (1)或（2)所述的原核生物，其特徵在於；在上述原核生物所具有的代謝化合 物P的酶中，酶XW外的任意一個W上的代謝酶的活性缺損或降低。
[0017] (4) (1)?（3)中任一項所述的原核生物，其特徵在於：上述啟動子B是通過添加 選自阿魏酸、香草酸、香蘭素、苯甲酸、3-輕基苯甲酸、間苯二酷、4-輕基苯甲酸、2, 4-二輕 基苯甲酸、果糖和藏糖的化合物而誘導的啟動子。
[0018] (5) (1)?（4)中任一項所述的原核生物，其特徵在於：編碼上述抑制物R的蛋白 的基因Z為穀氨酸棒狀桿菌ATCC13032株的vanR(cg2615)基因、pcaR(cg2624)基因、或 rhcRkgl308)基因。
[0019] (6) (1)?巧）中任一項所述的原核生物，其特徵在於：上述啟動子A為穀氨酸 棒狀桿菌ATCC13032株的VanA(cg2616)基因的啟動子、PObA(cgl226)基因的啟動子、 PC址(cg2631)基因的啟動子、或rh地(cgl309)基因的啟動子。
[0020] (7)化合物P的製備方法，其特徵在於：在抑制了啟動子A轉錄的狀態下、在碳源 的存在下培養（1)?化）中任一項所述的原核生物。
[0021] (8)化合物P的製備方法，其特徵在於：在抑制了啟動子A轉錄的狀態下、在碳源 的存在下培養（1)?（6)中任一項所述的原核生物，之後施加誘導啟動子B轉錄的處理，使 抑制物R的蛋白表達量增加，從而減少代謝物M的生成量。
[0022] (9)化合物P的製備方法，其特徵在於：在解除了啟動子A的轉錄抑制的狀態下、 在碳源的存在下培養（1)?化）中任一項所述的原核生物，之後施加誘導啟動子B轉錄的 處理，使抑制物R的蛋白表達量增加，從而減少代謝物M的生成量。
[002引 （10) (7)?（9)中任一項所述的化合物P的製備方法，其特徵在於：上述化合物P和上述代謝物M的組合為下述（f)?（i)中的任意一個， (f) 化合物P為3-脫氨莽草酸、代謝物M為莽草酸； (g) 化合物P為穀氨酸、代謝物M為N-己醜穀氨酸或Y-穀氨醜磯酸； 化）化合物P為天冬氨酸、代謝物M為目-天冬氨醜磯酸； (i)化合物P為絲氨酸、代謝物M為甘氨酸。
[0024] (11) (1)?做中任一項所述的原核生物，其特徵在於：除了具有（a)?（d)所 述的性質W外，還具有下述的性質（e)，W通過酶Y將蓄積的化合物P轉換成化合物Q， (e) 通過在編碼酶Y的蛋白的基因y的翻譯區、該基因的翻譯調節區或促進基因y轉 錄的啟動子區中具有1個W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突變，從化合物P向化合物Q 轉換的能力增強、或者基因y的表達受到不同於野生型的控制。
[002引（11)所述的原核生物，其特徵在於：在上述原核生物所具有的代謝化合物Q的酶中，任意一個W上的代謝酶的活性缺損或降低。
[002引（蝴（11)或所述的原核生物，其特徵在於：性質（e)所述的促進基因y轉 錄的啟動子區中的取代突變是將該啟動子的整個區域或一部分區域取代成不同於促進該 基因轉錄的本來的啟動子和啟動子A的啟動子C的DM的突變。
[0027] (14)(蝴所述的原核生物，其特徵在於：上述啟動子C與啟動子B相同、或者上 述啟動子C受到控制啟動子B轉錄的蛋白的轉錄控制。
[0028] (15) (13)或（14)所述的原核生物，其特徵在於：上述啟動子C為誘導啟動子。
[0029] (16) (15)所述的原核生物，其特徵在於：上述啟動子C是通過添加選自阿魏酸、 香草酸、香蘭素、苯甲酸、3-輕基苯甲酸、間苯二酷、4-輕基苯甲酸、2, 4-二輕基苯甲酸、果 糖和藏糖的化合物而誘導的啟動子。
[0030] (17)化合物Q的製備方法，其特徵在於：在抑制了啟動子A轉錄的狀態下、在碳源 的存在下培養（11)?（16)中任一項所述的原核生物。
[0031] (18)化合物Q的製備方法，其特徵在於：在抑制了啟動子A轉錄的狀態下、在碳源 的存在下培養（11)?（16)中任一項所述的原核生物，之後施加誘導啟動子B轉錄的處理， 使抑制物R的蛋白表達量增加，從而減少代謝物M的生成量、並增加化合物Q的生成量。 [003引（19)化合物Q的製備方法，其特徵在於：在解除了啟動子A的轉錄抑制的狀態下、 在碳源的存在下培養（11)?（16)中任一項所述的原核生物，之後施加誘導啟動子B轉錄 的處理，使抑制物R的蛋白表達量增加，從而減少代謝物M的生成量、並增加化合物Q的生 成量。
[003引 （20) (17)?（19)中任一項所述的化合物Q的製備方法，其特徵在於：在碳源的 存在下培養（11)?（16)中任一項所述的原核生物，之後施加誘導上述啟動子C轉錄的處 理，使上述酶Y的表達量增加，從而增加化合物Q的生成量。
[0034] (21) (17)?（20)中任一項所述的化合物Q的製備方法，其特徵在於：上述化合 物P、上述化合物Q和上述代謝物M的組合為下述（j)?（W)中的任意一個， (j)化合物P為3-脫氨莽草酸、化合物Q為原兒茶酸、代謝物M為莽草酸； 化）化合物P為分支酸、化合物Q為氨茵酸、代謝物M為預苯酸； (l) 化合物P為預苯酸、化合物Q為4-輕基苯基丙麗酸、代謝物M為苯基丙麗酸； (m) 化合物P為預苯酸、化合物Q為前酪氨酸、代謝物M為苯基丙麗酸； (n) 化合物P為預苯酸、化合物Q為苯基丙麗酸、代謝物M為4-輕基苯基丙麗酸或前 酪氨酸； (O) 化合物P為2-氧代異戊酸、化合物Q為2-異丙基蘋果酸、代謝物M為額氨酸； (P) 化合物P為2-氧代異戊酸、化合物Q為額氨酸、代謝物M為2-異丙基蘋果酸； (q) 化合物P為穀氨酸、化合物Q為Y-穀氨醜磯酸、代謝物M為N-己醜穀氨酸； (r) 化合物P為穀氨酸、化合物Q為N-己醜穀氨酸、代謝物M為Y-穀氨醜磯酸； (S)化合物P為天冬氨酸、化合物Q為天冬醜胺、代謝物M為目-天冬氨醜磯酸； (t)化合物P為天冬氨酸目-半酵、化合物Q為2, 3-二氨化巧二駿酸、代謝物M為高 絲氨酸； (U) 化合物P為高絲氨酸、化合物Q為0-己醜高絲氨酸、代謝物M為高絲氨酸磯酸； (V) 化合物P為高絲氨酸、化合物Q為高絲氨酸磯酸、代謝物M為0-己醜高絲氨酸； (W) 化合物P為絲氨酸、化合物Q為0-己醜絲氨酸、代謝物M為甘氨酸。
[00巧](22) (21)的（j)所述的原兒茶酸的製備方法，其特徵在於；上述酶X為莽草酸脫 氨酶，並且上述酶Y為3-脫氨莽草酸脫水酶。
[0036] (23) (22)所述的原兒茶酸的製備方法，其特徵在於，選自編碼原兒茶酸2, 3-雙 加氧酶的基因、編碼原兒茶酸3, 4-雙加氧酶的基因、編碼原兒茶酸4, 5-雙加氧酶的基因 和編碼原兒茶酸脫碳酸酶的基因的至少一個基因的性質為：通過向該基因的翻譯區或其轉 錄?翻譯調節區中導入1個W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突變，原兒茶酸的代謝活性 缺損或降低。
[0037] (24) (1)?（6)中任一項或（11)?（16)中任一項所述的原核生物，該原核生物 為穀氨酸棒狀桿菌或大腸桿菌。
[00測發明效果 根據本發明，可W根據葡萄糖等碳源獲得高效率地生產DHS或原兒茶酸等有用有機化 合物的微生物。另外，使用本發明的微生物時，可W使用不含芳族胺基酸的培養基高效率地 製備DHS或原兒茶酸等。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0039] 圖1顯示通過利用作為基因Z的產物的抑制物R控制酶X(使從化合物P向代謝 物M轉換的酶）的表達，製備從碳源到生長所必須的代謝物M的生物合成途徑上的中間代 謝物即目標化合物P的方法。
