多糖－蛋白軛合物疫苗的製作方法

2023-06-06 07:29:41

專利名稱：多糖－蛋白軛合物疫苗的製作方法
技術領域：
本發明提供了以較高產量合成與製備多糖-蛋白軛合物疫苗的方法。該方法涉及在一種反應物上的醯肼基與另一種反應物上的醛基或氰酸鹽酯基反應。所述反應以較高的軛合效率快速進行。可使用簡化的純化方法從未軛合的蛋白和多糖以及其他小分子副產物中分離所述軛合產物。
背景技術：
細菌多糖(PSs)是在大齡兒童和成人中誘導短期免疫的非T細胞依賴性抗原，但幼小嬰兒卻常常缺乏。PSs並不能與主要組織相容性複合物結合，所述主要組織相容性複合物是抗原提呈以及刺激T-輔助淋巴細胞所必需的。PSs可以在無需T-輔助細胞淋巴細胞的幫助下刺激B淋巴細胞產生抗體。作為所述B淋巴細胞非T細胞依賴性刺激的結果，在這些抗原的免疫之後依然缺少記憶誘導。
通過多糖與蛋白分子的共價結合，非T細胞依賴性多糖抗原可轉變為T細胞依賴性抗原。結合於所述軛合物疫苗多糖部分的B細胞可由輔助性T細胞來活化，該輔助性T細胞對該軛合載體蛋白部分的多肽具有特異性。對該載體蛋白產生應答的T輔助細胞能增強針對該多糖的抗體產生。多糖軛合疫苗是由蛋白與多糖的共價連接形成的多糖-蛋白雜合體。因為大多數天然細菌多糖在先經受某些化學修飾(「活化」)之前不能與蛋白化學相連，所以通常需要在結合前對所述多糖進行化學修飾。
對所述蛋白的結合產生了多種T細胞抗原決定簇。這些T細胞抗原決定簇會與CD4輔助性T細胞相互作用，極大地促進對所述結合多糖的抗體應答。甚至在嬰兒體內，對軛合物的所述T輔助細胞依賴性應答可產生血清IgG抗體和免疫記憶。而且，與天然多糖相比，所述個孔中。板在室溫培養1小時並洗滌三次。將含有鄰-苯二胺二氯氫化物(OPD)的100μl底物溶液和過氧化氫(SIGMA，St.Louis，MO，USA)加入到每個孔中，然後在室溫培養30分鐘。向每孔中加入2N硫酸50μl來終止顯色反應。於492nm測定每個孔的吸光度。抗體滴度定義為最高血漿稀釋度，其為在492nm處免疫血漿的孔中產生的消光(extinction)超過陰性對照血漿的孔中產生的消光的兩倍時的最高血漿稀釋度。
PEG化rMETase的SDS-PAGE分析用摩爾比30/1、60/1和120/1的PEG/rMETase製備了三種rMETase偶聯物。PEG偶聯到rMETase的程度和PEG化rMETase偶聯物的純度用SDS-PAGE測定(圖2)。當用上面的摩爾比時，經室溫90分鐘的反應所有的rMETase亞單位都被PEG化了，因為用SDS-PAGE沒有檢測到未PEG化的rMETase(圖2)。純化了的PEG化rMETase在10％的SDS-PAGE凝膠上跑膠。當提高PEG與rMETase的摩爾比時，有更多的PEG鏈偶聯到rMETase上，如用SDS-PAGE所見的(圖2)。凝膠用考馬斯亮藍染色，右邊的數字代表分子量。帶1分子量標記。帶2原型的rMETase。帶3PEG/rMETase 30。帶4PEG/rMETase 60。帶5PEG/rMETase 120。在膠上看到的寬帶代表在低PEG/rMETase摩爾比時的PEG化rMETase偶聯物的異質性。當在反應中採用更高的PEG/rMETase摩爾比時，觀察到PEG化rMETase偶聯物的較低的異質性。
用螢光胺分析和MALDI對PEG化程度的測定三種PEG化rMETase偶聯物的PEG化程度在表1中顯示。
表1.PEG化rMETase偶聯物的PEG化程度的測定
表16包衣(以mg給出的量)
表17包衣(以mg給出的量)
與其他Hib軛合物疫苗相比，Hib多糖-腦膜炎萘瑟菌(Neisseriameningitidis)外膜蛋白複合體軛合物疫苗(PRP-OMPC)具有多種獨特的性質。所述蛋白載體並不是白喉，破傷風和百日咳(DTP)疫苗的成分，但卻由脂多糖缺失的腦膜炎球菌外膜囊泡以及其上通過硫醚連接的大小縮小的Hib多糖構成。參見Marburg等人J.Amer.Chem.Soc.1986；1085282-5287；Ellis等人在《b型等嗜血桿菌軛合物疫苗的發展與臨床應用》(Development and clinical uses of Haemophilus b conjugatevaccines)一書中由Kniskern等人所著的《軛合物設計，化學與分析》″Conjugationdesign，chemistry，and analysis″章節，紐約，MarcelDekker出版社，1994年，37-69頁；以及Anderson等人，J.Immunol.1989；1422464-8。在該方法中，將單獨的連接物與所述蛋白和Hib多糖連接，然後將所述連接物融合形成硫醚鍵。
腦膜炎萘瑟菌(Neisseria meningitidis)是全世界細菌性腦膜炎和敗血症的首要原因。致病性腦膜炎球菌由多糖莢膜包被，該莢膜與該有機體的外膜表面相連接。根據莢膜多糖的免疫學特異性，已鑑定出了13種不同的腦膜炎球菌血清型(Frasch，C.E.等人，1985)。在這13種血清型中，有5種能導致絕大多數的腦膜炎球菌疾病；這些血清型包括血清型A，血清型B，血清型C，血清型W135和血清型Y。血清型A是造成大多數流行病的原因。血清型B，血清型C，和血清型Y能導致大多數的地方病及其局部爆發。對侵入性腦膜炎球菌的宿主防禦依賴於補體介導的溶菌作用。負責補體介導的溶菌作用的血清抗體主要旨在對付所述外莢膜多糖。
基於腦膜炎球菌多糖的常規疫苗能夠引起對於所述莢膜多糖的免疫應答。這些抗體能對所述血清型特異的腦膜炎球菌產生補體介導的溶菌作用。所述腦膜炎球菌多糖疫苗在兒童和成人中都表現得相當有效。然而，在嬰兒和幼兒中，其效率受到限制，其在幼兒人群中的後續劑量僅能引起較弱的應答或不能增強應答。
如表2所總結的，已採用了多種方法來活化所述腦膜炎球菌的多糖並進行軛合作用。在所述多糖分子上，即使僅有相對較少的幾個位點被活化的時候，每種活化方式也都具有改變重要抗原決定簇的潛能。例如，對C型腦膜炎球菌多糖的高碘酸活化，就能導致鏈斷裂從而產生具有末端醛基的較小的糖單位，其可通過還原氨基化連接於所述蛋白。參見，Richmond等人，J.Infect.Dis.1999；1791569-72。
表2
a.己二酸的N-羥基琥珀醯亞胺二酯b.脫乙醯化的多糖，僅對C型腦膜炎球菌有過報導在所述Hib軛合物的商業化之前，就已經出現了關於C型腦膜炎球菌軛合物的生產與優化的早期研究的報導。參見Beuvery等人，Infect.Immun.1982；3715-22；Beuvery等人，Infect.Immun.1983；4039-45；Beuvery等人，J.Infect.1983；6247-55；Jennings等人，J.Immunol.1981；1271011-8。
關於將所述C型多糖與蛋白載體的化學連接報導過兩種不同的軛合方法。參見Jennings等人，J.Immunol.1981；1271011-8；Beuvery等人，Infect.Immun.1983；4039-45。第一種方法是對多糖進行部分解聚化，通過高碘酸氧化產生末端醛基進行活化(表2中的方法#1)。在氰基硼氫鈉存在的條件下，通過還原氨基化反應，所述醛基與所述蛋白質的自由氨基(大多數為賴氨酸)結合。參見Jennings等人，J Immunol1981；1271011-8。在該方法中，活化發生在所述C型多糖的一個特異性位點上。
第二種方法採用的是碳二亞胺反應(表2中的方法#2)，將高分子量多糖中的羧基共價連接於所述載體蛋白賴氨酸的∈-氨基。與高碘酸活化的方法相比，該方法的活化位點更加隨機。
已經在動物上對通過這兩種方法製備的C型腦膜炎球菌軛合物進行了評價。參見Beuvery等人，Dev.Biol.Stand.1986；65197-204；以及Beuvery等人，J.Infect.1983；6247-55。在初次免疫時所述軛合物都能刺激T細胞非依賴性和T細胞依賴性的應答。參見Beuvery等人，J.Infect.1983；6247-55。然而，研究證明，所述多糖必須共價地與所述載體蛋白相連才能誘導T細胞依賴性的應答。
最初用於臨床試驗的A型和C型腦膜炎球菌軛合物是由ChironVaccine公司生產的，並在1992年就進行了報導(表2中的方法#3)。參見Costantino等人，Vaccine 1992；10691-8。所述軛和方法是基於通過溫和的酸性水解選擇性地對小分子寡糖的末端基團進行活化，然後通過烴間隔物與蛋白進行軛合。將白喉毒素的無毒性的突變體，CRM197用作蛋白載體。為了活化寡糖以進行軛合反應，向所述寡糖的末端加上氨基基團，然後與己二酸的N-羥基琥珀醯亞胺二酯反應生成活性酯。然後將該活性酯共價結合於CRM197蛋白賴氨酸的∈-氨基，形成了所述軛合物。
發明概述儘管在多糖活化中已經使用過ADH形式的醯肼，但是在製備多糖-蛋白軛合物疫苗的現有方法中，還沒有在還原氨基化軛合反應中採用醯肼化學的方法。這些現有技術都是利用所述蛋白的賴氨酸殘基上的∈-氨基與活化多糖上諸如醛基(還原氨基化)和羧基的官能團進行反應。該反應的效率較低，通常僅有20％左右。該反應還需要2-3天時間才能完成所述軛合，且必須採用純化步驟從未反應的多糖中分離出所述軛合物。參見Pollard等人《分子藥物方法》(Methods in MolecularMedicine)，第66卷《腦膜炎球菌疫苗方法與實驗設計》(Meningococcal Vaccinesmethods and Protocols)書中Guo等人的《蛋白-多糖軛合》″Protein-polysaccharide conjugation″內容，Humana Press，Totowa，NJ，2001，pg 49-54。對所得到的較低產量有幾種解釋。首先，在所述軛合條件下(pH6.5-7.4)賴氨酸∈-氨基的反應性較低(pKa＝10.5)。參見Inman等人，Biochemistry 1969；84074-4082。其次，大多數軛合方法都將類毒素用作載體蛋白。所述類毒素都來自於用甲醛脫毒處理過的毒素，這些甲醛會與所述毒素上的氨基結合，從而只會留下有限數量能夠進行軛合反應的氨基。第三，所得活化蛋白和蛋白-多糖軛合物的降低的溶解性經常導致沉澱。
因此，以較高產率合成和生產多糖-蛋白軛合物疫苗的方法是令人滿意的。同樣值得期待的還有這樣的反應，其具有較快反應速率，降低的不希望副產物的產生，以及在該反應結束時殘留未反應的蛋白和多糖量降低。
現有的基於多糖的疫苗在幼兒中使用受限，在成人中也不能提供長期保護。因此需要能夠具有在兒童和成人體內對諸如細菌性腦膜炎，流感，破傷風以及其他細菌感染疾病有保護的蛋白-多糖軛合物疫苗。可將優選實施方案中的蛋白-多糖軛合物用於製備能夠長期保護嬰兒，兒童和成人的疫苗製劑。
因此，在第一實施方案中提供了製備軛合物疫苗的方法，該方法包括將多糖與氧化劑反應，由此得到了醛活化的多糖溶液；通過緩衝液更換將所述醛活化的多糖溶液的pH調至約7到約8；在pH約為6至約7，存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的條件下，將蛋白與肼或己二酸二醯肼反應，由此得到醯肼活化的蛋白溶液；將所述醯肼活化的蛋白溶液的pH升高至約7.0到約11；通過緩衝液更換將所述醯肼活化的蛋白溶液的pH調至約10.0至約11.0；在pH約6至約8的條件下，將所述醛活化的多糖與醯肼活化的蛋白反應，由此得到含有一或多個C＝N雙鍵的軛合物；以及將所述軛合物的全部C＝N雙鍵基本還原成C-N單鍵，由此得到能刺激免疫反應的軛合物疫苗。
在第一實施方案的一個方面，所述氧化劑包括NaIO4。
在第一實施方案的一個方面，用HEPES緩衝液對所述醛活化的多糖溶液進行緩衝液更換。
在第一實施方案的一個方面，用Na2CO3緩衝液對所述醯肼活化的蛋白溶液進行緩衝液更換。
在第一實施方案的一個方面，以約1∶2至約2∶1的比例將所述醛活化的多糖與所述醯肼活化的蛋白反應。
