一種雲芝菌種以及採用該菌種生產雲芝胞內糖肽的方法
2023-06-06 14:33:56
專利名稱：一種雲芝菌種以及採用該菌種生產雲芝胞內糖肽的方法
技術領域：
本發明屬於藥用微生物發酵領域，具體涉及雲芝胞內糖肽生產菌及其發酵培養方法。
背景技術：
雲芝胞內糖肽系自藥用真菌雲芝(Coriolus Versicolor)液體培養菌絲體或從雲芝子實體中提取得到的結合蛋白多糖，雲芝胞內糖肽具有廣泛的藥理作用，特別對機體的免疫功能具有調節和增強作用，是一種有效的免疫增強藥，已成為治療免疫功能低下者的藥物。雲芝胞內糖肽可預防和治療慢性B型肝炎、肝硬化等類肝病，可預防和治療多種腫瘤疾病如肝癌、乳腺癌、胃癌、食道癌、大腸癌、頭頸部癌、婦癌等類惡性腫瘤手術，可降低放、化療毒副反應，可作為治療癌症的輔助藥品。此外雲芝糖肽還具有鎮痛、鎮靜、降血糖、抗B肝病毒、以及提高抗氧化能力，清除脂質過氧化物作用。雲芝胞內糖肽已於1998年被國家衛生部批准為國家II類新藥。
雲芝胞內糖肽是將天然雲芝菌子實體或通過深層發酵培養獲得雲芝菌絲體，通過粉碎、水煮，過濾去除固體殘渣，濾液濃縮至一定體積後，利用多糖溶於水而不溶於醇的特點，將糖肽沉澱醇沉出來。
有關雲芝液體發酵有一些文獻報導，但由於雲芝糖肽是一個多組分複雜體系，糖肽的理化性質、生理活性與分子量有很大關係，如何篩選得到一個優良菌株，如何通過液體發酵，特別是補料發酵及控制pH，以獲得大量雲芝菌絲體，提取得到較高有效成分含量產品，特別是符合國家藥品標準WS-XG-021-2002要求的產品，目前無相關專利報導。
目前雲芝菌絲體培養一般採用間歇分批發酵工藝，如中國專利(申請號89105471.5)一種雲芝糖肽(PSP)的生產方法中，採用分批發酵的方法，分批發酵其菌體量相對較低，因而雲芝胞內糖肽的得率也不高，一般來說其得率不超過1.2克/升發酵液。
中國專利申請號89105471.5中，雲芝胞內糖肽的提取，採用發酵醪壓濾後得到溼菌絲體，用100C熱水浸提3小時；中國專利(申請號90102310.8)「一種雲芝多糖提取新工藝」中描述了雲芝子實體加水煮沸，在浸出液中加入氫氧化鈣，使雲芝多糖形成絡合物而沉澱析出，再加酸溶解雲芝多糖鈣絡合物沉澱，溶解液中加入乙醇使雲芝多糖沉澱；由於菌體破碎不完全，造成雲芝胞內糖肽收率不高。
因此，本領域迫切需要改進雲芝培養方法以及培養物中雲芝胞內糖肽的提取方法，提高產量及收率。
發明內容
本發明的目的之一是提供一種高產雲芝胞內糖肽的雲芝菌種，彌補現有技術的不足；本發明的另一目的是提供一種通過補料和控制發酵液pH，以提高雲芝菌絲體量，進而提高了雲芝胞內糖肽產率的發酵方法，解決現有技術菌絲體產量不高、胞內糖肽得率低的問題；本發明的再一目的是提供一種新的雲芝胞內糖肽提取方法，以克服現有技術操作時間長，雲芝胞內糖肽得率低，以及有效成分含量低的問題。
本發明的第一方面，公開了一種雲芝菌株，該雲芝菌株是從東北野生雲芝子室體中分離得到，已於2004年11月5日保藏在武漢中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M204081。
所述菌種採集於南京江浦老山樹林間，生於櫟樹的腐木上。
