環介島等溫基因擴增結果分析方法
2023-06-06 15:50:31 1
專利名稱：環介島等溫基因擴增結果分析方法
技術領域：
本發明屬於基因檢測技術，具體地說，就是通過在線監測陣列環介島等溫基因擴 增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)反應液電導率的變化來反映生化反 應進程，進而獲得目標基因的定性、定量信息。
背景技術：
得到廣泛研究與應用的LAMP基因檢測技術是利用4種不同的特異性引物識別靶 基因的6個特定區域，在等溫條件進行擴增反應，不需要模板的熱變性和長時間溫度循環， 具有 艮多優越『性(見文獻 Notomi Τ, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N,Hase T Loop-mediated isothermal amplification of DNA,Nucleic Acids Res 2000,28(12) :E63·)。與傳統的PCR擴增技術相比，LAMP具有簡便、快速、不需要昂貴的儀 器設備、適合現場使用、特異性好等特點，因此解決了基於核酸的分子生物學檢測技術的諸 多難題，使快速、廉價診斷成為可能。其反應過程如下(DNA/RNA)n_!+dNTP = (DNA) n+P2074-(1);P2074-+2Mg2+ = Mg2P2O7 (沉澱)(2)。目前，對LAMP結果的分析，目前主要有以下幾種1、肉眼直接觀察生成的焦磷酸鎂沉澱(見文獻Enosawa M，Kageyama S， Sawai K, Watanabe K, Notomi T, Onoe S, Mori Y, Yokomizo Y :Use of Loop-Mediated Isothermal Amplification of the IS900Sequence for Rapid Detection of Cultured Mycobacterium avium subsp.Paratuberculosis, J.Clin.Microbiol. 2003,41, 4359-4365)，或滴加顯色劑後觀察顏色變化(見文獻Zhang Q，Shi C，Huang J, Jia K，Chen X, Liu HRapid diagnosis of turbot reddish body iridovirus in turbot using the
loop-mediated isothermal amplification method,J. Virol. Meth. 2009,158,18-23)-
該方法缺點是主觀誤差不可避免。2、濁度儀測定焦磷酸鎂沉澱法(見文獻Mori Y，Kitao M，Tomita N, Notomi T Real-time turbidimetry of LAMP reaction for quantifying template DNA,J. Biochem. Biophys. Methods. 2004，59，145-157)，——該方法缺點是增加了貴重儀器的投入，且對各 相關試劑溶液的透明度都有苛刻要求。3、電泳法(見文獻 Ihira M, Yoshikawa T, Enomoto Y, Akimoto S, Ohashi M, Suga S, Nishimura N, Ozaki T, Nishiyama Y, Notomi T, Ohta Y, Asano Y :Rapid Diagnosis of Human Herpesvirus 6Infection by a Novel DNA Amplification Method,Loop-Mediated
Isothermal Amplification, J.Clin. Microbiol. 2004，42 (1)，140-145)-該方法缺點是
耗時較長，效率低。4、螢光定量PCR儀作螢光定量檢測(見文獻蔡哲鈞，馮傑雄，朱聖禾，核酸環介導 等溫擴增技術，國際檢驗醫學雜誌，2006，27，1092-1096)——該方法缺點是極大增加了使 用成本，也不利於儀器小型化設計。
5、雜交生物傳感器法(見文獻孫偉，高宏偉，鍾江華，覃鵬，焦奎，環介導等溫擴 增-納米硫化鎘標記電化學檢測單增李斯特菌的方法，專利公開號10U604M和文獻 Ahmed M, Hasan Q, Hossain M, Saito M, Tamiya E :Meat species identification based on the loop mediated isothermal amplification and electrochemical DNA sensor, Food Control, 2010, 21，599-605)——該方法其缺點是傳感器製作繁瑣，且只能用一次。綜上所述，目前的擴增結果分析手段是制約LAMP更快發展與推廣的關鍵因素。