在第一實施方案的一個方面，還原包括用NaBH4進行還原。
在第一實施方案的一個方面，所述多糖選自腦膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感桿菌多糖，傷寒桿菌Vi多糖，以及B型鏈球菌多糖。
在第一實施方案的一個方面，所述蛋白選自破傷風類毒素，白喉類毒素，CRM197以及腦膜炎球菌蛋白。
在第二實施方案中也提供了製備軛合物疫苗的方法，該方法包括將多糖與1-氰-4-二甲基銨吡啶四氟硼酸反應，由此得到氰酸鹽活化的多糖溶液；在pH約為6至約7，存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的條件下，將蛋白與肼或己二酸二醯肼(adipic aciddihydrazide)反應，由此得到醯肼活化的蛋白溶液；將所述醯肼活化的蛋白溶液的pH升高至約7到約11；通過緩衝液更換將所述醯肼活化的蛋白溶液的pH調至約10.0到約11.0；在pH約6至約8的條件下，將所述氰酸鹽活化的多糖與醯肼活化的蛋白反應，得到能刺激免疫反應的軛合物疫苗。
在第二實施方案的一個方面，所述氰酸鹽活化的多糖與醯肼活化的蛋白的反應步驟是在沒有封閉劑的條件下進行的。
在第二實施方案的一個方面，所述多糖選自腦膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感桿菌多糖，傷寒桿菌Vi多糖，以及B型鏈球菌多糖。
在第二實施方案的一個方面，所述蛋白選自破傷風類毒素，白喉類毒素，CRM197以及腦膜炎球菌蛋白。
在第三實施方案中也提供了製備軛合物疫苗的方法，該方法包括在pH約為6至約7，存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的條件下，將蛋白與1-氨基-2，3-丙二醇(APDO)反應，由此得到APDO修飾的蛋白溶液；通過緩衝液更換將所述APDO修飾的蛋白溶液的pH調至約10.0到約11.0；將所述APDO修飾的蛋白與氧化劑反應，由此得到醛活化的蛋白溶液；通過緩衝液更換將所述醛活化的蛋白溶液的pH調至約10.0至約11.0；在pH約6至約8的條件下，將所述醯肼活化的多糖與醛活化的蛋白反應，由此得到含有一或多個C＝N雙鍵的軛合物；以及將所述軛合物的全部C＝N雙鍵基本還原成C-N單鍵，由此得到能刺激免疫反應的軛合物疫苗。
在第三實施方案的一個方面，所述多糖選自腦膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感桿菌多糖，傷寒桿菌Vi多糖，以及B型鏈球菌多糖。
在第三實施方案的一個方面，所述蛋白選自破傷風類毒素，白喉類毒素，CRM197以及腦膜炎球菌蛋白。
在第三實施方案的一個方面，通過在溶液中將多糖與氧化劑反應，由此得到醛活化的多糖；將所述醛活化的多糖與己二酸二醯肼反應，得到含有一或多個C＝N雙鍵的中間體；以及將所述中間體的全部C＝N雙鍵基本還原成C-N單鍵，由此得到醯肼活化的多糖。
在第三實施方案的一個方面，通過將多糖與1-氰-4-二甲基銨吡啶四氟硼酸反應，由此得到氰酸鹽官能化的多糖；將所述氰酸鹽官能化的多糖與己二酸二醯肼反應，由此得到醯肼活化的多糖。
在第三實施方案的一個方面，在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽存在的條件下，將多糖與己二酸二醯肼反應，由此得到醯肼活化的多糖。
在第四實施方案中提供了軛合物疫苗，所述軛合物疫苗包含至少一種多糖部分和至少一種蛋白部分，其中所述多糖部分與所述蛋白部分通過至少一種式-C(＝O)-NH-NH-CH2-的連接基團相連接。
在第四實施方案的一個方面，所述軛合物疫苗含有通過多個連接基團將多個多糖部分與多個蛋白部分交聯形成的晶格結構。
在第四實施方案的一個方面，所述多糖選自腦膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感桿菌多糖，傷寒桿菌Vi多糖，以及B型鏈球菌多糖。
在第四實施方案的一個方面，所述蛋白選自破傷風類毒素，白喉類毒素，CRM197以及腦膜炎球菌蛋白。
在第五實施方案中提供了軛合物疫苗，所述軛合物疫苗包括至少一種多糖部分和至少一種蛋白部分，其中所述多糖部分與所述蛋白部分通過至少一種式-C(＝O)-NH-NH-C(＝NH)-O-的連接基團相連接。
在第五實施方案的一個方面，所述軛合物疫苗含有通過多個連接基團將多個多糖部分與多個蛋白部分交聯形成的晶格結構。
在第五實施方案的一個方面，所述多糖選自腦膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感桿菌多糖，傷寒桿菌Vi多糖，以及B型鏈球菌多糖。
在第五實施方案的一個方面，所述蛋白選自破傷風類毒素，白喉類毒素，CRM197以及腦膜炎球菌蛋白。
在第六實施方案中提供了軛合物疫苗，所述軛合物疫苗包括至少一種多糖部分和至少一種蛋白部分，其中所述多糖部分與所述蛋白部分通過至少一種式-C(＝O)-NH-CH2-CH2-NH-NH-的連接基團相連接。
在第六實施方案的一個方面，所述軛合物疫苗含有通過多個連接基團將多個多糖部分與多個蛋白部分交聯形成的晶格結構。
在第六實施方案的一個方面，所述多糖選自腦膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感桿菌多糖，傷寒桿菌Vi多糖，以及B型鏈球菌多糖。
在第六實施方案的一個方面，所述蛋白選自破傷風類毒素，白喉類毒素，CRM197以及腦膜炎球菌蛋白。
附圖的簡要描述

圖1所示為經高碘酸活化的C型腦膜炎球菌多糖與a)賴氨酸的∈-氨基(TT)(常規方法)，以及與b)天冬氨酸和穀氨酸殘基上的醯肼基(TT-H)進行軛合反應產物的圖譜。所述圖譜是在對軛合產物進行透析步驟之前進行的，並且在超過25分鐘後有超常峰，其在透析後不可見。TTH的軛合物(Conj.)產量比TT的軛合物產量大得多。
圖2所示為在有無封閉劑ADH，肼，甘氨酸或乙醇胺的條件下，通過氰基化軛合製備的Pn 18C PS-TT軛合物的高效分子排阻色譜圖(HPSEC)。在封閉劑存在的情況下，所述軛合物(Conj.，15.5分鐘)峰明顯降低，而游離蛋白峰(22分鐘)不降低。所述圖譜是在對軛合產物進行透析步驟之前進行的，並且在超過25分鐘後有超常峰，其在透析後不可見。
圖3所示為通過醛活化的多糖與醯肼活化的蛋白的還原氨基化軛合反應製備的4種Mn C PS-TT軛合物的HPSEC圖。在不同時間所述HPSEC圖略有漂移。在22.5-24分鐘的右肩峰來自於未軛合的蛋白TTH或TTADH，而16-17分鐘的左肩峰則來自較高分子量的軛合物。
圖4所示為對通過醛活化多糖與醯肼活化蛋白還原氨基化軛合反應製備的Mn C PS-TT軛合物中游離多糖的估計。圖4A所示為在測定蛋白的280nm，對Mn C PS-TT軛合物的C18吸附前(3)與吸收後(1)，以及純TTH(2)進行監測的HPSEC圖。C18對來自所述軛合產物的對各種蛋白類型的完全吸收可見於圖譜(1)。圖4B所示為在測定蛋白和多糖的206nm，對如圖4A所示的三種相同的進樣樣品進行監測的HPSEC圖。在C18吸附後(1)22.5分鐘的峰來自於所述軛合產物中未被吸收的游離多糖。圖4C所示為在206nm，軛合產物中的游離多糖HPSEC圖譜(1)與含有0.033mg/ml(2)，0.067mg/ml(3)和0.134mg/ml(4)的活化Mn C多糖的HPSEC圖譜的比較。
圖5所示為對通過醛活化多糖與醯肼活化蛋白的還原氨基化軛合反應製備的Mn C PS-TT軛合物中游離多糖的定量。測定圖4C中在22.5分鐘HPSEC圖譜2，圖譜3，圖譜4的峰面積，並分別對其濃度進行作圖從而構建標準曲線。從圖4C中在22.5分鐘HPSEC圖譜1的峰面積計算軛合產物中的游離多糖濃度。
圖6所示為使用Waters Ultrahydrogel線性柱對通過醛活化多糖與醯肼活化蛋白的還原氨基化軛合反應製備的Mn A多糖-TT軛合物MA031219R以及TTH得到的HPSEC圖譜(280nm)。在軛合時，所述蛋白信號從17.5分鐘遷移到15分鐘。
圖7所示為使用Waters Ultrahydrogel線性柱對通過氰基化軛合反應製備的Pn 6B PS-TT軛合物以及TTH得到的HPSEC圖譜(280nm)。在軛合時，所述蛋白信號從17分鐘遷移到13.5分鐘。所述圖譜是在對軛合產物進行透析步驟之前進行的，並且在超過25分鐘後有超常峰，其在透析後不可見。
圖8所示為通過氰基化軛合反應製備的Pn 7F PS-TT軛合物的HPSEC圖譜(280nm)。在軛合時，所述蛋白信號從17分鐘遷移到13.5分鐘。所述圖譜是在對軛合產物進行透析步驟之前進行的，並且在超過25分鐘後有超常峰，其在透析後不可見。
圖9所示為通過醯肼活化多糖與醛活化蛋白TT-醛經過還原氨基化製備的Pn 9V多糖-TT軛合物的HPSEC圖譜(280nm)。在軛合時，所述蛋白信號從17分鐘遷移到13.5分鐘。
優選實施方案的詳細描述以下內容和實施例將對本發明的優選實施方案進行詳細描述。本領域所屬技術人員應該理解對本發明進行多種變化和修改均包括在本發明的範圍內。因此，對優選實施方案的描述不應被認為對本發明的範圍有所限制。
簡介常規合成與生產多糖-蛋白軛合物疫苗的方法通常的軛合反應效率都比較低(一般為20％左右)。這意味著喪失了最高至80％所加入的活化多糖。而且，通常還需要將所述軛合物從未軛合的多糖中純化出來的色譜方法。優選實施方案的合成方法利用的是一種反應物上的醯肼基與另一反應物上的醛基或氰酸鹽酯基反應的特有的化學性質，其軛合物產量也有所提高(一般高至60％左右)。
當所述軛合反應以較高的軛合效率進行時，反應後殘留的未軛合蛋白與多糖的量會低至無需對其進行去除。因此，對所述軛合產物的純化過程可以簡化成，例如，對小分子副產物進行去除的透析步驟。可以在反應物濃度為約1-約40mg/mL，多糖/蛋白摩爾比從約1∶5到約5∶1，優選為從約1∶2到約2∶1，最優選為1∶1，在一或兩天之內完成基於醯肼的軛合反應，雖然在某些實施方案中，更高或更低的比率是優選的。隨所述多糖的最適條件的變化，優選進行所述軛合反應的條件是溫度是從約4℃至約40℃，優選為從約5，10，15或20℃至約25，30或35℃，pH至從約6至約8.5，優選從約6.1，6.2，6.3，6.4或6.5至約6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9，8.0，8.1，8.2，8.3或8.4。因此，當採用基於醯肼的軛合物反應時，可以較低的成本生產軛合物疫苗。
為了克服軛合物疫苗常規合成方法中的某些不足，提供了在還原氨基化和氰基化軛合反應中使用醯肼化學將多糖與載體蛋白軛合的方法。通過碳二亞胺與肼、ADH、碳醯肼(carbohydrazide)或琥珀醯二肼反應向蛋白分子的天冬氨酸和/或穀氨酸殘基的羧基上引入具有-NH-NH2結構的醯肼。在軛合前，在pH值從約10至約11.5，優選為從約10.1，10.2，10.3或10.4至約10.6，10.7，10.8，10.9，11.0，11.1，11.2，11.3或11.4，最優選為約10.5；緩衝液濃度從約3mM或更低至約10mM或更高，優選從約4或5mM至約6，7，8或9mM時，所活化的蛋白是可溶解的。適合的緩衝也包括Na2CO3，3-(環己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS)(3-(cyclohexylamino)-l-propanesulfonicacid)和2-(N-環己基氨基)乙磺酸(CHES)(2-(N-cyclohexylamino)ethane sulfonic acid)。然後在pH值從約6至約8.5，優選從約6.1，6.2，6.3，6.4或6.5至約6.6，6.7，6.8，6.9，7.0，7.1，7.2，7.3，7.4，7.5，7.6，7.7，7.8，7.9或8.0；在緩衝液濃度為從約100mM或更低至約200mM，優選從約110，120，130，140或150mM至約160，170，180或190mM時，將所活化的蛋白與含有醛基(還原氨基化)或氰酸鹽(氰化軛合)基活化的多糖反應。適合的緩衝液包括N-(2-羥乙基)哌嗪-N`-(2-乙磺酸)(HEPES)，磷酸鹽緩衝液(PBS)，TES(EDTA，Tris-HCI，SDS)，嗎啉基丙磺酸(MOPS)以及N，N-二(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)。
