抗高遷移率族蛋白b-1的單克隆抗體及其應用的製作方法

2023-06-06 15:01:36

專利名稱：抗高遷移率族蛋白b-1的單克隆抗體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及抗高遷移率族蛋白B-I的單克隆抗體及其應用。
背景技術：
HMGB-I (high mobility group box，I)是染色體蛋白中高遷移率家族的成員之 一。HMGB-I是一條由219個胺基酸殘基構成的、分子量為30kDa的單鏈多肽，其表達普遍 而且量也較大。蛋白可被分為三大部分兩個同源的DNA結合區域(Boxes A和B)及酸性 C末端。HMG boxes A和B是由相似的80個胺基酸片段形成的L型結構。HMGB-I結合於雙鏈DNA的小溝內，結合部位與DNA序列無關，但與其結構密切相 關，通常位於節狀DNA、彎曲DNA或十字交叉點處。HMGB-I可以迅速地彎曲DNA，促成核蛋白 複合體的形成，進而促成DNA結合蛋白與其各自對應位點的相互作用。如p53轉錄因子不 能直接與直線DNA結合，只有在HMGB-I先與DNA結合併使其彎曲後，p53才能有效地與其 對應位點相結合，然後HMGB-I從複合體中脫離出來。HMGBl-/-鼠在GR應答基因的激活上 有缺陷，因此會因血糖過低而在出生後不久就死去，此結果進一步支持了 HMGB-I作為轉錄 調控因子的結論。HMGB-I存在於神經細胞的細胞間隙中，可以刺激神經突起的生長。HMGBl刺激平 滑肌細胞(SMC)和原纖維細胞的遷移，還能夠引起細胞骨架肌動蛋白的重組以及運動型細 胞的形態改變。此外，HMGB-I與纖維蛋白酶原活化系統相關，因此在細胞外蛋白水解、細胞 遷移、炎症、纖維蛋白溶解、傷口癒合和腫瘤入侵的調控中發揮作用。HMGB-I不具有信號序列，它的分泌過程不通過經典的〃粗面內質網-高爾基體〃 途徑。在活化的單核細胞中，HMGB-I經過一個從核內到分泌小泡的再分配過程，然後經細 胞外分泌得以釋放。研究表明，用LPS刺激RAW264. 7細胞，應用SDS-PAGE分析細胞培養液中成分變 化，18個小時後，發現有分子量為30-KD的蛋白出現。根據該因子的N端序列分析，將其歸 屬於HMG-I，一種DNA結合的非組蛋白。HMG-I後改名為HMGB-I。小鼠實驗證實，注射LPS、IL-I或TNF-8小時後，單核巨噬細胞開始分泌HMGB1，並 在隨後的24 h中血清HMGBl濃度維持較高水平，HMGBl抗體可以改善LPS引起的內毒素血 症；反過來，HMGBl也可刺激單核巨噬細胞分泌某些促炎因子，如TNF-、IL-l、II-6、IL-8等。 注射HMGBl小鼠出現內毒素休克樣症狀。人體檢測也發現，膿毒症患者血清HMGBl水平升 高，並且升高的程度與感染嚴重性相關。當細胞壞死或受損時，核內的HMGBl可釋放到胞外，引發單核巨噬細胞分泌促炎 因子；而促炎因子又反過來促進HMGBl的分泌，這樣正反饋環就形成了。在炎性反應的後 期，這種正反饋效應對炎性反應的維持起到了相當重要的作用。在近期研究中，發現HMGBl 的功能與全身炎症反應綜合症，急性肺損傷，類風溼性關節炎，糖尿病以及臟器缺血造成的 梗塞密切相關。因此，需要一種有效抑制HMGBl行使促炎症因子功能的物質，以治療炎症相關疾病。

發明內容
本發明的一個目的是提供分泌特異性結合人高遷移率族蛋白Bl的單克隆抗體。本發明所提供的抗體可以為如下1)、2)、3)或4)所述的抗體1) 一種抗體，其重鏈可變區具有序列表中序列1所示的胺基酸殘基序列，其輕鏈 可變區具有序列表中序列2所示的胺基酸殘基序列。2) 一種抗體，其輕鏈具有序列表中序列8所示的胺基酸殘基序列，重鏈具有序列 表中序列9所示的胺基酸殘基序列。此抗體為人_鼠嵌合抗體.3) 一種抗體，其胺基酸殘基序列如序列表中序列3所示。此抗體為單鏈抗體。4)由雜交瘤細胞株抗人HMGBl雜交瘤3B1 CGMCC No. 2907分泌得到的單克隆抗 體。由雜交瘤細胞株抗人HMGBl雜交瘤3B1 CGMCC No. 2907分泌得到的單克隆抗體的 Fab片段也屬於本發明的保護範圍。上述1)中所述抗體的重鏈可變區的編碼基因和輕鏈可變區的編碼基因也屬於本 發明的保護範圍。上述2)中所述抗體的重鏈和輕鏈的編碼基因也屬於本發明的保護範圍。