純尿激酶酶原與人血清白蛋白通過二硫橋鍵共價連接形成的血纖維蛋白溶酶原激活劑複合物的製作方法

2023-06-06 00:54:21 4

專利名稱：純尿激酶酶原與人血清白蛋白通過二硫橋鍵共價連接形成的血纖維蛋白溶酶原激活劑複合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及使用尿激酶酶原作為溶解血栓的藥劑，以溶解患者體內的血纖維旦白凝塊。
尿激酶酶原(UK酶原)由單鏈組成，分子量為55千道爾頓，是雙鏈尿激酶(UK)的前體(酶原)。在美國再頒專利32，221中Husain等人對尿激酶酶原作了詳細描述，在本文中作為參考。單鏈尿激酶酶原經酶促轉化作用活化為雙鏈UK形式，其特徵是轉移絲氨酸旦白酶家族到適當位置。尿激酶酶原通過靜脈注射後很快從血漿中清除，約為5-8分鐘。這一清除時間比它的活性衍生物即高分子量的雙鏈UK的清除時間短。
本發明描述了由純尿激酶酶原與人血清白蛋白(HSA)共價連接形成的血纖維旦白溶酶原激活劑複合物。形成的複合物可明顯延遲尿激酶酶原從血漿中清除，同時保留了溶解血纖維旦白的特性。本文所說的「尿激酶酶原」是指天然存在的或重組產生的UK酶原(UK酶原的任何酶原缺失突變型)、或者是任何具生物學活性的UK酶原的單鏈衍生物或片段，該衍生物或片段含有一個能與HSA的游離半胱氨酸殘基進行硫醇一二硫基轉換的胱氨酸殘基，在下文將詳細描述。本文所說的「HSA」是指天然存在的或重組的HSA。本文所說的「純」是指在使用前該複合物實質上(佔重量的95%或更大)不含其它物質(如血液或組織培養物中的其他成分)。
由於本發明所述的複合物比UK酶原本身在體內具有更長的半衰期，因而提高了它在血栓溶解治療中的使用價值。而本發明的複合物不僅可預防血栓形成，而且能長期地預防心血管病變，如已知與血纖維旦白溶解活性受抑制有關的動脈粥樣硬化。
由於在體內的半衰期得到改善，本發明所述的UK酶原HSA複合物可通過靜脈內注射方法用於治療。從而改進了UK酶原本身在治療中使用，因為UK酶原在體內的半衰期短，在治療時必須進行連續靜脈內注射，從而給治療帶來極大的不便，尤其是醫院外的治療。
本發明的其它特徵和優點在下面描述的優選實施例和權利要求中能明顯地看出。
首先對附圖進行描述如下

圖1(a)是完整的單鏈UK酶原分子的模式圖，(Holmes et al，Biotechnology(1985)，3，923-929);圖1(b)顯示單鏈UK酶原與HSA的共價連接。
圖2顯示UK酶原/HSA混合物在37℃中溫育4小時後過濾層析結果。收集0.5ml餾出物測定蛋白質含量(O)和血纖維旦白溶解活性(O)。
圖3是UK酶原在不同介質中溫育後的酶譜。
泳道2-在緩衝液中溫育3-在HSA中溫育4-在CBS血漿中溫育5-在CBS血漿和HSA中溫育6-在血漿中溫育。
7-10表示經過α(HSA)-Sephadex柱後UK酶原與HSA一起溫育。
圖4顯示泳道2-3表示純化的複合物的酶譜。
4-表示純化的複合物與α(HSA)溫育1小時後的酶譜，以及通過α(HSA)-Sephadex柱後純化的複合物的酶譜。泳道3中的樣品在電泳前先在SDS緩衝液中煮沸2分鐘，而不用在37℃ SDS緩衝液中溫育30分鐘這一經典方法。
圖5中泳道2，3，4分別表示pH值為5，7.5，9時UK酶原與純化的HSA中溫育後的酶譜。泳道6，7，8分別是在Zn2+、Ca2+、以及Zn2+和Ca2+存在時UK酶原與純化的HSA溫育後的酶譜。泳道9是UK酶原與HSA濃度比為10時兩者一起溫育後的酶譜。
圖6中顯示泳道2-UK酶原在緩衝液中溫育後的酶譜泳道3、4、5和6分別表示UK酶原在血漿中溫育0小時、1小時、2小時、6小時、的酶譜。
7-表示UK在緩衝液中溫育後的酶譜。
8、9-分別表示在血漿中溫育0，6小時後的酶譜。
10-表示在濃縮尿中溫育後酶譜。