可選擇地，可使用醯肼及對所述多糖進行官能化。在採用pH為6.5-7.5較強的緩衝液時，可將所活化的多糖與醛基(還原氨基化)活化蛋白軛合。所述蛋白可在pH約為10.5較弱的緩衝液中一直保持其可溶性，直至軛合。由於在中性/弱酸性條件下與賴氨酸的∈-氨基(pKa＝10.5)相比，醯肼基的反應性(pKa＝2.6)要高得多，而且在軛合之前使用在pH至約為10.5時保持可溶性的活化蛋白能提高所述軛合物的溶解性，所以所述軛合反應的產量的到了很大提高。醯肼活化破傷風類毒素(TT-H)與破傷風類毒素(TT)的反應性比較如圖1所示。
正如在小鼠實驗中所證明的那樣，通過這些方法製備的軛合物在實驗動物中都具有免疫原性。而且，該軛合反應可以在沒有氰基硼氫鈉下高效完成，由此還避免了在該軛合產物中氰化物離子的引入。該反應可在弱酸性或中型pH條件下，在室溫或在4℃過夜完成，這與常規還原氨基化軛合方法所需要的數天時間正好相反。這又一次確保了對來自諸如b型嗜血流感桿菌，19F型肺炎鏈球菌以及A型腦膜炎奈瑟菌的不穩定多糖的較高的軛合疫苗生產。可將優選實施方案中的方法用來製備更廉價的軛合物疫苗，從而大力推進公共衛生事業。
多糖在本文中，術語「多糖」涵義廣泛，取其常規含義，包括含有多個重複單位的糖，包括含有50個或更多重複單位的多糖以及含有50個或更少重複單位的寡糖。通常，多糖含有從約50，55，60，65，70，75，80，85，90或95個重複單位至約2,000個或更多重複單位，優選為從約100，150，200，250，300，350，400，500，600，700，800，900或1000個重複單位至約1100，1200，1300，1400，1500，1600，1700，1800或1900個重複單位。寡糖通常含有從約6，7，8，9或10個重複單位至約15，20，25，30或35至約40或45個重複單位。
適合在優選實施方案中進行使用的多糖包括來自具莢膜細菌的多糖和寡糖。所述多糖和寡糖可以是任意來源的，例如，可來自天然發生的細菌，遺傳工程細菌或可以人工合成。在活化前可將所述多糖和寡糖進行一個或多個步驟的處理，例如，純化，官能化，使用弱氧化條件解聚化，脫乙醯化等等。如果需要的話還可以進行後續處理步驟。可以採用本領域內公知的適當方法對適合的多糖和寡糖進行合成，製備和/或純化。
適於在優選實施方案中進行使用的多糖和寡糖包括，例如血清型為1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，IIA，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F的肺炎球菌多糖；血清型為A，B，C，W135和Y的腦膜炎球菌多糖；b型嗜血流感菌多糖聚核糖基核糖醇磷酸；血清型III和V的B型鏈球菌多糖以及傷寒桿菌Vi多糖。肺炎球菌和B型鏈球菌血清型以及腦膜炎球菌血清型的其它多糖也適於在本發明中使用，其他T細胞非依賴性多糖和寡糖抗原，例如來自A型鏈球菌，葡萄球菌，腸球菌，肺炎克雷伯氏桿菌，大腸桿菌，綠膿假單胞菌和炭疽芽孢桿菌的多糖和寡糖，也一樣適於在本發明中使用。儘管細菌多糖和寡糖是特別優選的，但革蘭氏陰性細菌的脂多糖和脂寡糖及其多糖衍生物和寡糖衍生物，以及病毒性多糖和病毒性寡糖都是可以使用的。
在優選實施方案中適合的是具有側鏈磷和/或主鏈磷的多糖。優選實施方案的軛合物反應特別適於使用具有主鏈磷的多糖。這些多糖對斷裂和降解特別敏感，因此隨著發生降解反應持續時間的減少，所述軛合反應的快速也導致了較高產量的軛合物產生。
在任意的預處理步驟完成之後，可將多糖或寡糖用於「活化」步驟。術語「活化」是指為所述多糖提供能與所述蛋白進行反應的化學基團的化學處理。在特定的優選實施方案中，活化涉及利用能與醛基的官能化蛋白進行反應的醯肼基官能化多糖或寡糖。可選擇地，可採用與醯肼基的官能化蛋白發生反應的醛基，酮基或氰酸鹽基對所述多糖或寡糖進行官能化。
可採用適合的官能化反應利用醯肼基來活化多糖或寡糖。優選官能化反應是還原氨基化，其中在高碘酸鹽活化反應中將所述多糖或寡糖與NaIO4反應生成醛基，所述醛基隨後與己二酸二醯肼反應，再用NaBH4進行還原。可選擇地，還可以採用氰基化軛合反應，其中將多糖或寡糖與溴化氰或1-氰-4-二甲基銨吡啶四氟硼酸反應引入氰基，隨後再使該氰基與己二酸二醯肼反應。還可以採用碳二亞胺反應，其中在存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺氯化氫的條件下，將多糖或寡糖與己二酸二醯肼反應。可採用適合的官能化反應利用氰酸鹽基來活化多糖或寡糖。優選地，在存在三乙胺的條件下將所述多糖與寡糖和1-氰-4-二甲基銨吡啶四氟硼酸反應。
可採用適合的官能化反應利用醛基來活化多糖或寡糖。某些具有末端醛基的多糖和寡糖可參與所述軛合反應。如果採用醛基對所述多糖和寡糖進行活化，則優選的反應涉及氧化劑，例如NaIO4的反應。氧化劑具有將所述多糖或寡糖斷裂的能力。通過選擇特定的氧化劑以及該氧化劑的濃度來避免或控制不需要的片斷。酮基也能與醯肼反應，因此在某些實施方案中也可使用酮基來活化所述多糖或寡糖。
優選地，可採用強緩衝溶液的方式將強緩衝(pH從約6.5至約8，從約100mM至約200mM的較高緩衝濃度)活化的多糖溶液用於軛合反應。可以使用任意適合的緩衝液，優選為諸如N-(2-羥乙基)哌嗪-N`-(2-乙磺酸)的緩衝液。
蛋白活化的多糖或寡糖與蛋白軛合能產生軛合物疫苗。適合的蛋白包括細菌毒素，這些毒素是可通過化學或遺傳手段安全地對患者進行給藥的免疫有效載體。其示例包括諸如白喉類毒素，CRM197，破傷風類毒素，百日咳類毒素，大腸桿菌LT，大腸桿菌ST以及來自綠膿假單胞菌外毒素的滅活的細菌毒素。也可以採用細菌外膜蛋白，例如外膜蛋白複合體c(OMPC)，孔道蛋白(porins)，轉鐵蛋白結合蛋白，肺炎球菌溶酶(pneumolysin)，肺炎球菌表面蛋白A(PspA)，肺炎球菌結合素蛋白(PsaA)，或肺炎球菌表面蛋白BVH-3和BVH-11。還可以使用諸如炭疽芽孢桿菌的保護性抗原(PA)，卵清蛋白，鑰孔戚血藍素(KLH)，人血清白蛋白，牛血清白蛋白(BSA)以及結核菌素衍生物純化蛋白(PPD)的其他蛋白。所述蛋白優選無毒和無反應原性的蛋白，且可得到足夠優選實施方案軛合方法所需的量與純度。例如，可從白喉棒狀桿菌(Corynebacteria diphtheriae)的培養物中純化得到白喉毒素，並使用甲醛進行化學脫毒從而得到適合的蛋白。
也可使用那些含有至少一種T細胞抗原決定簇的天然毒素或類毒素片斷，同樣可使用以上所列的外膜蛋白複合體，以及多種蛋白的某些類似物，片斷和/或類似片斷。上述蛋白可以是從天然來源獲得的，通過重組技術生產的或者是由本領域公知技術合成的。可以通過多種方式獲得類似物，例如，可以在不喪失利用諸如抗體的抗原結合區或底物分子的結合位點的結構產生的相互結合能力的條件下，用某些胺基酸替換蛋白中的另一些胺基酸。還可以使用諸如那些含有表面暴露有穀氨酸或天冬氨酸基團的其他蛋白質。
可以採用任意的官能化反應利用醯肼基來活化所述蛋白。常規的醯肼基修飾蛋白的製備方法包括EDC催化以及使用N-琥珀醯亞胺碘乙酸酯和巰基醯肼經由該蛋白的賴氨酸∈-氨基的兩步方法。參見King等人，Biochemistry 1986；255774-5779。通常需要將由EDC催化製備的修飾蛋白斷裂成適於軛合反應使用的片斷，且所述兩步方法也過於繁複。因此，通常並不傾向於採用這樣的方法製備醯肼修飾的蛋白。然而，在某些實施方案中這樣的方法是可以採用的，甚至是需要的。
優選地，可以採用碳二亞胺反應，例如通過在EDC的存在下與肼，碳醯肼，琥珀醯二醯肼，己二酸二醯肼或其他二醯肼經由該蛋白的天冬氨酸和穀氨酸殘基上的羧基向所述蛋白引入醯肼基。EDC可用作催化劑利用肼或二醯肼來活化和修飾所述蛋白反應物。可將包含EDC的任意水溶性碳二亞胺用作催化劑。EDC-催化的蛋白通常具有聚合和沉澱的趨勢，因此在涉及蛋白的軛合物製備中並不是優選的。參見Schneerson等人，Infect.Immun.1986，52519-528；Shafer等人，Vaccine2000，18(13)1273-1281；以及Inman等人，Biochemistry 1969，84074-4082。所述活化蛋白的聚集和沉澱部分依賴於其pH環境。因此，可通過在緩衝溶液中保持這些醯肼修飾蛋白的可溶性，來控制其聚合與沉澱的趨勢。通過對所述反應混合物進行緩衝液更換將所述活化蛋白的pH維持在約10.5，從而使得所活化的蛋白保持其可溶性以及穩定性以進行軛合反應。優選地，可以採用諸如從約3mM至約10mM的較低濃度Na2CO3弱緩衝液。
然後，當將所述緩衝的醯肼修飾蛋白加入pH從約6至8.5，優選從約6.5至約8的活化多糖中的時候，可製備蛋白-多糖軛合物而不產生沉澱。可使用任意適合的官能化反應利用醛基來活化蛋白。優選地，該蛋白在EDC的存在下與1-氨基-2，3-丙二醇進行反應。可使用諸如葡糖胺，半乳糖胺等等氨基糖來代替1-氨基-2，3-丙二醇。在這一反應中，EDC可被用作催化劑利用氨基二醇來活化和修飾該蛋白反應物，經由該蛋白的天冬氨酸和穀氨酸殘基的羧基進行。
通過還原氨基化製備軛合物可通過醛基和醯肼基的反應(還原氨基化)製備軛合物。所述還原氨基化軛合反應可用來將醯肼修飾的反應物(蛋白或多糖)與含有醛基的其它組分軛合。
在常規還原氨基化反應中，在醛基和氨基之間的反應是可逆和不利的，因此需要使用氰基硼氫鈉來協助所述軛合反應，所述氰基硼氫鈉通過將C＝N雙鍵轉化成C-N單鍵從而使得所述整個還原氨基化事件成為不可逆。相比較而言，由於所述醯肼-醛反應具有較高的效率，因此在優選實施方案中的該還原氨基化軛合反應是在沒有氰基硼氫鈉的幫助下完成的。在該還原氨基化軛合反應結束的時候，可使用硼氫鈉或其他適合的反應物來將C＝N雙鍵還原成C-N單鍵，同時將任意的醛基還原成醇基。優選實施方案中的所述還原氨基化軛合反應避免了所產生的軛合物中混有氰化物，氰基硼氫鈉副產物的沾染。
為了降低所述軛合反應中的活化蛋白的沉澱，該活化蛋白優選地存在於從約3mM至約10mM的較低濃度的弱緩衝液中，然後將其加入到較強緩衝(pH值從約6.5至約7.5，約100mM至約200mM的高緩衝濃度)活化的多糖溶液中。優選地，將所述活化蛋白溶液的pH值緩衝至約pH10到約pH11.5，最優選為約pH10.5。將所活化多糖溶液優選地強緩衝至約pH6到約pH8，最優選為約pH6.5至約pH7.5。所述醯肼-醛還原氨基化反應以高速完成，對活化蛋白在pH低於10.5(例如pH低至約8.5至約9.5)條件下具有的沉澱作用可以通過具有反應活性的活化多糖的分子性質得以克服。
通過氰基化軛合製備軛合物可通過醯肼與氰基的反應(氰基化軛合)製備軛合物。所述氰基化軛合反應是高效和可逆並且有利於產物形成的。在某些實施方案中，可使用封閉試劑去除殘留的氰基。然而，向所述反應混合物中加入封閉試劑會驅動所述軛合反應逆向進行，使所述軛合物產量降低5-12％。現已對多種封閉試劑對產量的影響進行了研究。用CDAP活化肺炎球菌多糖的Pn 18C多糖，然後將其與醯肼活化的破傷風類毒素(TTH)軛合過夜。將五份所述產物加入水或濃度為0.2M的封閉試劑。孵育4小時後，使用配備有280nm監測器的Waters Ultrahydrogel 2000柱子對所述樣品進行HPSEC分析(圖2)。如表3所示，通過測定對總蛋白15.5分鐘軛合物峰的％面積，即軛合物峰加上游離TTH峰(22分鐘)，來測定每種樣品的軛合物產率。儘管在某些實施方案中，需要使用封閉試劑猝滅所剩餘的殘留氰基，但通常還有優選地避免使用封閉試劑從而避免軛合物產率的降低。
