甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶及其製備與應用的製作方法

2023-06-06 07:08:01

專利名稱：：甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶及其製備與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及用甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶，及其製備與應用。
背景技術：
：早在30多年前，Storr和Burton就提出控制胺基酸在腫瘤治療上的可能性(StorrJM，BurtonAF.Theeffectsofargininedeficiencyonlymphomacells.BrJCancer.30:50-59(1974))，其中，被研究的最多的是天冬醯胺酶，它能分解細胞生長和細胞生命維持所需的天冬醯胺。在許多白血病(Leukemia)患者中，白血病細胞與正常細胞不同，它們自己不能合成天冬醯胺，必須依靠外界提供的天冬醯胺來維持生存。天冬醯胺酶的治療耗盡體內腫瘤細胞所需的游離天冬醯胺，從而導致腫瘤細胞死亡，而正常細胞不會受到太大影響。但是，L-天冬醯胺酶是來源於微生物，對人體來說具有很強的免疫原性，進入人體以後很容易誘導生成抗天冬醯胺酶的抗體，產生副作用並影響其療效；但是，如同Y.K.Park等在AntieancerRes.1:373—376(1981)中描述的，由於L-天冬醯胺酶受其分子量大小的限制，進入人體後容易被腎臟過濾清除，從而影響其在體內的循環半衰期。用聚乙二醇共價修飾的大腸桿菌L-天冬醯胺酶降低了其抗原性，延長了其循環半衰期(Y.Kamisaki等，J.Pharmacol.Exp.Ther.216:410-414(1981));Y.Kamisaki等，Gann.73:47-474(1982))。正常細胞的生長不需要精氨酸，因為它們能通過由精氨琥珀酸合成酶和精氨琥珀酸裂解酶催化的一個兩步反應從胍氨酸合成精氨酸。然而肝細胞瘤、黑色素瘤和其他一些的肉瘤不表達精氨琥珀酸合成酶，因而它們是精氨酸的營養缺陷型。精氮酸脫亞氨酶能催化精氨酸向胍氨酸的轉化，可被用來清除精氨酸。這方面的研究工作，最早是J.B.Jones在"精氮酸脫亞胺酶對小鼠白血病成淋巴細胞的作用"，博士論文，TheUniversityofOklahoma,1-165頁(1981)中開始研究的。他從惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)中提取的精氨酸脫亞胺酶(ADI)，在體外可以有效殺死腫瘤細胞，特別是肝癌和黑色素瘤相關的腫瘤細胞，但是從惡臭假單胞菌中提取的ADI在體內卻沒能表現出其應有的作用，研究發現是因為中性pH下幾乎沒有酶活性，並且因為惡臭假單胞菌中提取的精氨酸脫亞胺酶(ADI)對實驗動物來說具有很強的免疫原性，進入機體以後很容易誘導生成抗體，形成抗原-抗體免疫複合物從實驗動物的血液循環中被快速清除，如Takakuetal，Int.J.Cancer,51:244-249(1992)和美國專利NO.5，474,928中描述的，在此將其公開全部引為參考。Takaku等人用聚乙二醇通過氰尿醯氯基團對從精氨酸支原體中提取的精氨酸脫亞胺酶進行化學修飾。修飾後的精氮酸脫亞胺酶雖然在體外的生物學活性顯著下降，但是，由於PEG修飾降低了精氨酸脫亞胺酶的免疫原性，因此在體內保留了抗腫瘤的活性(Takaku等，Jpn丄Cancer.Res.84:1195-1200(1993))。然而，限於當時的技術水平，採用的修飾方式為氰尿醯氯連接基團，這種連接方式並不穩定，而且有可能釋放出有毒的代謝產物，因此限制了其在臨床上的使用。進一步的，Clark,MikeA在美國專利NO.6183738中所提到的，通過用琥珀醯亞胺基團作為連接基團來修飾精氨酸脫亞胺酶，避免了用氰尿醯氯基團修飾存在的缺陷，也同樣製備獲得了在動物體內具有抗腫瘤的活性的PEG化精氨酸脫亞胺酶，並在人體中的應用進行了研究(StevenACurley，Hepato-Gastroenterology，50:1208-1211(2003);Francescolzzo,JClinOncol.22:1815-1822(2004);PaoloA.Ascierto，JClinOncol23:7660-7668(2005))。但是，對於常規的用聚乙二醇來修飾生物活性的蛋白，包括精氨酸脫亞胺酶，L-天冬醯胺酶等都會導致酶活性的嚴重下降，甚至完全喪失。(RezaMehvarJ.PharmPharmaceutSci.3:125-136(2000))。例如O.Schiavon(IIFarmaco55:264—269(2000))研究了用不同的聚乙二醇來修飾Uricase，最終獲得的聚乙二醇化Uricase生物學活性僅為原來的0-40%之間；YuyingTan(PROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION12,45—52(1998));ZhijianYang(CANCERRESEARCH,64:6673~6678(2004)研究製備聚乙二醇化methioninase用於腫瘤的治療，用重均分子量為5000的聚乙二醇修飾methioninase後，也僅保留了40%的生物學活性。而且，對於一個蛋白分子結合多個聚乙二醇後，隨著聚乙二醇結合數量的增加，對活性的影響更加顯著。FrederickW.Holtsberg等(JournalofControlledRelease,80:259-271(2002))在研究聚乙二醇修飾精氨酸脫亞氨酶時發現，當一個精氨酸脫亞氨酶結合8-10個PEG2o,分子時，其酶活性僅保留了不到50%。