圖7是HSA經DFP和氯胺T處理(不影響形成複合物)以及BSA經DTT處理(使之恢復與UK酶原形成複合物的能力)後得的酶譜。
泳道1-UK酶原在緩衝液中溫育。
2-UK酶原與HSA一起溫育。
3-UK酶原與緩衝液處理的HSA一起溫育4-UK酶原與DFP處理的HSA一起溫育5-UK酶原與緩衝液處理的HSA一起溫育。
6-UK酶原與氯胺T處理的HSA一起溫育。
7-UK酶原以二聚體形式存在於緩衝液。
8-相同二聚體形式的UK酶原與BSA一起溫育。
9-UK酶原與經DTT處理的BSA(恢復硫醇形式)一起溫育。其中二聚體完全消除，存在有UK酶原BSA複合物。
圖8A和8B的酶譜表示PDI對複合過程的影響。
圖8A中泳道1表示單獨存在於緩衝液中的酶原酶譜。泳道2，3，4，5，6，7分別是重組UK酶原(0.5μg/ml)與硫醇白蛋白(40mg/ml)一起溫育，時間分別為0，15分鐘，30分鐘和1小時，2小時，4小時的酶譜。
圖8B中將8A中相應的混合物在PDI(920μg/ml)存在時溫育。
圖9的酶譜表示劑量與形成的複合物的相關性中PDI的作用。
泳道1表示UK酶原單獨存在於緩衝液中。泳道2，3，4，5，6，7表示UK酶原(10μg/ml)和巰基白蛋白(40mg/ml)在PDI濃度分別為0，23，230，460，690，920(μg/ml)時溫育6hr。
圖10是UK酶原與來自於E。Coli的重組HSA(rec-HSA)形成的複合物的酶譜。
圖11中泳道1，2，3，4，5，6，7，8，9，10分別表示37℃時0.5μg/ml的UK酶原在緩衝液中溫育0，6hr，在血漿中溫育0，1hr，4hr，6hr，以及在去除血纖維旦白溶酶原而加入aprotinin(20KIU/ml)的血漿中溫育0，1hr，4hr，6hr後，在37℃的SDS中製得樣品的酶譜。
圖12表示下列樣品的酶譜。
泳道1-表示37℃時0.5μg/ml UK酶原在緩衝液溫育。
泳道2-表示37℃時0.5μg/ml的UK酶原與CBS-HSA(40mg/ml)一起溫育。
3-表示UK酶原(0.5μg/ml)在去除HSA的血漿中溫育。
4-表示UK酶原(0.5μg/ml)在去除HSA的血漿中重新補充HSA後溫育。
5-表示血漿與未經UK-Ab Sepharose柱過濾的UK酶原一起預保溫。
6-9分別表示血漿與經過UK-Ab Sepharose柱過濾後流出的4個部分預培養。
圖13表示下列不同形式的UK(0.5μg/ml)和巰基白蛋白(40mg/ml)預培養6hr後的酶譜(10%SDS-PAGE)。
泳道1-HMW-UK存在緩衝液中的酶譜。
泳道2-HMW-UK和HSA預培養。
泳道3-LMW-UK存在於緩衝液中。
泳道4-LMW-UK和HSA一起培養。
泳道5-重組UK酶原與HSA培養。
泳道6-缺失突變型UK酶原存在於緩衝液中。
泳道7-缺失突變型UK酶原與HSA共培養。
圖14是利用UKAb與下列樣品進行的Western免疫吸印反應。
泳道1-UK酶原(0.3μg/ml)在緩衝液中37℃時培養7hr。
泳道2-UK酶原與未經處理的BSA(40μg/ml)一起溫育。
泳道3-UK酶原與CBS-HSA共溫育。
泳道4-單獨存在的CBS-HSA泳道5-8表示分別與1-4相同的混和物樣品在還原性條件下培養。
圖15顯示泳道1-表示在緩衝液中培養的UK酶原的酶譜。
2，3分別表示在含有0.5mM和5mM氧化型穀胱甘肽(GSSG)的緩衝液中培養的UK酶原的酶譜。
4-6分別表示UK酶原在血漿、含有0.5mM和 5mM的GSSG的血漿中培養時的酶譜。
圖16顯示的酶譜泳道1-5表示UK酶原分別培養於緩衝液、含有10-3M、3×10-3M，6×10-3M，10-2M的DTNB的緩衝液中的酶譜。泳道6-10表示UK酶原分別培養於血漿、含有10-3M、3×10-3M，6×10-3M，和10-2M的DTNB的血漿時的酶譜。
圖17酶譜表示pH和HSA濃度對形成複合物的影響。
泳道1-單獨存在於緩衝液中的UK酶原的酶譜。