表3
為了在不使用封閉試劑的條件下去除所述軛合產物中殘留的氰基，需要延長該軛合時間。優選地，該軛合反應是在約0℃至約5℃進行36-48小時，最優選為在4℃進行36小時，然後在約20℃至約25℃再進行18-24小時，最優選為在約20℃至約24℃進行18小時，使得所殘留的氰基與水反應並分解。根據需要，可使用更長或更短的軛合反應時間和/或更高或更低的軛合反應溫度，或者在不同時間的不同步驟順序和溫度來進行反應。然而，所需要的是，至少在起始的時候在低溫，優選為從約0℃至約5℃，更優選為約4℃進行所述軛合反應，從而降低所述軛合物沉澱的程度。
由於所述軛合產物具有較高的軛合產率和較高的免疫原性，因此就沒有必要在未軛合多糖中對所述軛合物進行的諸如柱層析和/或硫酸銨沉澱的純化步驟了。然而，在某些實施方案中還是需要進行一或多步純化。
軛合物兩種反應物的每個分子都含有多個反應基團。活化的多糖分子可以反應並形成與不止一個活化蛋白的分子連接的不止一個鍵。類似地，活化蛋白分子也可反應並形成與不止一個活化多糖的分子連接的不止一個鍵。因此，所述軛合物是具有多種交聯基質型晶格結構的混合物。例如，可以只有單鍵，或2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29或30個或更多的鍵。優選地，可對多糖與蛋白之間連接鍵的平均數進行調節。所述連接鍵的平均數依賴於多糖的類型，蛋白的類型，軛合方法，反應條件等等。通常存在1至約2，3，4或5個連接鍵，從而避免了由過度軛合造成的所述蛋白對免疫系統刺激能力的幹擾，也不會引起所述多糖結構的改變。然而，在某些實施方案中，高於5個連接鍵的情況也是可以容忍甚至是需要的。
軛合反應完成之後，可使用任意適合的方法對所述軛合物進行純化。純化的目的是為了去除未反應的多糖，蛋白或小分子反應副產物。純化的方法包括超濾，分子排阻色譜，密度梯度離心，疏水作用色譜，硫酸銨分級分離等等本領域公知的方法。如上所述，優選實施方案中的所述軛合反應的產率較高，且產生了更少的不需要的小分子反應副產物。因此，無需進行純化，或僅需要進行較低程度的純化。根據需要，可將所述軛合物濃縮或稀釋，或加工成任意適於在藥物組合物中進行使用的形成。
治療方法可將由所述優選實施方案製備的軛合物以適合形式的免疫有效劑量對個體進行給藥從而治療和/或預防感染性疾病。在此使用的術語「個體」是指諸如哺乳動物的動物。例如，哺乳動物包括了人類，靈長類，狗，貓，綿羊，牛，山羊，豬，馬，小鼠，大樹，兔子，豚鼠等等。術語「個體」，「患者」和「宿主」可以交替使用。在本文中，術語「免疫有效」劑量的所述軛合物疫苗是指適於引起免疫反應的劑量。該具體的劑量依賴於需要進行治療個體的年齡，體重和臨床狀態以及給藥的方法。本領域所屬技術人員應該很容易對適合的劑量進行確定。
與常規疫苗相比，含有優選實施方案的軛合物疫苗的藥物組合物具有多種優點，包括增強較弱免疫原性抗原的免疫原性，有效地將抵抗原的用量，降低加強免疫的頻率，提高效率，對免疫系統進行優先刺激，或者對免疫應答具有潛在的靶效應。可通過下述的多種方式對個體進行疫苗給藥，包括腸道外(例如，通過腦池內注射和灌輸技術)，皮內，跨膜的，透皮的(包括局部的)，肌肉的，腹膜內的，靜脈的，動脈內的，灶內的，皮下的，口服以及鼻內(例如吸入)方式進行給藥。可通過彈丸注射或連續灌輸，以及例如對疾病或損傷位點的局部給藥進行軛合物疫苗給藥。所述軛合物疫苗可以藥物或生理可接受載體的形式進行給藥。
在本文中，術語「疫苗」涵義廣泛，取其常規含義，包括優選實施方案的軛合物或其他抗原，與佐劑，稀釋劑，賦形劑，載體和其他藥物可接受物質配製而成。術語「藥物可接受的」是指可與諸如細胞，細胞培養物，組織或有機體的生物系統相容的無毒材料。
使用優選實施方案軛合物的免疫方法為個體提供了預防或治療疾病，病症和/或感染的組合物和方法。在本文中，術語「治療」涵義廣泛，取其常規含義，包括治癒性，阻止性，預防性，緩解性和/或改善性的治療。
所述疫苗組合物優選是滅菌的，並含有治療或預防有效量的適於對個體進行給藥的重量單位或體積的所述軛合物。在本文中，術語「藥物可接受的載體」是指適於對個體進行給藥的一或多種相容的固體或液體填充劑，稀釋劑或膠囊材料。術語「載體」是指有機或無機的，天然或合成的，與所述活性成分合併後可以促進應用的成分。所述載體的性質依賴於其給藥方式。生理和藥物可接受的載體包括稀釋劑，填充劑，鹽，緩衝液，穩定劑，增溶劑以及其他本領域公知的材料。
以不存在對所需要的藥物效率造成潛在危害的相互作用的形式，藥物組合物的成分也可以與所述優選實施方案的軛合物進行共混合，以及相互混合。
可適用本領域公知的方法將優選實施方案中的所述軛合物疫苗配製到藥物組合物中。所述疫苗組合物可含有一種或多種佐劑。適合的佐劑包括諸如氫氧化鋁或磷酸鋁的鋁佐劑，弗氏佐劑，BAY，DC-chol，pcpp，單磷醯脂A，CpG，QS-21，霍亂毒素以及甲醯甲硫氨醯肽。參見，例如《疫苗設計，亞基和佐劑方法》Vaccine Design，the Subunit andAdjuvant Approach，1995(M.F.Powell and M.J.Newman，eds.，PlenumPress，N.Y.)。
對個體進行給藥的軛合物疫苗劑量以及給藥方案對醫藥和獸醫領域的所屬技術人員而言是很容易理解的，需要參考諸如預期用途，具體的抗原，佐劑(如果有的化)，年齡，性別，體重，物種，一般情況，以往疾病和/或治療情況，以及給藥方式的因素。根據動物試驗可以確定初始劑量，根據本領域內所接受的諸如標準劑量試驗的實際操作，也可以確定對人給藥的劑量大小。例如，可以從血清抗體水平測試對治療有效劑量進行初步估測。所述劑量依賴於所述軛合物的特異活性，並可通過常規實驗很容易地測定。
在實施治療和/或預防特異的疾病的免疫方案中，可以對個體進行治療有效量軛合物的給藥。在本文中，術語「有效量」是指足以表現出對個體具有有意義好處的治療劑(例如軛合物)或其他活性成分的總量，這些有意義的好處包括對相關臨床狀態(疾病，感染等等)的增強的免疫應答，治療，治癒，預防或緩解；或者是提高的對這些病症治療率，治癒率，預防率或緩解率。當將術語「有效量」用於單獨給藥的單獨治療劑時，該術語指單獨的治療劑。當將該術語用於聯合給藥時，是指無論是合併給藥，依次給藥或同時給藥的條件下，產生所述治療效果的所述組分的合併量。在本文中，短語治療劑的「有效量給藥」是指對所述個體進行所述治療劑的治療，其量與時間足以誘導至少一個反映所述疾病，感染或病症嚴重性的指徵得到了某些改善，優選為持續的改善。
如果患者一段時間間隔的至少兩次都表現出了改善的情況，那麼則認為所述改善是「持續的」。可根據，例如免疫資料，疾病，感染或病症的信號或症狀確定改善的程度。可對反映所述患者疾病程度的多種指徵進行評估來確定治療的量和時間是否是充分的。可以根據所述患者在所述接受治療劑初次劑量給藥之前的檢查情況，或根據從健康患者人群中得到的統計學數據確立所選擇指徵或多種指徵的基線值。如果將所述治療劑給藥用來治療急性症狀，則所述初次劑量應儘可能快地進行實際給藥。直到所述患者表現出對於所選定的指徵或多種指徵的基線值具有改善的時候，治療劑給藥誘導了改善。在治療慢性疾病的過程中，可通過在一段時間，例如一個月，兩個月，三個月或更長，或無限期的重複給藥所述治療劑，從而獲得這種程度的改善。單劑量可足以治療或預防某種疾病。如果需要的話，與所述患者的疾病無關，可在所述相同水平或減少的劑量或頻率進行無限期的治療。一旦治療有所降低或中斷，如果症狀復發，則能以所述原始水平重新開始治療。
通常，所述軛合物提供的為對抗細菌感染接種的有效劑量或治療有效量從約1μg或更低至約100μg或更高，優選從約2，3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，35，40，45或50μg至約55，60，65，70，75，80，85，90或95μg每千克體重。如果所述感染後時間持續的較短，則有效劑量對抗體的需要也可有所降低，因為對所述細菌的增殖而言時間也更短。有效劑量還可依賴於診斷時的細菌量(bacteriaload)。對於治療用途，可以考慮在一段時間內進行多次注射給藥。
可以單劑量或包含一或多次加強給藥的一系列劑量對所述軛合物疫苗進行給藥。例如，嬰兒或兒童可在其一生的早期接受單劑量給藥，然後在1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多年之後接受加強劑量的給藥。所述加強劑量可從已接觸抗原的B細胞中產生抗體，即記憶應答。換言之，加強給藥後，所述軛合物疫苗能在嬰兒或兒童體內引發較高的初級功能抗體反應，並能引起記憶應答，說明由所述軛合物疫苗引起的保護性免疫應答是長期有效的。
可將所述軛合物疫苗配製成液體製劑，進行，例如口服，鼻內，肛門，直腸，含服，陰道，口服，胃內，黏膜，perlinqual，肺泡，牙齦，鼻或呼吸道黏膜給藥。適於這些給藥的形式包括懸液，糖漿和酏劑。可將所述軛合物疫苗配製成腸道外，皮下，皮內，肌肉，腹膜內或靜脈給藥，注射給藥，植入物的緩釋給藥，或通過滴眼劑給藥。適於這些給藥的形式包括滅菌的懸液和乳濁液。這些軛合物疫苗可與諸如滅菌水，生理鹽水，葡萄糖等等適合的載體，稀釋劑或賦形劑混合。還可將所述軛合物疫苗冷凍乾燥。根據所需要的給藥方式和製劑形式，所述軛合物疫苗可含有輔助性物質，例如溼潤劑或乳化劑，pH緩衝劑，凝膠或粘度增強添加劑，防腐劑，調味劑，色素等等。無需進行不適當的實驗，可參考諸如《雷明頓製藥科學與操作》″RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy″，Lippincott WilliamsWilkins，第20版(2003年6月1日)以及《雷明頓製藥科學》″Remington′sPharmaceutical Sciences″，Mack Pub.Co.，第18和第19版(分別在1985年12月和1990年6月出版)的標準材料製備適合的製劑，在此將其全部引用作為參考。這些製劑可包括複合試劑，金屬離子，諸如聚乙酸，聚乙醇酸，水凝膠，右旋糖苷等等的聚合物，脂質體，微乳濁劑，微團(micelles)，單層或多層囊泡，血影(erythrocyte ghosts)或球芽(spheroblasts)。適於脂質體製劑的適合脂類包括但不限於甘油單酯，甘油二酯，硫酯，溶血卵磷脂，磷脂，皂角苷，膽汁酸等等。這些附加成分的存在會影響所述物理狀態，溶解性，穩定性，體內釋放率，以及體內清除率，從而根據目的應用進行選擇，由此對所述載體的性質進行改造以適合所選擇的給藥途徑。
優選地，以液體懸液或冷凍乾燥產物的形式提供所述軛合物疫苗。適合的液體製劑包括例如緩衝至選定pH值的等滲水溶液，懸液，乳濁液，或粘性組合物。透皮的製劑包括洗液，凝膠，噴霧劑，藥膏或其他適合的技術手段。如果需要進行鼻內或呼吸道(黏膜)給藥(例如噴霧法或吸入法)，組合物則為能夠通過擠壓噴霧器，泵分配器或氣霧劑分配器進行使用的形式。氣霧劑通常都採用烴的方式進行壓縮。泵分配器可優選地對測定的劑量或具有特定顆粒大小的藥劑進行分配，如下所述。
當以溶液，懸液和凝膠形式存在時，除了所述活性成分外，所述軛合物的配方通常含有大量的水(優選為純淨水)。還可以具有少量的其他成分，例如pH調節劑，乳化劑，分散劑，緩衝劑，防腐劑，溼潤劑，膠凝劑，色素等等。
優選地，所述組合物與受者的血液或其他體液是等滲的。可使用酒石酸鈉，丙二醇或其他無機或有機溶質使得所述組合物具有等滲性。特別優選的是氯化鈉。還可以使用緩衝劑，例如乙酸及其鹽，檸檬酸及其鹽，硼酸及其鹽，以及磷酸及其鹽。胃腸外載體包括氯化鈉溶液，Ringer′s葡萄糖，葡萄糖和氯化鈉，乳酸鹽Ringer′s或不揮髮油。靜脈載體包括液體和營養補充劑，電解質補充劑(例如那些基於Ringer′s葡萄糖的補充劑)等等。