[0040] 圖2顯示關於從碳源開始的芳族胺基酸的生物合成的莽草酸途徑。
[0041] 圖3顯示通過用作為基因Z的產物的抑制物R控制酶的表達，製備從碳源到生長 所必須的代謝物M的生物合成途徑上的目標化合物P，同時通過表達使從化合物P向化合物 Q轉換的酶Y，製備目標化合物Q的方法。
[0042] 圖4顯示通過抑制物R對啟動子A的轉錄抑制將酶X的表達維持在低水平、並限 制代謝物M的生產量，從而可W高效率地生產化合物P。
[0043] 圖5顯示在培養前期通過解除抑制物R對啟動子A的轉錄抑制使酶X正常生產， 但在培養後期通過恢復抑制物R對啟動子A的轉錄抑制，酶X的表達量大幅減少，化合物P 蓄積。
[0044] 圖6顯示在培養前期由於抑制物R的量少，所W通過啟動子A的轉錄使酶X正常 生產，但在培養後期由於抑制物R的量增加，所W酶X的表達量大幅減少，化合物P蓄積。
[0045] 圖7顯示通過處於啟動子B的控制下的基因Z所編碼的抑制物R來抑制啟動子的 轉錄，所W酶X的表達量大幅減少，化合物P蓄積，進而通過作為基因Z的產物的酶Y的作 用將化合物P轉換成化合物Q。
[0046] 圖8顯示在培養前期通過解除抑制物R對啟動子A的轉錄抑制而使酶X正常生產， 但在培養後期通過恢復抑制物R對啟動子A的轉錄抑制，酶X的表達量大幅減少，蓄積的化 合物P通過酶Y的作用轉換成化合物Q。
[0047] 圖9顯示在培養前期由於抑制物R的量少，所W通過啟動子A的轉錄使酶X正常 生產，但在培養後期由於抑制物R的量增加，所W酶X的表達量大幅減少，蓄積的化合物P 通過酶Y的作用轉換成化合物Q。
[0048] 圖10顯示在培養前期利用抑制物R對啟動子A的轉錄抑制使酶X的表達維持在 低水平、並限制代謝物M的生產量，從而可W在使微生物增殖的同時生產少量的化合物P， 但在培養後期通過誘導表達將化合物P轉換成化合物Q的酶Y使酶Y的表達量增加，從而 使化合物Q的生產量增加。
[0049] 圖11顯示在培養前期通過抑制物R對啟動子A的轉錄抑制使酶X的表達維持在 低水平、並限制代謝物M的生產量，從而可W在使微生物增殖的同時生產少量的化合物P， 但在培養後期通過使抑制物R誘導表達W增加化合物P的蓄積量，同時誘導表達將蓄積的 化合物P轉換成化合物Q的酶YW增加酶Y的表達量，從而使化合物Q的生產量增加。
【具體實施方式】
[0050] W下，利用圖1和圖3,對本發明進行詳細說明。
[0051] 本發明的微生物是用於高效率地製備從碳源到生長所必須的代謝物M的生物合 成途徑上的中間代謝物即目標化合物P的微生物，其具有W下所示的4個性質（a)?（d)。 該微生物優選為抑制物R的轉錄抑制系統發達W進行基因表達控制的原核生物。
[0052] (a)在與從該微生物所能利用的碳源到化合物P的生物合成有關的酶群中，任意 一個W上的酶的活性較該原核生物的野生株有所增強。
[0053] 化）通過在編碼將化合物P轉換成代謝物M的酶X的蛋白的野生型基因X的翻譯 區、該基因的翻譯調節區或促進基因X轉錄的啟動子區中具有1個W上的核巧酸的取代、缺 失或添加的突變，酶X的活性缺損或降低。
[0054] (C)利用與促進上述基因X轉錄的本來的啟動子不同、且轉錄被抑制物R的蛋白 抑制的啟動子A，控制編碼活性型酶X的DNA的轉錄。
[0055] (d)具有1拷貝W上的編碼抑制物R的蛋白的基因Z，該基因的轉錄被該基因的本 來的啟動子和/或不同於該啟動子的誘導啟動子B控制。
[0056] 對於與從葡萄糖等碳源到化合物P的生物合成途徑有關的酶群中的任意一個W 上的酶，通過如下操作進行酶活性的增強和/或酶蛋白量的增加，可W對本發明中利用的 微生物賦予性質（a)。目P，通過利用向編碼該酶蛋白的基因的翻譯起始區導入突變、向該基 因的啟動子區導入突變、將該啟動子取代成其他強的啟動子、對多拷貝質粒通過克隆等擴 增該基因、增加正向控制該基因轉錄的蛋白的表達和/或減少?缺損負向控制該基因轉錄 的蛋白的表達等方法，進行該酶活性的增強和/或該酶蛋白量的增加，可W增加化合物P的 生成量。或者，當為受到下遊代謝物的反饋抑制的酶時，通過向酶蛋白中導入解除其反饋抑 制的胺基酸的突變，也可W增加化合物P的生成量。關於向該些DNA或蛋白中導入突變，可 W通過誘變處理等來進行，但也可W利用重組DNA技術或同源重組技術來進行。
[0057] 關於性質化）的賦予，可W利用誘變處理或重組DNA技術等使酶X的活性缺損，但 優選利用同源重組技術向野生型基因X的翻譯區內導入缺失突變。該種情況下，若缺失整 個翻譯區，則有時會因極性效果而抑制下遊的基因表達，由此希望留下翻譯區的5'側部分 和3'側部分，符合讀框地向翻譯區內導入缺失突變。另外，通過向基因X的翻譯起始區周 邊或促進基因X轉錄的啟動子區中導入1個W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突變，也可 W使酶X的活性缺損。另外，通過將促進基因X轉錄的本來的啟動子區取代成性質（C)所 述的啟動子A的DNA，可W同時賦予性質化）和性質（C)。
[0058] 通過將編碼活性型酶X的蛋白的DNA置於轉錄被抑制物R抑制的啟動子A的控制 下，可W賦予性質（C)。啟動子A是不同於促進上述基因X轉錄的本來的啟動子的啟動子， 並且只要轉錄被抑制物R抑制，則可W是任何的啟動子。優選地，作為在大腸桿菌K-12株內 被抑制物R抑制的啟動子A,可W列舉；受到A瞻菌體的CI857基因產物的轉錄抑制的pL啟動子或PR啟動子、受到IacI基因產物的轉錄抑制的Iac啟動子、或受到galR基因產物 的轉錄抑制的gal操縱子的啟動子。另外，作為在ATCC13032株內被抑制物R抑制的啟動 子A，可W列舉；受到vanR(cg2615)基因（W下稱作VanR基因）的產物（W下簡記為VanR 抑制物）的轉錄抑制的VanA啟動子、受到rhcR(cgl308)基因（W下稱作rhcR基因）的產 物（W下簡記為化CR抑制物）的轉錄抑制的rhcH(cgl309)基因（W下稱作rhcH基因） 的啟動子（W下簡記為rhcH啟動子）、或受到pcaR(cg2624)基因（W下稱作pcaR基因） 的產物（W下簡記為化aR抑制物）的轉錄抑制的pcal(cg2623)基因（W下稱作pcal基 因）的啟動子（W下簡記為pcal啟動子）。需要說明的是，基因X可W使用來自本發明的 微生物的基因，也可W使用來自不同於本發明的微生物的原核生物或真核生物的基因。
[0059] 本發明的微生物因賦予性質化）和性質（C)，使得在通常狀態下酶X的表達量低。 但是，該微生物通過賦予性質（a)，而具有增加化合物P的量的突變，因此可W生產生長所 必需的量的代謝物M。當化合物P的生成量極低、生長差時，可W解除基於抑制物R的轉錄 抑制，使酶X的表達量上升，從而使該微生物的生長良好。
[0060] 不僅是通過製作編碼抑制物R的蛋白的基因Z的野生型表達單元可W賦予性質 (d)，通過製作將基因Z置於不同於該基因的啟動子的誘導啟動子B的控制下的基因Z的表 達單元，也可W賦予性質（d)。在本發明的微生物中除了插入基因Z的野生型表達單元W 夕F，還可W插入置於誘導啟動子B的控制下的基因Z的表達單元。關於抑制物R，只要是來 自原核生物的抑制物，則可W使用任何的抑制物，但優選使用通過添加誘導物質或溫度變 化等可W解除抑制的抑制物。具體而言，當使用大腸桿菌K-12株作為本發明的微生物時， 例如，可W使用下述基因所編碼的抑制物等；通過38CW上的培養而誘導的A瞻菌體的 CI857基因、通過添加乳糖而誘導的IacI基因、通過添加半乳糖而誘導的galR基因、或者通 過添加四環素而誘導的tetR基因。當使用ATCC13032株作為本發明的微生物時，例如可W 使用；通過添加阿魏酸、香草酸或香蘭素來解除抑制的VanR抑制物、通過添加間苯二酷或 2, 4-二輕基苯甲酸來解除抑制的化CR抑制物、或者通過添加4-二輕基苯甲酸來解除抑制 的化aR抑制物。
