靶向親合體重組蛋白的構建及其表達和純化方法

2023-06-06 00:49:06 2

專利名稱：靶向親合體重組蛋白的構建及其表達和純化方法
技術領域：
本發明屬於基因重組及生物分子材料製備技術領域，涉及靶向親合體重組蛋白的構建及其表達和純化方法。
背景技術：
親合體是通過定向分子進化技術篩選獲得的一類新型的獨特的蛋白結合配體，其作用類似於抗體，但卻擁有比抗體更加優越的性質:親合體的結合位點與抗體相似且親和力強；分子量小，不易在體內誘發免疫應答，組織穿透性好；性質十分穩定，可人工合成。親合體的這些獨特優勢引起了科研工作者的關注，目前已發現的親合體主要有Zhee2和Zkfk兩類。研究人員利用Zhek2作為HER2高表達腫瘤疾病(宮頸癌、卵巢癌、乳腺癌等)的特定靶向配體，利用Z_親和體作為EGFR高表達腫瘤疾病(皮膚癌等)的特定靶向配體，已展開了較多的研究，探索其各種潛在應用，包括腫瘤靶向成像和靶向治療。有研究報導將ZHEK2:342親合體與量子點或磁性氧化鐵納米顆粒連接，二者均在卵巢癌中實現了高的特定靶向能力。利用2_:19(17與64&1相偶聯製成PET造影劑在人皮膚鱗狀細胞癌A431細胞株中可實現很強的對比增強效果。以上研究結果表明這兩種親合體ZHEK2:342、Z_■可作為高親和力的靶向分子與目標分子或探針連接，實現靶向功能化。隨著現代納米生物醫學技術的發展，基於納米技術的靶向性輸送體系有望實現傳統腫瘤診斷和治療方法所無法企及的高效、低毒的效果，成為腫瘤診斷和治療的有效手段之一。靶向分子是構建靶向性輸送體系的重要因素，親合體的獨特優勢決定了其可作為高親和力祀向分子連接到納米載體上，實現主動祀向。目前，將親合體Z 臓:342、Zegfe:1907作為靶向分子進行靶向腫瘤能力的研究中，親合體主要是通過化學合成獲得的(1.0rlova A, et al.Synthetic affibodymolecules:A novel class of affinity ligands for molecular imaging ofHER2-expressing malignant tumors.Cancer Research.2007;67:2178-2186 ；2.GaoJHjet al.Affibody-based nanoprobes for HER2_expressing cell and tumorimaging.Biomaterials.2011;32:2141-2148 ；3.Tolmachev V，et al.Tumor TargetingUsing Affibody Molecules:1nterplay of Affinity, Target Expression Level,andBinding Site Composition.Journal of Nuclear Medicine.2012;53:953-960 ;4.Miao Z，et al.Smal 1-Animal PET Imaging of Human Epidermal GrowthFactor Receptor Positive Tumor with a64Cu Labeled Affibody Protein.Bioconjugate Chemistry.2010 ; 21: 947-954 ；5.Hoppmann S，et al.177Lu - D03A -HSA - Zegfe.1907 !characterization as a potential radiopharmaceutical forradionuclide therapy of EGFR-expressing head and neck carcinomas.Journal ofBiological Inorganic Chemistry.2012; 17: 709-718.)。但化學合成親合體的方法成本較高，且雜質多，不易純化。