使用藥物可接受的增稠劑可在選定的水平保持所述組合物的粘度。甲基纖維素是優選的，因為其較容易和廉價得到，且易於使用。其他適合的增稠劑包括黃原膠，羧甲基纖維素，羥丙基纖維素，卡波姆(carbomer)等等。所述增稠劑的優選濃度可依賴於所選擇的所述製劑。重要的是使用的量能獲得所選定粘度。通常可優選地從加入這些增稠劑的溶液中製備粘性組合物。
可使用藥物可接受的防腐劑來提高所述組合物的保存期。雖然有多種防腐劑，例如對羥苯甲酸酯(parabens)，硫柳汞(thimerosal)，氯丁醇(chlorobutano1)或氯苄烷銨(benzalkonium chloride)可以使用，但苯甲醇是較為適合的。儘管會隨所選擇的製劑的變化而發生改變，所述防腐劑的適合濃度可從0.02％至2％(基於所述總重量)。
還可以將所述軛合物進行肺部給藥。當吸入並穿過肺上皮層進入血流時，可對哺乳動物進行所述軛合物的肺給藥。可使用多種針對治療產品進行肺給藥的醫療器械，包括但不限於噴霧器，計量吸入器以及粉末吸入器，這些器械對本領域所屬技術人員是相當熟悉的。這些器械可使用對所述軛合物進行分配的適當配方。通常，除了用於治療中的稀釋劑，佐劑和/或載體之外，每種配方對該種器械都是特異性的，還會涉及適當的促進材料的使用。
為了進行肺部給藥，可將所述軛合物方便地製備成平均顆粒大小從約0.1μm或更低至10μm或更高，更優選為從約0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8或0.9μm至約1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0或9.5μm的用於肺部給藥的顆粒。適於將所述軛合物進行肺部給藥的藥物可接受載體包括諸如海藻糖，甘露醇，木糖醇，蔗糖，乳糖和山梨醇的糖。其他用於所述配方的成分還包括DPPC，DOPE，DSPC和DOPC。還可以使用包括聚乙二醇和諸如環葡聚糖的葡聚糖的天然或合成的表面活性劑。還可以使用膽鹽和其他相關的增強劑，纖維素和纖維素衍生物以及胺基酸。還可以使用脂質體，微膠囊，微球體，內含物複合體以及其他類型的載體。
適合使用噴射或超聲波噴霧器的配方，通常都包括以每毫升溶液含有約0.01或更低至100mg或更高軛合物的濃度，優選為每毫升溶液含有約0.1，1，2，3，4，5，6，7，8，9或10mg至約15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85或90mg的溶解或懸浮於水中的所述軛合物。所述配方還可以包括緩衝液和簡單的糖(例如，用於蛋白穩定以及滲透壓調節)。所述噴霧劑配方還可含有表面活性劑，從而降低或防止在所述氣溶膠形成過程中由溶液霧化引起的表面誘導的所述軛合物的聚集。
適合使用計量吸入器裝置的配方通常都包含精細粉末，該精細粉末含有表面活性劑協助的懸浮於促進劑的本發明化合物。所述促進劑可包括諸如含氯氟烴，氫代含氯氟烴(hydrochlorofluorocarbons)，氫代含氟烴(hydrofluorocarbons)的常規促進劑，以及諸如三氯氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇以及1，1，1，2-四氟乙烷的烴及其組合。適合的表面活性劑包括去水山梨糖醇三油酸酯，大豆卵磷脂和油酸。
適於從粉末吸入裝置中進行分配的配方通常都包含精細研磨的乾粉，所述乾粉含有所述軛合物，可任選地包括促進所述粉末從所述裝置中進行分配的諸如乳糖，山梨醇，蔗糖，甘露醇，海藻糖或木糖醇的填充劑，其劑量通常為約1％重量比或更低至99％或更高重量比的所述配方，優選從約5，10，15，20，25，30，35，40，45或50％重量比至約55，60，65，70，75，80，85或90％重量比的所述配方。
當通過靜脈，經皮，皮下或其他注射方式對所述軛合物進行給藥時，所述軛合物疫苗優選為無熱源，注射可接受的水性液體。具有適合pH，等滲能力，穩定性等等的所述注射可接受溶液的製劑是本領域內公知的。優選的適於注射的藥物組合物優選的含有諸如氯化鈉注射液，Ringer’s注射液，葡聚糖注射液，葡聚糖和氯化鈉注射液，乳酸Ringer’s注射液的載體，或其他本領域內公知的等滲載體。
根據不同的因素所述注射的持續時間也有所變化，包括從幾秒或更短時間的單次注射給藥到1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23或24小時或更長時間的連續靜脈給藥。
可通過液體或凝膠，或作為植入體或裝置對所述軛合物進行局部，系統或區域地給藥。
優選實施方案中的軛合物，或優選實施方案中的軛合方法對於製備治療多種細菌感染的疫苗而言非常有用，這些細菌感染包括由幽門螺旋桿菌(Helicobacter Pyloris)，Borelia burgdorferi，嗜肺性軍團病菌(Legionella pneumophilia)，分支桿菌屬(Mycobacteria sps.)(例如結核分支桿菌(M.tuberculosis)，鳥型分枝桿菌(M.avium)，胞內分枝桿菌(M.intracellulare)，堪薩斯分支桿菌(M.kansasii)，戈氏分枝桿菌(M.gordonae))，金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)，腦膜炎萘瑟菌(Neisseria meningitidis)，單核細胞增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)，釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes)(A型鏈球菌)，無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae(B型鏈球菌))，鏈球菌(草綠色型，viridans group)，糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis)，牛鏈球菌(Streptococcus bovis)，鏈球菌(厭氧型(anaerobicsps.))，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)，致病的彎曲桿菌屬(Campylobacter sp.)，腸球菌屬(Enterococcus sp.)，流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)，炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)，白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)，棒狀桿菌屬(corynebacterium sp.)，豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，產氣莢膜梭狀芽孢桿菌(Clostridium perfringers)，破傷風梭狀芽胞桿菌(Clostridium tetani)，產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)，肺炎克氏桿菌(Klebsiellapneumoniae)，Pasturella multocida，擬桿菌屬(Bacteroides sp.)，具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)，念珠狀鏈桿菌(Streptobacillusmoniliformis)，蒼白梅毒螺旋體(Treponema pallidium)，雅司螺旋體(Treponema pertenue)，細螺旋體屬(Leptospira)，以色列放線菌(Actinomyces israelli)引起的感染。
可使用優選實施方案的某些方法製備疫苗，所述疫苗可對個體進行治療或免疫，從而抵抗諸如哺乳動物肉瘤和癌瘤的癌症，例如纖維肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，軟骨肉瘤，成骨肉瘤，脊索瘤，血管肉瘤，內皮肉瘤，淋巴管肉瘤，淋巴管內皮肉瘤，滑膜瘤，間皮瘤，尤因氏瘤，平滑肌肉瘤，橫紋肌肉瘤，結腸癌，胰腺癌，乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，扁平細胞癌，基底細胞癌，腺癌，汗腺癌，皮脂腺癌，乳頭狀癌，乳頭狀腺癌，囊腺癌，髓樣癌，支氣管癌，腎細胞癌，肝癌，膽管癌，絨毛膜癌，serminoma，胚胎性癌，維爾姆斯氏腫瘤(Wilms′tumor)，子宮頸癌，睪丸腫瘤，肺癌，小細胞肺癌，膀胱癌，上皮癌，神經膠質瘤，星形細胞瘤，成神經管細胞瘤，顱咽管瘤，室管膜瘤，松果體瘤，成血管細胞瘤，聽神經瘤，少突神經膠質瘤，腦脊膜瘤，黑素瘤，成神經細胞瘤，視網膜母細胞瘤；以及白血病，例如急性淋巴細胞性白血病和急性髓細胞性白血病(原始粒細胞性白血病，前髓細胞性白血病，粒單核細胞白血病，單核細胞性白血病以及紅白血病)；慢性白血病(慢性粒細胞性(粒細胞的)白血病以及慢性淋巴細胞性白血病)；以及真性紅細胞增多症，淋巴瘤(何杰金氏病和非何杰金氏病)，多發性骨髓瘤，瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血症以及重鏈病，淋巴細胞增生性疾病，包括自身免疫淋巴細胞增生症候群(ALPS)，慢性成淋巴細胞白血病，毛細胞性白血病，慢性淋巴性白血病，外周T-細胞淋巴瘤，小淋巴細胞淋巴瘤，套細胞淋巴瘤，濾泡性淋巴瘤，伯基特淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)，EB病毒陽性T-細胞淋巴瘤，組織細胞性淋巴瘤，何杰金氏病，彌散攻擊性淋巴瘤，急性淋巴性白血病，T-γ淋巴細胞增生症，皮膚B細胞淋巴瘤，皮膚T細胞淋巴瘤(即蕈樣肉芽腫病)和Szary症候群。
可將所述軛合物與多種目前正在使用或開發中，適於人類或非人類個體的疫苗結合給藥。適於人類患者並對感染性疾病的疫苗包括聯合的白喉和破傷風類毒素疫苗；百日咳全細胞疫苗；滅活的流感疫苗；23價肺炎球菌疫苗；麻疹活疫苗；流行性腮腺炎活疫苗；病毒性風疹活疫苗；卡介苗(BCG)結核疫苗；A型肝炎疫苗；B型肝炎疫苗；C型肝炎疫苗；狂犬病疫苗(例如人二倍體細胞疫苗)；滅活的脊髓灰質炎疫苗；腦膜炎球菌多糖疫苗；四價腦膜炎球菌疫苗；黃熱病活病毒疫苗；滅活的傷寒全細胞疫苗；霍亂疫苗；滅活的日本乙型腦炎疫苗；腺病毒疫苗；巨細胞病毒疫苗；輪狀病毒疫苗；水痘疫苗；炭疽疫苗；天花疫苗以及其他可商業獲得的疫苗和實驗疫苗。
可以採用試劑盒的形式為進行給藥的醫生或其他健康關懷職業人員提供所述軛合物。所述試劑盒是具有容器的包裝，其含有對個體進行軛合物疫苗給藥的所述軛合物疫苗以及操作指導。任選地所述試劑盒可包含一或多種其它治療試劑。任選地所述試劑盒可包含一或多種診斷工具及其使用指導。例如，其可包括含有2種或更多疫苗的混合疫苗(cocktail vaccine)，或含有不同疫苗或治療劑的單獨的藥物組合物。所述試劑盒可包含進行連續給藥或順序給藥所述軛合物疫苗的分別劑量。所述試劑盒可包含適合的給藥裝置，例如注射器，吸入裝置等等，以及所述治療劑的給藥指導。所述試劑盒可選地包含關於將所包括的任意或全部治療劑進行儲存，重組(如果可用的話)，以及給藥的指導。所述試劑盒可包括反映需要對個體進行給藥數量的多個容器。如果所述試劑盒含有第一和第二個容器，則存在多個。