對於用於治療用途的這些PEG修飾的酶，保留生物學活性和增加半衰期，降低免疫原性是一個矛盾。增加PEG修飾程度，可以增加酶在體內的半衰期，降低免疫原性，但是，隨著PEG修飾度的增加，往往會導致活性的急劇下降，甚至喪失(YuyingTan，ProteinExpressionandPurification,12:45—52(1998))。如何尋找一個既可以保留或基本保留被修飾酶的活性，又可以增加酶在體內的半衰期，降低免疫原性的製備方法，是人們一直在努力尋找的目標。另一方面，聚乙二醇(PEG)分子必須通過一個活化基團活化，才能與蛋白質表面的反應基團反應，以共價鍵形式連接到蛋白質分子上。但是，由於蛋白質分子量巨大，因此其潛在的可以與活性PEG反應的基團也是數目眾多。在不同的位點結合PEG，其產物的穩定性，生物學活性等性質都是不同的。Yu-SenWang(AdvancedDrugDeliveryReviews54:547-570(2002))研究重組人幹擾素a2a(IFNa2a)的PEG修飾時，就對此問題進行了詳細闡述。當用12KDsuccinimidylcarbonatePEG(SC-PEG)修飾時，IFNa2a分子中包括N端氨基，Lys,His等共有14個基團可能被修飾，對於單修飾的PEG-IFNa2a，最終分析證明修飾製備所得的PEG-IFNa2a是由14種不同位點結合有一個PEG分子組成的混合物，而且這14種PEG-IFNa2a的活性是不一致的，其相對生物學活性最高保留了37%,最低僅保留了6%。同樣的，OlaffiKinstler等(美國專利US5985265，1999年公開)研究重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-CSF)的PEG修飾時也發現，當採用20KD的SCM-mPEG(N-hydroxysuccinimidylestersofcarboxymethylmethoxypolyethyleneglycol)修飾時，最終製備獲得的單一修飾的PEG-rhG-CSF是由N端，Lys35，Lys41分別結合有一個PEG分子組成的混合物。進一步分析這三種不同的PEG-rhG-CSF分子，發現N端修飾的PEG-rhG-CSF活性最高，保留了原有活性的68%，Lys35和Lys41修飾產物活性分別為56n/。和2P/。，而且Lys35修飾產物是不穩定的，在體外很容易被降解。為了解決PEG修飾rhG-CSF時存在的這些問題，該專利方法提供了一種特別的低pH修飾方法，使PEG能定向結合於rhG-CSF的N端，從而獲得均一，穩定而且高活性的PEG-AG-CSF。但是，這些經驗都無法用於精氨酸脫亞氨酶的PEG修飾。這是由於精氨酸脫亞氨酶的結構都比這些蛋白要複雜的多，其一級結構中有28個伯胺(視不同來源，精氨酸脫亞氨酶的伯胺數目會略有不同)，現有的修飾方法，無法選擇對哪些伯胺基團進行修飾。因此，無論結合的PEG數量的多少，最終的修飾產物總是不均一的。以有28個伯胺的精氨酸脫亞氨酶為例，如果平均修飾有5個PEG分子，則大約有107種組合，如果平均結合10個PEG分子，則大約有5X10"種組合。即使某些伯胺基團由於空間位阻的原因而不能與活性PEG反應，但是修飾反應最終所產生的總產物種類數目仍然是驚人的。如果採用美國專利5985265中特殊的修飾方法，使PEG定點結合於精氨酸脫亞氨酶的N端，雖然可以保持相對較高的活性並獲得均一產物，但是N端結合PEG無法完全屏蔽精氨酸脫亞氨酶的免疫原性位點，仍然無法在臨床研究使用。因此，現有的PEG修飾的精氨酸脫亞氨酶存在很多的弊端l.有些伯胺基團處於精氨酸脫亞氨酶活性位點，被修飾後會嚴重影響生物學活性，因此臨床使用勢必增加酶的用量，但酶用量的增加又會增加免疫原性；2.由於修飾位點的不確定，因此精氨酸脫亞氨酶具有強免疫原性的位點能否被屏蔽也是不確定的；3.由於修飾產物是由數量龐大的混合物組成，用現有的分析方法無法確定修飾混合物中具體每種修飾產物的結構和數量，因5此沒有很好的質量控制手段來保證修飾的精氨酸脫亞氨酶混合物的質量穩定性。這些缺陷帶來的最終結果是用現有的修飾方法獲得的PEG化精氨酸脫亞氨酶在不同批次之間是有區別的，人們無法預測其生物學活性和免疫原性，也缺乏有效的手段進行控制。這些缺陷己經從現有的PEG化精氨酸脫亞氨酶臨床試驗中已經得到表現，如不確定的抗腫瘤藥效，重複給藥引起的免疫原性以及由此引發的一些嚴重的毒副作用，如嚴重的肝臟損傷，過敏反應，elevatedlipase(Li-JiuanShen，CurrentOpinioninMolecularTherapeutics8:240-248(2006))。許多研究已經證明，增加蛋白質或酶的修飾程度能增加修飾物的循環半衰期，然而增加修飾程度卻會減少蛋白或酶的生物學活性(RameshrajaP等，Currentaspectinpharmacologyofmodifiedhomoglobins[J]AdvdrugdelivReview.40,185(2000))。一般地，PEG修飾率低對酶活力影響小，但是半衰期短，被屏蔽的抗原決定簇也少，因此對降低免疫原性的作用也小；PEG修飾率高，半衰期更長，修飾蛋白中被屏蔽的抗原決定簇也多，因此對降低免疫原性的作用大，但是對生物學活性的影響也高。要提高修飾率，降低免疫原性，延長半衰期而不降低被修飾酶的生物學活性，在目前的技術條件下始終是一件極其困難的工作。本發明針對目前存在的這些問題，研究製備了一種高活性，無免疫原性的甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶，來克服現有產品存在的弊端。