也有研究者通過構建表達載體在大腸桿菌中實現親合體 Zhee2:342 矛口 ZEGFR:1907 的表達(6.0rlova A, et al.Tumor Imaging using a pi comolaraffinity HER2 binding affibody molecule.Cancer Research.2006;66:4339-4348 ;7.Gopal V，et al.Structure prediction and validation of an affibodyengineered for cell-specific nucleic acid targeting.Systems and syntheticbiology.2010;4:293-297 ；8.Govindarajan S，et al.Targeting human epidermalgrowth factor receptor 2 by a cell-penetrating peptide-affibody bioconjugate.Biomaterials.2012;33:2570-2582 ；9.Tolmachev V，et al.Affibody Molecules forEpidermal Growth Factor Receptor Targeting In Vivo:Aspects of Dimerization andLabeling Chemistry.Journal of Nuclear Medicine.2009; 50:274-283.)。但由於其中親合體的編碼序列未經優化，產物表達量較低，且產物與目標分子或探針的連接位點較少，不易實現祀向功能化。

發明內容
本發明的目的在於提供靶向親合體重組蛋白的構建及其表達和純化方法。用於表達和純化重組靶向親合體Cys-ZHEK2:342-6His的核苷酸序列為:GGATCCGACGATGACGACAAATGCGTTGATAACAAGTTTAACAAAGAAATGCGCAACGCGTACTGGGAAATCGCACTGCTGCCGAACCTGAACAACCAGCAGAAACGTGCCTTCATTCGTTCCCTGTATGATGACCCTAGCCAATCTGCTAACCTGCTGGCAGAGGCGAAAAAACTGAATGATGCTCAGGCGCCAAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG(SEQ:1D:N0.1)其中，中間下劃線部分為親合體ZHEK2:342的編碼序列。用於表達和純化重組靶向親合體CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS的核苷酸序列為: GGATCCGATGACGATGACAAGTGCGTGGATAACAAATTCAACAAAGAGATGTGGGCGGCATGGGAAGAAATCCGTAACCTGCCAAACCTGAATGGTTGGCAGATGACCGCCTTTATTGCGAGCCTGGTTGATGACCCTTCTCAGTCCGCTAACCTGCTGGCTGAAGCGAAAAAACTGAACGACGCACAAGCTCCGAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG(SEQ:1D:N0.2)其中，中間下劃線部分為親合體Ζ_.的編碼序列。用於表達和純化靶向親合體重組蛋白的核苷酸序列順序依次為=BamH I酶切位點、腸激酶酶切位點編碼序列、半胱氨酸密碼子、親合體編碼序列、6Hi s-Tag序列、終止密碼子和XhoI酶切位點。該重組序列經密碼子優化後可在對應宿主中實現高效表達和純化，同時，加入的半胱氨酸和 組氨酸可提高重組親合體與輸送載體的連接性能。所述用於表達和純化靶向親合體重組蛋白的構建方法如下:I)在親合體編碼序列的基礎上設計重組蛋白的核苷酸編碼序列:序列前端依次加ABamH I酶切位點、腸激酶酶切位點編碼序列和半胱氨酸密碼子，序列中間為親合體編碼序列，序列後端依次加入6His-Tag純化標籤序列、終止密碼子和Xho I酶切位點；2)對重組編碼序列中的所有密碼子按照表達宿主的密碼子偏好性進行鹼基優化；3)鹼基優化後的重組基因片段由人工合成獲得，再將重組片段進行BamH 1、Xho I雙酶切，酶切產物純化後通過連接酶連接到表達質粒上，構建重組表達質粒，酶切等方法驗證質粒構建的正確性，以備用於表達和純化靶向親合體重組蛋白。