[0061] 作為啟動子B，只要是來自原核生物的誘導啟動子，則可W使用任何的啟動子。具 體而言，在大腸桿菌K-12株中表達基因Z時，可W使用A瞻菌體的pL啟動子或PR啟動 子、Iac啟動子、gal操縱子的啟動子、trp操縱子的啟動子、或araBAD啟動子等。另外，在 ATCC13032株中表達基因Z時，可W使用下述啟動子：通過添加阿魏酸、香草酸或香蘭素而 誘導的VanA啟動子、通過添加間苯二酷或2, 4-二輕基苯甲酸而誘導的rhcH啟動子、通過 添加4-輕基苯甲酸而誘導的pcal啟動子、通過添加3-輕基苯甲酸而誘導的nagl(c的351) 基因（W下稱作nadl基因）的啟動子（W下簡記為nagl啟動子）、通過添加苯甲酸而誘導 的benA(cg2637)基因（W下稱作benA基因）的啟動子（W下簡記為benA啟動子）、或通 過添加果糖或藏糖中的任一種而誘導的cg2118基因的啟動子或ptsS(cg2925)基因（W下 稱作PtsS基因）的啟動子。
[0062] 當本發明的微生物具有除了酶X W外的代謝化合物P的酶活性，在化合物P的制 備中該化合物的蓄積量有可能減少時，優選通過誘變處理或重組DNA技術，使該微生物所 具有的化合物P的代謝酶中任意一個W上的代謝酶的活性缺損或降低。
[006引本發明的微生物優選為屬於棒狀桿菌屬似巧^^/^弘^^扣'^/曲^短桿菌屬 脈沁riuffl)、節桿菌屬地-化TO知C沁r)、類諾卡氏菌屬（Abcar出oit/aceae)、微杆 菌屬泌/cro知C沁ritt?)、鏈黴屬菌（化re/7f(9化Fees)、擬無枝酸菌屬C^fco7<3崎7sis)、紅 球菌屬（化0沁COCC化)、動球菌屬體ineococc化)、不動桿菌屬C^cinez^i^cz^r)、假單 胞菌屬（/?^化/offlimas)、泛菌屬（化/7拉6<3)、克雷伯氏菌屬體7e如ie77a)和埃希氏菌屬 肢'cAericAia)中的任一個屬的原核生物。進一步優選，本發明的微生物為在胺基酸的發酵 生產中經常使用的穀氨酸棒狀桿菌或性狀已詳細解析的大腸桿菌。
[0064] 使用了本發明的微生物的化合物P的製備方法例如可W列舉；通過在含有碳源的 培養基中、在抑制了啟動子A的轉錄的狀態下進行培養，來製備目標化合物P的方法。在本 發明的微生物中，由於控制酶X的表達的啟動子A的轉錄量被抑制物R抑制在低水平，所W 代謝物M的生產量受到限制，可W高效率地生產化合物P(圖4)。
[0065] 在本發明的製備方法中，由於控制酶X的表達的啟動子A的轉錄量低而導致該微 生物的生長緩慢時，還可W通過將化合物P的製備步驟分成培養前期和培養後期該兩期來 製備目標化合物P。目P，在含有碳源的培養基中接種該微生物後，根據抑制物R的性質添加 誘導物質或者升高或降低培養溫度等W解除轉錄抑制，從而增加酶X的表達量，繼續培養。 之後，在適當的時期恢復抑制物R的抑制，W抑制酶X的表達，從而可W增加化合物P的生 產量（圖5)。使用通過添加誘導物質而誘導的啟動子A時，通過調節該誘導物質的添加量 使在培養後期該誘導物質耗盡，可W恢復基於抑制物R的抑制。使用通過升高或降低培養 溫度而誘導的啟動子A時，通過將培養溫度恢復至抑制物R產生抑制的溫度，可W恢復基於 抑制物R的抑制。
[0066] 優選通過使用將抑制物R的表達置於誘導啟動子B的控制下的本發明的微生物， 將化合物P的製備步驟分成培養前期和培養後期該兩期，來製備目標化合物P。目P，在含有 碳源的培養基中接種該微生物使菌體增殖，之後根據誘導啟動子B的性質添加誘導物質或 者升高或降低培養溫度，由此激活誘導啟動子B，W增加抑制物R的生成量，從而抑制代謝 物M的生產，增加化合物P的生產量（圖6)。
[0067] 如上所述，當採用利用了本發明的微生物的製備方法時，根據該微生物的增殖狀 態或化合物P對該微生物的影響，使用相同的微生物來改變培養方法，從而可W容易地使 化合物P的生產量最大化。
[0068] 作為碳源，只要是本發明的微生物所能利用的碳源，則可W使用任何的碳源。例 女口，可W使用；葡萄糖、藏糖、果糖等糖類；己醇、甲醇等醇類；構稼酸、蘋果酸、玻巧酸等有 機酸類；甘油、廢糖蜜等。
[0069] 化合物P只要是由碳源生成生長所必須的代謝物的生物合成途徑上的代謝物即 可，可W是任何的有機化合物。例如，可W列舉DHS、穀氨酸、天冬氨酸和絲氨酸等。
[0070] D服可W通過控制生成莽草酸（代謝物M)的莽草酸脫氨酶（酶幻的表達來生產。 DHS除了可W用作抗氧化劑W外（美國專利5, 821，266)，還可用作使用微生物來製備原兒 茶酸或莽草酸等時的原料。
[0(m] 作為有用胺基酸的穀氨酸可W通過控制生成N-己醜穀氨酸（代謝物M)的N-己 醜轉移酶（酶幻或生成Y-穀氨醜磯酸（代謝物M)的Y-穀氨醜激酶（酶幻的表達來 生產。
[0072] 作為有用胺基酸的天冬氨酸可W通過控制生成目-天冬氨醜磯酸（代謝物M)的 天冬氨酸激酶（酶幻或生成天冬醜胺（代謝物M)的天冬醜胺合成酶（酶幻的表達來生 產。
[0073] 作為有用胺基酸的絲氨酸可W通過控制生成甘氨酸（代謝物M)的絲氨酸輕甲基 轉移酶（酶幻或生成0-己醜絲氨酸（代謝物M)的絲氨酸轉移酶（酶幻的表達來生產。
[0074] 該裡，作為更具體的例子，對來自高效率地生產D服的ATCC13032株的菌株進行詳 述。需要說明的是，關於ATCC13032株的基因組序列，可W從美國國立生物技術信息中也 (^tionalCenterforBiotechnologyInformation,W下簡記為NCBI)的GenBank(W下 簡記為GB)資料庫中，作為GB登錄號BX927147而獲得。另外，與其基本相同的基因組序列 也可W作為GB登錄號NC_003450而獲得，但在本說明書中，根據GB登錄號BX927147的核 巧酸編號和基因名稱而記作核巧酸的位置和基因名稱。
[00巧]來自生產D服的ATCC13032株的菌株是指具有下述性質（aa)?（dd)的微生物。
[0076] (aa)在與從該菌株所能利用的碳源到DHS(化合物巧的生物合成有關的酶群中， 任意一個W上的酶的活性較野生株有所增強。
[0077] 化b)通過在編碼將D服轉換成莽草酸（代謝物M)的莽草酸脫氨酶（酶幻的蛋 白的野生型基因（基因X)的翻譯區或翻譯調節區、或者促進該基因轉錄的啟動子區中具有 1個W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突變，由DHS向莽草酸轉換的能力缺損或降低。就 ATCC13032株而言，作為編碼活性型莽草酸脫氨酶的基因，有aroE3(cgl835)基因（互補鏈 核巧酸編號1，726, 078?1，726, 908的DNA區）、aroEl(cgl283)基因（互補鏈核巧酸編號 1，182, 337 ?1，183, 143 的DNA區）和qsuD(cg0504)基因（核巧酸編號 446, 537 ?447, 388 的DNA區）該3種，但通過向在由D服向莽草酸轉換中發揮主要作用的aroE3基因中導入 突變，使該基因的活性型莽草酸脫氨酶的表達缺損或降低，也可W賦予性質化。而且，除了 aroE3基因的突變W外，對於qsuD基因和/或aroEl基因，通過導入使該基因的活性型莽草 酸脫氨酶的表達缺損或降低的突變，也可W賦予性質化。