子實體形態特徵菌蓋扇形至貝殼形，無柄，復瓦狀疊生於枯木樹幹上。體積為1-6×1-10釐米，厚1-3(-4.5)毫米。菌蓋革質、薄，表面生有細長絨毛或絨毛，顏色呈灰褐色、灰黃色、灰黑色、灰白色等多種，並排列成2-3鍾顏色相間的同心環帶，故云芝稱雜色雲芝，彩絨革蓋菌。菌蓋邊緣薄，完整或波浪狀，呈白色或淺色，其下側無子實層。菌肉白色，半纖維質至木栓質，厚0.5-1(-1.5)毫米，菌蓋內部構造由三種形態不同的菌絲組成，即生殖菌絲、骨架菌絲、聯絡菌絲。菌管面在幼時為白色，漸變成淺黃色或灰色，管口圓形至多角形，每毫米間有3-5個，菌管長0.5-2毫米，管壁薄，全緣。擔孢形圓筒形，稍彎曲，光滑無色，5-8×1.5-2.5微米。
菌絲體特徵在培養基質上，菌落白色，菌絲絨毛狀，質地緊密，緊貼基質上，分泌黃色或淺褐色色繁，菌絲有爬壁現象，培養基表面常出現黃斑，反面淺黃色。顯微鏡下檢驗菌絲無色，細長，有分隔，分枝繁茂，菌絲直徑3.5微米，菌絲細胞壁上有鎖狀聯合，生長的前、中期鎖狀聯合較多，後期減少。
該菌種在PDA培養基上，28℃培養1-2天，可見有白色菌絲長出，培養4-5天，白色菌絲擴展、稠密；該菌種通過《中國的真菌》(鄧叔群科學出版社)文獻公開的方法進行鑑定，屬於雲芝菌種(Coriolus Versicolor)，但是，與常規的雲芝菌種有明顯的區別，其最主要的區別在於從該菌絲體提取得到雲芝胞內糖肽的HPLC圖譜與雲芝胞內糖肽標準品(中國藥品生物製品檢定所購得)一致，且有效成分相對含量高。
本發明的第二方面，提供了一種流加式培養雲芝培養物的方法，包括如下步驟在發酵罐中接入發酵培養基和種子液，種子液和培養基的體積比百分比為5-20％，種子液和發酵培養基體積為發酵罐總體積的40-80％；種子液培養時間為20-50h，發酵液培養時間為72-144h。
在攪拌轉速120-300rpm、通風0.4-1.0v/v/m、溫度25-30C條件下發酵培養；按照本發明優選的技術/方案，在起始培養後20-50小時之間，補加pH調節劑和營養物質；pH調節劑為濃度為0.05～0.2N的氫氧化鈉，補料後培養基的pH控制在4.5-6.0；營養物質選自重量濃度為1-4％的葡萄糖、重量濃度為0.5-2％玉米漿、重量濃度為0.1-0.6％蛋白腖中的一種或其混合物，營養物質的添加量為發酵培養基的總體積的0.5～6％；繼續培養，在起始培養後4-5天，獲得含菌絲體的發酵液，即培養物。
其中發酵培養基的組分和含量為(g/l)葡萄糖10-50，蔗糖10-50，玉米粉2-40，麩皮5-30，蛋白腖1-20，豆餅粉10-40，磷酸氫二鉀1-10，硫酸鎂0.2-；其中，種子液為菌種CCTCC M204081的斜面培養物經兩級液體發酵培養製備斜面菌種培養斜面培養基(g/l)為土豆180～220，葡萄糖5～15，蔗糖5～15，酵母粉0.5～2，瓊脂1～3；接種後，26-28℃培養5-6天；一級、二級種子培養種子培養基(g/l)為葡萄糖10-50，蔗糖10-50，玉米粉2-40，麩皮5-30，蛋白腖1-20，豆餅粉10-20，磷酸氫二鉀1-10，硫酸鎂0.2-1；接種後培養40-70小時，溫度25-30℃，轉速150-200rpm。