所述用於表達和純化靶向親合體重組蛋白的核苷酸序列，是對編碼序列進行了重組設計的；並對編碼序列中的所有密碼子按照表達宿主的密碼子偏好性進行了鹼基優化。如此，可使重組未合體在宿主中聞效表達，同時實現聞純化效率和聞性能的目的。在重組序列中加入BamH I酶切位點和Xho I酶切位點，有利於重組親合體核苷酸序列與表達型質粒的連接，構建重組表達質粒。在重組序列中加入腸激酶酶切位點序列和終止密碼子，有利於實現重組親合體的分離純化並保證表達產物的準確性。在重組序列中加入半胱氨酸密碼子，有利於親合體通過半胱氨酸殘基中的巰基與目標分子或探針進行連接，實現輸送載體的靶向功能化。在重組序列中加入6His_Tag純化標籤序列，便於重組親合體的分離純化，提高純化效率；並可利用6His_Tag通過鎳離子的配位作用實現重組親合體與目標分子或探針的連接功能化。所述靶向親合體重組蛋白的表達和純化方法，包括以下步驟:I)將已構建的重組質粒轉化到密碼子偏好對應的宿主中，加入誘導劑誘導重組親合體的表達，驗證重組蛋白是否表達；在步驟I)中，所述轉化的方法可採用電轉化等方法；所述驗證的方法可通過蛋白質電泳等方法；所述誘導劑可採用異丙基_β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)等誘導劑。2)收集全部表達產物，經鎳柱親和層析初步純化得到融合蛋白，用腸激酶酶切融合蛋白，再用凝膠柱層析進一步分離純化，最後得到高純度的重組親合體。本發明提供靶向親合體重組蛋白的構建及其表達和純化方法，降低親合體的生產成本並提高其性能。本發明提供的重組核苷酸序列是依據表達宿主的密碼子偏好性進行了喊基優化的，可實現未合體的 聞效表達。本發明提供的重組親合體的核苷酸序列，是在親合體編碼序列的基礎上設計的。親合體編碼序列前端依次添加BamH I酶切位點、腸激酶酶切位點編碼序列和半胱氨酸密碼子；親合體編碼序列後端依次添加6His-Tag純化標籤序列、終止密碼子和Xho I酶切位點。重組序列中添加BamH I酶切位點和Xho I酶切位點，有利於重組片段與表達型質粒的連接，構建重組表達質粒。重組序列中添加腸激酶酶切位點序列和終止密碼子，有利於實現重組親合體的分離純化並保證表達產物的準確性。重組序列中加入半胱氨酸密碼子，有利於親合體通過半胱氨酸殘基中的巰基與目標分子或探針進行連接，實現輸送載體的靶向功能化。重組序列中加入6His-Tag純化標籤序列，便於重組親合體的分離純化，提高純化效率；同時可利用6His-Tag通過鎳離子的配位作用實現重組親合體與目標分子或探針的連接功能化。因此，在親合體編碼序列的基礎上添加以上序列可實現重組親合體的高效表達及分離純化，有效保證其生物活性同時增加其與目標分子或探針的連接位點，易於實現靶向性納米輸送體系的構建，提高了重組親合體的性能。本發明提出的靶向親合體重組蛋白的構建和表達純化方法，是在親合體編碼序列基礎上加入了 BamH I酶切位點、腸激酶酶切位點序列、半胱氨酸密碼子、6His_Tag純化標籤序列、終止密碼子和Xho I酶切位點，並對該重組序列依據表達宿主的密碼子偏好性進行鹼基優化，可實現重組親合體的高效表達和快速純化，極大降低了生產成本；同時序列中添加的半胱氨酸和組氨酸可增加重組親合體與運輸載體的連接位點，提高其性能。本發明可實現靶向親合體的高效表達純化，降低生產成本，同時提高其性能，有利於對親合體深入開展靶向功能的研究和應用，為構建靶向性納米輸送載體開闢新的途徑。本發明對重組親合體的編碼序列進行了優化設計，在序列中添加腸激酶酶切位點編碼序列、半胱氨酸密碼子、6His_Tag純化標籤序列和終止密碼子，增加重組親合體與納米載體的連接位點，並保證表達產物的準確性，提高純化效率；同時對編碼序列中的所有密碼子按照表達宿主的密碼子偏好性進行了鹼基優化，可使重組親合體在宿主中實現高效表達。