[0078] (CC)通過不同於促進上述基因X轉錄的本來的啟動子、且轉錄被抑制物R的蛋白 抑制的啟動子A來控制編碼活性型酶X的DNA的轉錄。
[0079] (dd)具有1拷貝W上的編碼抑制物R的蛋白的基因Z，該基因的轉錄受到該基因 的本來的啟動子和/或不同於該啟動子的誘導啟動子B的控制。
[0080] 如上所述，作為抑制物R，可W使用通過添加阿魏酸、香草酸或香蘭素來解除抑制 的VanR抑制物、通過添加間苯二酷或2, 4-二輕基苯甲酸來解除抑制的化CR抑制物、或通 過添加4-二輕基苯甲酸來解除抑制的化aR抑制物。
[00則作為啟動子A，作為在ATCC13032株內被抑制物R抑制的啟動子A，可W列舉讀到VanR抑制物的轉錄抑制的VanA啟動子、受到化cR抑制物的轉錄抑制的rh地啟動子、或者 受到化aR抑制物的轉錄抑制的pcal基因的啟動子。
[0082] 作為啟動子B，可W使用；通過添加阿魏酸、香草酸或香蘭素而誘導的VanA啟動 子、通過添加間苯二酷或2, 4-二輕基苯甲酸而誘導的rhcH啟動子、通過添加4-輕基苯甲 酸而誘導的pcal啟動子、通過添加3-輕基苯甲酸而誘導的nagl啟動子、通過添加苯甲酸 而誘導的benA啟動子、或者通過添加果糖或藏糖中的任一種而誘導的cg2118基因的啟動 子或PtsS啟動子。
[0083] 通過將促進編碼莽草酸脫氨酶（酶幻的蛋白的aroE3基因（基因X)轉錄的本來 的啟動子區取代成性質（CC)所述的啟動子A的DNA，可W同時賦予性質化b)和性質（CC)。
[0084] 關於上述性質（aa)的賦予，根據公知的經驗，只要導入強化由DAHP生成畑S的途 徑的突變、或增加DAHP的生成量的突變即可。
[00財 DAHP通過3-脫氨奎尼酸合成酶轉換成3-脫氨奎尼酸（W下簡記為D冊)，D冊再 通過D冊脫水酶轉換成D服。因此，通過向編碼D冊合成酶的基因aroB(cgl827)基因 下稱作aroB基因）和/或編碼D冊脫水酶的aroD(cg0503)基因（W下稱作aroD基因）的 轉錄?翻譯調節區中導入突變，可W增強D冊合成酶和/或D冊脫水酶的表達量，增加D服 量。例如，通過將促進aroB基因和/或aroD基因的轉錄的本來的啟動子取代成啟動子活 性強的化啟動子，可W增加D服量。
[0086] 另外，還可W通過增加DAHP量來增加D服量。作為增加DAHP量的方法，可W列舉 下述方法；解除芳族胺基酸對DAHP合成酶的反饋抑制、增強DAHP合成酶的表達量、或者增 加作為DAHP合成酶底物的赤薛糖-4-磯酸（W下簡記為E4巧或磯酸帰醇式丙麗酸（W下 簡記為陽巧的量。
[0087]DAHP合成酶往往會受到色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸的反饋抑制。已知通過向DAHP 合成酶中導入氨基取代突變等可W解除反饋抑制，因此向aroF(cgll29)基因（W下稱作 aroF基因）和aroG(cg2391)基因（W下稱作aroG基因）等DAHP合成酶基因中導入突變， 可W使DAHP量增加。
[008引作為增強DAHP合成酶的表達量的方法，可W列舉向編碼DAHP合成酶的基因的轉 錄?翻譯調節區導入突變的方法。例如，通過將促進編碼DAHP合成酶的基因轉錄的本來的 啟動子取代成化啟動子，可W增加DAHP量。
[0089] 作為增加DAHP合成酶底物即E4P的量的方法，可W列舉：向編碼轉麗醇酶的 tkt(cgl774)基因（W下稱作tkt基因）、編碼轉酵醇酶的tal(cgl776)基因（W下稱作 cgl776基因）、或編碼葡萄糖-6-磯酸1-脫氨酶的ZWf(cgl778)基因等與戊糖磯酸途徑有 關的酶基因的轉錄?翻譯調節區導入突變W增強該基因的表達的方法。
[0090] 另外，作為增加DAHP合成酶底物即陽P的量的方法，可W列舉；向編碼陽P合成酶 的pps(cg0644)基因或編碼PEP駿激酶的pck(cg3169)基因的轉錄?翻譯調節區導入突變 W增強該基因的表達的方法。
[0091] 而且，通過向編碼丙麗酸激酶的pyk(cg2291)基因、編碼陽P駿化酶的 ppc(cgl787)基因、或編碼參與葡萄糖等糖的攝入的磯酸轉移酶的基因組（cg2117基因等） 的任一個基因的翻譯區或該基因的轉錄?翻譯調節區導入突變，並抑制PEP的轉換，也可W 增加陽P的量。
[0092] 可W向單獨的基因中導入突變W賦予上述性質（aa)，但為了進一步提高畑S的生 成量，優選向上述基因中的多個基因中導入突變。
[0093] 來自具有上述的性質（aa)?（dd)的ATCC13032株的菌株根據葡萄糖等碳源可W 生產D服。由於編碼D冊脫水酶的aroD基因與編碼將D服轉換成原兒茶酸的D服脫水酶的 qsuB(cg0502)基因（W下稱作qsuB基因）形成操縱子，所W為了賦予性質（aa)而通過啟 動子取代來增加aroD基因的表達時，qsuB基因的表達也增加，從而導致蓄積的一部分DHS 轉換成原兒茶酸。抑制向原兒茶酸轉換時，優選向qsuB基因的翻譯區或該基因的轉錄?翻 譯調節區導入突變。
[0094] 當本發明的微生物除了具有上述的4個性質（a)?（d)還具有下述的性質（e)時， 通過使用該微生物，將從碳源到生長所必須的代謝物M的生物合成途徑上的化合物P轉換 成化合物Q，從而可W高效率地製備目標化合物Q。
[0095] (e)通過在編碼由化合物P轉換成化合物Q的酶Y的蛋白的基因y的翻譯區、該 基因的翻譯調節區或促進基因y轉錄的啟動子區中具有1個W上的核巧酸的取代、缺失或 添加的突變，由化合物P到化合物Q的轉換能力增強、或者基因y的表達受到不同於野生型 的控制。
[0096]關於性質（e)，由於在野生型的狀態下酶Y的表達量往往不充分，所W通過向該基 因y的翻譯調節區或促進基因y轉錄的啟動子區中導入1個W上的核巧酸的取代、缺失或 添加的突變，使酶Y的表達量增強、或者將基因y的轉錄置於不同於野生型啟動子的控制的 控制下，從而可W賦予性質（e)。另外，分支途徑的最初的酶往往會受到最終產物的反饋抑 巧||，所W通過向基因y的翻譯區內導入突變來解除該反饋抑制，使酶Y的活性增強，從而也 可W賦予性質（e)。
[0097] 優選通過將促進基因y轉錄的啟動子的整個區域或一部分區域取代成不同於促 進該基因轉錄的本來的啟動子和啟動子A的啟動子C的DNA，可W賦予性質（e)。
[0098] 作為啟動子C，可W使用不同於基因y的本來的啟動子、且不同於啟動子A的啟動 子。作為啟動子C，還可W使用構成的表達啟動子，但優選使用誘導啟動子。作為誘導啟動 子，還可W使用作為在上述性質（d)的賦予中使用的啟動子B的例子而列舉的啟動子的任 意一種。
[0099]目P，作為啟動子C，可W使用：A瞻菌體的pL啟動子或pR啟動子、Iac啟動子、gal 操縱子的啟動子、trp操縱子的啟動子、或araBAD啟動子等；或者通過添加阿魏酸、香草酸 或香蘭素而誘導的VanA啟動子、通過添加間苯二酷或2, 4-二輕基苯甲酸而誘導的rh地 啟動子、通過添加4-輕基苯甲酸而誘導的pcal啟動子、通過添加3-輕基苯甲酸而誘導的 nagl啟動子、通過添加苯甲酸而誘導的benA啟動子、或通過添加果糖或藏糖中的任一種而 誘導的cg2118基因的啟動子或PtsS啟動子。
[0100] 在性質（e)的賦予中使用的啟動子C可W和在性質（d)的賦予中使用的啟動子B 相同。另外，該啟動子C還可W是：受到基於控制該啟動子B轉錄的蛋白的轉錄控制的啟動 子。