所述抗 體的輕鏈編碼基因具體具有序列表中序列6的核苷酸序列，重鏈編碼基因具體具有序列表 中序列7的核苷酸序列。上述3)中所述抗體的編碼基因也屬於本發明的保護範圍。上述任一所述抗體在製備以人高遷移率族蛋白Bl為靶點的藥物中的應用也屬於 本發明的保護範圍。所述以人高遷移率族蛋白Bl為靶點的藥物可以為用於治療由人高遷移率族蛋白 Bl參與的炎症反應的藥物、用於治療由人高遷移率族蛋白Bl參與的自身免疫性疾病的藥 物、或用於治療由人高遷移率族蛋白Bl參與的器官損傷性疾病的藥物。所述炎症反應為敗血症、全身炎症反應綜合症或急性肺損傷；所述自身免疫性疾 病為類風溼性關節炎、糖尿病或紅斑狼瘡；所述器官損傷性疾病為心肌梗塞、腦梗、藥物性 或病毒性肝損傷。上述任一所述抗體在檢驗人高遷移率族蛋白Bl中的應用。本發明的另一個目的是提供一種分泌特異性結合人高遷移率族蛋白Bl的單克隆 抗體的雜交瘤細胞系。該雜交瘤細胞係為鼠雜交瘤抗人HMGBl雜交瘤3B1，已於2009年2月27日保藏 於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區大屯 路，中國科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 2907。實驗證明雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體、衍生於該單克隆 抗體的單鏈抗體3BlscFV、人-鼠嵌合抗體ch-3Bl或Fab片段與人HMGBl的解離常數分別 為7. 8nM，100nM，7. 8nM，40nM。雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體、衍生 於該單克隆抗體的單鏈抗體3BlscFV、人-鼠嵌合抗體ch-3Bl或Fab片段可以阻斷人HMGBl 刺激Raw264. 7細胞產生的IL-6上調，在LPS誘導的小鼠敗血症模型中具有保護作用。
上述單克隆抗體及其衍生物能夠高親和力特異性識別高遷移率族蛋白Bi，並中和 其生物學活性，可以用於治療敗血症，全身炎症反應綜和症或急性肺損傷等炎症反應；可以 用於治療類風溼性關節炎，糖尿病或紅斑狼瘡等自身免疫性疾病。還可用於臨床檢驗HMGBl 的水平。


圖1為ELISA檢測雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體與人HMGBl 的解離曲線(縱坐標是ELISA顯色後的光吸收值)圖2為雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體在HMGBl上的結合位
點鑑定。圖3為雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體特異性鑑定。圖4為雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體抑制人HMGBl刺激 Raw264. 7細胞產生的IL_6mRNA上調。圖5為注射LPS和注射LPS和雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗 體的小鼠的存活情況。
具體實施例方式下述實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例中所使用的試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑購買。實施例1、鼠雜交瘤CGMCC No. 2907及其分泌的抗高遷移率族蛋白Bl (HMGBl)的單 克隆抗體的製備和鑑定一、雜交瘤細胞株鼠雜交瘤CGMCC No. 2907的製備1、抗原的製備人 HMGBl 與結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis, MT)Psts-I 蛋白胺基酸 326-344 小肽(DQVHFQPLPPAVVKLSDAL)的融合蛋白(HMGBl-MT)的獲得將編碼人 HMGBlN 端181胺基酸的cDNA與小肽通過PCR方法重組，得到融合基因HMGBl-MT ；將融合基因克隆 至刪除了 GST編碼區的PET_41a載體(Novagen，USA)，克隆的質粒在DH5 α裡擴增，再經由 BL21中表達，得到融合蛋白HMGB1-MT。