發明內容本發明的目的是克服現有技術中的缺陷，提供一種mPEG修飾的精氨酸脫亞氨酶及其製備與應用。本發明一方面公開了一種甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶的製備方法，包括下列步驟1.將精氨酸脫亞氨酶安慰性底物與精氨酸脫亞氨酶混合反應，使精氨酸脫亞氨酶安慰性底物與精氨酸脫亞氨酶的活性位點可逆結合；2.將結合了精氨酸脫亞氨酶安慰性底物的精氨酸脫亞氨酶用甲氧基聚乙二醇修飾；3.分離純化甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶並去除安慰性底物。步驟1中，精氨酸脫亞氨酶安慰性底物對精氨酸脫亞氨酶的摩爾比為1:1-50:1，在滿足精氨酸脫亞胺酶活性結合位點被安慰性底物飽和前提(原則)下，優選的比例範圍是3:1-10:1。所述精氨酸脫亞氨酶安慰性底物選自BOC-精氨酸或FMOC-精氨酸。精氨酸脫亞氨酶安慰性底物與精氨酸脫亞氨酶混合反應可在各種常規的甲氧基聚乙二醇修飾精氨酸脫亞氨酶用的緩衝體系中進行，如100mMBicine，pH8.0。步驟2中，將精氨酸脫亞氨酶安慰性底物的精氨酸脫亞氨酶用甲氧基聚乙二醇修飾可採用已知的各種常規的甲氧基聚乙二醇修飾精氨酸脫亞氨酶的條件進行。步驟3中，甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶的純化可採用巳知的甲氧基聚乙二醇修飾精氨酸脫亞氨酶純化方式進行，這樣可以獲得高活力的甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶。由於安慰性底物與酶之間是可逆性結合的，因此在吸附性層析純化過程中，修飾後的酶會與填料結合，但是未結合安慰性底物直接流出，與酶結合的安慰性底物在衝洗過程中動態解離而被去除。進一步的，步驟3的分離純化步驟，包括將步驟2的產物通過結合有抗精氨酸脫亞氨酶抗體的親和層析柱去除暴露有免疫原性位點的聚乙二醇化精氨酸脫亞氨酶。分離純化步驟中增加該步驟可以獲得沒有免疫原性的甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶。如本發明實例列舉的，親和層析柱可以為CNBrSepharose4B親和層析柱。抗精氨酸脫亞氨酶抗體優選抗精氨酸脫亞氨酶多抗。結合有抗精氨酸脫亞氨酶抗體的親和層析柱中，抗精氨酸脫亞氨酶抗體與親和層析柱的混合比例較佳的為5土0.5mg抗體:lml填料。本發明第二方面，公開了由上述方法獲得的甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶。本發明獲得的聚乙二醇化精氨酸脫亞氨酶的基本保留了原有活性，更進一步的，還可以沒有免疫原性。其中，所述的精氨酸脫亞氨酶是精氨酸支原體、人型支原體或關節炎型支原體的精氨酸脫亞氨酶。甲氧基聚乙二醇通過連接基團與所述精氨酸脫亞胺酶的伯胺共價相連。所述的連接基團是琥珀醯亞胺基團，包括琥珀酸琥珀醯亞胺酯、丙酸琥珀醯亞胺酯、羧甲酸琥珀醯亞胺酯、琥珀醯亞胺基琥珀醯胺、N-羥基琥珀醯亞胺或其組合。所述的甲氧基聚乙二醇重均分子量範圍在5,000到60,000之間。所述的甲氧基聚乙二醇是線性的，也可以是分枝型的。所述的精氨酸脫亞胺酶與3個到10個聚乙二醇分子共價連接，優選的是5-8個甲氧基聚乙二醇分子共價連接。本發明的第三方面，公開了一種藥物組合物，它通常含有安全有效量的本發明PEG-ADI以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但並不限於)緩衝液、胺基酸、糖類、注射用水及其組合。藥物製劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被製成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行製備。藥物組合物如針劑、溶液宜在無菌條件下製造。本發明的化合物可與磷酸鹽緩衝液或任何本領域技術人員己知的適當溶液相混合。根據需要，所述的PEG-ADI製劑可以固體(冷凍乾燥)或液體劑型施用。本發明第四方面，還公開了上述mPEG修飾的精氨酸脫亞氨酶在製備治療癌症藥物上的應用。所述治療癌症藥物可以是治療肉瘤、肝細胞瘤或黑色素瘤等癌症的藥物。本發明中，術語"聚乙二醇"或"PEG"是指環氧乙垸和水的直鏈或支鏈形式縮聚物的混合物，由一般分子式HO(OCH2CH2)nOH來代表，在此n至少為4。用"聚乙二醇"或"PEG"連同其後面的數字後綴一同來表示它的大約平均分子量。例如，PEG2,q是指平均分子量大約為20,000的聚乙二醇。術語"甲氧基聚乙二醇"或"mPEG"是指通過環氧乙烷與甲氧根離子聚合產生的聚乙二醇術語"免疫原性"是指能剌激機體產生抗體和致敏淋巴細胞的特性。術語"安慰性底物"是指能與酶的活性中心結合，但是不能作為酶的底物的一類化合物。術語"修飾"是指用高分子化合物於蛋白質上某些基團通過共價鍵連接的過程。術語"生物學活性"是指在生物體內或活細胞內具有的某種生理功能。術語"半衰期"是指藥物從體內消除一半所需的時間，也是血藥濃度下降一半所需要的時間，用"/2表示。術語"黑色素瘤"可以是一種從皮膚或其他器官(包括口腔、食道、肛門、陰道、小腦膜(leptomeningers)、結膜或眼睛)的黑色素細胞系統發展而來的惡性或良性腫瘤。術語"肝細胞瘤"可以是肝的一種惡性或良性腫瘤，包括例如肝細胞性癌。