[0101] 由於本發明的微生物具有代謝化合物Q的酶活性，所W在化合物P的製備中該化 合物的蓄積量有可能減少的情況下，優選通過誘變處理或重組DNA技術，使該微生物所具 有的化合物P的代謝酶中的任意一個W上的代謝酶的活性缺損或降低。
[0102] 使用了本發明的微生物的化合物Q的製備方法例如可W列舉；通過在含有碳源的 培養基中、在抑制了啟動子A的轉錄的狀態下進行培養，來製備化合物Q的方法。在本發明 的微生物中，由於控制酶X的表達的啟動子A的轉錄量被抑制物R抑制在低水平，所W代謝 物M的生產量受到限制，可W由化合物P高效率地生產化合物Q(圖7)。
[0103] 在本發明的製備方法中，由於控制酶X表達的啟動子A的轉錄量低而導致該微生 物生長緩慢時，優選通過將化合物Q的製備步驟分成培養前期和培養後期該兩期來製備化 合物Q。目P，將該微生物接種在含有碳源的培養基中，之後根據抑制物R的性質通過添加 誘導物質或升高或降低培養溫度等來解除轉錄抑制，從而增加酶X的表達量W繼續進行培 養。之後，在適當的時期恢復基於抑制物R的抑制，W抑制酶X的表達，從而可W增加由化 合物P生成化合物Q的量（圖8)。使用通過添加誘導物質而誘導的啟動子A時，調節該誘 導物質的添加量，W使該誘導物質在培養後期耗盡，從而可W恢復基於抑制物R的抑制。使 用通過升高或降低培養溫度而誘導的啟動子A時，通過將培養溫度恢復至發生基於抑制物 R的抑制的溫度，可W恢復基於抑制物R的抑制。
[0104] 優選使用將抑制物R的表達置於誘導啟動子B的控制下的本發明的微生物，通過 將化合物Q的製備步驟分成培養前期和培養後期該兩期來製備化合物Q。目P，將該微生物接 種在含有碳源的培養基中使菌體增殖，之後根據誘導啟動子B的性質通過添加誘導物質或 者升高或降低培養溫度來激活誘導啟動子B，W增加抑制物R的生成量，從而可W抑制代謝 物M的生產，增加由化合物P生成化合物Q的量（圖9)。
[0105] 在本發明的製備方法中，當化合物Q對本發明的微生物的增殖產生影響時，優選 使用將酶Y的表達置於誘導啟動子C的控制下的微生物，通過將化合物Q的製備步驟分成 培養前期和培養後期該兩期來製備化合物Q。目P，將該微生物接種在含有碳源的培養基中 使菌體增殖，之後根據誘導啟動子C的性質，通過添加誘導物質或者升高或降低培養溫度 來激活誘導啟動子C的轉錄，W增加酶Y的生成量，從而可W增加由化合物P生成化合物Q 的量（圖10)。而且，可W通過在培養後期激活誘導啟動子C的轉錄W增加酶Y的生成量， 同時激活誘導啟動子BW增加抑制物R的生成量，來抑制代謝物M的生產，增加由化合物P 生成化合物Q的量（圖11)。
[0106] 該種情況下，通過使啟動子C和啟動子B成為相同的啟動子，可W在同一時期進行 啟動子C的誘導和啟動子B的誘導。另外，當從受到同一控制蛋白的轉錄控制的啟動子組 中選擇啟動子C和啟動子B時，即使各自是不同的啟動子，也可W在同一時期進行啟動子C 的誘導和啟動子B的誘導。
[0107] 如上所述，採用通過本發明的微生物進行的製備方法時，根據該微生物的增殖狀 態或化合物Q對該微生物的影響，通過使用相同的微生物來改變培養方法，可W容易地使 化合物Q的生產量最大化。
[010引關於可W使用本發明的微生物來製備的化合物Q，在由碳源經由化合物P生成生 長所必須的代謝物M的生物合成途徑或代謝途徑中，只要可W由化合物P通過分支的途徑 生成化合物Q，則也可W製備任何的化合物。
[0109] 化合物P只要是由碳源生成生長所必須的代謝物的生物合成途徑上的代謝物即 可，可W是任何的有機化合物。例如，可W列舉DHS、分支酸、預苯酸、2-氧代異戊酸、穀氨 酸、天冬氨酸、天冬氨酸目-半酵、高絲氨酸和絲氨酸等。化合物Q只要是通過用酶Y轉換 化合物P而獲得的物質即可，可W是任何的有機化合物。例如，可W列舉原兒茶酸、氨茵 酸、4-輕基苯基丙麗酸、前酪氨酸、苯基丙麗酸、2-異丙基蘋果酸、額氨酸、Y-穀氨醜磯酸、 N-己醜穀氨酸、天冬醜胺、2, 3-二氨化巧二駿酸和0-己醜高絲氨酸等。
[0110] 當化合物P為D服時，通過莽草酸脫氨酶（酶幻生成莽草酸（代謝物M)，但可W 通過D服脫水酶（酶Y)生產原兒茶酸（化合物巧。原兒茶酸除了作為醫藥、農藥、香料等 的原料W外，還可用作使用微生物來製備被期待作為新的塑料原料的2-化喃麗-4, 6-二甲 酸時的原料。
[0111] 當化合物P為分支酸時，通過分支酸變位酶（酶幻生成預苯酸（代謝物M)，但可 W通過氨茵酸合成酶（酶巧生產氨茵酸（化合物巧。氨茵酸成為作為芳族胺基酸的色氨 酸等的合成原料，當該微生物具有色氨酸的生物合成途徑時，還可W直接生產色氨酸。
[0112] 當化合物P為預苯酸時，通過預苯酸脫水酶（酶幻生成苯基丙麗酸（代謝物M)， 但本發明的微生物在大腸桿菌K-12株等中通過預苯酸脫氨酶（酶巧可W生產4-輕基苯 基丙麗酸（化合物曲。4-輕基苯基丙麗酸成為作為芳族胺基酸的酪氨酸的合成原料，當該 微生物具有由4-輕基苯基丙麗酸生成酪氨酸的生物合成途徑時，還可W直接生產酪氨酸。
[0113]當化合物P為預苯酸時，通過預苯酸脫水酶（酶幻生成苯基丙麗酸（代謝物M)，但 本發明的微生物在穀氨酸棒狀桿菌等中通過預苯酸轉氨酶（酶巧可W生產前酪氨酸（化 合物曲。前酪氨酸成為作為芳族胺基酸的酪氨酸的合成原料，當該微生物具有由前酪氨酸 生成酪氨酸的生物合成途徑時，還可W直接生產酪氨酸。
[0114] 當化合物P為預苯酸時，本發明的微生物在大腸桿菌K-12株等中通過預苯酸脫氨 酶（酶幻生成4-輕基苯基丙麗酸（代謝物M)，且本發明的微生物在穀氨酸棒狀桿菌等中 通過預苯酸脫氨酶（酶幻生成前酪氨酸（代謝物M)，但通過預苯酸脫水酶（酶巧可W生 產苯基丙麗酸（化合物曲。苯基丙麗酸成為作為芳族胺基酸的苯丙氨酸的合成原料，當該 微生物具有苯丙氨酸的生物合成途徑時，還可W直接生產苯丙氨酸。
[0115] 當化合物P為2-氧代異戊酸時，通過支鏈胺基酸氨基轉移酶（酶幻生成額氨酸 (代謝物M)，但通過2-異丙基蘋果酸合成酶（酶巧可W生產2-異丙基蘋果酸（化合物 Q)。2-異丙基蘋果酸成為亮氨酸的合成原料，當該微生物具有亮氨酸的生物合成途徑時，還 可W直接生產亮氨酸。
[0116] 當化合物P為2-氧代異戊酸時，通過2-異丙基蘋果酸合成酶（酶幻生成2-異 丙基蘋果酸（代謝物M)，但通過支鏈胺基酸氨基轉移酶（酶巧還可W生產額氨酸（化合物 曲。
[0117] 當化合物P為穀氨酸時，通過胺基酸-N-己醜轉移酶（酶幻生成N-己醜穀氨酸 (代謝物M)，但通過Y-穀氨醜激酶（酶Y)可W生產Y-穀氨醜磯酸（化合物曲。Y-谷 氨醜磯酸成為脯氨酸的合成原料，當該微生物具有脯氨酸的生物合成途徑時，還可W直接 生產脯氨酸。
[0118] 當化合物P為穀氨酸時，通過Y-穀氨醜激酶（酶幻生成Y-穀氨醜磯酸（代謝 物M)，但通過胺基酸-N-己醜轉移酶（酶Y)可W生產N-己醜穀氨酸（化合物曲。N-己醜 穀氨酸成為精氨酸的合成原料，當該微生物具有精氨酸的生物合成途徑時，還可W直接生 產精氨酸。
[0119] 當化合物P為天冬氨酸時，通過天冬氨酸激酶（酶幻生成目-天冬氨醜磯酸（代 謝物M)，但通過天冬醜胺合成酶（酶Y)可W生產天冬醜胺（化合物曲。
[0120] 當化合物P為天冬氨酸目-半酵時，通過高絲氨酸脫氨酶（酶幻生成高絲氨酸 (代謝物M)，但通過二輕基焦磯酸合成酶（酶巧可W生產2, 3-二氨化巧二駿酸（化合物 Q)。2, 3-二氨化巧二駿酸成為賴氨酸的合成原料，當該微生物具有由2, 3-二氨化巧二駿酸 生成賴氨酸的生物合成途徑時，還可W直接生產賴氨酸。