融合蛋白中帶有6 XhisTag，通過Ni-NTA親和層析 純化。2、免疫以步驟1得到的融合蛋白作為抗原免疫NZB/W Fl小鼠，共免疫三次10微克 HMGBl-MT加完全弗氏佐劑皮下免疫(第一次免疫)，14天後5微克HMGBl-MT加不完全弗氏 佐劑皮下免疫(第二次免疫)。14天後5微克HMGBl-MT加不完全弗氏佐劑皮下第三次免 疫；3天後的NZB/W Fl小鼠取脾中的免疫細胞與鼠骨髓瘤SP2/0細胞以5 1比例混合， 用聚乙二醇進行融合，HAT篩選後得到雜交瘤。3、雜交瘤篩選GST-HMGB1重組蛋白的製備將人HMGBl的編碼區(序列如序列表中序列11所 示)克隆至PET-41a載體(Novagen, USA)的EcoR I和HindIII酶切位點，轉化至DH5 α， 抗性篩選得到陽性克隆，提取陽性克隆的質粒，測序，結果質粒中HMGBl的序列及插入方向正確；將陽性質粒轉入大腸桿菌BL21，ImM IPTG誘導表達；純化融合蛋白中帶有GST Tag, 通過穀胱甘肽親和層析純化，具體步驟是，將誘導後的菌液5000rpml0min離心收集，棄上 清，用PBS將菌體重懸，超聲破碎，5000rpm離心lOmin，棄沉澱，將上清緩慢通過穀胱甘肽 層析柱(Sigma)，用穀胱甘肽洗脫液將掛在穀胱甘肽層析柱上的融合蛋白洗脫下來，得到 GST-HMGB1重組蛋白。分泌特異性結合HMGBl抗體的雜交瘤檢測以GST-HMGB1重組蛋白(10微克/毫 升)作為包被原包板，雜交瘤上清(進行梯度稀釋)為一抗，HRP偶聯的羊抗小鼠IgG多克 隆抗體(R&D Systems)為二抗進行ELISA檢測。亞克隆用限制性稀釋法多次克隆分泌特異性抗體的雜交瘤細胞，最後獲得雜交 瘤細胞株鼠雜交瘤抗人HMGBl雜交瘤3B1。該細胞株已於2009年2月27日保藏於中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia 北京市朝陽區大屯路，中國 科學院微生物研究所，郵編100101)，保藏號為CGMCC No. 2907。4、單克隆抗體的製備體外培養方法將已經建立的雜交瘤細胞CGMCC No. 2907置於細胞培養基中，置於37°C和5% CO2孵箱中培養，每隔2d換一次細胞培養液，待細胞濃度大於IO5個/ml時停止換液，持續 培養到細胞全部死亡。1500rpm，離心10分鐘，收集培養上清，上清含有高水平的單克隆抗 體，-20°C保存備用。所述細胞培養基為向DMEM培養基中添加胎牛血清，使胎牛血清在細胞 培養基中的終濃度為20% (體積百分含量)，所述細胞培養基的PH為7. 4。純化將體外培養得到的上清進行如下純化，將上述上清緩慢通過蛋白A/G親和 層析柱(Pierce)，再用0. IM Glycine/HCl (pH2. 5)將掛在層析柱上的目的蛋白洗脫下來， 得到純化後的蛋白。5、雜交瘤CGMCC No. 2907分泌的抗體的性能檢測(I)ELISA檢測雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體與HMGBl的解
離曲線。實驗方法用HMGBl-MT (製備方法見步驟1) (2ug/ml)作為包被抗原，步驟4製備 純化的雜交瘤細胞CGMCC No. 2907分泌的單抗作為一抗(以160ug/ml為起始濃度，二倍二 倍進行稀釋)，羊抗小鼠IgG-HRP (R&D) (1 2000)為二抗進行ELISA測定。實驗設3次重複，結果如圖1所示，ELISA最大讀數的50%相對應的抗體濃度為抗 體的解離常數。表明雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體與HMGBl的解離 常數為7. 8nM。圖1的橫坐標是雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體的濃 度。(2)抗體亞型鑑別實驗以GST-HMGB1重組蛋白(10微克/毫升)包板，雜交瘤上 清為一抗，HRP偶聯的大鼠抗小鼠IgGl, IgG2a，或IgG2b單克隆抗體(BD Pharmingen)為 二抗進行ELISA檢測。