實驗材料破傷風類毒素(TT)得自於Lederle Vaccines，Pearl River，NY andSerum Institute of India，Pune，印度。A型和C型腦膜炎球菌多糖(分別得Mn A多糖和Mn C多糖)得自Bio-Manguinhos，Rio de Janeiro，巴西。Mn A多糖還可來自SynCo Bio Partners，阿姆斯特丹，荷蘭。Mn W135和Y PS′s得自Aventis Pasteur。血清型為1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F的肺炎球菌(Pn)多糖得自Lederle Vaccines。B型流感嗜血桿菌的多糖(PRP或Hib多糖)得自Lederle Vaccines。傷寒桿菌Vi多糖得自Aventis Pasteur。血清型為III和V的B型鏈球菌多糖可根據公開試驗指南從培養基中分離得到。參見Carey等人，Infection and Immunity 1980；28195-203。肼，碳醯肼(carbohydrazide)，己二酸二醯肼(ADH)，1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，N-(2-羥乙基)哌嗪-N`-(2-乙磺酸)(HEPES)，高碘酸鈉，硼氫化鈉，氰基硼氫化納，4-氰-二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)和1-氨基-2，3-丙二醇購買自Sigma/Aldrich化學公司。TNBSA(2，4，6-三硝基苯磺酸)和BCA(雙金雞納酸)(bicinchoninic acid)分析試劑盒購自Pierce。
方法通過本文所述方法用於與蛋白進行軛合作用的細菌多糖包括血清型為A，C，W135和Y的腦膜炎球菌多糖，血清型為1，2，3，4，5，6B，7F，8，9N，9V，10A，11A，12F，14，15B，17F，18C，19A，19F，20，22F，23F和33F的肺炎球菌多糖，B型流感嗜血桿菌的多糖(PRP或Hib多糖)，傷寒桿菌Vi多糖，以及血清型為III和V的B型鏈球菌多糖。以下通過三種常見方法A，常見方法B和常見方法C對多糖與蛋白的軛合作用進行描述。
常見方法A醛活化的多糖與醯肼活化的蛋白反應(還原氨基化軛合)
在pH6.5，存在有EDC的條件下，用肼或己二酸二醯肼活化破傷風類毒素，然後用pH約為10.5的30mM NaCl，3mM Na2CO3進行緩衝液更換。用NaIO4活化多糖，在4℃，pH7.5條件下用10mM HEPES進行緩衝液更換。以2∶1至1∶2的比例和1-40mg/ml的濃度，將醯肼活化的TT與醛活化的多糖在pH6.5-7.5，4-40℃的條件下反應過夜。然後加入NaBH4(相當於初始反應物中所述醛基的10倍摩爾數)，保持6小時，將所述C＝N雙鍵還原成C-N單鍵，並將所述未反應的醛基還原成醇。使用12-14kDa的分子量排阻膜，用鹽水，10mM HEPES，pH7.5，以及1mM EDTA對所述溶液進行緩衝液更換。通過Lowry分析方法測定總蛋白含量(參見Pierce Catalog 2003-2004，306頁)。針對不同的細菌多糖可採用不同的化學分析方法測定總多糖含量，例如對Mn A型和C型多糖採用間苯二酚分析方法(Monsigny等人，Anal.Biochem.1988；175525-530)，對Pn多糖採用蒽酮分析方法(Keleti等人，《生物科學微量測定方法手冊61卷己糖(蒽酮)》Handbook ofmicromethods for the biological sciences.61.Hexoses(Anthrone).73頁.Van Nostrand Reinhold Co.，New York，1974)，對Mn A型多糖，Hib多糖和含磷的Pn多糖採用磷分析方法，對Mn W135和Y多糖和含乙二醇的Pn多糖採用紫色分析方法(purpald assay)(Lee等人，Anal.Biochem.2001；29673-82)。
常見方法B氰酸鹽活化的多糖與醯肼活化的蛋白反應(氰基化軛合)在pH6.5，存在有EDC的條件下，用肼或己二酸二醯肼活化破傷風類毒素，然後用pH約為10.5的30mM NaCl，3mM Na2CO3進行緩衝液更換。在三乙醇胺存在的條件下，在20-24℃，用CDAP對多糖活化2-2.5分鐘。以2∶1至1∶2的比例和0.2-1mg/ml的濃度，將醯肼活化的TT與氰酸鹽活化的多糖在pH6.5-7.5的條件下反應。在4℃反應36小時之後，將所述混合物在20-24℃再孵育18小時。延長的孵育可確保所剩餘的未反應氰酸鹽基團降解。使用12-14kDa的分子量排阻膜，用鹽水，10mM HEPES，pH7.5，以及1mM EDTA對所述溶液進行緩衝液更換。參照常見方法A，通過Lowry分析方法測定總蛋白含量。如常見方法A中所述，針對不同的細菌多糖可採用不同的化學分析方法測定總多糖含量，例如對Mn A型和C型多糖採用間苯二酚分析方法，對Pn多糖採用蒽酮分析方法，對Mn A型多糖，Hib多糖和含磷的Pn多糖採用磷分析方法，對Mn W135和Y多糖和含乙二醇的Pn多糖採用紫色分析方法。
常見方法C醯肼活化的多糖與醛活化的蛋白反應(還原氨基化軛合)在pH6.5，存在有EDC的條件下，用1-氨基-2，3-丙二醇(APDO)與破傷風類毒素反應，然後用pH約為10.5的30mM NaCl，3mMNa2CO3進行緩衝液更換。將TT-APDO與NaIO4反應產生醛基，然後用pH約為10.5的30mM NaCl，3mM Na2CO3進行緩衝液更換。有三種製備醯肼活化多糖的方法a)將多糖與NaIO4反應然後與己二酸二醯肼反應，隨後用NaBH4還原(還原氨基化)；b)用CDAP活化多糖，然後與己二酸二醯肼反應(氰基化軛合反應)；或c)在EDC存在的條件下，將多糖與己二酸二醯肼反應(碳二亞胺反應)。以2∶1至1∶2的比例和1-5mg/ml的濃度，將醛活化的TT與醯肼活化的多糖在pH6.5-7.5，4-40℃的條件下反應18小時。然後加入NaBH4(目當於初始反應物中所述醛基的10倍摩爾數)，保持64時，將所述C＝N雙鍵還原成C-N單鍵，並將所述未反應的醛基還原成醇。使用12-14kDa的分子量排阻膜，用鹽水，10mM HEPES，pH7.5，以及1mM EDTA對所述溶液進行緩衝液更換。參照常見方法A，通過Lowry分析方法測定總蛋白含量。如常見方法A中所述，針對不同的細菌多糖可採用不同的化學分析方法測定總多糖含量，例如對Mn A型和C型多糖採用間苯二酚分析方法，對Pn多糖採用蒽酮分析方法，對Mn A型多糖，Hib多糖和含磷的Pn多糖採用磷分析方法，對Mn W135和Y多糖和含乙二醇的Pn多糖採用紫色分析方法。
反應物，活化多糖和軛合產物的物理-化學分析高效液相分子排阻色譜圖(HPSEC)將蛋白，多糖和軛合產物的樣品與鹽水以0.5mL/分鐘的流速流經配備有Waters Ultrahydrogel 2000或Ultrahydrogel線性柱子的DionexHPLC系統，該系統使用Chromelean軟體，在280nm和206nm的UV檢測器，以及Waters 2410微分折射計(RI檢測器)。在280nm使用UV檢測器對含蛋白質物質以及含有芳香部分的化合物的信號進行監測。在206nm使用UV檢測器通過羰基的存在對所述蛋白和多糖進行測定，而所述RI檢測器則負責測定所述蛋白，多糖，軛合物及鹽的信號。
多糖-蛋白軛合物在小鼠中的免疫原性對小鼠進行的免疫在第0天和第14天，或在第0天，第14天和第28天，以1μg/劑量的多糖或多糖-蛋白軛合物對小鼠(NIH-Swiss；每組10隻)進行免疫，所述多糖-蛋白軛合物由常見方法A(Mn A多糖-TT軛合物以及Mn C多糖-TT軛合物)，常見方法B(Pn 6B多糖-TT以及Pn 7F多糖-TT軛合物)和常見方法C(Pn 9V多糖-TT軛合物)製備，並分別在第28天和第42天收集抗血清。使用ELISA對由不同的天然多糖引起的抗體水平進行測定。
ELISA方法使用100μL含多糖(對Mn A型和C型，以及Pn 7F多糖而言濃度為5μg/mL；對Pn 6B多糖而言濃度為2μg/mL；對Pn 9V多糖而言濃度為2.5μg/mL)和甲基化人血清白蛋白(對Mn A型和C型，Pn 6B以及Pn 7F多糖而言濃度為5μg/mL；對Pn 9V多糖而言濃度為2.5μg/mL)混合的包被溶液對Immunolon 1板(Dynatech)進行包被18小時。用150μL洗滌緩衝液(含有0.05％Tween 20，0.02％NaN3的PBS)洗滌三次之後，向每一個孔中加入100μL從1/200(採用含有PBS，4％新生小牛血清，0.02％NaN3(在肺炎球菌的情況中細胞壁多糖的濃度為2μg/mL)稀釋)開始倍比連續稀釋的特定的抗血清樣品和對照血清(濃度為指定的3200單位/mL抗多糖抗體；兩份)。過夜孵育後，將該板洗滌三次，再和100μL與鹼性磷酸鹽軛合的羊抗鼠IgG Fc(在稀釋緩衝液中稀釋為1/3000)孵育2小時。將該板洗滌(3×150μL)後，將該板與100μL對-磷酸硝基苯基酯(1mg/mL對-磷酸硝基苯基酯溶解於1MTris，pH 9.8，0.3mM MgCl2)孵育30分鐘，加入50μL 1N NaOH中止反應。通過讀板器測定ELISA讀數，從該ELISA讀數以及相同板中共分析的對照血清的標準曲線，計算出所述抗血清樣品的抗多糖抗體水平。計算每組小鼠的抗體水平的幾何平均值。
特定實施例常見方法A-C型腦膜炎球菌軛合物對TT進行活化使其含有醯肼基在pH6.5，20-24℃，存在有20mM EDC，0.1M MES的條件下，用0.42M肼或己二酸二醯肼活化破傷風類毒素(4.2mg/mL)。反應4小時之後，用1N NaOH中止反應，所述反應混合物的pH會升高至7.5-10。然後使用12-14kDa的分子量排阻膜，在4℃，用pH約為10.5的30mMNaCl，3mM Na2CO3進行緩衝液更換。以牛血清白蛋白作為標準，採用Lowry分析(參見Pierce Catalog 2003-2004，306頁)方法測定了所得TT-醯肼樣品中的蛋白濃度。以己二酸二醯肼作為標準，採用Vidal，J.Immunol.Methods 1986；86155-156中所述的TNBS方法測定了其醯肼含量。由此製備的TT的活化程度為每TT分子中約有50個醯肼基。
對Mn C型多糖進行活化使其含有醛基在20-24℃，將Mn C型多糖(10mg/mL)與6mM NaIO4反應4小時。然後使用12-14kDa的透析膜，在4℃，用pH約為7.5的10mM HEPES透析所述樣品。如Monsigny等人，在Anal.Biochem.1988；175525-530中所述，使用N-乙醯神經氨酸作為標準，Mn C型多糖/N-乙醯神經氨酸的校正因子為1.104/1，通過間苯二酚方法測定了所得活化多糖的濃度。以葡萄糖作為標準，使用BCA(Pierce Catalog 2003-2004，241頁和305頁)方法測定了所述活化多糖中的醛含量。通過該方法製備的活化Mn C型多糖的活化程度為每80個單體中約有一個醛基。
活化的Mn C型多糖與活化的TT的軛合通過冷凍乾燥與在水中重新溶解，將含醯肼的TT調為25mg/mL的等份。通過冷凍乾燥以及在pH7.5的0.2M HEPES，30mM EDTA中重新溶解，將含醛的Mn C型多糖調為25mg/mL的等份。將所述活化的TT溶液加入等體積的活化Mn C型多糖溶液中並攪拌。將所述反應混合物在20-24℃孵育18小時。然後用NaBH4(相當於所述活化多糖中初始醛基摩爾數的10倍)處理6小時。使用12-14kDa的分子量排阻膜，用鹽水，pH7.5的10mM HEPES以及1mM EDTA對所述溶液進行緩衝液更換。以牛血清白蛋白作為標準，使用Lowry分析方法測定總蛋白。以N-乙醯神經氨酸作為標準，使用間苯二酚的方法測定了總Mn C型多糖的含量，參照Monsigny等人，Anal.Biochem.1988；175525-530。
