多糖結合疫苗及其製備方法

2023-06-06 07:22:16 2

專利名稱：多糖結合疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明涉及疫苗領域，更具體而言，本發明涉及多糖結合疫苗及其製備方法。
背景技術：
細菌的莢膜多糖是一種重要的保護性抗原。用化學方法純化的細菌莢膜多糖組分疫苗來預防傳染病，是疫苗發展史上的重要舉措之一，其中已在全世界範圍內廣泛應用的多糖疫苗有流行性腦膜炎球菌的A、C、Y和W135等4價多糖疫苗，以及肺炎雙球菌23價多糖疫苗。但多糖疫苗存在很大的局限性，在2歲以下嬰幼兒中的免疫原性差，不能誘導有效地免疫保護。用細菌的多糖(PQ與蛋白載體通過化學方法製備的疫苗，稱之為結合疫苗 (conjugate vaccine)。Goebel和Avery早於19 年就首次成功地用化學方法將肺炎球菌的第3型莢膜多糖共價結合至蛋白載體上去製備成多糖-蛋白結合疫苗。這種具有胸腺依賴性(T-cbpendent，TD)的蛋白載體可將胸腺非依賴性(T-incbpendent，!！)的多糖抗原轉變成胸腺依賴性的抗原，從而啟動T輔助淋巴細胞產生一系列的免疫增強效應。自第一個多糖結合疫苗_b型嗜血流感桿菌結合疫苗(Hib)於1987年經美國食品和藥物管理署(FDA)批准投入臨床應用以來，各種多糖蛋白結合疫苗的研究發展迅速，已成為當今疫苗研究領域的熱點之一。目前的結合疫苗主要有流感嗜血桿菌結合疫苗、肺炎球菌結合疫苗、腦膜炎球菌結合疫苗、痢疾桿菌結合疫苗、傷寒Vi結合疫苗、乙型溶血性鏈球菌結合疫苗等。大多數的多糖結合疫苗主要以破傷風類毒素(TT)和白喉內毒素的脫毒突變體 (CRM197)作為載體，種類比較單一，會造成多糖抗體應答低下的現象，這是由於結合疫苗中相同的載體蛋白只能與同一輔助性T細胞(Th)競爭性結合，從而使每種多糖抗原最終激活的B細胞數量減少，多糖特異性的抗體水平下降。載體的多樣化可以使上述問題得到改善， 其原因可能是用不同載體蛋白結合同一種多糖時激活的Th細胞克隆數要多於單一載體蛋白的Th細胞克隆數，可產生更高水平的特異性抗體。同時，結合疫苗可同時產生針對多糖和蛋白載體的免疫應答，為多聯疫苗的開發提供了思路。結合疫苗還具有載體蛋白效應，在接種結合疫苗時，載體蛋白能產生類似佐劑的作用。因此，對載體蛋白的研究和開發勢在必行。許多研究者致力於開發黏膜投遞型疫苗，這種投遞途徑與大多數病原體的自然感染途徑相同，而且黏膜投遞途徑簡單、安全，避免了注射疫苗所需的嚴格標準，有利於開展大規模人群的免疫接種。許多研究表明，相對於在自然感染中通過黏膜途徑感染的一些病原體而言，通過黏膜途徑對機體進行疫苗免疫，機體所產生的免疫保護是最有效的。它既能產生機體黏膜系統的局部免疫保護反應，又能產生全身性的免疫反應來預防疾病的發生。 因此，開發黏膜投遞型疫苗具有一定的科學性和必要性。有研究表明，以TT為載體蛋白的C群腦膜炎球菌多糖蛋白結合疫苗通過滴鼻免疫小鼠，誘發了較好的黏膜免疫應答。有的研究者將不可分型流感嗜血桿菌(NTHi)來源的寡糖類物質與TT結合後，滴鼻免疫小鼠，結果產生了較好的體液免疫和細胞免疫應答。因此，TT可以作為黏膜投遞型多糖蛋白結合疫苗的蛋白載體。大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)為代表的一些病原菌蛋白成分是近年來研究較多的一類黏膜佐劑。研究表明，流感病毒亞單位抗原或白喉類毒素(DT)與LTB形成疫苗，共同鼻內免疫小鼠後，血清中產生了高滴度的特異性IgG抗體，口腔、陰道分泌物中和肺部表面產生了中等水平的黏膜IgA抗體。目前研究的C群腦膜炎球菌多糖結合物主要以TT或CRM197為載體，大腸桿菌不耐熱腸毒素LT-K63隻是作為佐劑來增強結合物的免疫原性。目前尚未見到以此類蛋白為載體蛋白的細菌多糖結合物。因此，目前要研究同時具有保護性抗原和佐劑功能的多糖載體蛋白、進而改善和延伸現有多糖結合疫苗的功能正日益成為熱點。以這類蛋白為載體的多糖蛋白結合疫苗具有重要的實際應用意義和廣闊的市場前景。