發明內容
本發明要解決的技術問題是建立一種LAMP反應結果分析新方法，就是通過在線 監測環介島等溫基因擴增(LAMP)反應液電導率的變化來反映生化反應進程，進而獲得目 標基因的定性、定量信息，可簡便、快速、低成本地進行生物基因檢測。本發明是按以下技術方案實現的1、構建反應池-檢測池將4-96個電導率測定傳感器探頭排成陣列，每個探頭腔 體內插入一個0. 2ml 一次性薄壁管作為LAMP反應池，整個陣列嵌入由電加熱裝置與溫控器 構成的恆溫槽內。開啟電導率儀，即可在線感應測定每個薄壁管內液體的電導率值。2、建立目標基因LAMP方法確定LAMP反應混合液配方，根據靶基因資料庫信息設 計併合成對應於不同目標基因的成套引物。3、制定工作曲線將LAMP反應所需試劑混合後分裝，向系列薄壁管中分別加入 5μ1標準濃度DNA梯度樣品，置於保持65°C的反應池內30分鐘。測定並記錄各反應池開 始反應及反應終點時的電導率數據，計算每個反應池測得電導率差值(Y)，並求出Y與標準 DNA濃度值(Cx)之間的函數關係即得工作曲線。對於定性檢測要求的樣品，無需建立該曲線，根據LAMP反應前後電導率變化差值 直接判斷結果差值為零-陰性；差值大於零-陽性。4、樣品檢測常規方法提出待分析生物樣品DNA代替標準樣品，按步驟3進行。將 所得每個反應池電導率差值帶入工作曲線方程得到目標基因的定性、定量信息。本發明與已有技術對比具有以下特點1、本方法可以通過測得的電導率變化來判斷反應進程/結果，這種進程/結果與 所加入的目標基因引物相關，可進而推斷出目標基因的定性、定量信息。而電導率分析方法 從本質上具有內在的優越性，得到的是電信號，不需要轉換裝置即可以直接輸出，便於自動 化，是典型的「綠色分析技術」。2、本方法具有明顯的快捷優勢，可以快速高效實時監控反應進程。3、本方法中不需要複雜昂貴的儀器設備，硬體成本低；使用能耗低；不使用光學、 電學、生物學探針或指示劑，材料成本低，無健康危害風險。4、該方法在食品、藥品質量控制，環境監測，臨床診斷，轉基因生物及其產品甄別 等諸多領域中，都具有廣泛的應用前景。
具體實施例方式下面通過實施例的兩例來詳細敘述本發明的技術方法(本發明不限於實例，實用 廣泛)。實施例1、36份玉米轉基因定性甄別
步驟一、將38個電導率測定傳感器探頭排成陣列，每個探頭腔體內插入一個 -次性薄壁管作為LAMP反應池，整個陣列嵌入由電加熱裝置與溫控器構成的恆溫槽
0. 2ml內。步驟二、常規方法提取36份玉米待測樣品的DNA、1份轉基因玉米的DNA(陽性) 和1份非轉基因玉米的DNA(陰性)。步驟三、查資料庫，得到玉米轉基因啟動子(CaMV 35S promoter)基因序列，設計 外引物1、外引物2、內引物1、內引物2及兩個成環引物LoopF和LoopB。
夕卜弓丨物 1 :5，-tccactgacg taagggatga ； 外弓丨物 2 :5，-caacacgtgagcgaaaccct
內引物 1 5' -gagcgtgtcctctccaaatg caatcc cactatcctt cgca ； 內引物 2 5' -agtctct ctctacaaatcta gattaagggaatagaccctt ； LoopF :5，-cttatatagaggaagggtct ； LoopB 5' -g gtattattac acactcatc。
步驟四、將0. 2 μ M的外引物1和外引物2、0. 8 μ M的LoopF和LoopB、1. 6 μ M的內 引物1和內引物2、2mM 1%2+、0.811甜菜鹼、10\88{ DNA聚合酶反應緩衝液、38 μ L Bst DNA 聚合酶(SU/μ L)迅速混勻並分裝於1-38號0. 2ml薄壁管內。向1_36號薄壁管內依次加 入5 μ L 1-36編號的待測樣品DNA溶液，向37和38號薄壁管內分別加入5 μ L陽性和陰性 對照樣DNA溶液。滅菌水補至每管終體積25 μ L，迅速置入恆溫65°C的反應池陣列中，開啟 感應式電導率儀分別測定每個薄壁管內混合液的電導率值(Stl)。步驟五、孕育30分鐘後，分別測定每個薄壁管內混合液的電導率值(S3tl)。步驟六、結果判定將每個反應池內所得比較，數值不變的為陰性樣品，數 值降低的為陽性樣品。陽性和陰性對照樣反應池電導率數值的變化用來指示LAMP反應正 常與否S30 (陽)-Stl (陽)=O Ω /m-擴增不成功；S30 (陽)-S。(陽)< O Ω /m-擴增成功；S30 (陰)-S。(陰)=O Ω /m-正常，無模板DNA汙染；
S30 (陰)-Stl (陰)< O Ω /m-DNA汙染形成假陽性。
實施例2、20個淡水水樣中大腸桿菌(E. Coli) 一般菌株的定量測定 步驟一、將20個電導率測定傳感器探頭排成陣列，每個探頭腔體內插入一個 次性薄壁管作為LAMP反應池，整個陣列嵌入由電加熱裝置與溫控器構成的恆溫槽