在本發明的公開中，以下的縮寫可能被應用ADI,精氨酸脫亞胺酶；rADI，重組精氨酸脫亞胺酶；raADI，重組精氨酸支原體來源精氨酸脫亞胺酶；PEG，聚乙二醇；mPEG,甲氧基聚乙二醇；mPEG-rADI，甲氧基聚乙二醇修飾重組精氨酸脫亞胺酶；BOC-Arg，叔丁氧羰基精氨酸Fmoc-Arg，芴甲氧羰基精氨酸；SS，琥珀酸琥珀醯亞胺酯；SSA，琥珀醯亞胺基琥珀醯胺；SPA，丙酸琥珀醯亞胺酯NHS，N-羥基琥珀醯亞胺;PB,磷酸緩衝液；PBS,磷酸鹽緩衝液。本發明的第一個創新是在修飾反應體系中加入特定的精氨酸脫亞氨酶的安慰性底物，特異性保護ADI酶活性中心不被破壞，以提高修飾後的mPEG-ADI的活性。PEG修飾導致蛋白活性的下降，主要是因為PEG對蛋白活性位點中賴氨酸側鏈游離NH2基團修飾引起。本發明的研究者通過大量的研究發現，在PEG修飾反應過程中添加ADI的安慰性底物，如BOC-Arg(A^-(feW陽Butoxycarbonyl)-L-arginine,分子式HN=C(NH2)NH(CH2)3CH(COOH)NHC(0)OC(CH3)3)，Fmoc-Arg(A^-(9-Fluorenylmethoxycarbonyl)-L-arginine，分子式C21H24N404)等，這些安慰性底物可以與ADI的催化活性位點可逆性地結合，因此在PEG修飾時由於空間位阻的作用，避免了位於活性位點的賴氨酸被PEG結合(如圖1所示)，從而達到保護活性位點的作用，並且使得在同樣數量mPEG結合到rADI的情況下，與不加安慰性底物相比，修飾獲得的酶活力大大提高。這種保護性修飾方法通過三步反應來完成第一步，rADI與可逆性保護試劑BOC-Arg結合；第二步，添加活性PEG進行PEG修飾反應；第三步，分離獲得修飾產物。根據實例2提供的方法，比較了在不同修飾程度下採用本專利方法的優越性。由表I的結果可看出，當修飾率低時，添加安慰性底物對酶活力保留的影響較小。而當raADhSPA-PEG2,比例為1:30(摩爾比)時未添加保護試劑的修飾產物酶活力保留40%，而添加保護試劑的選擇性修飾產物的酶活性保留提高到近80%。表1添加安慰性底物對SPA-PEGM(K)修飾ADI活性的影響raADI:SPA-PEG2Q,比例相對ADI酶活性(％)保護試劑(-)保護試劑(+)1:588.391.0h1565.184.31:3045.778.5採用本發明上述方法修飾獲得的PEG-ADI還是不均一的，ADI分子上通常會連接數量不等的PEG分子，因此，始終還有部分PEG-ADI暴露有較多的抗原決定簇從而在重複給藥後產生免疫原性。本發明的另一個創新是採用特殊的分離純化方法，製備出免疫學上更均一的PEG-ADI。這種方法通過如下方式來實現的。首先是製備抗ADI的抗體。將ADI樣品免疫小鼠，如Balb/c鼠，然後用提取免疫後的鼠血清，經蛋白A親和層析柱分離獲得抗ADI的鼠抗體。然後將抗ADI的鼠抗體用化學方法結合於層析載體，如溴化氰活化的瓊脂糖樹脂(CNBr-Sepharose)，將修飾獲得的PEG-ADI混合物流經該抗體柱，PEG-ADI混合物中那些還暴露有與抗體結合位點，也就是具有免疫原性的PEG-ADI被特異性結合而從混合物中除去，從而獲得免疫學上均一的PEG-ADI製品。類似的，也可以免疫兔，羊甚至黑猩猩等動物，來獲得相應的抗ADI抗體，用來上述用途。本發明的化合物的治療有效量是能有效地抑制腫瘤生長的量。通常，治療以小劑量開始，然後逐漸增加劑量直至達到完全分解機體內的精氨酸。通常，本發明的化合物的治療劑量可以是從約1到30U/kg，每周一次到大約每兩周一次。此外，本發明的PEG-ADI還可與其他治療劑聯合使用，如化學抗腫瘤治療劑以達到更好的抗腫瘤治療效果。本發明的主要優點在於通過在修飾反應中添加安慰性底物來保護活性位點，修飾獲得的PEG-ADI與現有的修飾型PEG-ADI相比，在相同的修飾率下，具有更高的生物學活性。其次，通過特異性的親和層析去除有免疫原性的PEG-ADI,最終製備的PEG-ADI在活性高，免疫學上更均一，在體內沒有免疫原性，從而在臨床中更為安全有效。圖l:保護反應示意圖圖2:重組aADI(raADI)RP-HPLC圖圖3:正常鼠免疫原滴度試驗結果圖4:H22移植瘤模型藥效試驗具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。實施例1:重組ADI的生產許多研究已經表明，多種支原體來源的ADI，雖然序列上有一定差異，但是其酶學特性是相同的。如精氨酸支原體(ATCC23243)(SEQIDNO:l)、人形支原體(ATCC23114)(SEQIDNO:2〉、關節炎支原體(ATCC23192)(SEQIDNO:3)來源的ADI,胺基酸序列同源性超過96%。文獻研究(Clark,MikeA，美國專利NO.6183738)已經證明從比活性、Km、Vmax，和最適pH等方面證明這些酶是生化不可區分的。因此這些不同來源的ADI都適用於本發明。本發明以下的實例中以精氨酸支原體來源的ADI(簡稱aADI)做舉例說明。aADI基因來源於精氨酸型支原體，由於支原體的部分密碼子不能被大腸桿菌有效識別和翻譯，所以我們採用了全合成的方式，在不改變胺基酸結構的前提下以大腸桿菌偏愛的密碼子來設計併合成aADI的全基因(見SEQIDNO:4)。參照S.Misawa在J.Biotechnology，36:145-155(1994)文獻方法構建aADI表達株，並復性和純化。具體方法簡述如下aADI重組菌經高密度發酵，離心，收集菌體，高壓勻漿破碎菌體，離心收集包涵體。lg包涵體溶解在15ml的增溶液(6M鹽酸胍，5mMEDTA，lOmMTris，pH8.5)中，室溫攪拌2小時。加入75(3-巰基乙醇繼續攪拌30min。然後將增溶液用1800ml的復性液(lOmMPB，pH7.2)緩慢稀釋，15'C攪拌復性48小時。