發明內容
本發明的目的是提供一種多糖結合疫苗。本發明的目的還在於提供該多糖結合疫苗的製備方法。為了實現本發明的目的，本發明提供一種多糖結合疫苗，包含細菌多糖與載體蛋白的化學偶聯物，其中所述載體蛋白為細菌黏膜侵襲相關蛋白。優選地，所述載體蛋白選自大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白Al (FspAl)、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白A2(FspA2)、肺炎球菌表面蛋白(PspA)和肺炎球菌表面黏附素(PsaA)。優選地，所述細菌多糖選自腦膜炎球菌多糖、嗜血流感桿菌多糖和肺炎球菌多糖。優選地，所述細菌多糖為腦膜炎球菌多糖，並且所述載體蛋白為大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位。本發明的疫苗可以是本發明方法直接製備得到的液體製劑的形式，也可以是將該液體通過濃縮得到的濃縮液形式，或是通過乾燥(例如)冷凍乾燥後得到的凍乾粉劑形式。優選地，所述多糖結合疫苗為液體製劑，該液體製劑中還包含有未與所述載體蛋白結合的游離細菌多糖，並且在所述液體製劑中，總細菌多糖的含量為30-800μ g/ml，載體蛋白的含量為30-900μ g/ml，以及總細菌多糖和載體蛋白之間的重量比為0. 3_3。優選地，在本發明所述疫苗中，未與所述載體蛋白結合的游離細菌多糖的含量低於 30%。優選地，所述多糖結合疫苗的液體製劑形式是通過注射或黏膜投遞的方式來施用的。本發明還提供一種多糖結合疫苗的製備方法，該方法包括1)提供細菌多糖；2)提供載體蛋白；3)使所述細菌多糖和所述載體蛋白化學偶聯；其中，所述載體蛋白為細菌黏膜侵襲相關蛋白。優選地，所述載體蛋白選自大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白Al (FspAl)、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白A2(FspA2)、肺炎球菌表面蛋白(PspA)和肺炎球菌表面黏附素(PsaA)。
優選地，所述細菌多糖選自腦膜炎球菌多糖、嗜血流感桿菌多糖和肺炎球菌多糖。在本發明中，可利用基因工程方法體外重組表達載體蛋白，包括(例如)大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白Al (FspAl)、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白A2(FspA2)、肺炎球菌表面蛋白(PspA)和肺炎球菌表面黏附素O^saA)，並將載體蛋白與多糖抗原進行化學偶聯製備成多糖蛋白偶聯物。本發明人發現，這種偶聯物可以作為預防多糖和蛋白所對應的病原體的疫苗。由於這些載體蛋白分別是大腸桿菌、空腸彎曲菌和肺炎球菌的保護性抗原成分，它既是一種保護性抗原又是較強的黏膜佐劑，因此，如果將這些蛋白作為多糖結合疫苗的載體蛋白，可以使傳統的多糖結合疫苗改型為黏膜投遞型疫苗。而且載體多樣化可以解決多價多糖結合疫苗中載體單一造成的抗體應答低下現象和載體蛋白的毒性蓄積現象。不僅如此，以這些蛋白為載體的多糖結合疫苗提供了針對產毒性大腸桿菌、空腸彎曲菌以及肺炎球菌的交叉免疫保護反應。


