豬呼吸與繁殖障礙症候群病毒的生產方法
2023-06-06 01:06:21
專利名稱：豬呼吸與繁殖障礙症候群病毒的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種應用激流-灌注式生物反應器與紙片載體細胞培養技術生產疫 苗的方法，可用於工業化生產豬呼吸與繁殖症候群疫苗，替代傳統的轉瓶培養法生產工藝。
背景技術：
目前，國內豬呼吸與繁殖障礙症候群疫苗生產主要依靠細胞轉瓶培養法實現。該 傳統工藝勞動強度大，耗時長、效率低，生產成本高；容易被環境汙染；不同生產批次間或 同一生產批次不同瓶間的差異大；難以擴大生產；容易出現被細菌或其它病毒汙染而致的 疫苗質量隱患，涉及生物安全和公共衛生問題。
發明內容
本發明的目的在於克服現有細胞轉瓶培養法技術存在的不足之處，提供一種應用 激流_灌注式生物反應器紙片載體細胞培養生產豬呼吸與繁殖障礙症候群疫苗的方法。該 方法可以大量降低生產成本，而且生產周期短，佔用場地小，易於快速擴大生產規模，環境 汙染少且易於處理，自動化程度高，用人少，質量易於實現均衡穩定。可顯著提高疫苗產量 和質量。為達到上述目的，本發明採取了如下的技術方案一種豬呼吸與繁殖障礙症候群病毒的生產方法，包括如下步驟(1)制苗用細胞的傳代與培養取長滿單層Marc-145生產用細胞，經胰酶消化液消化傳代，以細胞生長液培養， 培養溫度為35 38°C ；形成細胞單層時，用於繼續傳代或接種於激流_灌注式生物反應器 中進行紙片載體灌注培養。(2)種毒的繁殖用細胞維持液將豬呼吸與繁殖症候群病毒種毒按體積百分比0. 1 比例接種 到步驟(1)的細胞單層繼續培養，至細胞80 90%病變時收穫病毒液；再將此病毒液作為 種毒，在Marc-145細胞上進行細胞連續傳代復壯，每次傳代產物進行病毒TCID5(I檢驗和無 菌檢驗，傳至病毒TCID5(1穩定且達到107_°TCID5(1/mL以上時停止復壯，作為生產種毒。(3)Marc-145細胞在激流-灌注式生物反應器中的紙片載體灌注培養準備好激流-灌注式生物反應器，按激流_灌注式生物反應器總體積的70%加入 細胞生長液，啟動激流-灌注式生物反應器，打開蠕動泵，開始循環；取步驟(1)長滿單層 的Marc-145細胞，經胰酶液消化製備為細胞懸液，細胞計數後按1 X 106個/mL 3 X 106個 /ml的密度接種到反應器中，設定溫度、pH、循環速度、搖床轉速、溶氧等培養參數，進行激 流_灌注式生物反應器的自動控制培養。(4)制苗用毒液的繁殖間隔固定時間無菌抽取步驟(3)的細胞生長液樣品，測定細胞生長液中的殘糖濃 度，計算細胞生長過程中的耗糖速率，根據細胞的耗糖速率來計算細胞的生長狀況，計算細
4胞數目，當細胞數計算結果達到3 X IO6個/mL 5 X IO6個/mL時進行接毒操作，按0. 1 比例接入步驟(2)製備好的豬呼吸與繁殖障礙症候群病毒生產種毒，設定好溫度、pH、 循環速度、溶氧等培養參數，進行反應器自動控制培養；接毒後每隔一定時間取反應器中細 胞維持液，測定殘糖，計算耗糖速率，並檢測樣品的TCID5tl ；待計算殘糖量達到或低於限定 值，且耗糖速率基本穩定不變時，開始收穫病毒，收穫上清液和含有紙片載體的灌注袋。(5)收穫病毒液的處理將含紙片載體的灌注袋經2 3次凍融後與收穫病毒上清混合，_20°C冷凍保存備 用。上述技術方案中，激流_灌注式生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧、攪拌 速度等參數，適用於紙片載體灌注培養的激流_灌注式生物反應器，容積為5L 2000L。上述技術方案中，紙片載體為聚酯醯胺紙片載體，紙片載體在使用前需預處理，方 法如下1)用無菌PBS (磷酸鹽緩衝液)浸泡紙片載體過夜；2)用無菌PBS (磷酸鹽緩衝液) 循環清洗紙片載體3遍；3)用細胞培養生長液浸泡紙片載體2小時。上述技術方案中，所述的胰酶消化液配方為質量份數為0. 25%的胰酶溶液(規 格為1 250)；細胞生長液配方為體積百分含量為90% 92% DMEM液、8% 10%牛血 清、1 %的雙抗(青黴素和鏈黴素混合溶液)，1 %的穀氨醯胺，pH為7. 2 7. 6。上述技術方案中，種毒接種量為體積百分比0. 