[0121] 當化合物P為高絲氨酸時，通過高絲氨酸激酶（酶幻生成高絲氨酸磯酸（代謝物 M)，但通過高絲氨酸己醜轉移酶（酶Y)可W生產0-己醜高絲氨酸（化合物曲。0-己醜高 絲氨酸成為甲硫氨酸的合成原料，當該微生物具有甲硫氨酸的生物合成途徑時，還可W直 接生產甲硫氨酸。
[0122] 當化合物P為高絲氨酸時，通過高絲氨酸己醜轉移酶（酶幻生成0-己醜高絲氨 酸（代謝物M)，但通過高絲氨酸激酶（酶幻可W生產高絲氨酸磯酸（化合物曲。高絲氨 酸磯酸成為蘇氨酸或異亮氨酸的合成原料，當該微生物具有異亮氨酸的生物合成途徑時， 還可W直接生產蘇氨酸或異亮氨酸。
[0123]當化合物P為絲氨酸時，通過絲氨酸輕甲基轉移酶（酶幻生成甘氨酸（代謝物M)， 但通過絲氨酸轉移酶（酶Y)可W生產0-己醜絲氨酸（化合物曲。0-己醜絲氨酸成為半脫 氨酸的合成原料，當該微生物具有半脫氨酸的生物合成途徑時，還可W直接生產半脫氨酸。
[0124] 編碼與上述化合物Q的生產有關的酶Y的基因可W使用來自本發明的微生物的基 因，也可W使用來自不同於本發明的微生物的原核生物或真核生物的基因。例如，使用本發 明的微生物製備原兒茶酸時，由於ATCC13032株攜帶D服脫水酶基因，所W只要在原兒茶酸 的生產中使用該基因產物即可，但由於大腸桿菌K-12株未攜帶D服脫水酶基因，所W需要 使用來自其他微生物的DHS脫水酶基因。
[01巧]該裡，作為更具體的例子，對高效率地生產原兒茶酸的菌株進行詳述，所述原兒茶 酸可W通過對來自上述ATCC13032株的D服生產菌株賦予性質（ee)來製備。
[0126] 來自生產原兒茶酸的ATCC13032株的菌株，是指除了具有上述的性質（aa)?（dd) 還具有下述的性質（ee)的微生物。
[0127] (ee)利用不同於促進qsuB基因（基因y;核巧酸編號444, 184?446, 040)轉錄 的本來的啟動子、並且不同於啟動子A的啟動子C來控制qsuB基因的轉錄，所述qsuB基因 編碼由D服轉換成原兒茶酸的D服脫水酶（酶Y)的蛋白 來自具有上述的性質（aa)?（ee)的ATCC13032株的菌株根據葡萄糖等碳源可W生 產原兒茶酸，但由於該菌株具有原兒茶酸雙加氧酶，所W有可能分解所生成的原兒茶酸W 減少原兒茶酸的量。因此，優選通過向編碼原兒茶酸4, 5-雙加氧酶?a亞單元.蛋白的 pcaG(cg2630)基因（互補鏈核巧酸編號2, 511，382?2, 511，996))和/或編碼原兒茶酸 4, 5-雙加氧酶?目亞單元?蛋白的PC址(cg2631)基因（互補鏈核巧酸編號2, 512, 008? 2, 512, 700)的翻譯區或該基因的轉錄?翻譯調節區中導入1個W上的核巧酸的取代、缺失 或添加的突變，使該酶所具有的分解活性缺損或降低。
[0128]另外，該菌株具有將原兒茶酸的5位氨氧化、並催化向沒食子酸轉換的對輕基苯 甲酸輕化酶，所W有可能將生成的一部分原兒茶酸轉換成沒食子酸。因此，通過向編碼對輕 基苯甲酸輕化酶?蛋白的PObB(cgl226)基因（互補鏈核巧酸編號1，126, 301?1，127, 488) 的翻譯區或該基因的轉錄?翻譯調節區中導入1個W上的核巧酸的取代、缺失或添加的突 變，使該對輕基苯甲酸輕化酶所具有的氨氧化活性缺損或降低。
[0129] W下，在製備本發明的微生物時，對DNA克隆和突變導入株的製備方法進行闡述。 需要說明的是，如上所述，如果本發明的微生物是屬於棒狀桿菌屬、短桿菌屬、節桿菌屬、 類諾卡氏菌屬、微桿菌屬、鏈黴菌屬、擬無枝酸菌屬、紅球菌屬、動球菌屬、不動桿菌屬、假 單胞菌屬、泛菌屬、克雷伯氏菌屬和埃希氏菌的微生物，則可W使用任一種微生物，但對向 ATCC13032株進行突變導入的方法進行詳細說明。需要說明的是，作為用於DNA克隆和導入 突變的宿主菌，主要使用大腸桿菌K-12株。
[0130] 上述的大腸桿菌K-12株和ATCC13032株分別通過通常用於培養大腸桿菌和棒狀 桿菌屬細菌的公知方法進行培養。培養後，利用公知的方法（例如化rrentprotocolsin molecularbiology中記載的方法）分離、純化該微生物的染色體DM。利用限制酶消化法、 聚合酶鏈反應（PCR)法、或使用了合成DNA的雜交法等，可W由該染色體DNA獲得包含編碼 上述啟動子或代謝酶等的DNA的片段。
[013。 作為用於連接DNAW進行DNA克隆或突變導入的大腸桿菌用載體，只要是在大腸 桿菌K-12株等中能夠自主複製的載體，則可W使用質粒載體、瞻菌體載體等任一種，具體 而言，可W使用pUC19 [Gene, 33，103 (1985)]、pUC18、地R322 等。
[0132]用作上述載體的宿主的大腸桿菌，只要是屬於大腸桿菌的微生物，則均可使用，具 體而言，可W列舉大腸桿菌巧scherichiacoli)XLl-BlueMRF'[義I' 3夕,一シ公司制 造、Strategies, 5, 81 (1992)]、大腸桿菌JM109、大腸桿菌I3L21 等。
[0133] 向屬於棒狀桿菌屬、短桿菌屬、節桿菌屬、類諾卡氏菌屬、微桿菌屬、鏈黴菌屬、擬 無枝酸菌屬、紅球菌屬、動球菌屬、不動桿菌屬、假單胞菌屬、泛菌屬、克雷伯氏菌屬和埃希 氏菌屬的微生物中導入上述DNA時，使用在該些微生物中能夠進行自主複製的載體。優選 可W使用在任一種該微生物和大腸桿菌K-12株該兩種微生物中能夠自主複製的穿梭載 體，向作為宿主的該微生物中導入重組DNAd
[0134] 作為在棒狀桿菌屬細菌中能夠自主複製的穿梭載體，可W列舉pAM330(參照日本 特開昭58-67699號公報）、P歷1519 (參照日本特開昭58-77895號公報）等。另外，從該 些載體中取出具有在棒狀桿菌內能夠自主複製質粒的能力的DNA片段，將其插入大腸杆 菌-棒狀桿菌用穿梭載體中時，可W用作在大腸桿菌和棒狀桿菌兩者中能夠自主複製的載 體。例如，通過在作為大腸桿菌用載體的抑56298(夕力3W才公司製造）中插入穀氨酸 棒狀桿菌ATCC13058株所具有的質粒PHM1519的複製區作為用於在棒狀桿菌屬株中複製質 粒的複製區，可W構建該穿梭載體。可W保持該穿梭載體。ATCC13032株和穀氨酸棒狀桿菌 ATCC13058株可W從獨立行政法人?製品評價技術基盤機構?生物遺傳資源部口（W下簡 記為NITC)獲得。
[013引作為DNA的導入方法，只要是向上述宿主細胞中導入DNA的方法，則均可使用，例 女口，可W列舉使用巧離子的方法〔Proc.化tl.Acad.Sci.USA, 69，2110 (1972))、電穿 孔法〔NucleicAcidsRes., 16，6127 (1988))等。向穀氨酸棒狀桿菌中導入DNA還可W 通過vanderRest等人的方法〔Appl.Microbiol.Biotechnol., 52, 541 (1999))來進 行。
[0136] 可W從如上操作獲得的轉化體中提取DNA，確定該DNA中所含的本發明的DNA的核 巧酸序列。確定核巧酸序列時可W使用通常採用的核巧酸序列分析方法、例如雙脫氧法〔Proc. Acad. Sci. USA, 74，5463 (1977))或3730x1型DNA測定儀（7 F .W才合義，厶乂公司製造）等核巧酸序列分析裝置。
[0137] 另外，根據上述確定的DNA的核巧酸序列，通過使用パ一*才，才W才合義 ，厶《公司製造的8905型DNA合成裝置等進行化學合成，也可W製備目標DNA。