復性液用蒸餾水稀釋兩倍，上樣於以流動相AUOmMPB，pH7.2)預平衡好的DEAESepharoseFastFlowXK50/20陰離子交換柱。用含0.5mol/LNaCl的流動相A以50ml/min的速度洗脫，收集目標峰。DEAE柱洗脫的目標峰中加入硫酸銨至硫酸銨終濃度為1.0mol/L，上樣於以流動相A(lOmMPB，l.Omol/L硫酸銨pH7.2)預平衡好的PhenylSpharoseHPXK26/20疏水層析柱。以lOmMPB，pH7.2為流動相B,以10倍柱體積內硫酸銨由l.Omol/L降至0.1mol/L的線性梯度洗脫，收集目標峰。純化後的重組aADI(raADI)經RP-HPLC證明純度達到98%(見附圖2)。每克包涵體最終獲得約10毫克蛋白。分子篩層析分析的結果表明，mADI為二聚體活性狀態(約90KD)。實施例2.ADI酶活性測定ADI以精氨酸(Arg)為底物，產物胍氨酸能與血尿氮試劑(BUN)在IOO'C高溫下反應顯紅色。反應體系中加入終濃度10mMArg,5ngADI，補充20mMPB(pH7.2)至500ul，37'C準確反應30min後，取50ul反應液加入血尿氮試劑(BUN)中，混勻，沸水浴lOmin，最後測OD54o,以胍氨酸為標準品作標準曲線。空白對照為不加ADI的血尿氮試劑(BUN)。從標準曲線上換算反應底物胍氨酸的含量(timol)。酶活力單位的定義1個酶活力單位(U)定義為37°C，1分鐘內催化lumol精氨酸完全轉化為lfxmol胍氨酸的酶活力。用考馬斯亮藍法測定蛋白含量，計算ADI酶的比活力。最後測得純化後的raADI的比活力約為33U/mg。實施例3:raADI的PEG修飾修飾實驗分兩組進行反應(1):在100毫升1毫克/毫升的raADI溶液(緩衝體系為100mMBicine，pH8.0)中，按1:30摩爾比加入PEG試劑(mPEG2G。M-SPA，，Nektar)。室溫下攪拌反應1小時。修飾後的產物PEG-raADI用Phenyl-SepharoseHP純化，收集相應目標峰，最後用G25脫鹽柱除去(NH4)2S04。最終製備所得產物命名為mPEG2,o-raADI。反應(2):除了先在raADI溶液中加入10毫克/毫升的BOC-Arg(對應BOC-Arg:raADI的摩爾比為5:1)，純化修飾產物可在洗脫前的平衡階段適當增加平衡時間，利用安慰性底物與酶之間的可逆性結合與解離特性，則能方便的去除之，其他條件與反應(l)完全一致，最終製備所得產物命名為P-mPEG20000-raADI(protectedmPEG20000-raADI)。反應(3):除了BOC-Arg:raADI的摩爾比為l:1夕卜，其餘同反應2。反應(4):除了安慰性底物採用Fmoc-Arg,且Fmoc-Arg:raADI的摩爾比為50:1夕卜，其餘同反應2。精氨酸脫亞胺酶的修飾程度的測定參照A.Abuchowski等在J.Biol.Chem，252，3582-3586(1977)描述的方法進行，即用三硝基苯磺酸(TNBS)方法滴定游離氨基，通過比較PEG修飾前後游離氨基變化，確定修飾程度。酶活性檢測方法與實施例1一致。檢測結果見表2表2反應PEG平均修飾數目比活性(U/mg)相對raADI酶活性(%)1mPEG2oooo-raADI8.215.145.72P-mPEG20000-raADIA8.525.978.5P-mPEG調o-raADIB8.324.273.34P-mPEG讓o-raADIC8.223.771.8實施例4:ADI鼠多克隆抗體的製備將純化的raADI溶於無菌的生理鹽水中，然後與等體積的弗氏完全佐劑混合乳化製成免疫抗原溶液，採用皮下多點注射方法進行免疫處理，按100yg/raADI(次.只)的劑量免疫6周齡Balb/c小鼠20隻，隨後每次間隔2周再加強免疫2次(100ug/raADI與弗氏不完全佐劑)，35-40天後摘小鼠眼球取血，靜止後離心收集血清，即得ADI小鼠多克隆抗體，血清樣品-7(TC低溫保存備用。實施例5:親和層析製備免疫學均一的P-PEG400(K)-raADI含抗raADI的多克隆抗體的腹水1500g離心10分鐘去除細胞。上樣於用平衡緩衝液(20mMPB,pH7.0)預先平衡好的HiTraprProteinAFF5ml柱，再用平衡緩衝液平衡5個柱體積，然後換用0.05M檸檬酸鈉(PH4.0)的洗脫緩衝液洗脫，收集目標峰。含raADI多克隆抗體的組分按每毫升50ixL的比例加入lM的磷酸鈉(pH8.0)以中和pH。將純化的raADI多克隆抗體與以50mM磷酸鹽緩衝液，pH8.0預處理過的CNBrSepharose4B親和層析填料按5mgprotein:lml填料的比例混合，4。C過夜，以5倍體積的50mMTris-Cl，pH8.5的緩衝液洗脫未結合的蛋白。製備得到結合有raADI多克隆抗體的CNBr-Sepharose4B親和層析柱。將實施例3反應的P-PEG2oo(X)-raADI的樣品於PBS中透析平衡除鹽後,緩慢上樣至預先用PBS充分平衡的結合有PEG-raADI多克隆抗體的CNBr-Sepharose4B親和層析柱上，收集流穿峰，用截留分子量為10000MWCO的AmiconUltm-4超濾管濃縮，比活性及酶活性檢測結果見表3。表3:tableseeoriginaldocumentpage13實施例6:正常鼠免疫原性試驗選取10隻6周齡Balb/C小鼠，分成3組，每組5隻。分別肌注10U的mPEG2GOoo-raADI，P-mPEG2DOo-raADI，取反應2的產物，未經親和層析純化的P-mPEG2W)WrraADI(命名為P-mPEG2,-raADI-W)，每周注射一次，共給藥五周。分別在注射前、注射後第三周、第五周時在小鼠尾靜脈取血檢測抗ADI抗體的滴度，抗體滴度檢測採用ELISA法，96孔板包被ADI蛋白，二抗為鹼性磷酸酶標記的羊抗鼠多抗。