使用肼或己二酸二醯肼作為間隔物，製備了4種Mn C型多糖-TT軛合物。圖3所示為這些軛合物的HPSEC洗脫圖譜(280nm監測)。在這些洗脫圖譜中可觀察到輕微的漂移以及在22.5-25分鐘未軛合游離蛋白的右肩峰。
通過在所述軛合產物中蛋白的C18顆粒吸附方法，然後將HPSEC上清中的糖信號與已知濃度的活化Mn C型多糖的糖信號進行比較，測定了未軛合的游離Mn C型多糖(圖4和圖5)。為了估計所述軛合反應的產量，將所述軛合產物稀釋成濃度約為1mg/mL的Mn C型多糖。在溫和攪拌的條件下，將100μL所述溶液與250μL活化的C18顆粒混合併孵育1小時。離心後收集上清液，用100μL鹽水洗滌所述C18凝膠兩次。用鹽水將上清液與洗滌液的組合調節至333μL，並流經0.2μm的膜微過濾器。將所得濾液與0.033，0.067和0.134mg/mL的活化MnC型多糖的標準濃度一同進行HPSEC分析，這些樣品分別得到的糖信號面積為19.4，4.8，9.2和18.4。以標準曲線為0.141mg/mL對所得濾液的糖濃度進行計算，其相當於所述初始樣品體積的3.3倍。因此所述初始樣品含有0.465mg/mL(0.141mg/mL×3.3)的游離Mn C型多糖。通過改進的間苯二酚分析方法測定的總Mn C型多糖的濃度為1.131mg/mL。估計其產率為約60％(100％×(1-0.465/1.131))。
核對條件Q＞Qnop。
根據得到的值，我們可以看到該條件是滿足的(36,87％＞33％)，且該受控塊狀物與含有有價值的成分的塊狀物的工藝股有關。
方法實施例2將包含兩種主要組分-赤鐵巖和石英巖的塊狀物進行微波電磁場作用2秒鐘。在輻射和微波場作用下的塊狀物的物理參數列於表2中。
表2
有價值的成分的閾值含量為42％的塊狀物的穩態溫度值通過下面表達式(27)來計算TUnop=UOcrQnop+TOc(1-Qnop)crQnop+c(1-Qnop)=]]>=279,51596300,42+273,059850(1-0,42)6300,42+850(1-0,42)=275,3142K.]]>在控制時間Δtk結束時，其由下面表達式(26)給出
對Mn A型多糖進行活化使其含有醛基在20-24℃，將Mn A型多糖(10mg/mL溶解於25mM HEPES中，pH7.4)與6mM NaIO4反應4小時。然後使用12-14kDa的透析膜，在4℃，用pH 7.4的10mM HEPES透析所述樣品。通過磷分析方法，對所得活化多糖的濃度進行了測定，參見Keleti等人，《生物科學微量測定方法手冊70卷磷(總磷)》Handbook of micromethods for the biologicalsciences.70.Phosphorus (Total).84頁.Van Nostrand Reinhold Co.，NewYork，1974。以葡萄糖作為標準，使用BCA(Pierce Catalog 2003-2004，241頁和305頁)方法測定了所述活化多糖中的醛含量。通過該方法製備的活化Mn A型多糖的活化程度為每80-110個單體重複單位中約有一個醛基。
活化的Mn A型多糖與活化的TT的軛合通過冷凍乾燥與在水中重新溶解，將含醯肼的TT調為10mg/mL的等份。通過冷凍乾燥與在pH7.5的0.2M HEPES，30mM EDTA中重新溶解，將含醛的Mn C型多糖調為10mg/mL的等份。將所述活化的TT溶液加入等體積的活化Mn A型多糖溶液中並攪拌。將所述反應混合物在20-24℃孵育18小時。然後用NaBH4(相當於所述活化多糖中初始醛基摩爾數的10倍)處理6小時。使用12-14kDa的分子量排阻膜，用鹽水，pH7.5的10mM HEPES以及1mM EDTA對所述溶液進行緩衝液更換。以牛血清白蛋白作為標準，使用Lowry分析方法測定總蛋白。通過磷分析方法，對所得活化多糖的濃度進行了測定，參見Keleti等人，《生物科學微量測定方法手冊70卷磷(總磷)》Handbook ofmicromethods for the biological sciences.70.Phosphorus(Total).84頁.Van Nostrand Reinhold Co.，New York，1974。製備了幾種Mn A型多糖-TT軛合物製劑。這些軛合物中的一種與所述活化的TT的HPSEC圖譜如圖6所示。
Mn A型多糖-TT軛合物的免疫原性在第0天和第14天，以1μg多糖/劑量，分別將這些Mn A型多糖-TT軛合物和天然Mn A型多糖用來免疫每組10隻的小鼠。假定參考血清的水平為3200單位/mL，第二次注射後兩周，天然多糖對照組所誘導的抗體水平(單位/mL)的幾何平均值為79單位/mL，所述軛合物組為11,000-47,000(表5)。與所述天然Mn A型多糖對照相比，在小鼠中所述軛合物誘導了169-595倍的抗-Mn A型多糖特異性抗體。
表5
a.用1μg/劑天然Mn A型多糖或所述4種Mn A型多糖-TT軛合物的第二次免疫後兩周小鼠分組(每組10隻)的抗-Mn A型多糖抗體水平的幾何平均值(與抗-Mn A型多糖抗體水平為3200單位/mL的參考血清相比)與1SD置信區間。
方法B-6B型肺炎球菌軛合物對TT進行活化使其含有醯肼基在pH6.5，20-24℃，存在有20mM EDC，0.1M MES的條件下，用0.42M肼活化破傷風類毒素(4.2mg/mL)。反應4小時之後，用1NNaOH中止反應，所述反應混合物的pH會升高至7.5-10。然後使用12-14kDa的分子量透析膜，在4℃，用pH約為10.5的30mM NaCl，3mM Na2CO3進行緩衝液更換。以牛血清白蛋白作為標準，採用Lowry分析(參見Pierce Catalog 2003-2004，306頁)方法測定了所得TT-醯肼樣品中的蛋白濃度。以己二酸二醯肼作為標準，採用Vidal，J.Immunol.Methods 1986；86155-156中所述的TNBS方法測定了其醯肼含量。由此製備的TT的活化程度為每TT分子中約有50個醯肼基。
對Pn 6B型多糖進行活化使其含有氰基在20-24℃，在存在有38μL 0.2M三乙醇胺的條件下，用38μLCDAP(100mg/mL溶解於乙腈)將Pn 6B型多糖(0.4mL，10mg/mL)活化2-2.5分鐘。將所述活化的多糖與5mL冰預冷的pH7.5的0.2M HEPES，30mM EDTA混合，立即用於軛合。
活化的Pn 6B型多糖與活化的TT的軛合將所述活化的多糖加入到2mg活化的TT(冰預冷的，0.5mL，4mg/mL)中；攪拌。在伴隨輕柔振蕩在4℃孵育36小時之後，將所述反應混合物在20-24℃再孵育18小時。延長的孵育時間可確保任意殘留未反應的氰酸鹽基團的降解。使用12-14kDa的分子量排阻膜，用鹽水，pH7.5的10M HEPES，1mM EDTA對所述溶液進行緩衝液更換。使用Lowry分析方法(參見Pierce Catalog 2003-2004，306頁)測定總蛋白。採用蒽酮分析方法測定所述總多糖含量，參見Keleti等人，《生物科學微量測定方法手冊61卷己糖(蒽酮)》Handbook of micromethods forthe biological sciences.61.Hexoses(Anthrone).73頁.Van Nostrand在運行20分鐘後，對反應器內的淤漿進行取樣，離心分離後使用GF/B濾紙吸濾，進行固液分離。吸濾後，使用原子吸光法分別測定濾液中的鉛濃度和過濾後的土壤中的鉛的含有濃度。作為對照系統，如圖15和圖16所示，將圖13和圖14的裝置的兩端的壁面拆除，並通過邊長10cm的格框固定使得陽離子交換平膜(アストム公司製造的NEOSEPTACMB)的有效面積達到1.44m2，在其外側設置容積為200L的陽極區，浸漬10根與被驗系統中所使用的相同陽極(每次各5根)，填充作為反應液的5％的硫酸液。在反應器容器中，設置10個與被驗系統所使用的相同的陰極。其他的條件與被驗系統相同，在恆電流運行20分鐘後測定鉛濃度。結果如表10所示。表10鉛汙染土壤的電解析出除去試驗結果
(*分配到電極上的鉛重量分配比是通過與添加的土壤中的鉛重量的差計算得到的。)由表10可知，通過用隔膜單元代替平膜並在其周圍設置陰極，即使是大型的反應器，也能夠有效地進行鉛的電解析出，在附著在土壤中的鉛中，98％或以上附著到電極上，從而從土壤和間隙水中除去。像這樣，通過使用本發明，對於固體被汙染物中所包含的鉛，可以得到比現有技術更好的效果。錫汙染土壤的電解析出除去試驗將圖13和圖14所示的體積為2000L的方形反應器改造成如圖15Methods 1986；86155-156中所述的TNBS方法測定了其醯肼含量。由此製備的TT的活化程度為每TT分子中約有50個醯肼基。
對Pn 7F型多糖進行活化使其含有氰基在20-24℃，在存在有38μL 0.2M三乙醇胺的條件下，用38μLCDAP(100mg/mL溶解於乙腈)將Pn 7F型多糖(0.4mL，10mg/mL)活化2-2.5分鐘。將所述活化的多糖與5mL冰預冷的pH7.5的0.2M HEPES，30mM EDTA混合，立即用於軛合。
活化的Pn 7F型多糖與活化的TT的軛合將所述活化的多糖加入到2mg活化的TT(冰預冷的，0.5mL，4mg/mL)中並進行攪拌。在伴隨輕柔振蕩在4℃孵育36小時之後，將所述反應混合物在20-24C再孵育18小時。延長的孵育時間可確保任意殘留未反應的氰酸鹽基團的降解。使用12-14kDa的分子量排阻膜，用鹽水，pH7.5的10M HEPES，1mM EDTA對所述溶液進行緩衝液更換。使用Lowry分析方法(參見Pierce Catalog 2003-2004，306頁)測定總蛋白。採用蒽酮分析方法測定所述總多糖含量，參見Keleti等人，《生物科學微量測定方法手冊61卷己糖(蒽酮)》Handbook ofmicromethods for the biological sciences.61.Hexoses(Anthrone).73頁.Van Nostrand Reinhold Co.，New York，1974。所述Pn 7F型多糖-TT和所述活化的TT的HPSEC圖譜如圖8所示。
Pn 7F型多糖-TT軛合物的免疫原性在第0天，第14天和第28天，以1μg多糖/劑量，分別將如上製備的Pn 7F型多糖-TT軛合物和天然Pn 7F型多糖(對照)用來免疫每組10隻的小鼠。假定所述參考血清的水平為3200單位/mL，第三次注射後兩周，天然Pn 7F型多糖對照組所誘導的抗體水平(單位/mL)的幾何平均值為17單位/mL，而所述Pn 7F型多糖-TT軛合物組則為17,077單位/mL(表7)。與所述天然Pn 7F型多糖對照相比，在小鼠中所述軛合物誘導了1,005倍的抗-Pn 7F型多糖特異性抗體。
最先商業化的Hib軛合物，多聚核糖基核糖醇磷酸白喉類毒素軛合物(PRP-D)通過6-碳間隔物、己二酸二醯肼(ADH)連接於白喉類毒素的部分大小減少的Hib多糖，使用的是Schneerson等人的方法，J.Exp.Med.1980；152361-376。在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)存在的條件下，使用ADH以該方法進行反應得到了白喉類毒素的ADH衍生物。然後通過使用CNBr在所述羥基上產生氰基來活化所述His多糖。將所活化的多糖與所述ADH-類毒素(氰基化軛合)軛合，但該方法產生的連接不穩定，而且所述軛合物還具有溶解性的問題。
隨後對Robbins軛合化學進行了改進，使得所述ADH間隔物首先被加在所述多糖上，然後在EDC(碳二亞胺反應)存在的條件下，將該多糖軛合於純化的蛋白。參見Chu等人，Infect.Immun.1983；40245-256；Schneerson等人，Infect.Immun.1986，52519-528。這一改進提高了軛合效率和產物的溶解性。多聚核糖基核糖醇磷酸破傷風蛋白軛合物(PRP-T)疫苗就是利用這一改進的化學方法共價地將Hib多糖連接於破傷風類毒素(參見表1)。