泳道2-6分別表示pH為6，7.0，7.4，8.0，8.5時5μg/ml的UK酶原與巰基白蛋白(40mg/ml)在37℃時一起培養24hr後的酶譜。
泳道7-表示標準分子量對照泳道8-10表示5μg/mlUK酶原與濃度分別為80mg/ml，20mg/ml，10mg/ml的HSA在37℃pH＝8時培養24hr的酶譜。
圖18酶譜表示與CBS-HSA相關的UK活性。
泳道1-其中CBS-HSA來自於與UK酶原(0.5μg/ml)預培養20hr的血漿。
泳道2-其中CBS-HSA來自於富含(5μg/ml)UK酶原的血漿(但未經預培養處理)泳道3-表示UK複合物與從新鮮血漿中分離的CBS-HSA發生免疫沉澱反應。
圖19A是包含二組數據的曲線圖。X軸上標示的二組數據表示血漿通過一個標準G-75柱凝膠過濾，收集的餾出部分的數目。Y軸上開環數據表示在280nm的吸收值。Y軸上的閉環數據表示在血纖維旦白的平板上測得的溶解面積(mm2)圖19B顯示收集到的餾出部分(分別與圖11A中的A、B、C、D部分相同)UK免疫沉澱物的酶譜。
本發明所述的UK酶原白蛋白複合物具有下列特性1)在37℃的十二烷基磺酸鈉(SDS)中比在100℃時更穩定。2)在還原性條件下不穩定。3)用二硫蘇糖醇(DTT)預處理的HSA(恢復硫醇形式)可促進複合。4)蛋白二硫同分異構酶(PDI)催化複合反應。5)複合過程受DTNB和GSSG的抑制。複合物的這些特性暗示在白蛋白的游離半胱氨酸殘基與UK酶原的胱AA殘基之間形成一個二硫鍵。由於UK酶原發生缺失突變(丟失了11-135殘基)或存在LMW-UK而不發生複合作用的實驗中可推知形成一個二硫鍵的複合物中UK酶原的胱AA是在A鏈;很可能就是UK酶原NH2末端的配對胱AA之一。
純化的HSA貯存很長時間後，由於游離半胱AA被氧化，阻礙了二硫基交換，導致它與UK酶原形成複合物的能力喪失。但用DTT處理後能重新獲得與UK酶原結合的能力。這種處理是在酸性pH值條件下進行的，以保證維持HSA旦白質構型的二硫鍵的完整性。
在下文將詳細描述本發明所述的溶解血栓組合物的二種製備方法。每一種方法，首先分別純化UK酶原和白蛋白，然後藉助二硫鍵連接結合(見圖1A和1B)。
第一種方法，根據Peters，T.在Advances In Protein Chemistry，37∶161-245(1985)提出的方法，在pH＝6.0時用DTT處理白蛋白，使之恢復硫醇形式。通過滲析移走DTT，然後在PDI存在條件下，UK酶原與白蛋白結合。
第二種方法，純UK酶原與硫醇白蛋白在37℃pH＝8.0培養過程中相結合。
下文描述的第一種方法中，UK酶原是由Collaborative Research Inc.(Bedford，MA)提供的，是從人腎細胞系培養物基質中純化得到的。為抑制微量的UK汙染物，UK酶原與20μM丹磺醯一穀氨酸一甘氨酸-精氨酸氯甲基酮(GGACK)在37℃0.1M HEPES，0.2mg/ml BSA，0.001%吐溫，pH＝7.4時一起培養30分鐘(見Pannell等人在Blood，69∶22-26，1987中的描述)。在下文描述的第二種方法中，UK酶原製劑通過一個Sephadex G-75柱(1×45cm)過濾，用10mM NaAc，0.1m NaCl，0.001%吐溫pH＝4.8進行平衡和洗脫，去除UK酶原二聚體。然後與上面描述的相同方法處理，以抑制微量UK汙染物。
從貯存血漿中純化人血清白蛋白(HSA)的過程採用已公開的方法。以0.63%檸檬酸三鈉和0.9%NaCl平衡Cibacron Blue-Sepharose(CBS)柱(1.5×25cm)，將10ml貯存血漿上柱，過濾，當在280nm的吸收值小於0.02時，用0.2M硫氰酸鈉洗脫HSA，然後在蒸餾水中滲析，凍幹。