0. 2ml內。
步驟二、常規方法提取20個待測水樣中所有微生物的DNA並作相應編號。 步驟二、查資料庫，得到E. Coli—般菌株通用保守基因序列，設計外引物1、外引 物2、內引物1、內引物2及兩個成環弓I物LoopF和LoopB。夕卜弓I物 1 :5，-atttaccgcagccagacg ；外弓丨物 2 :5，-gccatctcctgatgacgc ；|^弓1· 1 5' —ctggggcgaggtcgtggtattccgacaaacaccacgaat ；內引物 2 5' -cattttgcagctgtacgctcgcagcccatcatgaatgttgct ；
LoopF :5，-ctttgtaacaacctgtcatcgaca ；LoopB :5，-atcaatctcgatatccatgaaggtg。步驟三、制訂工作曲線。將0. 2μΜ的外引物1和外引物2、0. 8μΜ的LoopF和 LoopB、l. 6μ M的內引物1和內引物2、2mM Mg2+、0. 8M甜菜鹼、10 X BstDNA聚合酶反應緩衝 液、12 μ L Bst DNA聚合酶(8U/μ L)迅速混勻並分裝於1-12號0.2ml薄壁管內，然後按順序 分別向其中加入 1 X IOH5 X l(T16g/L、1 X l(T15g/L、5 X l(T15g/L、1 X 10_14g/L、5 X 10-V LUX l(T13g/L、5X l(T13g/L、1 X l(T12g/L、5X l(T12g/L、1 X l(T"g/L和 5X l(T"g/L 的標準濃度 DNA (提自Ε. Coli 一般菌株)5 μ L。滅菌水補至每管終體積25 μ L，迅速置入恆溫65°C的反 應池陣列中，開啟感應式電導率儀分別測定每個薄壁管內混合液的電導率值(Stl)。LAMP反 應30分鐘後，分別再測定每個薄壁管內混合液的電導率值(S3tl)。計算每個反應池測得電導 率差值(Y = &-SJ，並求出Y與標準DNA濃度值(Cx)之間的函數關係即得工作曲線方程。步驟四、用20個待測水樣中微生物的DNA代替標準樣品DNA模板，按照步驟三獲 得各自的電導率差值Y，然後帶入工作曲線方程得到E. Coli —般菌株DNA的濃度，然後換算 出菌株濃度。
權利要求
1.一種環介島等溫基因擴增結果分析方法，其特徵在於它是通過測定環介島等溫基因 擴增反應液電導率的變化數據來獲得目標基因的定性、定量信息的分析方法。
2.根據權利要求1所述的環介島等溫基因擴增結果分析方法，其特徵在於以下分析方 法步驟(1)構建反應池-檢測池將4-96個電導率測定傳感器探頭排成陣列，每個探頭腔體 內插入一個0. 2ml 一次性薄壁管作為環介島等溫基因擴增反應池，整個陣列嵌入由電加熱 裝置與溫控器構成的恆溫槽內；開啟電導率儀，即可在線感應測定每個薄壁管內液體的電 導率值；(2)建立目標基因環介島等溫擴增方法確定環介島等溫基因擴增反應混合液配方， 根據靶基因資料庫信息設計併合成對應於不同目標基因的成套引物；(3)制定工作曲線將環介島等溫基因擴增反應所需試劑混合後分裝，向系列薄壁管 中分別加入5 μ 1標準濃度DNA梯度樣品，置於保持65°C的反應池內30分鐘；測定並記錄 各反應池開始反應及反應終點時的電導率數據，計算每個反應池測得電導率差值Y並求出 Y與標準DNA濃度值Cx之間的函數關係即得工作曲線；(4)樣品檢測常規方法提出待分析生物樣品DNA代替標準樣品，按步驟C3)進行；將 所得每個反應池電導率差值帶入工作曲線方程得到目標基因的定性、定量信息。
3.根據權利要求2所述的環介島等溫基因擴增結果分析方法，其特徵在於對於定性檢 測要求的樣品，無需建立工作曲線，根據LAMP反應前後電導率變化差值直接判斷結果差 值為零-陰性；差值大於零-陽性。
全文摘要
一種環介島等溫基因擴增(LAMP)結果分析方法，是建立一種LAMP反應結果分析新方法，通過測定LAMP液電導率的變化獲得目標基因的定性、定量信息，其工作方法是(1)感應式電導儀工作傳感器內插入薄壁管作為LAMP反應池；(2)分別在線測定每個反應池生化反應前後混合液的電導率值；(3)從各反應單元電導率的變化推知LAMP反應結果，進而給出目標DNA信息。本方法的特點是簡便快速、高靈敏度、操作簡便、儀器設備簡單廉價、費用低；可低成本地進行生物基因檢測。可廣泛用於食品、藥品質量控制，環境監測，臨床診斷，轉基因生物及其產品甄別等領域。
文檔編號G01N27/06GK102141533SQ20101057919
公開日2011年8月3日 申請日期2010年11月26日 優先權日2010年11月26日
發明者崔正國, 張旭志, 張豔, 李秋芬, 陳碧鵑, 馬紹賽 申請人:中國水產科學研究院黃海水產研究所