圖1為本發明實施例1中的Z臓:342重組親合體DNA片段及重組質粒pET32a(+) -Cys-ZHEE2:342 -6His 酶切驗證圖。在圖1 中，I 為 Zhe懸2，2 為 2000bp DNA Marker,3 為 pET32a (+)質粒 BamH I 單酶切產物，4 為 pET32a (+) -Cys-ZHEK2:342 -6His 重組質粒 BamHI單酶切產物，5為Ikb DNA Marker。圖2為本發明實施例1的pET32a(+)-CyS-Zhek2:342_6His重組表達質粒的結構示意圖。圖3為本發明實施例1中CyS-ZHEK2:342 -6HiS重組親合體在大腸桿菌中高效表達的Tricine SDS-PAGE分析及分步純化過程。在圖3中，I代表重組菌BL21 (DE3)-pET32a-Cys-ZHEE2:342 -6His的超聲破碎上清液，2代表鎳柱親和層析初步純化後的融合蛋白Trx-Cys-ZHEE2:342 -6His, 3代表Trx-Cys_ZHEK2:342 -6His的腸激酶酶切產物,4代表凝膠柱層析純化後的重組親合體CyS-ZHEK2:342 -6HiS，5代表蛋白質分子量標準。圖4為實施例1獲得的重組親合體CyS-ZHEK2:342-6HiS的質譜結果圖。圖5為本發明實施例2中的Z_:19(l7重組親合體DNA片段及重組質粒pET32a (+) -Cys-Z腿:19(l7-6His 酶切驗證圖。在圖 5 中，I 為 Zegfe:1907，2 為 2000bp DNA Marker,3 為 pET32a (+)質粒 BamH I 單酶切產物，4 為 pET32a (+) -Cys-ZEGFE:1907-6Hi s 重組質粒 BamHI單酶切產物，5為Ikb D NA Marker。圖6為本發明實施例2的pET32a (+) -Cys-ZEGFE:1907-6His重組表達質粒的結構示意圖。圖7為本發明實施例2中CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS重組親合體在大腸桿菌中高效表達的Tricine SDS-PAGE分析及分步純化過程。在圖7中，I代表蛋白質分子量標準，2代表對照菌BL21 (DE3)的超聲破碎上清液，3代表重組菌BL21 (DE3) -pET32a-Cys-ZEGFR:1907-6His的超聲破碎上清液，4代表鎳柱親和層析初步純化後的融合蛋白Trx-CyS-Zkfk:19(l7-6HiS，5代表Trx-CyS-Zkfk:19(l7-6His的腸激酶酶切產物，6代表凝膠柱層析純化後的重組親合體Cy S-Zegfe.1907_6Hi s。圖8為本發明實施例2獲得的重組親合體CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS的質譜結果圖。圖9為重組親合體核苷酸序列示意圖。
具體實施例方式下面通過實施例和附圖對本發明進行具體描述，本實施例只用於對本發明作進一步的說明，不能理解為對本發明保護範圍的限制，本領域的技術人員根據上述發明的內容做出的一些非本質的改進和調整，均屬本發明的保護範圍。
實施例1:CyS-ZHEK2:342 -6HiS重組親合體的構建及其表達和純化方法(I) CyS-Zhee2.342_6His重組親合體表達質粒的構建首先,設計重組親合體Cys-ZHEK2:342 -6His的核苷酸序列。在親合體Zhek2:342的鹼基序列前端加入 24 個鹼基:GGATCCGACGATGACGACAAATGC(SEQ:1D:N0.3)。在親合體 Zhek2:342 的鹼基序列後端加入 30 個鹼基:CATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG(SEQ:1D:N0.4)。說明:在SEQ:1D: N0.3 中，GGATCC 為 BamH I 酶切位點，GACGATGACGACAAA 編碼腸激酶酶切位點DDDDK，TGC編碼半胱氨酸Cys。在SEQ:1D: N0.4中，CATCACCATCACCATCAT編碼6His-Tag純化標籤，TAATAG為兩個終止密碼子，CTCGAG為Xho I酶切位點。