採用分批分離方法製備不含血纖維旦白溶酶原的血漿。先將1ml賴氨酸瓊脂糖和5ml血漿在0.005M HEPES和0.15M NaCl(pH＝7.4)中混勻，然後4℃時攪拌2hr，離心，取上清，用經典的血凝塊溶解技術，測定上清中血纖維旦白溶酶原含量。
根據Laemmli描述的方法，進行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)其中聚丙烯醯胺凝膠的含量為7.5%。在沒有其他特殊規定條件下，樣品製備需在非還原條件下進行，將樣品與緩衝液(0.06M Tris-HCl，pH＝6.8 2% SDS)一起在37℃加熱37分鐘，然後電泳。電泳結束後，在2.5% TritonX-100中，洗凝膠，然後按照Wun等人描述的方法將膠鋪在血纖維旦白酶原血纖維旦白瓊脂板上得到酶譜。根據Towbin和Pluskal等人描述的方法(只在規格上作些更改)進行Western吸印。聚丙烯醯胺凝膠和四張濾紙均勻地浸於吸印緩衝液(39mM甘AA，48mM Tris，20% 甲醇，0.0375%SDS)中平衡。二氟化聚偏乙烯(PVDF)膜預先在甲醇中浸幾秒鐘，然後在蒸餾水中平衡10分鐘。進行吸印反應的各個部件裝配成三明治形狀，在LKB Multipore Ⅱ Semi-dry吸印儀，0.8mA/cm2電流時電泳轉移1hr，然後用TTBS(100mM Tris，0.15M NaCl，0.1% Tween-80，pH＝7.5)洗PVDF膜，10分鐘，再在含3%BSA的TTBS浸1hr。
用第一種方法獲得吸印後的PVDF膜後，經過下列兩次培養，然後進行免疫著色試驗。首先將上述得到的PVDF膜與兔的UK抗抗體(10μg/ml)或HSA的單克隆抗體(以1500稀釋度)在0.25%BSA的TTBS中37℃培養。然後將該膜與羊抗兔或兔抗鼠免疫球旦白(IgG)鹼性磷酸酶結合物(Sigma)(以11000稀釋度)在0.25%BSA的TTBS中37℃時培養1hr。利用第二種方法獲得的膜，首先在13μg/ml的α(UK)和0.25%BSA的TTBS溶液中37℃培養2hr，然後與鹼性磷酸酶結合物(以1500稀釋度)在0.25%BSA的TTBS中37℃培養2hr。
顏色反應是利用5-Br-4-Cl-3-吲哚磷酸甲苯胺鹽(0.15mg/ml)和p-硝基藍tetrazolium Chloride(0.3mg/ml)在碳酸緩衝液(0.1M碳酸鈉，1mM MgCl2，pH9.8)中進行。每次培養後，將PVDF膜在TTBS中洗三次，時間為10分鐘。最後在碳酸緩衝液中洗15分鐘，然後進行顏色反應。
按經典方法在37℃時用Kabi底物S2444測定UK酶原/UK醯胺溶解活性。反應緩衝液含0.1M Tris-HCl，0.1M NaCl，0.1mg/ml BSA，100μ/ml aprotinin，pH＝8.8，和0.75mM的底物。用1∶1的鹽水5%乙酸終止反應，在405nm測定吸收值。血纖維旦白酶原激活因子的活性可用標準瓊脂血纖維平板或穀氨酸-血纖維旦白酶原和Kabi底物S2251測定。
方法1根據Peters，T。在Adv，prot，chem，37∶161-245，1985中描述的方法，用10mM二硫基蘇糖醇(DTT)在50mM MES，0.15M NaCl pH＝6.0處理HSA或BSA，以再生硫醇形式HSA和BSA，且從理論上計算每分子巰基白蛋白應含1個-SH。在pH為5-7時可保存維持構型的二硫鍵。通過滲析移走DTT，在920μg/ml PDI存在時將5μg/ml UK酶原與一種HSA試劑(40mg/ml)或與BSA，在0.1M HEPES緩衝液(pH＝8.0)中37℃時至少培養4hr以製備UK酶原白蛋白複合物。最後將200μl上述混合物通過Sephadex G-75柱(1×45cm)過濾，用0.1M HEPES，pH7.5，0.15M NaCl，0.001%吐溫80，20KIU/ml aprotinin平衡和洗脫，收集0.5ml流出物，測定旦白質含量(280nm時的吸收值)和溶解血纖維旦白的活性，在非還原性條件下，複合物遷移出表觀分子量約為100KDa的部分(已被定為標準)，但在該條件下，複合物遷移發生在UK酶原形成二聚體後。因此UK酶原HSA複合物的實際分子量約為120KDa。相當於120KDa複合物的3個流出部分被貯存。