實驗證明雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體為 IgG2b亞型。(3)抗體結合位點鑑定利用GST-A box、GST-B box和GST-A+B Box分別包板， 實驗方法用GST-A box、GST-B box和GST-A+B Box分別以2ug/ml作為包被抗原包板， 步驟4製備的雜交瘤 胞CGMCC No. 2907分泌的單抗作為一抗，羊抗小鼠IgG-HRP(R&D)(1 2000)為二抗進行ELISA測定。GST-A box的製備步驟將人HMGBl A box的編碼區(序列如序列表中序列14所 示)克隆至PET-41a載體(Novagen，USA)的BamHI和HindIII酶切位點，轉化至DH5 α，抗 性篩選得到陽性克隆，提取陽性克隆的質粒，測序，結果質粒中HMGBl的序列及插入方向正 確；將陽性質粒轉入大腸桿菌BL21，ImM IPTG誘導表達；純化融合蛋白中帶有GST Tag, 通過穀胱甘肽親和層析純化，具體步驟是，將誘導後的菌液5000rpm IOmin離心收集，棄上 清，用PBS將菌體重懸，超聲破碎，5000rpm離心lOmin，棄沉澱，將上清緩慢通過穀胱甘肽 層析柱(Sigma)，用穀胱甘肽洗脫液將掛在穀胱甘肽層析柱上的融合蛋白洗脫下來，得到 GST-A box重組蛋白。GST-B box的製備步驟將人HMGBl B box的編碼區(序列如序列表中序列15所 示)克隆至PET-41a載體(Novagen，USA)的BamHI和HindIII酶切位點，轉化至DH5 α，抗 性篩選得到陽性克隆，提取陽性克隆的質粒，測序，結果質粒中HMGBl的序列及插入方向正 確；將陽性質粒轉入大腸桿菌BL21，ImM IPTG誘導表達；純化融合蛋白中帶有GST Tag, 通過穀胱甘肽親和層析純化，具體步驟是，將誘導後的菌液5000rpm IOmin離心收集，棄上 清，用PBS將菌體重懸，超聲破碎，5000rpm離心lOmin，棄沉澱，將上清緩慢通過穀胱甘肽 層析柱(Sigma)，用穀胱甘肽洗脫液將掛在穀胱甘肽層析柱上的融合蛋白洗脫下來，得到 GST-B box重組蛋白。GST-A+B Box的製備步驟將人HMGBl A+Bbox的編碼區(序列如序列表中序列11 所示)克隆至PET-41a載體(Novagen,USA)的BamH I和HindIII酶切位點，轉化至DH5 α， 抗性篩選得到陽性克隆，提取陽性克隆的質粒，測序，結果質粒中HMGBl的序列及插入方向 正確；將陽性質粒轉入大腸桿菌BL21，ImM IPTG誘導表達；純化融合蛋白中帶有GST Tag, 通過穀胱甘肽親和層析純化，具體步驟是，將誘導後的菌液5000rpml0min離心收集，棄上 清，用PBS將菌體重懸，超聲破碎，5000rpm離心lOmin，棄沉澱，將上清緩慢通過穀胱甘肽 層析柱(Sigma)，用穀胱甘肽洗脫液將掛在穀胱甘肽層析柱上的融合蛋白洗脫下來，得到 GST-A+B box重組蛋白。實驗設3次重複，結果如圖2所示，3B1隻結合HMGBl中間的A Box0(4)抗體特異性鑑定用SDS-PAGE電泳分離人PBMC或Hela細胞的裂解液，以生 物素標記的抗體進行western檢測，Streptavidin-HRP為二抗，ECL顯色。人PBMC，用Ficoll密度梯度離心法從人全血中分離得到(血液由北京市紅十字血 液中心提供)；Hela細胞購自協和細胞中心，產品目錄號為CCC0011。Str印tavidin-HRP購自中杉金橋，產品目錄號為ZB-2404。細胞裂解緩衝液購自上海碧雲天生物技術有限公司。人PBMC或Hela細胞的裂解液的獲得方法人PBMC或Hela細胞用PBS洗2_3遍， 離心收集細胞，按50萬個細胞加IOOul細胞裂解緩衝液比例加入，同時加入PMSF，4度裂解 30分鐘後，12000rpm4度離心15分鐘，取上清即可。western檢測方法細胞裂解中獲得的上清經10% SDS-PAGE電泳，轉膜後用10% 脫脂牛奶-TBS封閉(室溫2小時)，用TBS-T洗3遍，同3Bl-biotin(l 1000TBS稀釋) 室溫反應1小時，再用TBS-T洗3遍，與str印tavidin-HRP (1 8000)室溫反應1小時，用 TBS-T洗3遍後曝光。