本發明的第三方面，提供了一種從雲芝培養菌絲體中提取雲芝胞內糖肽的方法，包括如下步驟(1)板框過濾含菌絲體的發酵液通過板框過濾獲得菌絲體，洗滌，去除殘留物質；(2)菌絲體破碎板框過濾後得到的菌絲體，加入菌絲體重量3～8倍的水，經高壓均質機在400～600Kg/cm2下均質破碎菌絲體；(3)抽提經高壓均質破碎的菌絲體，在水中煮沸0.5～2小時，板框過濾，濾餅用95～100℃的沸水洗滌，板框過濾；(4)超濾濃縮濾過液採用截留分子量為0.5～2萬，優選1萬的超濾膜超濾，體積的濃縮倍數為3-10倍，得到雲芝胞內糖肽濃縮液；(5)酒精沉澱加入超濾濃縮液體積的2～5倍的、體積濃度為75～95％的乙醇醇沉，靜置6-8小時，收集雲芝胞內糖肽沉澱，乾燥，得到雲芝胞內糖肽產品。
通過高效液相色譜(HPLC)示差折光檢測器檢測，所製備的雲芝糖肽產品與雲芝糖肽標準品出峰時間一致，其總糖、單糖、肽含量等指標，均符合國家藥品標準WS-XG-021-2002的要求。
本發明的補料培養雲芝菌絲體的方法，通過補料調節發酵液pH值，有利於菌絲體生長和胞內糖肽合成；同時，通過補料補充了菌絲體生長所需的碳源、氮源等營養物質。與分批培養方法相比，本發明的補料培養方法有利於提高菌絲體產量，提高胞內糖肽及胞外糖肽的產率。
本發明的提取雲芝糖肽的方法，採用高壓均質方法破碎細胞，使胞內糖肽最大程度的釋放，減少熱水抽提時間，節約能耗，同時可保留有效成分的活性，提高胞內糖肽得率。
本發明的提取雲芝糖肽的方法，超濾步驟去除大部分小分子物質，提高了終產品中大分子量多糖等有效成分比例，獲得的雲芝胞內糖肽產品，其總糖≥35％，還原糖≤10％，肽≥20％，顯著提高了產品質量。
圖1實施例2的雲芝胞內糖肽HPLC圖譜。
具體實施例方式
本發明的發明人從全國各地採集了8株雲芝菌種，經篩選獲得可產生符合國家藥品要求的雲芝胞內糖肽優良菌株CV-LS。該雲芝菌株CV-LS是從老山野生雲芝子室體中分離得到，已於2004年11月5日保藏在武漢中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC M204081。
本發明所說的雲芝糖肽的國家藥品標準WS-XG-021-2002參見「中國藥典2000年版」，用於雲芝糖肽鑑定的對照品/標準品由中國藥品生物製品檢定所提供。
本發明中採用的30升全自動不鏽鋼發酵罐購於無錫三海生化工程有限公司；高壓均質機為APV Gaulin Inc.公司的15MR-8TBA型號的產品，也可以採用上海張堰輕工機械廠生產的高壓均質機，型號為JHG-Q54-P60。
下面結合實施例對本發明做進一步說明，應理解，實施例只用於具體闡述本發明，並不限制本發明的範圍。
實施例1種子液為菌種CCTCC M204081的斜面培養物經兩級液體發酵培養製備斜面菌種培養斜面培養基(g/l)為土豆200，葡萄糖10，蔗糖10，酵母粉0.1，瓊脂2；接種後，27℃培養5天；一級、二級種子培養種子培養基(g/l)為葡萄糖30，蔗糖30，玉米粉21，麩皮17，蛋白腖10，豆餅粉15，磷酸氫二鉀6，硫酸鎂0.6；接種後培養50小時，溫度28℃，轉速170rpm，獲得種子液。
實施例2發酵培養基每升培養基含30g葡萄糖，20g豆餅粉，6g蛋白腖，5g麩皮及無機鹽等。30升全自動不鏽鋼發酵罐(無錫三海生化工程有限公司生產)，裝液量22L，121℃滅菌25min，冷卻至室溫後，接入實施例1的種子液，接種量為10％，攪拌轉速200rpm，通風0.8v/v/m，溫度27℃、罐壓0.5kg/cm2。
培養4天後結束髮酵，菌絲體乾重為18.50g/l，菌絲體經破壁熱水抽提，過濾，減壓濃縮，醇沉乾燥後，獲得1.10g/l胞內糖肽，經檢測其總糖為44.57％，肽27.92％，HPLC檢測，其出峰時間與標準品相同。其他指標均符合國家藥品標準WS-XG-021-2002。雲芝胞內糖肽的HPLC圖譜見圖2。