圖1為重組質粒pET42b+LTB構建示意圖(LTB =LTB基因；NdeI =NdeI酶切位點； AvrII =AvrII 酶切位點)；圖2為重組質粒pET30a+fspAl構建示意圖(fspAl :fspAl基因；NdeI =NdeI酶切位點；Sac I =SacI酶切位點)；圖3為重組質粒pET30a+pspA構建示意圖(pspA :pspA基因；NdeI =NdeI酶切位點；Sac I =SacI酶切位點)。
具體實施例方式以下結合附圖通過具體實施方式
的描述對本發明作進一步說明，但這並非是對本發明的限制，本領域技術人員根據本發明的基本思想，可以做出各種修改或改進，但是只要不脫離本發明的基本思想，均在本發明的範圍之內。本發明所使用的培養基可通過如下方法製備LB液體培養基胰化蛋白腖(bacto-tryptone，OXOID公司)10g，酵母提取物 (bacto-yeast extract, 0X0ID 公司)5g, NaCl 10g，加蒸餾水溶解，定容至 1000ml，高壓滅菌(0. 12Mpa，115°C，20分鐘)後4°C保存備用。LB液體培養基(Kana+)胰化蛋白腖(bacto-tryptone，0X0ID公司)10g，酵母提取物(bacto-yeast extract，0X0ID公司)5g，NaCl 10g，加蒸餾水溶解，定容至1000ml，高壓滅菌(0. 12Mpa，115°C，20分鐘)，等到溫度降到50°C時，加入卡那黴素(Kana)至終濃度為 30ug/ml，4°C保存備用。LB固體培養基(Kana+)在100ml上述LB液體培養基中加入1. 5g瓊脂，高壓滅菌 (0. 12Mpa, 115°C，20分鐘)，等到溫度降到50°C時，加入卡那黴素(Kana)至終濃度為30ug/ ml，鋪板，4°C保存備用。實施例1下面以大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)與C群流行性腦膜炎球菌多糖 (GCMP)的結合為例，來對本發明進行詳細說明。(一 )、重組大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(rLTB)的克隆和表達1)LTB基因的合成與表達載體的構建LTB基因序列選自於GENBANK，序列號為GI :157021177。按照大腸桿菌密碼子使用頻率表(參考文獻:Maloy, S.，V. Stewart, andR. Taylor. 1996. Genetic analysis of pathogenic bacteria. Cold SpringHarbor Laboratory Press, NY. ) iXitiitl^^i, ^Ε ψβ] C 末端加上6個組氨酸標籤和終止密碼子，然後在序列兩端分別加上Ndel、AvrII酶切位點。人工合成上述LTB基因，然後用NdeI、AvrII雙酶切LTB和pET42b (購自Novagen)， 再將雙酶切LTB後的目的片段和pET42b載體連接，構建成重組質粒pET42b+LTB，如圖1所示。全基因合成及上述構建工作由上海捷瑞生物工程有限公司完成。2)重組載體的酶切鑑定將步驟1)獲得的重組質粒pET42b+LTB轉化到大腸桿菌DH5 α中，並將轉化子接種到LB固體培養基(Kana+)平板上，從中挑取生長狀態良好的菌落，接於LB液體培養基 (Kana+)中，於37°C搖床、230rpm過夜培養。提取質粒，進行NdeI、AvrII雙酶切，經瓊脂糖凝膠電泳分析證明，在相應的位置上有LTB目的基因片段和pET42b載體片段，條帶大小與