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實驗設3次重複，結果如圖3所示。(圖3中CTL表示TBS)表明3B1抗體可以與 細胞裂解液中內源性的HMGBl (大約30kd條帶)特異性結合。TBS 配方Tris-HCI 緩衝液(0. 5M ρΗ7· 6) 100ml, NaCI 8. 5 9g(0. 15mol/L)，雙蒸 水加至1000ml。6、雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體的生物活性鑑定將Raw264. 7細胞接種於細胞培養基中，向其中分別加入不同的刺激物，培養4小 時；用real-time RT-PCR檢測細胞中IL_6mRNA水平，所用引物序列為5』 TGG GAAATC GTG GAA ATG AG 3，、5，CTC TGA AGG ACT CTG GCT TTG 3，。實驗設 3 次重複。細胞培養基組成添加了 10%胎牛血清的RPMI 1640培養基。Raw264. 7細胞購自協和細胞中心，產品目錄號為CCC0146。GST-HMGB1重組蛋白的製備方法見步驟3各實驗設如下處理處理1 不加任何刺激物；處理2 只添加GST-HMGB1重組蛋白，其在培養體系中的終濃度為lug/ml ；處理3 只添加3B1單抗(其在培養體系中的終濃度為50ug/ml)；處理4 添加GST-HMGB1重組蛋白(其在培養體系中的終濃度為lug/ml)和步驟4 製備的雜交瘤細胞CGMCC No. 2907分泌的單抗(其在培養體系中的終濃度為50ug/ml)，具 體方法是先將GST-HMGB1重組蛋白和雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體 混合，再刺激Raw264. 7細胞。實驗結果如圖4所示(1表示處理1，2表示處理2，3表示處理3，4表示處理4)，表 明lug/ml HMGB-I能顯著上調IL_6mRNA的表達水平(處理2)，50ug/ml的雜交瘤細胞CGMCC No. 2907分泌的單抗可以中和HMGB-I活性，顯著降低lug/ml HMGB-I誘導的IL_6mRNA上 調(處理4)。雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體可以阻斷人HMGBl刺激 Raw264. 7細胞產生的IL_6mRNA上調。7、抗HMGBl抗體在敗血症小鼠模型中的應用C57BL/6雌性小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。LPS購自Sigma，產 品目錄號為L2880。8周齡C57BL/6雌性小鼠16隻，重19. 5g—20. 5g，按體重匹配均分為2組PBS組 (LPS+PBS)和抗體組(LPS+3B1)。實驗前在SPF級動物房中同籠48小時，自由進食及水。 注射前2小時禁食。PBS組和抗體組小鼠依體重給予LPS (Sigma 0111 :B4) 22. 5mg/kg。抗 體組在給LPS後，給予步驟4製備的雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體 5mg/kg，用無菌PBS緩衝液將抗體稀釋到終體積200ul。PBS組在給LPS後，給予PBS緩衝 液，200ul/kg。腹腔內注射。將兩組分籠餵養，餵養條件相同。觀察給藥後情況。實驗設3 次重複。兩組小鼠在注射後12小時後，觀察無明顯異常。但在20hr後，均出現相似的顫抖， 體毛直立，對外界刺激不敏感表現。24小時後，LPS組開始有小鼠死亡；各組動物存活情況 變化見圖5。說明雜交瘤細胞株3B1CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體在LPS誘導的小鼠敗 血症模型中具有保護作用。實施例2、抗HMGBl人-鼠嵌合抗體ch_3Bl的製備鼠抗體在人體內會產生免疫排斥反應，因此只能用於急症的治療，一旦人體內產生針對鼠抗體的抗抗體，作為藥物的鼠抗體就會失效。為了克服這一缺點，本發明對鼠抗體 進行了人源化，製備了人-鼠嵌合抗體ch_3Bl。