[0138] 具有目標表型的菌株可W通過使用N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基脈或己基甲賴酸 等突變劑的處理或照射UV或放射線等的突變處理、或自然突變等導入突變而獲得。或者， 克隆該菌株的導入突變的區的DNA，在試管內（體外）向DNA中導入突變。當導入大的取代 突變時，在構建在該菌株內能夠複製的載體上擔載了應該取代的DNA的質粒後，將該質粒 導入該菌株中，或者還可W通過該質粒與染色體DNA之間的同源重組導入取代突變。關於 導入的突變的種類，只要體現出目標表型，則可W是核巧酸取代突變、缺失突變、插入突變 或與大的DNA片段的取代突變的任意一種，並且關於突變的大小，當為1個核巧酸W上時， 也可W是任何大小的突變。W下，只要沒有特別說明，則突變的導入方法採用上述方法。
[0139]在本發明的微生物中，當需要通過除啟動子或轉錄控制蛋白W外的手段來調節基 因的表達量時，可W通過調整核糖體結合序列與翻譯起始密碼子之間的距離、改變翻譯起 始密碼子周圍的序列、或者改變翻譯區內的核巧酸序列等來調節該基因的翻譯起始效率。
[0140]將如此操作而獲得的用於導入突變的DNA插入通常在大腸桿菌內能夠複製的質 粒中，之後利用上述的DNA導入法導入作為宿主菌的穀氨酸棒狀桿菌中。當該質粒是溫度 敏感性載體時，通過高溫培養選擇，選出一次交叉型同源重組體；而當該質粒具有在宿主菌 內能夠表達的卡那黴素耐性等抗生素耐性標誌物時，通過該抗生素耐性選擇，選出一次交 叉型同源重組體。為了獲得在與該DNA片段相同的染色體區通過二次交叉型同源重組取代 了該DNA的突變株時，通常可W採用WJager等人〔J. Bacteriol.174，5462 (1992))開 發的使用枯草芽抱桿菌妨株的果聚糖藏糖酶基因（sacB基因）的 方法。採用藏糖耐性選擇。採用本方法時，表達枯草芽抱桿菌168株的sacB基因的穀氨酸 棒狀桿菌在含有藏糖的培養基中死亡，所W通過藏糖耐性選擇可W獲得通過二次交叉型同 源重組失去了果聚糖藏糖酶基因的突變株。
[0141]本發明的微生物的培養可W在含有碳源、氮源、無機鹽、各種維生素等的普通的營 養培養基中進行，作為碳源，例如使用葡萄糖、藏糖、果糖等糖類、己醇、甲醇等醇類、構稼 酸、蘋果酸、玻巧酸等有機酸類、甘油、廢糖蜜等。作為氮源，例如將氨、硫酸饋、氯化饋、硝酸 饋、尿素等分別單獨或混合使用。另外，作為無機鹽，例如使用磯酸一氨鍾、磯酸二氨鍾、硫 酸鎮等。此外，可W在培養基中添加蛋白腺、肉提取物、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白胺基酸、 生物素等各種維生素等營養素。
[0142] 培養通常在通氣攬拌、振蕩等需氧條件下進行。培養溫度只要是本發明的微生物 能夠生長的溫度即可，沒有特別限定，另外，對培養過程中的抑也沒有特別限定，只要是本 發明的微生物能夠生長的抑即可。培養中的抑調節可W通過添加酸或鹼來進行。
[0143] 關於培養結束後的培養液中的目標有機化合物，根據需要，可W通過離也分離等 從該培養液中除去菌體等不溶成分後，例如通過將基於己酸己醋等有機溶劑的提取法、使 用活性炭的方法、使用離子交換樹脂的方法、晶析法、鹽析等沉澱法、蒸觸法等方法單獨或 組合，來採集目標有機化合物。 實施例
[0144]W下，通過實施例，對作為本發明的微生物的、高效率地生產作為化合物P的DHS 的ATCC13032株的菌株的製作和利用該微生物進行的D服的製備方法進行具體闡述。另 夕F，通過實施例，對作為本發明的微生物的、高效率地生產作為化合物Q的原兒茶酸的 ATCC13032株的菌株的製作和利用該微生物進行的原兒茶酸的製備方法進行具體闡述。需 要說明的是，本發明並不限於該些實施例。
[0145] 實施例1.Pben-vanR株與N甜AaroE3AqsuBAqsuD株的D服生產性比較 如下操作，用化的發酵缸培養下述菌株：通過qsuB基因的符合讀框缺失突變，失去了 從D服向原兒茶酸轉換的能力，且aroE3基因的表達被處於benA啟動子控制下的VanR基 因所編碼的VanR抑制物抑制的化en-vanR株（參考例11) ;W及通過qsuB基因和qsuD基 因和aroE3基因的符合讀框缺失突變，失去了從D服向莽草酸轉換的能力和從D服向原兒 茶酸轉換的能力的N甜AaroE3AqsuBAqsuD株（參考例10)，進行D服的生產性試驗。需 要說明的是，由於與由DAHP合成DHS有關的4種基因（aroF、aroG、aroB和aroD基因）的 轉錄被化啟動子控制，所W與野生株相比該些菌株的D服生成量增加。
[0146] 作為該些菌株的W前的培養和前培養用的培養基，使用CGXII培養基（20g/L的硫 酸饋、5g/L的尿素、Ig/L的磯酸二氨鍾、Ig/L的磯酸氨二鍾、0. 25g/L的硫酸鎮走水合物、 lOmg/L的氯化巧、lOmg/L的硫酸亞鐵走水合物、lOmg/L的硫酸猛五水合物、Img/L的硫酸鋒 走水合物、0. 2mg/L的硫酸銅、0. 02mg/L的氯化媒六水合物、0. 2mg/L的生物素、20g/L的葡 萄糖、30mg/L的原兒茶酸、抑7. 0)。將該些菌株的1%的W前的培養液接種在前培養液中， 之後在3(TC下培養24小時。用CGXII培養基稀釋使前培養液在600nm的吸光度達到3. 0， 之後只取1%到化發酵缸（工株式會社製造BMS-03NP2)內的0.化本培養用培養基 中。作為本培養用培養基，使用含有2.Ig/L的構稼酸酢和1.Og/L的硫酸鐵? 7馬0的作為 CGXII培養基的CGCF培養基。W下，只要沒有特別說明，則D服W及原兒茶酸的生產實驗利 用該方法來進行。
[0147] 需要說明的是，由於N甜AaroE3AqsuBAqsuD株在CGXII培養基和CGCF培養基 中生長極差，所W在該些培養基中添加0. 5g/L的色氨酸、0. 4g/L的苯丙氨酸、0. 45g/L的酪 氨酸、17mg/L的莽草酸、45mg/L的維生素K2和14mg/L的對氨基苯甲酸進行培養。在本培 養開始後的適當時期採集培養液，用5%的己膳水溶液稀釋至1000倍，利用高效液相色譜法 (Waters公司、LCTPremierXE)在表1的分離條件下進行分析，之後根據W濃度已知的D服 水溶液值服從Sigma公司購入）為對照的D服峰的面積比來計算。W下，D服的定量利用 該方法進行測定。
[014引關於化en-vanR株，在本培養開始時添加終濃度為5mM的苯甲酸，38小時後W 4.Og/小時的比例添加葡萄糖，再培養48小時。另一方面，關於N甜AaroE3AqsuBAqsuD 株，在本培養開始後45. 5小時的時刻W6.Og/小時的比例添加葡萄糖，再培養16. 5小時。 Pben-vanR株和N甜AaroE3AqsuBAqsuD株的D服的生產量分別在培養開始後第86小時 和第62小時達到最大，該些菌株的D服的最大生產量分別為15. 4g/L和7. 7g/L。由該結 果可知；與在含有芳族胺基酸等的培養基中培養的N甜AaroE3AqsuBAqsuD株相比，通過 VanR抑制物可W人為控制aroE基因表達的化en-vanR株即使在不含芳族胺基酸等的培養 基中培養，其D服的生產性也優異。
[0149][表1]
【權利要求】
1. 原核生物，該原核生物具有下述的（a)?（d)所述的所有性質，以調節將由碳源生 成生長所必須的代謝物M的生物合成途徑中作為中間代謝物的化合物P轉換成代謝物M的 酶X的表達量，從而使化合物P蓄積， (a) 在與從該原核生物所能利用的碳源到化合物P的生物合成有關的酶組中，任意一 個以上的酶的活性較該原核生物的野生株有所增強； (b) 通過在編碼酶X的蛋白的野生型基因x的翻譯區、該基因的翻譯調節區或促進基 因x轉錄的啟動子區中具有1個以上的核苷酸的取代、缺失或添加的突變，酶X的活性缺損 或降低； (c) 利用與促進上述基因x轉錄的本來的啟動子不同、且轉錄被抑制物R的蛋白抑制 的啟動子A來控制編碼活性型酶X的DNA的轉錄； (d) 具有1拷貝以上的編碼抑制物R的蛋白的基因z，該基因的轉錄被該基因的本來的 啟動子和/或不同於該啟動子的誘導啟動子B控制。