結果如圖3所示。結果表明經親和層析純化的P-mPEG2。,-raADI比未經親和層析純化的P-mPEG2,o-raADI免疫原性有所降低，而未經安慰性底物結合的mPEG2(KKX)-raADI免疫原性最高。實施例7:H22移植瘤模型藥效試驗為驗證P-PEG2G(X)Q-raADI抑制肝細胞性肝癌的作用，隨機選取30隻6周齡Balb/C小鼠製備荷瘤鼠模型，每隻鼠於背部皮下注射5X10S個小鼠肝癌細胞H22，荷瘤後讓瘤體生長到大約直徑0.5cm，分成4組，分別為P-PEG2,o-raADI治療組、raADI治療組、生理鹽水組，並以10隻正常的Balb/C小鼠為對照組。分別肌注10IUP-PEG2(xK)o-raADI，10IUraADI,生理鹽水0.02ral/次'只。每周給藥一次，共給藥二周，停藥後小鼠繼續飼養觀察二周。與raADI治療組和生理鹽水對照組比較，P-PEG2o,-raADI對H22荷瘤小鼠生存率明顯提高，至觀察期結束，荷瘤小鼠100%存活，在統計學上均有顯著差異(圖4)。表4的結果說明P-PEG2QWK)-raADI對H22移植瘤的生長具有顯著的抑制效應。tableseeoriginaldocumentpage14在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。〈110>杭州基偉生物技術有限公司〈120〉甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶及其製備與應用PCNJW0909424Patentlnversion3.1〈210〉1409PRT<213〉Mycoplasmaarthritidis1MetSerValPheAspSerLysPhe15lieGlyGluLeuGluThrValLeu20LysGlylieHisValTyrSerGlu1015ValHisGluProGlyLysGlulie2530AspTyrlieThrProAlaArgLeuAspGluLeuLeuPheSerAlalie354045UuGluSerHisAspAlaArgLysGluHisLysGluPheValAlaGlu505560LeuLysLysArgGlylieAsnValValGluLeuValAspLeulieVal65707580GluThrTyrAspLeuAlaSerLysGluAlaLysGluLysLeuLeuGlu859095GluPheLeuAspAspSerAlaProValLeuSerAspGluHisArgAla100105110AlaValLysLysPheLeuGinSerGinLysSerThrArgSerLeuVal115120125GluTyrMetlieAlaGlylieThrLysHisAspLeuLyslieGluSer15AspLeuGluLeulie145AspProPheAla135ValAspProMet150ValGlyAsnGlySer165GinArgGluThrTyrLysVaJArg180LysLeuValAsn140ProAsnLeuTyrPheThrArg155160ValThrlieHisTyrMetArg170175PheSerArgPheValPheSerAsnHisPro195SerlieGluGlyLeu185ProTrpTyrTyrGlyLeu210LeuValValGlyVal225LeuAlaLysAsnThr200AspValPheGly215GluArgThrAspSer230LysAlaAsnLyslie245ValAlalieAsnValProLysTrp260MetLeuAspLyslieTyr220LeuGinThrlie235CysGluPheLysVal190AspProAlaGlu205AsnAsnAspThrGlu250Asn丄euMetHisTrpLeuThr275ValPheLysPheAsnAsp290AlaProGinProVal305SerlielieGlyAsp280TrpAspTyrAsp295AsnGlyLeuProThr265LysPheLeuTyrThrLeu240Arglie255LeuAspThr270SerProlieAla285AsnGlyGlyAspAsp310LysProThrLeuLys325AsplieGluArgAlaSerGinlie340ValAlaProGlyLeuVal300LeuGluAspLeuLeuLys315320lieProlieAlaGlyAlaGly330335ThrHisPheAspGlyThrAsnTyrLeuLysThrlie360AlaGlu345VallieGlyTyrAla355AsnAlaAlaLeuGluAlaAlaGlylieThrValLeuProPheAla365ValGly350ArgAsnGlu1370375380ArgGlyAsnGinLeuSerLeuGlyMetGlyAsnAlaArgCysMetSer385390395400MetProLeuSerArgLysAspValLys405〈210>2409〈212>PRT〈213〉Mycoplasmahorainis〈400〉2SerValPheAspSerLysMet1lieAspLeuMet65GluGlyTyrGlu50LysGlulie35SerLeu20Thr5GluThrValProAlaArgHisAspAlaAspArgGlyThrTyrAspThrPheLeuAlaValPheMet130Arg115MetGlu100AlaLeu85Glulie70AlaArg55AsnSerThrValPheLeuLeuSerGlylieThr135PheAsnGlylie10LeuValHisGlu25LeuAspGluLeu40LysGluHisGinValValGluLeu75LysAlaAlaLys90ProVeilLeuThr105SerLysProThr120LysTyrGluLeuHisProLeuSer60ThrGluGluHisGly140ValTyrSerGlu15GlyArgGlulie30PheSerAlalie45PheValLyslieAspLeuValAla80GluPhelieGlu95MaAsnLysLys110GluMetValGlu125ValGluSerGluAsnGluLeulieValAspProMetProAsnLeuTyrPheThrArgAsp145150ProPheAlaSerValGlyAsnGly165lieValArgArgArgGluThrLeu180LeuValLysThr155ValThrlieHisPhe170AlaArgPheValHisProLys195MetProlieGluGlyGly210ValValGlyValSer225AlaLysAsnliePhe185TrpTyrTyrAsp160MetArgTyr175PheArgAsn190AlaMetLysProTrpTyrTyrAsdPro200205ValPhelieTyrAsnAsnGluThrLeuAsp215ArgThrAspLys245AlalieAsnValProLysTrpThrVal260LeuAspLysAsnLysPheLeuTyrSerAsn265PheLeuAsp235ValGlu250LeuMetAsn220ThrlieThrGlu230AlaAsnLysGluValGluPheLysArgLeuLeu240lieVal255ThrTrpLeuThrMetLeuAspLysAsnLys275280PheLysPheTrpAspTyrAspLeuValAspVal290ProGinProGinLeu305lielieAsnLysAsp295AsnGlyLeuPro310ProValLeulieHisLeuAsp270ProlieAlaAsn285GlyGlyAlaGluGlu325lieAlaArgGluThrGluMetGlu340LysProGlyLeuVallieGlyTyrAspThr345lieleuAsp315Prolie330AsnPheAsn300LysLeuLeuGlyAspAlaSer320GlyAlaGlyAla335AsnTyrGlyLeuAlalieLysProGlyLeuVal355360AlaAlaLeuLysAlaAlaGlylieThrThr350AsnGluLysArg365LeuProPheHisThrAsnAlaAlaLeuLysAlaAlaGlylieThrVal370375380GlyAsnGinLeuSerLeuGlyMetGlyAsnAlaArgCysMetSerMet385390ProLeuSerArgLysAspVal405〈210>3410PRTMycoplasmaarginini〈400〉3SerValPheAspSerLys395400LysTrpMet1lieAspLeuLeu65GluGlyTyrGlu50LysGlulie35SerLeu20Thr5GluSerValProAlaArgHisAspAlaAlaAsnAspThrTyrAspGluPheLeuValValGluAsp145Asplie130HisArg115MetGlu100AsnLeu85Asplie70AlaArg55AsnPheLysLeuVal25LeuAsp40LysGluValValSerGinGluSerGluPheLeuLysMetAlaGlyGluLeulielie135AspProVal105AlaLys120ThrLysProMetVal150ProPheAlaSerValGlyAsnGlyGlylie10HisGluGluLeuHisLysGluLeu75AlaLys90LeuSerLysThrTyrAspProAsn155ValThrHisValTyrProGlyLeuPhe45GinPhe60lieAsp30SerSerGlu15GlulieAlalieValAlaGluLeuAspLysLeuGluGluSerArg125LeuGly140LeuTyrHis110GluValAla80lieGlu95LysValLeuVallieGluAlaPhelieHisTyrThrArg160MetArgTyrLysVa]Arg180AsnHisProLysLeulie195SerlieGluGly165GinArgGluThr170LeuPheSerArg185ProTrpTyrTyrLysLeu210LeuValValGlyVal225LeuAlaLysAsnAsnThr200GlyAspValPhelie215GluArgThrAsp175PheValPheSer190AspProSerLeu205AsnAsnAspThrSer230ValAlaAsnLysTyr220GinThrVallie245ValAlalieAsnValProLysTrp260MetLeuAspLysLeu235CysGluPheLysTrpLeuThr275AsnAspValPheLysPhe290GluProGinProVal305SerlielieAsnGlu250ThrAsnLeuMetHis265LysPheLeuTyrThrLeu240Arglie255AspThrAsp