其次，依據大腸桿菌的密碼子偏好性對重組親合體CyS-ZHEK2:342-6HiS的核苷酸序列進行鹼基優化，優化後重組核苷 酸序列如下:GGATCCGACGATGACGACAAATGCGTTGATAACAAGTTTAACAAAGAAATGCGCAACGCGTACTGGGAAATCGCACTGCTGCCGAACCTGAACAACCAGCAGAAACGTGCCTTCATTCGTTCCCTGTATGATGACCCTAGCCAATCTGCTAACCTGCTGGCAGAGGCGAAAAAACTGAATGATGCTCAGGCGCCAAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG(SEQ:1D:N0.1)說明:中間下劃線部分為親合體Z順:342的編碼序列。重組親合體CyS-ZHEK2:342 -6HiS鹼基優化後的基因片段由人工合成獲得，將此基因片段與pET32a(+)或pET22b(+)等表達型質粒分別進行BamH I, Xho I雙酶切反應。反應條件為:37°C水浴，酶切過夜。酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分離後割膠回收得到，用T4連接酶將雙酶切後的重組基因片段與質粒片段連接，構建重組親合體表達質粒，重組質粒通過酶切結果驗證。重組質粒pET32a-Cys-ZHEK2:342-6His的酶切結果見圖1,證明重組質粒構建正確。重組質粒pET32a-Cys-ZHEK2:342 -6His的結構示意圖見圖2。(2)利用大腸桿菌高效表達重組親合體CyS-ZHEK2:342 -6HiS製備大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，用氯化鈣或電穿孔等轉化方法將已構建的重組表達質粒轉化到BL21(DE3)中，誘導表達重組親合體。表達具體步驟如下:活化菌體，分離單菌落，接種至含有100 μ g/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中，37°C，200rpm前培養12h。以1%接種量將前培養菌液接種於500mL含有100 μ g/mL氨苄青黴素的LB液體培養基擴大培養，37 V，200rpm振蕩培養3 6h後，加入IPTG (0.5mM) 37°C誘導4 6h。由於pET32a-CyS-ZHEK2:342 -6HiS的表達產物為胞內可溶性蛋白，因此可通過超聲破碎細胞獲得表達產物。4°C，10000rpm，5min收集菌體。100W超聲下破碎細胞，破碎時間為IOmin (工作10s，停10s)。4°C，12000rpm，IOmin收集超聲破碎上清液，獲得胞內可溶性表達產物，用Tricine SDS-PAGE電泳驗證表達產物。(3)重組親合體Cys-ZHEK2:342 -6His的純化方法重組大腸桿菌BL21 (DE3) -pET32a-Cys-ZHEK2:342 -6His 的表達產物含有 6His_tag 純化標籤，因此用快速蛋白質液相層析系統(FPLC)結合鎳柱親和層析可初步純化融合蛋白Trx-Cys-ZHEE2:342 -6His,簡要步驟如下:超聲破碎上清液用0.22 μ m濾膜過濾後即為上樣樣品；先依次用5個柱體積的蒸餾水和結合液(20mM磷酸鈉，500mM氯化鈉，20mM咪唑，pH7.4)分別衝洗並平衡柱子(GE，HisTrap HP預裝柱)，流速為5mL/min ;再將樣品打入上樣環；用5個柱體積的結合液漂洗柱子至UV280nm基線水平，使目標蛋白與柱子結合，雜蛋白隨結合液流出；隨後用洗脫液(20mM磷酸鈉，500mM氯化鈉，200mM咪唑，pH7.4)進行洗脫，收集洗脫峰，得到含有重組親合體的融合蛋白Trx-Cys-ZHEK2:342-6His。將融合蛋白Trx-CyS-ZHEK2:342 -6HiS置於透析袋中，於4°C下，用腸激酶酶切緩衝液透析；透析完成後，再用腸激酶rEK酶切12 24h，使融合蛋白前端Trx被完全切除；最後用Superdex75 10/300GL凝膠柱層析(流動相為0.0lM PBS緩衝液,流速為1.5mL/min)分離得到目標產物:重組親合體CyS-ZHEK2:342 -6HiS。