2. 權利要求1所述的原核生物，其特徵在於：性質（b)所述的促進基因x轉錄的啟動 子區中的取代突變是將該啟動子的整個區域或一部分區域取代成性質（c)所述的啟動子A 的DNA的突變。
3. 權利要求1或2所述的原核生物，其特徵在於：在上述原核生物所具有的代謝化合 物P的酶中，酶X以外的任意一個以上的代謝酶的活性缺損或降低。
4. 權利要求1?3中任一項所述的原核生物，其特徵在於：上述啟動子B是通過添加 選自阿魏酸、香草酸、香蘭素、苯甲酸、3-羥基苯甲酸、間苯二酚、4-羥基苯甲酸、2, 4-二羥 基苯甲酸、果糖和蔗糖的化合物而誘導的啟動子。
5. 權利要求1?4中任一項所述的原核生物，其特徵在於：編碼上述抑制物R的蛋白 的基因z為穀氨酸棒狀桿菌ATCC13032株的vanR(cg2615)基因、pcaR(cg2624)基因、或 rhcR(cgl308)基因。
6. 權利要求1?5中任一項所述的原核生物，其特徵在於：上述啟動子A為穀氨酸 棒狀桿菌ATCC13032株的vanA(cg2616)基因的啟動子、pobA(cgl226)基因的啟動子、 pcaH(cg2631)基因的啟動子、或rhcH(cgl309)基因的啟動子。
7. 化合物P的製備方法，其特徵在於：在抑制了啟動子A轉錄的狀態下、在碳源的存在 下培養權利要求1?6中任一項所述的原核生物。
8. 化合物P的製備方法，其特徵在於：在抑制了啟動子A轉錄的狀態下、在碳源的存在 下培養權利要求1?6中任一項所述的原核生物，之後施加誘導啟動子B轉錄的處理，使抑 制物R的蛋白表達量增加，從而減少代謝物M的生成量。
9. 化合物P的製備方法，其特徵在於：在解除了啟動子A的轉錄抑制的狀態下、在碳源 的存在下培養權利要求1?6中任一項所述的原核生物，之後施加誘導啟動子B轉錄的處 理，使抑制物R的蛋白表達量增加，從而減少代謝物M的生成量。
10. 權利要求7?9中任一項所述的化合物P的製備方法，其特徵在於，上述化合物P 和上述代謝物M的組合為下述（f)?（i)中的任意一個： (f) 化合物P為3-脫氫莽草酸、代謝物M為莽草酸； (g) 化合物P為穀氨酸、代謝物M為N-乙醯穀氨酸或Y-穀氨醯磷酸； (h) 化合物P為天冬氨酸、代謝物M為0 -天冬氨醯磷酸； (i) 化合物P為絲氨酸、代謝物M為甘氨酸。
11. 權利要求1?6中任一項所述的原核生物，其特徵在於：除了具有（a)?（d)所述 的性質以外，還具有下述的性質（e)，以通過酶Y將蓄積的化合物P轉換成化合物Q， (e)通過在編碼酶Y的蛋白的基因y的翻譯區、該基因的翻譯調節區或促進基因y轉 錄的啟動子區中具有1個以上的核苷酸的取代、缺失或添加的突變，由化合物P向化合物Q 轉換的能力增強、或者基因y的表達受到不同於野生型的控制。
12. 權利要求11所述的原核生物，其特徵在於：在上述原核生物所具有的代謝化合物 Q的酶中，任意一個以上的代謝酶的活性缺損或降低。
13. 權利要求11或12所述的原核生物，其特徵在於：性質（e)所述的促進基因y轉錄 的啟動子區中的取代突變是將該啟動子的整個區域或一部分區域取代成不同於促進該基 因轉錄的本來的啟動子和啟動子A的啟動子C的DNA的突變。
14. 權利要求13所述的原核生物，其特徵在於：上述啟動子C與啟動子B相同、或者上 述啟動子C受到控制啟動子B轉錄的蛋白的轉錄控制。
15. 權利要求13或14所述的原核生物，其特徵在於：上述啟動子C為誘導啟動子。
16. 權利要求15所述的原核生物，其特徵在於：上述啟動子C是通過添加選自阿魏酸、 香草酸、香蘭素、苯甲酸、3-羥基苯甲酸、間苯二酚、4-羥基苯甲酸、2, 4-二羥基苯甲酸、果 糖和蔗糖的化合物而誘導的啟動子。
17. 化合物Q的製備方法，其特徵在於：在抑制了啟動子A轉錄的狀態下、在碳源的存 在下培養權利要求11?16中任一項所述的原核生物。
18. 化合物Q的製備方法，其特徵在於：在抑制了啟動子A轉錄的狀態下、在碳源的存 在下培養權利要求11?16中任一項所述的原核生物，之後施加誘導啟動子B轉錄的處理， 使抑制物R的蛋白表達量增加，從而減少代謝物M的生成量，並增加化合物Q的生成量。
19. 化合物Q的製備方法，其特徵在於：在解除了啟動子A的轉錄抑制的狀態下、在碳 源的存在下培養權利要求11?16中任一項所述的原核生物，之後施加誘導啟動子B轉錄 的處理，使抑制物R的蛋白表達量增加，從而減少代謝物M的生成量，並增加化合物Q的生 成量。
20. 權利要求17?19中任一項所述的化合物Q的製備方法，其特徵在於：在碳源的存 在下培養權利要求11?16中任一項所述的原核生物，之後施加誘導上述啟動子C轉錄的 處理，使上述酶Y的表達量增加，從而增加化合物Q的生成量。
21. 權利要求17?20中任一項所述的化合物Q的製備方法，其特徵在於，上述化合物 P、上述化合物Q和上述代謝物M的組合為下述（j)?（w)中的任意一個： (j) 化合物P為3-脫氫莽草酸、化合物Q為原兒茶酸、代謝物M為莽草酸； (k) 化合物P為分支酸、化合物Q為氨茴酸、代謝物M為預苯酸； (l) 化合物P為預苯酸、化合物Q為4-羥基苯基丙酮酸、代謝物M為苯基丙酮酸； (m) 化合物P為預苯酸、化合物Q為前酪氨酸、代謝物M為苯基丙酮酸； (n) 化合物P為預苯酸、化合物Q為苯基丙酮酸、代謝物M為4-羥基苯基丙酮酸或前 酪氨酸； (〇)化合物P為2-氧代異戊酸、化合物Q為2-異丙基蘋果酸、代謝物M為纈氨酸； (P)化合物P為2-氧代異戊酸、化合物Q為纈氨酸、代謝物M為2-異丙基蘋果酸； (q) 化合物P為穀氨酸、化合物Q為Y-穀氨醯磷酸、代謝物M為N-乙醯穀氨酸； (r) 化合物P為穀氨酸、化合物Q為N-乙醯穀氨酸、代謝物M為Y-穀氨醯磷酸； (s) 化合物P為天冬氨酸、化合物Q為天冬醯胺、代謝物M為天冬氨醯磷酸； (t) 化合物P為天冬氨酸0 -半醛、化合物Q為2, 3-二氫吡啶二羧酸、代謝物M為高 絲氨酸； (u) 化合物P為高絲氨酸、化合物Q為0-乙醯高絲氨酸、代謝物M為高絲氨酸磷酸； (v) 化合物P為高絲氨酸、化合物Q為高絲氨酸磷酸、代謝物M為0-乙醯高絲氨酸； (w) 化合物P為絲氨酸、化合物Q為0-乙醯絲氨酸、代謝物M為甘氨酸。
22. 權利要求21的（j)所述的原兒茶酸的製備方法，其特徵在於：上述酶X為莽草酸 脫氫酶，並且上述酶Y為3-脫氫莽草酸脫水酶。
23. 權利要求22所述的原兒茶酸的製備方法，其特徵在於，選自編碼原兒茶酸2, 3-雙 加氧酶的基因、編碼原兒茶酸3, 4-雙加氧酶的基因、編碼原兒茶酸4, 5-雙加氧酶的基因 和編碼原兒茶酸脫碳酸酶的基因的至少一個基因的性質為：通過向該基因的翻譯區或其轉 錄?翻譯調節區中導入1個以上的核苷酸的取代、缺失或添加的突變，原兒茶酸的代謝活性 缺損或降低。
24. 權利要求1?6中任一項或權利要求11?16中任一項所述的原核生物，該原核 生物為穀氨酸棒狀桿菌或大腸桿菌。
【文檔編號】C12P7/42GK104379729SQ201380032679
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2013年7月3日 優先權日:2012年7月3日
【發明者】飯田甲悟, 巖崎卓己, 西達也 申請人:株式會社吉那裡斯