1 1%，用於病毒培養的細胞維持 液配方為含體積百分含量1 4%血清的DMEM液、加的雙抗(青黴素和鏈黴素混合溶 液)，PH調整為7. 2 7. 8。培養溫度為35 38°C。上述技術方案中，激流-灌注式生物反應器設定參數為培養溫度33 38°C、 pH7. 0 7. 8、溶氧30% 80%、循環速度為50 150rpm。與現有技術相比，本發明具有如下有益效果(1)用「激流-灌注式生物反應器紙片載體細胞培養技術」代替「轉瓶細胞培養技 術」製造豬呼吸與繁殖障礙症候群疫苗，可解決生產效率低、產品質量不穩定、病毒效價低 的問題，通過生產技術和生產工藝的改變，全面提升疫苗質量和產量，提高疫苗的安全性。(2)本發明可以大量降低生產成本，而且生產周期短，每個生產周期僅需5 6天， 相比現有轉瓶細胞培養法的6 7天以上明顯縮短。(3)應用激流_灌注式生物反應器進行疫苗生產，具有自動化程度高，用人少，生 產工藝簡單穩定。易操作、產量大佔用場地小，易於快速擴大生產規模。質量易於實現均衡穩定。(4)應用本方法生產疫苗，產品病毒效價比傳統轉瓶細胞培養法提高10 20倍， 成本降低3 4倍。產品質量均一，易於規模化生產，整個生產工藝過程不涉及傳統生產方 法所具有的其他生物安全和公共衛生問題。(5)該生物反應器應用新型一次性培養用耗材，減少了罐體式生物反應器的清洗、 滅菌等複雜的工藝環節和工藝配套設施的安裝，具有節約能耗，減少汙染、佔地空間小、對 配套設施要求低等優點。(6)應用本方法生產疫苗，所採用的紙片載體具有無汙染，生物安全性高，細胞生 長密度大，使用後處理方便，無環境汙染等優勢。
圖1為本發明的製備流程圖
具體實施例方式以下結合說明書附圖及具體實施例來對本發明作進一步的描述。(1)選擇激流-灌注式生物反應器作為培養的手段IOL激流-灌注式生物反應
ο(2)選擇紙片載體作為細胞貼附生長的載體聚酯醯胺紙片載體。(3)紙片載體的預處理方法1)用無菌PBS浸泡紙片載體過夜；2)用無菌PBS循 環清洗紙片載體3遍；3)用細胞培養生長液浸泡紙片載體2小時以上。(4)選擇Marc-145細胞作為制苗用細胞。(5)制苗用細胞的傳代與培養。上述細胞經胰酶消化液消化傳代，以含10%牛血清、雙抗(青黴素和鏈黴素混 合溶液)，PH調整為7. 2的細胞生長液繼續培養，培養溫度為37°C。形成良好單層時，用於 繼續傳代或接種於激流_灌注式生物反應器中進行紙片載體灌注培養。細胞生長液的組成(或配方)為含體積百分比10%牛血清、雙抗(青黴素和 鏈黴素混合溶液)的DMEM，pH調整為7. 2。(6)細胞種毒的繁殖用細胞維持液，將豬呼吸與繁殖障礙症候群病毒種毒按比例接種生長良好的 上述細胞單層，繼續培養，培養溫度為37°C。至細胞80%以上病變時收穫病毒液；測定病毒 的TCID5tl，待病毒效價穩定且達到107_°TCID5(l/mL以上時停止復壯，將該病毒作為生產用種細胞維持液的組成(或配方)為含體積百分比2%牛血清、雙抗(青黴素和 鏈黴素混合溶液)的DMEM，pH調整為7. 2。(7)Marc-145細胞在激流-灌注式生物反應器中的紙片載體灌注培養取轉瓶上生長良好的Marc-145細胞，經胰酶細胞分散液消化製備為細胞懸液，細 胞計數後按3 X IO6個/mL的密度接種反應器中。激流-灌注式生物反應器設定如下參數 溫度37°C、pH 7. 2、溶氧含量50%、循環速度150rpm進行反應器自動控制培養。(8)制苗毒液的繁殖培養後第二日取樣測糖，計算耗糖速率。當耗糖速率不再增加，且糖耗速率不再變 化時可行接毒操作。設定溫度37°C、pH7. 6、循環速度120rpm、溶氧含量50%等培養參數， 進行反應器自動控制培養。接毒後每隔4小時取反應器中細胞維持液，測定糖耗，計算糖耗 速率。當耗糖速率不再增加，且細胞維持液中殘糖量降至1.0g/L以下時收穫。分別收穫上 清液和紙片載體。(9)收穫病毒液的處理將含紙片載體的灌注袋經3次凍融後與收穫病毒上清混合，-20°C冷凍保存備用。
權利要求