預期一致。3)目的蛋白LTB的表達將步驟1)獲得的重組質粒pEI^^b+LTB轉化至大腸桿菌BL21中，在237rpm、37°C 培養箱中培養至OD值為1. O時，加入終濃度為ImM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，誘導表達2-4小時(參考文獻《分子克隆試驗指南》第三版(上、下冊)(美)J.薩姆布魯克，黃培堂，科學出版社，2002)。經SDS-PAGE檢測(參考文獻《分子克隆試驗指南》，出處同上)和flfestern blot 鑑定(參考文獻《分子克隆試驗指南》，出處同上)證明，上述大腸桿菌BL21的表達產物為 LTB，且可與LTB的單克隆抗體(購自HyTest公司)特異性結合，與預期結果相符。(二)、rLTB 的純化將上述誘導表達後的大腸桿菌BL21離心(5000rpm，10分鐘)，棄上清，將菌體用 20mM、pH7. 0的磷酸緩衝液(磷酸二氫鈉_磷酸氫二鈉)清洗一次，再用上述20mM、pH7. 0 的磷酸緩衝液重懸，用超聲破碎儀破碎。破碎完全後離心(11000rpm，40分鐘)，收集上清， 用CM-FF陽離子交換柱(購自GE HEALTHY)純化，收集在洗脫液為0. 17mol/L NaCl時的洗脫峰，得到純化後的本發明目的蛋白rLTB。(三)、rLTB與GCMP的化學偶聯將上述純化所得蛋白rLTB在4°C下透析48小時後，過濾除菌，於4°C保存備用。取 2. 5ml GCMP (天壇生物製品股份有限公司饋贈)(約IOmg)，加入等質量的CNBr，攪拌進行反應，並用0. IM NaOH維持pH10. 8，在高pH條件下，CNBr與多糖糖鏈上的羥基反應生成氰酸酯。在上述反應進行10分鐘後，加入己二醯胼(ADH) 70mg,用0. IM NaOH維持pH8. 5，於4°C 反應過夜，使ADH與氰酸酯反應形成異脲鍵，生成GCMP-ADH醯胼類衍生物。然後將反應混合物裝入透析袋，於0. 2M NaCl中透析48小時，除去未反應的CNBr、ADH或反應中間物。然後用鹽酸調節透析物的PH值至5. 7，加入上述製得的載體蛋白rLTB，使透析物(多糖)與rLTB 的質量相等，再加入終濃度0. IM EDAC (碳二亞胺)，用鹽酸維持pH5.7，於2-8°C攪拌透析2 天，使載體蛋白的羧基與GCMP-ADH醯胼類衍生物的氨基發生縮合反應，生成GCMP-ADH-載體蛋白，然後收取透析物。
在上述氰酸酯與ADH反應透析4 後，用TNBS比色法檢測衍生物中ADH的含量， 可以反映多糖平均修飾度，檢測結果為0. 8-1. 5% (重量比)。(四)、rLTB與GCMP的結合物的純化將步驟(三)得到的反應產物於IOkD超濾管(Millipore)中超濾濃縮，再用 0. 45 μ m濾膜過濾，用kphorose 4FF凝膠柱純化，使用0. 2MNaCl為洗脫劑，收集外水體積處的洗脫峰，得到本發明GCMP-rLTB結合物溶液。對GCMP-rLTB結合物進行定性檢測和定量檢測，其中根據在分子篩外水體積處^Onm波長處有、無吸收峰來對GCMP-rLTB結合物進行定性檢測，如有吸收峰則表明載體蛋白與多糖生成了結合物，反之則說明沒有多糖蛋白結合物生成。對結合物中多糖和蛋白質含量的檢測採用《中華人民共和國藥典》第三部OOlO 年版，國家藥典委員會編，中國醫藥科技出版社)所記載的方法。