蛋白含量採用BCA方法測定，最後產物純度約為97.8%，回收效率1.0mg/mL。將最終純化產物用低溫真空冷凍乾燥獲得重組親合體Cys-ZHEE2:342 -6His的凍乾粉，_20°C儲存備用。重組親合體Cys-ZHEK2:342 -6His的純化過程及最終純化產物的Tricine SDS-PAGE電泳驗證見圖3。(4)表達產物重組親合體Cys-ZHEK2:342 -6His的鑑定取少量Cys-ZHEK2:342 -6His純化產物置於透析袋中，用蒸餾水透析；基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(MALD1-TOF)測定產物的精確分子量。取2 μ L透析後樣品與I μ L基質混勻後上樣，測得純化產物的分子量為7.648kDa (圖4)，與Cys-ZHEK2:342 -6His的理論值
7.631kDa，誤差0.2%，表明構建的Cys-ZHEK2:342 -6His重組親合體正確。實施例2:Cys-ZEGFE:1907-6His重組親合體的構建及其表達和純化方法(I) Cys-ZEGFE:1907-6His重組親合體表達質粒的構建首先，設計重組親合體Cys-ZEeFK:1907-6His的核苷酸序列。在親合體Zkfk:1907的鹼基序列前端加入 24 個鹼基:GGATCCGATGACGATGACAAGTGC(SEQ:1D:N0.5)。在親合體 Z_:19(l7的鹼基序列後端加入 30 個鹼基:CATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG(SEQ:1D:N0.4)。說明:在SEQ:1D: N0.5 中，GGATCC 為 BamH I 酶切位點，GATGACGATGACAAG 編碼腸激酶酶切位點DDDDK，TGC編碼半胱氨酸Cys。在SEQ:1D: N0.4中，CATCACCATCACCATCAT編碼6His-Tag純化標籤，TAATAG為兩個終止密碼子，CTCGAG為Xho I酶切位點。其次，依據大腸桿菌的密碼子偏好性對重組親合體CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS的核苷酸序列進行鹼基優化。優化後重組核苷酸序列如下:GGATCCGATGACGATGACAAGTGCGTGGATAACAAATTCAACAAAGAGATGTGGGCGGCATGGGAAGAAATCCGTAACCTGCCAAACCTGAATGGTTGGCAGATGACCGCCTTTATTGCGAGCCTGGTTGATGACCCTTCTCAGTCCGCTAACCTGCTGGCTGAAGCGAAAAAACTGAACGACGCACAAGCTCCGAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG(SEQ:1D:N0.2)說明:中間下劃線部分為親合體Zkfot的編碼序列。重組親合體CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS鹼基優化後的基因片段由人工合成獲得，將此基因片段與pET32a(+)或pET22b(+)等表達型質粒分別進行BamH I, Xho I雙酶切反應。反應條件為:37°C水浴，酶切過夜。酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳分離後割膠回收得到，用T4連接酶將雙酶切後的重組基因片段與質粒片段連接，構建重組親合體表達質粒，重組質粒通過酶切結果驗證。重組質粒pET32a-Cys-ZEeFK:19Q7-6His的酶切結果見圖5，證明重組質粒構建正確。重組質粒pET32a-Cys-Z EeFK:19(l7-6His的結構示意圖見圖6。(2)利用大腸桿菌表達重組親合體CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS製備大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，用氯化鈣或電穿孔等轉化方法將已構建的重組表達質粒轉化到BL21(DE3)中，誘導表達重組親合體。