該抗體的可變區序列來自鼠抗體-雜交瘤 細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體，不變區序列來自人IgGl。這種抗體保持了 鼠單抗的抗原結合特異性，同時降低了在人體內誘導的免疫排斥反應。製備嵌合抗體的步驟如下從雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907中分離純化mRNA，用oligo_dT合成第一鏈 cDNA。用PCR方法分別擴增抗體輕鏈和重鏈可變區，輕鏈引物為5，GAY ATT GTG MTSACM CAR WCT MCA 3'禾口 5' CTC CAG ATG TTA ACT GCT CAC 3'；重鏈引物為5'ATGSAR GTN MAG CTG SAG SAG TC 3，禾口 5，GGT CAA GGT CAC TGG CTC AGG3，。其中，R = G 或 A，Y = T 或 C，M = A或C，S = G或C，W = T或A，N = G或A或C或T。將PCR產物分別克隆到T載體 中測序。結果表明雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體的重鏈可變區的編 碼基因具有序列表中序列4的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列1的胺基酸殘基序列的 重鏈可變區；雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體的輕鏈可變區的編碼基 因具有序列表中序列5的核苷酸序列，編碼具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列的輕鏈 可變區。人的輕鏈和重鏈不變區基因的獲得方法從人PBMC中分離純化mRNA，用oligo-dT 合成第一鏈cDNA，用PCR方法分別擴增人輕鏈和重鏈不變區基因，輕鏈引物為5』 ttccat act cca gcg ctg cac cat ctg tct tea tct tcc cg3'和，cct cac tct agagtc gcg gcc gcc taa cac tct ccc ctg ttg aag ctc ttt g 3'，重鏈引物為 gcgtcg acc aag ggc cca tcg gtc ttc c 3』禾P 5』已cc ctc act cta gag tcg egg ccgctc att tac ccg gag aca ggg aga ggc t 3'□單克隆抗體的輕鏈可變區基因與人的輕鏈不變區基因的連接用PCR方法先將輕 鏈可變區基因的3，端加上人輕鏈不變區基因5，端的一段序列，引物為5，get get gctgtg gtt ccc egg ctc gcg atg cga tgt ttt gat gac cca aac tcc act ct 3'和 5' gac aga tgg tgc age cac agt ccg ttt gat ttc cag ctt g3』，再以帶有一段人輕鏈不變區基因的 輕鏈可變區基因和人輕鏈不變區基因為模板進行PCR反應，引物為5』gct get get gtg gtt ccc egg ctc gcg atg cga tgt ttt gat gac cca aac tcc actct 3』 禾P cct cac tct aga gtc gcg gcc gcc taa cac tct ccc ctg ttg aag ctcttt g 因輕鏈可變區基因 的3』端已帶有人輕鏈不變區基因5』端的一段序列，因此在PCR的退火階段，兩段基因可自 行連接。單克隆抗體的重鏈可變區基因與人的重鏈不變區基因的連接用PCR方法先將重 鏈可變區基因的3』端加上人重鏈不變區基因5』端的一段序列，引物為5』 ttt tcttgt cgc gat ttt aaa agg tgt cca gtg cca ggt cca act gca gca gcc t 3'和 5' ggc cct tgg tcg acg ctg agg aga ctg tga gag tgg tgc c3』，再以帶有一段人重鏈不變區基因的重鏈 可變區基因和人重鏈不變區基因為模板進行PCR反應，引物為5’ttt tct tgt cgc gat ttt aaa agg tgt cca gtg cca ggt cca act gca gca gcc t 3'和 5' acc ctc act cta gag tcg egg ccg ctc att tac ccg gag aca ggg aga ggc t3'。