所述定性檢測和定量檢測的結果為在分子篩外水體積處280nm波長處有吸收峰，蛋白含量J46. 5 μ g/ml，總多糖含量640. lyg/ml，游離多糖含量15. lyg/ml，多糖/蛋白(重量比):2. 5。(五)、GCMP-rLTB結合物的免疫效果1.試驗藥品通過上述方法製備的GCMP-rLTB結合物，以及GCMP-TT (北京生物製品研究所細菌研究室饋贈)、GAMP-TT+GCMP-TT(北京生物製品研究所細菌研究室饋贈)、 GCMP (天壇生物製品股份有限公司饋贈)，並配製成具有試驗所需總多糖含量的液體製劑。2.試驗動物BALB/c小鼠，24隻，雌性，6周齡，體重18_20g，購自天壇生物公司， 在天壇生物公司動物房飼養。3.動物分組將BALB/c小鼠隨機每6隻分為一組。4.免疫方式滴鼻組34 μ 1/只，含總多糖為10 μ g或20ug，從小鼠鼻孔緩慢滴入，注意勿流入口腔及肺；腹腔注射組100 μ 1/只，含總多糖10 μ g或20ug ；一共免疫4次，第0、14、21天免疫，第三次免疫後1周即第21天用含2%皂苷 PBS (pH7. 4)衝洗小鼠陰道/ 口腔/肺/小腸並收集衝洗液後，在小鼠眼球處取血約500μ 1 作檢測。末次免疫後1周即第觀天以同樣的方法收集衝洗液後，摘眼球取血拉頸處死小鼠。5.檢測方法小鼠陰道/ 口腔/肺/小腸衝洗物中抗多糖IgA的ELISA測定以每孔100 μ 1稀釋液(含總多糖 ο μ g)包被96孔酶標板4°C過夜後，37°C封閉3h，以1 32起始稀釋小鼠陰道/ 口腔/肺/小腸衝洗液後，再進行倍比稀釋，以每孔100 μ 1加入孔中，置於37°C培養箱Ih;加入以1 2000稀釋的羊抗鼠IgA 100 μ 1/孔，置於37°C培養箱Ih後顯色並用酶標儀讀數。小鼠血液中抗多糖IgG的ELISA測定以每孔100 μ 1稀釋液(含總多糖IOyg) 包被酶標板4°C過夜後，37°C封閉池，以1 100起始稀釋離心後的血清，再進行倍比稀釋， 以每孔100 μ 1加入孔中，置於37°C Ih;加入以1 5000稀釋的羊抗鼠IgG 100 μ 1/孔，置於37°C培養箱Ih後顯色並用酶標儀讀數。小鼠小腸/肺衝洗物中抗LTB IgA的ELISA測定將LTB蛋白(購自Sigma公司) 以10ug/ml的濃度包被酶標板(每孔100μ 1)4°C過夜後，37°C封閉3h，以1 10起倍比稀釋小腸/肺衝洗物，以每孔100μ1加入孔中，37°C孵育Ih;加入以1 2000稀釋的羊抗鼠IgA，置於37°C培養箱Ih後顯色並用酶標儀讀數。小鼠血液中抗LTB IgG的ELISA測定將LTB蛋白(購自Sigma公司)以IOug/ ml的濃度包被酶標板(每孔100μ 1)4°C過夜後，37°C封閉3h，以1 40起倍比稀釋血清， 以每孔100μ 1加入孔中，置於37°C Ih ；加入以1 5000稀釋的羊抗鼠IgG，置於37°C培養箱Ih後顯色並用酶標儀讀數。6.試驗結果A. GCMP特異丨牛血清和粘臘免,瘡應答水平試驗1.滴鼻免疫時GCMP-rLTB特異性血清和黏膜免疫應答水平以及與GCMP-TT 免疫應答水平的比較試驗結果見表1。從表1中可以看出，通過使用含總多糖為IOyg或20ug的 GCMP-rLTB滴鼻免疫小鼠，在第四次免疫後1周即觀天，小鼠陰道衝洗物中多糖抗體滴度都明顯高於第三次免疫後1周即第21天衝洗物中多糖抗體滴度(P < 0. 01)；血液中多糖抗體滴度也都明顯高於第三次免疫後1周血液中抗體滴度(P < 0. 01)；並且在第四次免疫後 1周即觀天，小鼠口腔衝洗物和肺衝洗物中也都表現出一定量的多糖抗體滴度。此外，GCMP-rLTB滴鼻組和GCMP-TT滴鼻組相比，小鼠陰道/ 口腔/肺衝洗物中的抗多糖IgA和血液中的抗多糖IgG的抗體滴度都有顯著性差異(P <0.05)。此結果說明 LTB和TT兩種載體蛋白在和GCMP的偶聯效果上，前者優於後者。表lGCMP-rLTB結合物、GCMP-TT的免疫效果評價數據(GMT為幾何均數)