應該注意，在培養步驟中使用固定化PDI，而不是PDI溶液。
方法2UK酶原HSA複合物通過下列步驟製備。5μg/ml UK酶原與40mg/ml HSA在0.1M HEPES緩衝液中37℃培養4hr，然後將200μl該混和物通過Sephadex G-75柱，用0.1M HEPES pH＝7.5，0.15M NaCl，0.001%吐溫80，20KIU/ml aprotinin平衡和洗脫，收集0.5ml流出物，按標準旦白質分析方法測定旦白質含量，用血纖維旦白平板測得溶解血纖維旦白活性，結果見圖2，(其中30-31-32流出部分貯存)。
用一種不溶性的多克隆UK抗體識別UK酶原HSA複合物，實驗結果見圖3所示。已純化的UK酶原HSA複合物與HSA抗抗體在37℃培養1hr，在酶譜上顯示的120KD裂解帶被一條更高分子量的帶所代替，表明複合物與HSA的抗體結合(見圖4所示)。同樣，純化的複合物能結合到α(HSA)Sepharose柱上。這些發現證實了複合物的組成成分。
HSA或BSA經長期貯存後，由於游離半胱AA被氧化，使HSA或BSA與UK酶原形成複合物的能力降低。用5，5′-二硫雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)滴定有用的游離半胱AA(處於天然狀態)方法測定不新鮮的商品HSA，結果表明每10分子商品HSA含1個游離半胱AA。相反，用上述方法2純化後的新鮮HSA，每2分子含有一個游離半胱AA，因此，在培養形成複合物前，建議在pH＝6.0時用DTT處理HSA和BSA。
pH＝8.0時對複合物形成更有利，圖5所示。在pH＝7.5時UK酶原與HSA能形成複合物(如其中3所示)，但在pH＝5或9時沒有複合物形成(見2和4所示)。6、7、8分別表示加入50μM Zn2+、5mM Ca2+和Ca2++Zn2+對複合物形成沒有影響，但是5-10μM Cu2+抑制複合物形成。
已發現在正常血漿中自發地產生UK酶原HSA複合物，從正常血漿中純化得到的HSA與UK酶原有關。因此，UK酶原HSA複合物天然存在。在這些實驗中，UK酶原與不含血纖維旦白溶酶原的血漿一起培養，血纖維旦白溶酶原激活因子的分子量可用酶譜分析測定。
UK酶原加到500ng/ml的血漿中，在37℃培養1-6hr，在此過程中，其酶促活性的部分以表觀分子量為100KDa(實際分子量為120KDa)進行遷移。圖6顯示遷移的酶譜。其中2-6和8-9分別表示存在於緩衝液中的UK酶原與UK的酶譜。3和8、4、5以及6和9分別表示UK酶原和UK在血漿中培養時間為0、1、2或6hr的酶譜。在血漿中產生的這種新的高分子量(HMW)譜帶是緩慢的依賴於時間現象。儘管由酶譜定量只不過是粗略估計，但從酶譜可大概知道在血漿中培養6hr後，酶活性的10%是由120KD(測得的實際值)分子產生的。從UK酶原在緩衝液中培養時沒有HMW裂解帶出現可排除UK酶原二聚體的形成。而且，如果UK酶原二聚體形成，應該遷移至複合物的前面(見圖7、8B、9、10)。這個發現暗示UK酶原結合一個分子量約65千道爾頓的血漿旦白形成一個約120千道爾頓的化合物。
曾在尿和血漿中觀察到由雙鏈UK和一種UK抑制物PAI-3組成的具相同分子量的複合物。但是，根據下列理由，說明上述發現中排除了這種複合物存在的可能性(1)UK酶原與PAI-3不形成複合物;(2)UK酶原在血漿中是穩定的。在實驗所用濃度時，UK酶原不會活化形成雙鏈UK。最後一點，複合物形成不受加入的UK抑制物(Glu Gly Arg氯甲基酮)、血纖維旦白溶酶原抑制物(aprotinin 20KIU/ml)的抑制或者由於去除血漿中的血纖維旦白溶酶原而阻礙形成。