因重鏈可變區基因的 3'端已 帶有人重鏈不變區基因5』端的一段序列，因此在PCR的退火階段，兩段基因可自行連接。將雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區基因分別與人的輕鏈和重鏈不變區基因連接，構建可編碼嵌合抗體ch_3Bl的融合基因，該嵌合 抗體輕鏈的編碼基因具有序列表中序列6的核苷酸序列，其編碼序列為自序列6的5'端第 1位-657位核苷酸，編碼具有序列表中序列8的胺基酸殘基序列的ch-3Bl輕鏈；該嵌合抗 體重鏈的編碼基因具有序列表中序列7的核苷酸序列，其編碼序列為自序列7的5'端第1 位-1341位核苷酸，編碼具有序列表中序列9的胺基酸殘基序列的ch-3Bl重鏈。嵌合抗體輕鍊表達載體pCI-gpt_3BlL的構建將該嵌合抗體輕鏈的編碼基因(序 列5所示)插入到有選擇性標記(鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶，gpt)和基因表達調控區(CMV啟 動子，終止子)的表達載體pCI-gpt的Nru I和Afe I位點中，得到該嵌合抗體輕鍊表達載 體pCI-gpt-3BlL。表達載體pCI-gpt的構建方法(以promega載體pCI為模版構建)從Hela細 胞(購自協和細胞中心，產品目錄號為CCC0011)中分離純化mRNA，用oligo-dT合成第一 鏈cDNA。用PCR方法擴增出gpt (gpt基因序列見序列表中序列12)，引物為5』ccgtcg cga age get atg age gaa aaa tac ate gtc acc tgg gac3'禾P 5' tta gcg accgga gat tgg egg gac gaa tac 3，。 gpt 插入 pCI 的 HindIII 禾口 BamHI 位點。嵌合抗體重鍊表達載體PCI-DHFR-3B1H的構建將該嵌合抗體重鏈的編碼基因 (序列4所示)插入到有選擇性標記(二氫葉酸還原酶DHFR)和基因表達調控區(CMV啟 動子，終止子)的表達載體pCI-DHFR的Nru I和NotI位點，得到該嵌合抗體重鍊表達載體 PCI-DHFR-3B1H。表達載體pCI-DHFR的構建方法(以promega載體pCI為模版構建)從Hela細 胞(購自協和細胞中心，產品目錄號為CCC0011)中分離純化mRNA，用oligo-dT合成第一 鏈cDNA.用PCR方法擴增出DHFR(DHFR基因序列見序列表中序列13)，引物為5，ccg gtc gcg age ggc cgc atg gtt cga cca ttg aac tgc ate gtc gcc3'和 5' aagttt gaa gtc tac gag aag aaa gac taa 3』。 DHFR 插入 pCI 的 HindIII 禾口 BamHI 位點。用電轉染的方法將含有嵌合抗體基因的表達載體pCI-gpt_3BlL和 PCI-DHFR-3B1H 一同導入到哺乳動物細胞NS/0 (ECACC購買)中。用黴酚酸酯 (Mycophenolate)在含黃嘌呤(Xanthine)的培養基中篩選轉化細胞，獲得穩定轉染的細胞 株，記作NS/3B1。細胞NS/3E8的培養方法用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基培養。按照實施例1的方法用ELISA鑑定抗體的分泌。實驗設3次重複。結果顯示得到的ch_3Bl抗體保留了雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單 克隆抗體的特異性和親和力，ch-3Bl抗體與HMGBl的解離常數為7. 8nM。實施例3、抗HMGBl單鏈抗體3B1 scFV的製備PCR方法分別擴增雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體的輕鏈和 重鏈可變區基因，然後用PCR方法將重鏈和輕鏈可變區用富含甘氨酸和絲氨酸的15胺基酸 片段連接起來，獲得抗HMGBl單鏈抗體3B1 scFV的編碼基因序列(序列10)。