多聚核糖基核糖醇磷酸交聯反應突變體白喉類毒素軛合物(PRP-CRM)疫苗，也稱為嗜血流感桿菌b型寡糖軛合物(HbOC)，並不含有His多糖。相反，它利用的是在核糖醇部分中通過乙二醇官能性的高碘酸氧化衍生得到的約20個重複單位的寡糖。然後在氰基硼氫鈉(還原氨基化)存在的條件下，將所述氧化的寡糖直接連接於CRM197，其是從白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)C7(β197)的培養物中分離到的一種白喉毒素的無毒性突變體。參見Anderson等人J.Immunol.酮)》Handbook of micromethods for the biological sciences.61.Hexoses(Anthrone).73頁.Van Nostrand Reinhold Co.，New York，1974。以己二酸二醯肼作為標準，採用Vidal，J.Immunol.Methods 1986；86155-156中所述的TNBS方法測定了其醯肼含量。通過該方法製備的Pn 9V多糖的活化程度為每個糖重複單位中約有1個醯肼基。
活化的Pn 9V型多糖與活化的TT的軛合將含有醯肼的Pn 9V型多糖(1mg；0.236mL，4.233mg/mL)等分與pH7.5的0.067mL 1M HEPES和0.068mL H2O混合。將含醛的TT(1mg；0.286mL，3.38mg/mL)加入到該活化的Pn 9V型多糖(總體積0.67mL；兩種反應物的初始濃度均為1.5mg/mL)中。將所述反應物在20-24℃孵育18小時。將所述反應混合物用NaBH4(相當於所述活化多糖中初始醛基摩爾數的10倍)處理6小時。使用12-14kDa的分子量排阻膜，用鹽水，pH7.5的10mM HEPES以及1mM EDTA對所述溶液進行緩衝液更換。以牛血清白蛋白作為標準，使用Lowry分析方法(參見PierceCatalog 2003-2004，306頁)測定總蛋白。採用蒽酮分析方法測定所述Pn 9V多糖總含量，參見Keleti等人，《生物科學微量測定方法手冊61卷己糖(蒽酮)》Handbook of micromethods for the biological sciences.61.Hexoses(Anthrone).73頁.Van Nostrand Reinhold Co.，New York，1974。所述Pn 9V型多糖-TT和所述活化的TT的HPSEC圖譜如圖9所示。
Pn 9V型多糖-TT軛合物的免疫原性在第0天，第14天和第28天，以1μg多糖/劑量，分別將如上製備的Pn 9V型多糖-TT軛合物和天然Pn 9V型多糖(對照)用來免疫每組10隻的小鼠。假定所述參考血清的水平為3200單位/mL，第三次注射後兩周，天然Pn 9V型多糖對照組所誘導的抗體水平(單位/mL)的幾何平均值為15單位/mL，而所述Pn 9V型多糖-TT軛合物組則為13,291單位/mL(表8)。與所述天然Pn 9V型多糖對照相比，在小鼠中所述軛合物誘導了886倍的抗-Pn 9V型多糖特異性抗體。
比表面積19m3/g平均微孔徑51空隙率39％[表2]
從表2可知，實施例2和實施例3中吸附材料的吸附性能無大的差異，但實施例3的吸附材料崩解，不能維持粒狀形態。認為是實施例2中燒結溫度低，以致於粘土之間不能充分熔融結合，導致吸附材料的強度低。與實施例1相比，除將活性炭的數量變更為表3所示的值以外，以和實施例1同樣的方法製造顆粒吸附材料。這些吸附材料的物性如表3所示。使用該吸附材料，以和實施例1同樣的方法進行吸附試驗和形狀維持性評價，結果如表3所示。表3中還一併表示比較例1和實施例2的結果。
權利要求
1.製備軛合物疫苗的方法，該方法包括將多糖與氧化劑反應，由此得到醛活化的多糖溶液；通過緩衝液更換將所述醛活化的多糖溶液的pH調至約7.0到約8.0；在pH約為6至約7，存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的條件下，將蛋白與肼或己二酸二醯肼反應，由此得到醯肼活化的蛋白溶液；將所述醯肼活化的蛋白溶液的pH升高至約7.0到約11；通過緩衝液更換將所述醯肼活化的蛋白溶液的pH調至約10.0到約11.0；在pH約6至約8的條件下，將所述醛活化的多糖與醯肼活化的蛋白反應，由此得到含有一或多個C＝N雙鍵的軛合物；及將所述軛合物的全部C＝N雙鍵基本還原成C-N單鍵，由此得到能刺激免疫反應的軛合物疫苗。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述氧化劑包括NaIO4。
3.如權利要求1所述的方法，其中用HEPES緩衝液對所述醛活化的多糖溶液進行緩衝液更換。
4.如權利要求1所述的方法，其中用Na2CO3緩衝液對所述醯肼活化的蛋白溶液進行緩衝液更換。
5.如權利要求1所述的方法，其中以約1∶2至約2∶1的比例將所述醛活化的多糖與所述醯肼活化的蛋白反應。
6.如權利要求1所述的方法，其中所述還原包括用NaBH4進行還原。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述多糖選自腦膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感桿菌多糖，傷寒桿菌Vi多糖，以及B型鏈球菌多糖。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述蛋白選自破傷風類毒素，白喉類毒素，CRM197以及腦膜炎球菌蛋白。
9.製備軛合物疫苗的方法，該方法包括將多糖與1-氰-4-二甲基銨吡啶四氟硼酸反應，由此得到氰酸鹽活化的多糖溶液；在pH約為6至約7，存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的條件下，將蛋白與肼或己二酸二醯肼反應，由此得到醯肼活化的蛋白溶液；將所述醯肼活化的蛋白溶液的pH升高至約7.0到約11；通過緩衝液更換將所述醯肼活化的蛋白溶液的pH調至約10.0到約11.0；在pH約6至約8的條件下，將所述氰酸鹽活化的多糖與醯肼活化的蛋白反應，得到能刺激免疫應答的軛合物疫苗。
10.如權利要求9所述的方法，其中所述氰酸鹽活化的多糖與醯肼活化的蛋白的反應步驟是在沒有封閉劑的條件下進行的。
11.如權利要求9所述的方法，其中所述多糖選自腦膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感桿菌多糖，傷寒桿菌Vi多糖，以及B型鏈球菌多糖。
12.如權利要求9所述的方法，其中所述蛋白選自破傷風類毒素，白喉類毒素，CRM197以及腦膜炎球菌蛋白。
13.製備軛合物疫苗的方法，該方法包括在pH約為6至約7，存在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的條件下，將蛋白與1-氨基-2，3-丙二醇(APDO)反應，由此得到APDO修飾的蛋白溶液；通過緩衝液更換將所述APDO修飾的蛋白溶液的pH調至約10.0到約11.0；將所述APDO修飾的蛋白與氧化劑反應，由此得到醛活化的蛋白溶液；通過緩衝液更換將所述醛活化的蛋白溶液的pH從約10.0調至約11.0；在pH約6至約8的條件下，將所述醯肼活化的多糖與醛活化的蛋白反應，由此得到含有一或多個C＝N雙鍵的軛合物；及將所述軛合物的全部C＝N雙鍵基本還原成C-N單鍵，由此得到能刺激免疫反應的軛合物疫苗。
14.如權利要求13所述的方法，其中所述多糖選自腦膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感桿菌多糖，傷寒桿菌Vi多糖，以及B型鏈球菌多糖。
15.如權利要求13所述的方法，其中所述蛋白選自破傷風類毒素，白喉類毒素，CRM197以及腦膜炎球菌蛋白。
16.如權利要求13所述的方法，其中通過以下步驟來製備醯肼活化的多糖在溶液中將多糖與氧化劑反應，由此得到醛活化的多糖；將所述醛活化的多糖與己二酸二醯肼反應，得到含有一或多個C＝N雙鍵的中間體；以及將所述中間體的全部C＝N雙鍵基本還原成C-N單鍵，由此得到醯肼活化的多糖。
17.如權利要求13所述的方法，其中通過以下步驟來製備醯肼活化的多糖將多糖與1-氰-4-二甲基銨吡啶四氟硼酸反應，由此得到氰酸鹽活化的多糖；將所述氰酸鹽活化的多糖與己二酸二醯肼反應，由此得到醯肼活化的多糖。
18.如權利要求13所述的方法，其中通過以下步驟來製備醯肼活化的多糖在1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽存在的條件下，將多糖與己二酸二醯肼反應，由此得到醯肼活化的多糖。
19.軛合物疫苗，所述軛合物疫苗包括至少一種多糖部分和至少一種蛋白部分，其中所述多糖部分與所述蛋白部分通過至少一種式-C(＝O)-NH-NH-CH2-的連接基團相連接。
20.如權利要求19所述的軛合物疫苗，其中所述軛合物疫苗含有通過多個連接基團將多個多糖部分與多個蛋白部分交聯形成的晶格結構。
21.如權利要求19所述的軛合物疫苗，其中所述多糖選自腦膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感桿菌多糖，傷寒桿菌Vi多糖，以及B型鏈球菌多糖。
22.如權利要求19所述的軛合物疫苗，其中所述蛋白選自破傷風類毒素，白喉類毒素，CRM197以及腦膜炎球菌蛋白。
23.軛合物疫苗，所述軛合物疫苗包括至少一種多糖部分和至少一種蛋白部分，其中所述多糖部分與所述蛋白部分通過至少一種式-C(＝O)-NH-NH-C(＝NH)-O-的連接基團相連接。
24.如權利要求23所述的軛合物疫苗，其中所述軛合物疫苗含有通過多個連接基團將多個多糖部分與多個蛋白部分交聯形成的晶格結構。
25.如權利要求23所述的軛合物疫苗，其中所述多糖選自腦膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感桿菌多糖，傷寒桿菌Vi多糖，以及B型鏈球菌多糖。
26.如權利要求23所述的軛合物疫苗，其中所述蛋白選自破傷風類毒素，白喉類毒素，CRM197以及腦膜炎球菌蛋白。
27.軛合物疫苗，所述軛合物疫苗包括至少一種多糖部分和至少一種蛋白部分，其中所述多糖部分與所述蛋白部分通過至少一種式-C(＝O)-NH-CH2-CH2-NH-NH-的連接基團相連接。
28.如權利要求27所述的軛合物疫苗，其中所述軛合物疫苗含有通過多個連接基團將多個多糖部分與多個蛋白部分交聯形成的晶格結構。
29.如權利要求27所述的軛合物疫苗，其中所述多糖選自腦膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感桿菌多糖，傷寒桿菌Vi多糖，以及B型鏈球菌多糖。
30.如權利要求27所述的軛合物疫苗，其中所述蛋白選自破傷風類毒素，白喉類毒素，CRM197以及腦膜炎球菌蛋白。
31.參照任一實施例基本上如本發明說明書所描述的軛合物疫苗。
32.參照任一實施例基本上如本發明說明書所描述的軛合物疫苗製備方法。
全文摘要
本發明公開了以高產率合成和製備多糖－蛋白軛合物疫苗的方法。該方法涉及一種反應物上的醯肼基團與其他反應物上的醛基或氰酸鹽酯基的反應。所述反應以較高的軛合效率快速進行，因此可以採用簡化的純化方法從未軛合的蛋白和多糖以及其他小分子副產物中分離出所述軛合物。
文檔編號A61K39/385GK1863553SQ200480028977
公開日2006年11月15日 申請日期2004年8月6日 優先權日2003年8月6日
發明者車恆·羅伯特·李, 卡爾·E·弗拉施 申請人:美國政府健康及人類服務部