再者，在UKPAI-1(血纖維旦白溶酶原激活因子抑制劑-1)複合物的培養和形成過程中活化UK酶原與上述結果不相符。因為後一種複合物遷移的分子量約為95KD，同時伴隨有分子量約為125KD和155KD的其他抑制劑複合物的產生。(Kruith of，E.K.O.et al;Blood，64∶907-913(1984))，而且在凝膠頂端存在能與α2-巨球旦白-Ab反應的第四種複合物。而且，為了減少在培養過程中UK酶原活化的可能性，可進行附加實驗將aprotinin(20KIU/ml)加入到去除血纖維蛋白酶原的血漿中。這些步驟沒有抑制120KD複合物的形成(圖11中7-10所示)。
但是，當UK酶原與不含HSA的血漿(CBS血漿)培養時，沒有高分子量的激活因子複合物產生，如圖3所示。這些結果證明在血漿中觀察到的複合物是由UK酶原和HSA結合形成的。
5μg/ml UK酶原與新鮮純化的CBS-HSA(40mg/ml)在0.1M HEPES pH＝7.4 37℃一起至少培養4hr，用SDS-PAGE和酶譜鑑定該混和物時，常出現一條分子量約120KD的譜帶(圖12中的2所示)，相反UK酶原在不含CBS的血漿培養時，沒有複合物形成(見圖12的3所示)。在不含CBS的血漿中加入足量的CBS-HSA後重新形成複合物(見圖2中的4所示)。將含有所說複合物的血漿(圖2的5)通過一個UK-Ab sepharose柱移走該複合物(見圖2的6-9所示)。
UK酶原與HSA和BSA的商品製劑一起培養時也可觀察到複合物的形成，但必須用DTT預處理以恢復硫醇形式。
以UK酶原與CBS-HSA一起培養形成的複合物可用Sepha-dex G-75凝膠過濾分離，然後用SDS-PAGE方法分析。將樣品煮沸，該複合物被完全分解，在凝膠酶譜圖上能看到37℃時只有部分(＜50%)化合物被分解(圖譜資料未列出)。
由於發現HMW-UK與HSA一起培養時也形成一種複合物(見圖13中的2所示)，但HMW-UK在緩衝液中培養時又不形成該複合物(圖13的1所示)，因此必須測定由UK和一種抑制物(與HSA在CBS柱上其純化得到)組成的複合物出現的可能性。
這種複合物遷移後在酶譜上顯示出的分子是約為120KD，相當於UK酶原在血漿中培養時形成的複合物(圖13中5所示)。但是LMW-UK(Abbokinase)與HSA培養時沒有複合物形成(見圖13的3，4所示)。而且UK酶原的缺失突變體(丟失了第11-135位殘基)與HSA共培養時也不形成複合物(圖13的7所示)。這些結果表明複合物不是UK抑制物形成的，UK的A鏈參與複合反應，旦白酶的另一條鏈不參與。
為進一步排除UK抑制物複合物形成，用DFP預處理CBS-HSA，以抑制絲AA旦白酶汙染物。DFP處理後不影響CBS-HSA與UK酶原形成複合物(如圖7中4所示，與2和3相比較)。其次，用能使Serpin s失活的氯胺T處理HSA製劑可排除Serpin汙染物(Stief et al.，Biol.Chem，Hoppe-Seyler，369∶1337-1348(1988))。這種處理也不抑制複合物的形成。因此，觀察到的UK酶原或HMW UK形成的複合物中沒有抑制劑參與。(圖7的6所示，與5相比較，其中HSA未經處理)。
UK酶原與CBS-HSA共培養時，用UK多克隆抗體進行的Western免疫吸印反應，產生一條分子量約為120KD的譜帶(見圖14中3所表示)。但如果UK酶原在緩衝液培養(圖14的1所示)或與未經DTT預處理的BSA共培養(圖5的2所示)時不出現120KD譜帶。作為對照的CBS-HSA與該抗體不發生可見的反應(見圖14中的4和8)在還原性條件下，分子量約為120KD的複合物發生分解，暗示該複合物是通過二硫鍵連接的(圖14中的7所示)。