權利要求
1.一種多糖結合疫苗，其特徵在於，包含細菌多糖與載體蛋白的化學偶聯物，其中所述載體蛋白為細菌黏膜侵襲相關蛋白。
2.根據權利要求1所述的多糖結合疫苗，其特徵在於，所述載體蛋白選自大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白Al、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白A2、肺炎球菌表面蛋白和肺炎球菌表面黏附素。
3.根據權利要求2所述的多糖結合疫苗，其特徵在於，所述細菌多糖選自腦膜炎球菌多糖、嗜血流感桿菌多糖和肺炎球菌多糖。
4.根據權利要求3所述的多糖結合疫苗，其特徵在於，所述細菌多糖為腦膜炎球菌多糖，並且所述載體蛋白為大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位。
5.根據權利要求1至4中任意一項所述的多糖結合疫苗，其特徵在於，所述多糖結合疫苗為液體製劑，該液體製劑中還包含有未與所述載體蛋白結合的游離細菌多糖，並且在所述液體製劑中，總細菌多糖的含量為30-800 μ g/ml，載體蛋白的含量為30-900 μ g/ml，以及總細菌多糖和載體蛋白之間的重量比為0. 3-3。
6.根據權利要求5所述的多糖結合疫苗，其特徵在於，在所述疫苗中，所述的未與所述載體蛋白結合的游離細菌多糖的含量低於30%。
7.根據權利要求1所述的多糖結合疫苗，其特徵在於，所述多糖結合疫苗是通過注射或黏膜投遞的方式來施用的。
8.一種多糖結合疫苗的製備方法，該方法包括1)提供細菌多糖；2)提供載體蛋白；和3)使所述細菌多糖和所述載體蛋白化學偶聯；其中，所述載體蛋白為細菌黏膜侵襲相關蛋白。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於，所述載體蛋白選自大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白Al、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白A2、肺炎球菌表面蛋白和肺炎球菌表面黏附素；所述細菌多糖選白腦膜炎球菌多糖、嗜血流感桿菌多糖和肺炎鏈球菌多糖。
全文摘要
本發明涉及一種多糖結合疫苗，包含細菌多糖與載體蛋白的化學偶聯物，所述載體蛋白為細菌黏膜侵襲相關蛋白，如大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白A1、空腸彎曲菌鞭毛分泌蛋白A2、肺炎球菌表面蛋白、肺炎球菌表面黏附素。本發明還涉及該多糖結合疫苗的製備方法。本發明所述的多糖結合疫苗可以在不添加其它任何外源性蛋白的前提下，實現多糖結合疫苗的黏膜投遞，這種免疫途徑將使疫苗的使用更加高效、便捷和安全。
文檔編號A61K47/48GK102462839SQ20101054839
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月12日 優先權日2010年11月12日
發明者衛江波, 唐玉龍, 張學峰, 張靖, 李啟明, 陳實, 靳玉琴, 馬智靜 申請人:北京生物製品研究所