表達具體步驟如下:活化菌體，分離單菌落，接種至含有100 μ g/mL氨苄青黴素的LB液體培養基中，37°C，200rpm前培養12h。以I %接種量將前培養菌液接種於500mL含有100 μ g/mL氨苄青黴素的LB液體培養基擴大培養，37°C，200rpm振蕩培養:T6h後，加入IPTG(0.5mM) 37°C誘導4 6h。由於pET32a-Cys-ZEGFE:1907-6His的表達產物為胞內可溶性蛋白，因此可通過超聲破碎細胞獲得表達產物。4°C，10000rpm，5min收集菌體。IOOW超聲下破碎細胞，破碎時間為IOmin (工作10s，停10s)。4°C，12000rpm，IOmin收集超聲破碎上清液，獲得胞內可溶性表達產物，用Tricine SDS-PAGE電泳驗證表達產物。(3)重組親合體CyS-Zegfk:19Q7-6His的純化方法重組大腸桿菌BL21 (DE3)-pET32a_CyS-Zkfk:19Q7_6His 的表達產物含有 6His_tag純化標籤，因此用快速蛋白質液相層析系統(FPLC)結合鎳柱親和層析可初步純化融合蛋白Trx-CyS-ZE(；FK:19(l7-6HiS，簡要步驟如下:超聲破碎上清液用0.22 μ m濾膜過濾後即為上樣樣品；先依次用5個柱體積的蒸餾水和結合液(20mM磷酸鈉，500mM氯化鈉，20mM咪唑，pH7.4)分別衝洗並平衡柱子(GE，HisTrap HP預裝柱)，流速為5mL/min ;再將樣品打入上樣環；用5個柱體積的結合液漂洗柱子至UV280nm基線水平，使目標蛋白與柱子結合，雜蛋白隨結合液流出；隨後用洗脫液(20mM磷酸鈉，500mM氯化鈉，200mM咪唑，pH7.4)進行洗脫，收集洗脫峰，得到含有重組親合體的融合蛋白Trx-Cys-ZEeFK:19(l7-6His。將融合蛋白TrX-CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS置於透析袋中，於4°C下，用腸激酶酶切緩衝液透析；透析完成後，再用腸激酶rEK酶切12 24h，使融合蛋白前端Trx被完全切除；最後用Superdex7510/300GL凝膠柱層析(流動相為0.0lM PBS緩衝液,流速為1.5mL/min)分離得到目標產物:重組親合體CyS-ZEeFK:19(l7-6HiS。蛋白含量採用BCA方法測定，最後產物純度約為98.3%，回收效率1.3mg/mL。將最終純化產物用低溫真空冷凍乾燥獲得重組親合體Cys-Zegfe:1907-6His的凍乾粉，_20°C儲存備用。重組親合體Cys-Z腿:19(l7-6His的純化過程及最終純化產物的Tricine SDS-PAGE電泳驗證見圖7。

(4)表達產物重組親合體CyS-ZEGFK:19Q7-6HiS的鑑定取少量Cys-Z_:19(l7-6His純化產物置於透析袋中，用蒸餾水透析；基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜(MALD1-T0F)測定產物的精確分子量。取2 μ L透析後樣品與I μ L基質混勻後上樣，測得純化產物的分子量為7.493kDa (圖8)，與CyS-ZEeFK:19(l7-6His的理論值7.470kDa，誤差0.3%，表明構建的Cys-ZEeFK:19(l7-6His重組親合體正確。重組親合體核苷酸序列示意圖如圖9所示。本發明提供的重組親合體編碼序列中包含BamH I酶切位點、腸激酶酶切位點編碼序列、半胱氨酸密碼子、親合體編碼序列、6His-Tag序列、終止密碼子和Xho I酶切位點，並依據表達宿主的密碼子偏好性對序列進行了鹼基優化，有利於重組親合體的高效表達、分離純化及後續與目標分子或探針的連接功能化，實現靶向的目的。本發明還提供了重組親合體的分離純化方法，此方法簡單易操作，成本較低，且產物純度高、活性強，易於放大生產。
權利要求