有其他證據證明UK酶原白蛋白複合物是通過二硫鍵連接的。首先，當類似於氧化型穀胱甘肽或DTNB的巰基試劑加到方法2的反應混合物中時，能抑制複合物形成(下面詳述)。氧化型穀胱甘肽加入血漿中後，在37℃時反應能進行2hr。試驗結果見圖15的酶譜，其中1-3表示在緩衝液中培養UK酶原時的酶譜。UK酶原HSA形成的複合物隨加入穀胱甘肽濃度的增大而減少，其中2和5表示加入的穀胱甘肽濃度為0.5mM，3和6表示加入穀胱甘肽濃度為5.0mM，如圖15中1-3所示，穀胱甘肽不會抑制UK酶原的溶解血纖維旦白活性。這種對穀胱甘肽的響應暗示複合物中包含了白蛋白的游離半胱AA，從而說明UK酶原與HSA是通過二硫鍵連接。同樣，利用能與游離半胱AA反應的DTNB進行試驗，結果表明DTNB抑制複合物的形成。圖16是UK酶原培養於緩衝液中的酶譜(其中1-5所示)，其中6-10表示UK酶原與HSA在DTNB存在時共培養產生的酶譜。其中1和6所用DTNB濃度為0.0M，2和7所用DTNB濃度為1mM，3和8所用DTNB濃度為3mM，4和9所用DTNB濃度為6mM，5和10所用DTNB濃度為10mM。
其次，HSA或BSA的商品試劑與UK酶原形成少量或不形成複合物。如圖7中的8所示，(只形成一個UK酶原二聚體)以及圖14中的2所示，而且，與新鮮製劑CBS-HSA發生絡合隨著貯存時間增加而減少。但是，所有這些試劑用DTT處理後重新獲得與UK酶原形成複合物的能力。DTT對商品BSA試劑的影響如圖7中的9所示。在pH＝5-7時用DTT處理恢復硫醇形式的作用不會引起結構型二硫鍵的分解，如Peters，T.在Adv.Prot.Chem.，37∶161-245(1985)所描述。因此該結果表明HSA或BSA中存在的一個有用的半胱AA巰基是與UK酶原形成複合物所必需的。
第三，DTNB滴定反應表明DTT處理前與處理後，商品HSA中可利用半胱AA比例為0.10.6。處理後的數據可與新鮮製備的CBS-HSA相比。因此，HSA試劑中可利用半胱AA數目與該試劑與UK酶原形成複合物之間呈正相關性。
第四，培養混和物含有催化巰基-二硫基轉換的PDI(Freed-man，R.B.，Cell，57∶1069-1072(1989);Gilbert，H.F.，Biochem.，28∶7298-7305(1989))存在時，能加快複合反應速度。如果沒有PDI存在，培養4hr後才能看到形成的複合物(圖8A所示)，但是在920μg/ml PDI存在時，培養1hr就能形成複合物(圖8B)。PDI的作用與它的濃度具相關性如圖9所示。其中UK酶原(10μμg/ml)與巰基白蛋白試劑(40mg/ml)在PDI濃度為0，23，230，460，680，或920μg/ml時一起培養6hr。PDI存在時UK酶原二聚體形成也進一步增加(如圖8A，8B和9所示)。表明這些二聚體是通過二硫鍵連接的。所需PDI量越大說明該酶效能越低。
將樣品在SDS中煮沸2分鐘能抑制複合物形成(圖14中的3所示)，說明存在有在煮沸時不穩定的二硫鍵連接的複合物。但是在抑制二硫基轉換的CuCl2存在時(CuCl2為1mm)，該複合物對沸騰具抗性。Volkin和Klibanov曾報導某些通過二硫鍵連接的結合物中二硫鍵在受熱時分解的特性。(Volkin et al.，J.Biol.Chem.，262∶2945-2950(1987))。
UK酶原的胱AA與白蛋白的未配對的半胱AA之間通過二硫鍵連接後，使結合白蛋白的UK酶原具有一個游離半胱AA。該游離的半胱AA能與另一個UK酶原分子的胱AA或另一個白蛋白分子的半胱AA反應。在這種情況下，形成的複合物不是由一分子UK酶原和一分子白蛋白組成，而是二分子UK酶原分子與一分子白蛋白結合或二分子白蛋白與一分子UK酶原結合。本發明已鑑定的這種三者聯合的複合物屬於本發明所述的複合物範圍內。