將3B1 scFV 的編碼基因序列克隆到表達載體pET-26b(Novagen，USA)的BamH I和Xho I位點，克隆的 質粒在DH5ci裡擴增，再經由BL21中表達。表達條件為用ImM IPTG (購自北京好友新創科 技發展有限公司)誘導2小時。融合蛋白中帶有6Xhis Tag，通過Ni-NTA親和層析純化。表達的3B1 scFV具有序列表中序列3的胺基酸殘基序列。按照實施例1的方法用ELISA鑑定抗HMGB1單鏈抗體3BlscFV，實驗設3次重複。 結果顯示抗HMGB1單鏈抗體3BlscFV保留了雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克 隆抗體的特異性和親和力，抗HMGB1單鏈抗體3BlscFV與HMGB1的解離常數為lOOnM。實施例4、抗HMGB1的Fab片段3BlFab的製備利用ImmunoPureTab製備試劑盒(Pierce)中的固定化木瓜蛋白酶消化雜交瘤細 胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體，將全長抗體降解成為Fab和Fc片段。酶解後 的產物用試劑盒中提供的固定化蛋白A柱純化得到Fab的抗體片段。按照實施例1的方法 用ELISA鑑定雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體的Fab片段3BlFab。實 驗設3次重複。結果顯示雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體的Fab片段 3BlFab保留了雜交瘤細胞株3B1 CGMCC No. 2907分泌的單克隆抗體的特異性和親和力，抗 HMGB1單鏈抗體3BlFab與HMGB1的解離常數為40nM。
權利要求
由雜交瘤細胞株鼠雜交瘤CGMCC No.2907分泌產生的單克隆抗體。
2.雜交瘤細胞株鼠雜交瘤，其保藏編號為CGMCCNo. 2907。
3.一種抗體，其重鏈可變區具有序列表中序列1所示的胺基酸殘基序列，其輕鏈可變 區具有序列表中序列2所示的胺基酸殘基序列。
4.一種抗體，其輕鏈具有序列表中序列8所示的胺基酸殘基序列，重鏈具有序列表中 序列9所示的胺基酸殘基序列。
5.一種抗體，其胺基酸殘基序列如序列表中序列3所示。
6.由雜交瘤細胞株鼠雜交瘤CGMCCNo. 2907分泌產生的單克隆抗體的Fab片段。
7.權利要求1中所述重鏈可變區的編碼基因和所述輕鏈可變區的編碼基因。
8.權利要求2中所述重鏈和輕鏈的編碼基因。
9.權利要求3所述抗體的編碼基因。
10.權利要求1、3或4所述的抗體、或權利要求5所述的Fab片段在製備以人高遷移 率族蛋白Bl為靶點的藥物中的應用；權利要求1、3或4所述的抗體、或權利要求5所述的 Fab片段在製備治療和/或預防敗血症的產品中的應用；權利要求1、3或4所述的抗體、或 權利要求5所述的Fab片段在製備預防和/或治療LPS誘導的小鼠敗血症藥物中的應用。
全文摘要
本發明公開了抗高遷移率族蛋白B-1的單克隆抗體及其應用。一種抗體，其重鏈可變區具有序列表中序列1所示的胺基酸殘基序列，其輕鏈可變區具有序列表中序列2所示的胺基酸殘基序列。實驗證明雜交瘤細胞株3B-1 CGMCC No.2907分泌的單克隆抗體、衍生於該單克隆抗體的單鏈抗體3B-1scFV、人-鼠嵌合抗體ch-3B-1或Fab片段與人HMGB-1的解離常數分別為7.8nM，100nM，7.8nM，40nM。上述單克隆抗體及其衍生物能夠高親和力特異性識別高遷移率族蛋白B-1，並中和其生物學活性，可以用於治療敗血症，全身炎症反應綜和症或急性肺損傷等炎症反應；可以用於治療類風溼性關節炎，糖尿病或紅斑狼瘡等自身免疫性疾病。還可用於臨床檢驗HMGB-1的水平。
文檔編號A61K39/395GK101891817SQ20101012256
公開日2010年11月24日 申請日期2010年3月3日 優先權日2009年3月3日
發明者周洪哲, 唐捷, 王雲波, 王惟 申請人:中國科學院生物物理研究所