實施例3發酵培養基每升培養基含30g葡萄糖，20g豆餅粉，6g蛋白腖，5g麩皮及無機鹽等。30升全自動不鏽鋼發酵罐，裝液量20L，接種量10％、攪拌轉速150rpm、通風1v/v/m、溫度26℃、罐壓0.5kg/cm2。發酵30h後補加1L重量濃度為20％葡萄糖，同時用0.1N NaOH控制pH為5，培養4.5天後結束髮酵，菌絲體乾重為28.78g/l，菌絲體經破壁熱水抽提，過濾，減壓濃縮，醇沉乾燥後，獲得2.0g/l胞內糖肽，經檢測其總糖為55.15％，肽34.42％，HPLC檢測，其出峰時間與標準品相同，符合國家藥品標準WS-XG-021-2002。
實施例4發酵培養基每升培養基含30g葡萄糖，20g豆餅粉，6g蛋白腖，5g麩皮及無機鹽等。30升全自動不鏽鋼發酵罐，裝液量18L，接種量10％、攪拌轉速150rpm、通風0.6v/v/m、溫度28℃、罐壓0.5kg/cm2。發酵48h後補加1.8L重量濃度為20％的葡萄糖水溶液和0.36L重量濃度為10％的蛋白腖水溶液，同時用0.1N NaOH控制pH為4.5，培養5天後結束髮酵，菌絲體乾重為29.94g/l，菌絲體經破壁熱水抽提，過濾，減壓濃縮，醇沉乾燥後，獲得2.20g/l胞內糖肽，經檢測其總糖為47.10％，肽37.72％，HPLC檢測，其出峰時間與標準品相同，符合國家藥品標準WS-XG-021-2002。
實施例5發酵過程採用0.1N NaOH調節控制發酵液pH為5.5，與未控制pH發酵，其胞內糖肽得率比較如表1所示。
表1、發酵過程控制pH對胞內糖肽得率的影響
可見控制pH發酵，胞內糖肽提高近70％，效果顯著，控制pH有利於胞內糖肽的合成。
實施例6(1)板框過濾實施例2的含菌絲體的發酵液通過板框過濾獲得菌絲體，洗滌，去除殘留物質；(2)菌絲體破碎板框過濾後得到的菌絲體，加入菌絲體重量5倍的水，經高壓均質機在400Kg/cm2下均質破碎菌絲體；(3)抽提經高壓均質破碎的菌絲體，在水中煮2小時，板框過濾，濾餅100℃的沸水洗滌，板框過濾；(4)超濾濃縮濾過液採用截留分子量1萬的超濾膜超濾，體積濃縮倍數為5倍，得到雲芝胞內糖肽濃縮液；(5)酒精沉澱加入超濾濃縮液的5倍體積的、體積濃度為95％的乙醇醇沉，靜置7小時，收集雲芝胞內糖肽沉澱，乾燥，得到雲芝胞內糖肽產品。其得率見表2。
實施例7～8同實施例6，其中，板框過濾後得到的菌絲體，加入菌絲體重量4倍的水，經高壓均質機分別在500和600Kg/cm2下均質破碎菌絲體；其得率如表2所示。
對比實施例1採用實施例6相同的工藝條件，其中，採用常規的機械方法破壁，其得率如表2所示。
表2、高壓均質與機械破壁效果比較
由表2可見，高壓破壁能使菌絲體破壁完全，明顯提高胞內多糖得率，而且熱水抽提時間縮短為1小時，能耗降低，降低了成本。
權利要求
1.一種保藏編號為CCTCC M204081的雲芝菌株。
2.一種補料培養雲芝培養物的方法，其特徵在於，包括如下步驟在發酵罐中接種CCTCC M204081的雲芝種子培養液，種子液和培養基的體積百分比為5-20％；在攪拌轉速120-300rpm、通風0.4-1.0v/v/m、溫度25-30℃條件下發酵培養，培養後4-5天，獲得含菌絲體的發酵液。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，在起始培養後20-50小時之間，補加pH調節劑和營養物質，補料後培養基的pH控制在4.5-6.0。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，pH調節劑為0.05～0.2N的氫氧化鈉。