1.一種豬呼吸與繁殖障礙症候群病毒的生產方法，其特徵在於以激流_灌注式生物反應器作為培養工具；以聚酯醯胺紙片載體作為細胞貼附的生長 載體；以Marc-145細胞作為制苗用細胞；包括如下步驟(1)制苗用細胞的傳代與培養取長滿單層Marc-145生產用細胞，經胰酶消化液消化傳代，以細胞生長液培養，培養 溫度為35 38°C ；形成細胞單層時，用於繼續傳代或接種於激流_灌注式生物反應器中進 行紙片載體灌注培養；(2)種毒的繁殖用細胞維持液將豬呼吸與繁殖症候群病毒種毒按體積百分比0. 1 比例接種到步 驟(1)的細胞單層繼續培養，至細胞80 90%病變時收穫病毒液；再將此病毒液作為種 毒，在Marc-145細胞上進行細胞連續傳代復壯，每次傳代產物進行病毒TCID5(I檢驗和無菌 檢驗，傳至病毒TCID5(I穩定且達到107_°TCID5(l/mL以上時停止復壯，作為生產種毒；(3)Marc-145細胞在激流-灌注式生物反應器中的紙片載體灌注培養準備好激流_灌注式生物反應器，按激流_灌注式生物反應器總體積的70 %加入細 胞生長液，啟動激流-灌注式生物反應器，打開蠕動泵，開始循環；取步驟(1)長滿單層的 Marc-145細胞，經胰酶液消化製備為細胞懸液，細胞計數後按1 X 106個/mL 3X 106個 /ml的密度接種到反應器中，設定溫度、pH、循環速度、搖床轉速、溶氧等培養參數，進行激 流_灌注式生物反應器的自動控制培養；(4)制苗用毒液的繁殖間隔固定時間無菌抽取步驟(3)的細胞生長液樣品，測定細胞生長液中的殘糖濃度， 計算細胞生長過程中的耗糖速率，根據細胞的耗糖速率來計算細胞的生長狀況，計算細胞 數目，當細胞數計算結果達到3 X 106個/mL 5 X 106個/mL時進行接毒操作，按0. 1 1 % 比例接入步驟(2)製備好的豬呼吸與繁殖障礙症候群病毒生產種毒，設定好溫度、pH、循環 速度、溶氧等培養參數，進行反應器自動控制培養；接毒後每隔一定時間取反應器中細胞維 持液，測定殘糖，計算耗糖速率，並檢測樣品的TCID5(i ；待計算殘糖量達到或低於限定值，且 耗糖速率基本穩定不變時，開始收穫病毒，收穫上清液和含有紙片載體的灌注袋；(5)收穫病毒液的處理將含紙片載體的灌注袋經2 3次凍融後與收穫病毒上清混合，-20°C冷凍保存備用。
2.根據權利要求1所述的豬呼吸與繁殖障礙症候群病毒的生產方法，其特徵在於採 用的激流-灌注式生物反應器為能夠自動控制溫度、pH、溶氧等參數，適用於紙片載體灌注 培養的激流_灌注式生物反應器，容積為5L 2000L。
3.根據權利要求1所述的豬呼吸與繁殖障礙症候群病毒的生產方法，其特徵在於紙 片載體為聚酯醯胺紙片載體，紙片載體在使用前需預處理，方法如下1)用無菌PBS浸泡紙 片載體過夜；2)用無菌PBS循環清洗紙片載體3遍；3)用細胞生長液浸泡紙片載體2小時。
4.根據權利要求1所述的豬呼吸與繁殖障礙症候群病毒的生產方法，其特徵在於所 述的胰酶消化液配方為質量百分數為0. 25%的胰酶溶液；細胞生長液配方為體積百分 含量90 % 92 %的DMEM液、8 % 10 %的牛血清、1 %的雙抗，1 %的穀氨醯胺，pH為7. 2 7. 6。
5.根據權利要求1所述的豬呼吸與繁殖障礙症候群病毒的生產方法，其特徵在於所 述的生產種毒接種量為體積百分比0. 1 1%，用於病毒培養的細胞維持液配方為為含血 清體積百分含量1 4%的DMEM液、加入佔細胞維持液體積的雙抗，pH調整為7. 2 7. 8;培養溫度為35 38°C。
6.根據權利要求1所述的豬呼吸與繁殖障礙症候群病毒的生產方法，其特徵在於所 述的激流-灌注式生物反應器設定參數為培養溫度33 38°C、pH7. 0 7. 8、溶氧30% 80%、循環速度為50 150rpm。
全文摘要
本發明公開了一種應用激流-灌注式生物反應器培養Marc-145細胞生產豬呼吸與繁殖障礙症候群(豬藍耳病)病毒的生產工藝，包括如下技術步驟1)選擇Marc-145細胞作為制苗用細胞；2)Marc-145細胞的傳代與培養；3)生產毒種的繁殖；4)Marc-145細胞在激流-灌注式生物反應器中紙片載體上的灌注培養；5)豬呼吸與繁殖障礙症候群病毒在激流-灌注式生物反應器中的生產；6)收穫病毒抗原液的處理。本發明可大幅降低生產成本，提高投入產出比10倍以上。且生產準備周期短，佔用場地小，易於快速擴大生產規模，環境汙染少且易於處理，自動化程度高，用人少，質量易於實現均衡穩定。顯著提高疫苗產量和質量。
文檔編號C12N7/02GK102002482SQ20101057737
公開日2011年4月6日 申請日期2010年12月8日 優先權日2010年12月8日
發明者丁光星, 徐宏軍 申請人:成都天邦生物製品有限公司