1.關於表達和純化重組靶向親合體Cys-ZHEK2:342-6His的核苷酸序列為: GGATCCGACGATGACGACAAATGCGTTGATAACAAGTTTAACAAAGAAATGCGCAACGCGTACTGGGAAATCGCACTGCTGCCGAACCTGAACAACCAGCAGAAACGTGCCTTCATTCGTTCCCTGTATGATGACCCTAGCCAATCTGCTAACCTGCTGGCAGAGGCGAAAAAACTGAATGATGCTCAGGCGCCAAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG 記為 SEQ:1D: N0.1 ； 其中，中間下劃線部分為親合體ZHER2:342的編碼序列。
2.關於表達和純化重組靶向親合體CyS-ZE(；FK:19(l7-6HiS的核苷酸序列為: GGATCCGATGACGATGACAAGTGCGTGGATAACAAATTCAACAAAGAGATGTGGGCGGCATGGGAAGAAATCCGTAACCTGCCAAACCTGAATGGTTGGCAGATGACCGCCTTTATTGCGAGCCTGGTTGATGACCCTTCTCAGTCCGCTAACCTGCTGGCTGAAGCGAAAAAACTGAACGACGCACAAGCTCCGAAACATCACCATCACCATCATTAATAGCTCGAG 記為 SEQ:1D: N0 .2 ； 其中，中間下劃線部分為親合體ZEeFK:19(l7的編碼序列。
3.關於表達和純化靶向親合體重組蛋白的核苷酸序列，其特徵在於其順序依次為:BamH I酶切位點、腸激酶酶切位點編碼序列、半胱氨酸密碼子、親合體編碼序列、6His-Tag序列、終止密碼子和Xho I酶切位點。
4.關於表達和純化靶向親合體重組蛋白的構建方法，其特徵在於包括以下步驟: O在親合體編碼序列的基礎上設計重組蛋白的核苷酸編碼序列:序列前端依次加入BamH I酶切位點、腸激酶酶切位點編碼序列和半胱氨酸密碼子，序列中間為親合體編碼序列，序列後端依次加入6His-Tag純化標籤序列、終止密碼子和Xho I酶切位點； 2)對重組編碼序列中的所有密碼子按照表達宿主的密碼子偏好性進行鹼基優化； 3)鹼基優化後的重組基因片段由人工合成獲得，再將重組片段進行BamH1、Xho I雙酶切，酶切產物純化後通過連接酶連接到表達質粒上，構建重組表達質粒。
5.向親合體重組蛋白的表達和純化方法，其特徵在於包括以下步驟: 1)將已構建的重組質粒轉化到密碼子偏好對應的宿主中，加入誘導劑誘導重組親合體的表達，驗證重組蛋白是否表達； 2)收集全部表達產物，經鎳柱親和層析初步純化得到融合蛋白，用腸激酶酶切融合蛋白，再用凝膠柱層析進一步分離純化，最後得到高純度的重組親合體。
6.按權利要求5所述靶向親合體重組蛋白的表達和純化方法，其特徵在於在步驟I)中，所述轉化的方法採用電轉化方法。
7.按權利要求5所述靶向親合體重組蛋白的表達和純化方法，其特徵在於在步驟I)中，所述驗證的方法是通過蛋白質電泳方法。
8.按權利要求5所述靶向親合體重組蛋白的表達和純化方法，其特徵在於在步驟I)中，所述誘導劑採用異丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷。
全文摘要
靶向親合體重組蛋白的構建及其表達和純化方法，屬於基因重組及生物分子材料製備技術領域。構建方法在親合體編碼序列的基礎上設計重組蛋白的核苷酸編碼序列；對重組編碼序列中的所有密碼子按照表達宿主的密碼子偏好性進行鹼基優化；鹼基優化後的重組基因片段由人工合成獲得，再將重組片段雙酶切，酶切產物純化後連接到表達質粒上，構建重組表達質粒。表達和純化方法將已構建的重組質粒轉化到密碼子偏好對應的宿主中，加入誘導劑誘導重組親合體的表達，驗證重組蛋白是否表達；收集全部表達產物，經鎳柱親和層析初步純化得到融合蛋白，用腸激酶酶切融合蛋白，再用凝膠柱層析進一步分離純化，最後得到高純度的重組親合體。
文檔編號C12N15/63GK103088019SQ201310027350
公開日2013年5月8日 申請日期2013年1月24日 優先權日2013年1月24日
發明者池小琴, 王效民, 尹震宇, 高錦豪, 朱祥龍, 胡娟 申請人:廈門大學附屬中山醫院