5.如權利要求3所述的方法，其特徵在於，營養物質選自重量濃度為1-4％的葡萄糖、重量濃度為0.5-2％玉米漿、重量濃度為0.1-0.6％蛋白腖中的一種或其混合物，營養物質的添加量為發酵培養基的總體積的0.5～6％。
6.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所說的發酵培養基的組分及配比按重量、體積比計，每升培養基含有葡萄糖10-50克，蔗糖10-50克，玉米粉2-40克，麩皮5-30克，蛋白腖1-20克，豆餅粉10-40克，磷酸氫二鉀1-10克，硫酸鎂0.2-1克。
7.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，所說的種子液為菌種CCTCCM204081的斜面培養物經兩級液體發酵培養的產物；斜面培養基的組分及配比按重量、體積比計，每升培養基含有土豆200克，葡萄糖10克，蔗糖10克，酵母粉1克，瓊脂2-2.5％；接種後，26-28℃培養5-6天；一級、二級液體培養的種子培養基的組分及配比按重量、體積比計，每升培養基含有葡萄糖10-50克，蔗糖10-50克，玉米粉2-40克，麩皮5-30克，蛋白腖1-20克，豆餅粉10-20克，磷酸氫二鉀1-10克，硫酸鎂0.2-1克，pH自然；接種後培養40-70小時，溫度25-30℃，轉速150-200rpm。
8.一種從雲芝培養菌絲體中提取雲芝胞內糖肽的方法，其特徵在於，包括如下步驟含菌絲體的發酵液過濾獲得菌絲體，洗滌，去除殘留物質；加入菌絲體重量3～8倍的水，經高壓均質機在400～600Kg/cm2下均質破碎菌絲體；經高壓均質破碎的菌絲體，在水中煮沸0.5～2小時，板框過濾，濾餅用95～100℃的沸水洗滌，板框過濾；濾過液採用截留分子量為0.5～2萬的超濾膜超濾，體積的濃縮倍數為3-10倍，得到雲芝胞內糖肽濃縮液；加入超濾濃縮液體積的2～5倍的、體積濃度為75～95％的乙醇醇沉，靜置6-8小時，收集雲芝胞內糖肽沉澱，乾燥，得到雲芝胞內糖肽產品。
全文摘要
本發明屬於藥用微生物發酵領域，具體涉及雲芝胞內糖肽生產菌及其發酵培養方法。發明人篩選得到可產生高含量有效成分的雲芝胞內糖肽生產菌種雲芝(Coriolus versicolor)CCTCC M204081，並提供了一種通過補料和控制pH優化發酵過程的新方法；本發明還公開了新的從菌絲體提取雲芝胞內糖肽的提取工藝。本發明的方法，提高菌絲體量，有利於雲芝胞內糖肽的合成，從而提高了雲芝胞內糖肽產率。獲得的雲芝胞內糖肽產品，其總糖≥35％，還原糖≤10％，肽≥20％，主峰的保留時間與對照品主峰的保留時間一致，符合國家藥品標準WS－XG－021－2002的要求。
文檔編號C12P21/00GK1807573SQ20051011230
公開日2006年7月26日 申請日期2005年12月29日 優先權日2005年12月29日
發明者餘曉斌, 胡衛珍, 濮文林 申請人:江南大學, 南京老山藥業股份有限公司