280TrpAspTyrAspLeu295AsnGlyLeuProLeu270ProlieAlaSer285AsnGlyGlyAlaGlu310LysProValLeuVal300GluGlyLeuLys325GlulieGluArgLeu315ProlieAlaGlyAlaSerGinMet340TyrLeuAlalieArgProGlyValVallieGlyTyr355360AsnAlaAlaLeuGluAlaGlu345Vallie330ThrHisPheAspLeuGin320GluGly335GlyThrAsn350ArgAsnGluLysThrAsnAlaAlaLeuGluAlaAlaGlylie370375HisGlyAsnGinLeuSerLeuGlyMetGly385390MetProLeuSerArgLysAspValLysTrpSer365ValUuProPheAsn395Lys380AlaArgCysMetSer400405410〈210〉4〈211〉1233acattgttgc"tgtg犯ttca犯cgtattgttgc犯tt犯c780gttccaaaatga3c犯ax:tta^tgcactt3ga_c3catg3Ct犯C已3tgtt840aaattcctatactc3ccaatcgctaacgacgtatttei犯ttctgagattatgacttagta■咖ggtggagC6Lg￡l￡lCCeLC￡Laccagttgaa犯cggattacctctagaaggattattacaa960tcaatcattaacaaaaaaccagtttt犯ttcctatcgcaggtg卿gtgc1020cttcgatggttagcaattagaccaggtgtt1080gt犯ttggttaacgctgctctagaagctgc1140gttcttccattccacggtaaccaattatcattaggtatgggtsacgctcgttgtatgtca1200atgcctttattgtt犯gtg3tag12332權利要求1.一種甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶的製備方法，包括下列步驟a、將精氨酸脫亞氨酶安慰性底物與精氨酸脫亞氨酶混合反應，使精氨酸脫亞氨酶安慰性底物與精氨酸脫亞氨酶的活性位點結合；b、將結合了精氨酸脫亞氨酶安慰性底物的精氨酸脫亞氨酶用甲氧基聚乙二醇修飾；c、分離純化甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶。2.如權利要求l所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶的製備方法，其特徵在於，步驟a中，精氨酸脫亞氨酶安慰性底物對精氨酸脫亞氨酶的摩爾比為1:1-50:1。3.如權利要求2所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶的製備方法，其特徵在於,.所述精氨酸脫亞氨酶安慰性底物對精氨酸脫亞氨酶的摩爾比為3:1-10:1。4.如權利要求1所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶的製備方法，其特徵在於，所述精氨酸脫亞氨酶安慰性底物選自B0C-精氨酸或FM0C-精氨酸。5.如權利要求1-4任一權利要求所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶的製備方法，其特徵在於，所述步驟c的分離純化步驟，包括將步驟b的產物通過抗精氨酸脫亞氨酶抗體親和層析柱去除暴露有免疫原性位點的聚乙二醇化精氨酸脫亞氨酶。6.—種甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶，由權利要求1-5中任一權利要求所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶的製備方法製得。7.如權利要求6所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶，其特徵在於，所述的精氨酸脫亞氨酶為精氨酸支原體、人型支原體或關節炎型支原體的精氨酸脫亞氨酶。8.如權利要求6所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶，其特徵在於，所述甲氧基聚乙二醇通過連接基團與所述精氨酸脫亞胺酶的伯胺共價相連。9.一種藥物組合物，它含有安全有效量的權利要求6-8中任一權利要求所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶以及藥學上可接受的載體或賦形劑。10.權利要求6-8中任一權利要求所述甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶在製備治療癌症藥物上的應用。全文摘要本發明公開了用甲氧基聚乙二醇修飾的精氨酸脫亞氨酶及其製備與應用。本發明通過在修飾反應中添加安慰性底物來保護活性位點，修飾獲得的PEG-ADI與現有的修飾型EG-ADI相比，在相同的修飾率下，具有更高的生物學活性。其次，通過特異性的親和層析去除有免疫原性的PEG-ADI，最終製備的PEG-ADI在活性高，免疫學上更均一，在體內沒有免疫原性，從而在臨床中更為安全有效。文檔編號A61K47/48GK101591649SQ20091005464公開日2009年12月2日申請日期2009年7月10日優先權日2009年7月10日發明者凌建群,梁偉峰,溫曉芳,王葉飛,王玉嬌,敏範,裘霽宛申請人:杭州基偉生物技術有限公司