培養在pH為6-8.5範圍內進行時，可看到形成複合物的最適pH值約為8-8.5(圖17中的1-6所示)。因此，大多數實驗是在pH＝8.0時進行。利用HSA試劑與UK酶原的一系列濃度比值範圍進行實驗，結果表明決定複合物形成的主要限制因子是HSA濃度，結果見圖17中的8-10所示。其中與UK酶原(5μg/ml)共培養的用DTT處理過的商品HSA濃度分別為80，20，10mg/ml。UK酶原濃度的提高不會加強複合物的形成。而且在過量HSA存在時，24hr後複合物形成逐漸達到停滯狀態。
上述結果暗示UK酶原複合物可能是HSA或BSA製劑中存在的少量汙染物。將HSA試劑用DEAE cellulose層析或通過伴刀豆球旦白-A Sepharose過濾除去汙染物的方法不會改變它與UK酶原試劑反應的能力。因此，如果是存在有微量的旦白質汙染物，也只能是糖旦白。除少數例外(HSA，transthyretin，結合蛋白質維生素A血漿旦白全是糖旦白(Peters，T，adv.prot.Chem.，37∶161-245(1985))。
根據方法1得到的UK酶原與高度純化的，經DTT處理HSA形成的複合物經SDS-PAGE電泳後從凝膠上電洗脫，然後，再次SDS-PAGE電泳。UK-Ab免疫吸印反應表明複合物分子量約為120KD。但是，雖然在大量實驗中這種複合物可通過HSA多克隆抗體識別，但在本實驗中用HSA單抗體不能識別(沒有顯示資料)。這種相矛盾的結果可以解釋為是由於HSA分子中能被這種單克隆抗體識別的主要抗原決定基被複合物掩蓋了。而且，這種相反的發現說明UK酶原複合物有可能是存在於HSA或BSA中少量血漿旦白汙染物。因此，實驗中可使用來自於E.Coli的重組HSA(rec-HSA)進行。這種HSA不含任何血漿旦白汙染物。
用DTT處理前(-)和處理後(+)，將Rec-HSA和天然HSA(40mg/ml)分別與UK酶原(5μg/ml)一起培養6hr，對培養混和物進行酶譜分析表明利用天然的或重組的HSA都能形成分子量約為120KD的複合物(c)，且用DTT預處理(+)HSA試劑可增加該複合物的形成。經DTT處理後也可促進高分子量複合物(c′)的形成，這種複合物中與HSA複合後的UK酶原可能含有未配對的半胱AA。從圖10可看出，UK酶原二聚體恰好遷移在120KD複合物之前。
可測定未被結合的UK酶原不能與HSA一起用CBS親和層析方法純化(用0.5M NaCl充分衝洗柱)。將UK酶原(5μg/ml)加入到血漿中立即進行CBS親和層析實驗結果證明了上述結論。在這些條件下，洗脫出的HSA在酶譜上不顯示可測定的溶解血纖維旦白活性(如圖18中的2所示)游離的UK酶原逐漸被0.5M NaCl衝洗掉。相反，如果將血漿與UK酶原(5μg/ml)在37℃預培養20hr，以形成複合物，經CBS純化的HSA的酶譜上顯示出與之相關的溶解血纖維旦白活性。從這種HSA酶譜上可看到，具有120KD和55KD的兩條遷移譜帶(如圖18中的1所示)。由於游離UK酶原不能進行共純化，因此55KD帶有可能是樣品製劑保存在SDS中，HSA複合物分解而產生的UK酶原的譜帶。
為測定血漿本身含有的UK酶原能否與HSA形成同樣的複合物，通過CBS層析方法(用0.5M NaCl充分洗滌層析柱)將約600mg的HSA從新鮮血漿中純化。純化後的HSA用葡萄球菌旦白A UK抗抗體吸附劑處理(如前面圖中6-9所示)，然後用以識別複合物中的UK酶原。產生的免疫沉澱在SDS樣品緩衝液中煮沸以分解抗原-抗體複合物。這些條件也引起UK酶原HSA複合物分解。隨後得到的酶譜出現了55KD裂解帶，暗示在HSA試劑中存在有UK酶原(圖18中的3所示)。由於游離的UK酶原不能用CBS親和層析方法純化，上述結果也證明在CBS柱上從血漿中分離出的UK酶原已經與HSA形成結合物。因此，在正常血漿中發現的結果和在富含UK酶原的血漿培養6hr或6hr以上後觀察到的結果相一致。從CBS親和層析方法分離出的UK是一種UK抑制劑複合物，而不是UK酶原HSA複合物的可能性幾乎是不存在的，因為UK形成的抑制劑結合物在100℃的SDS中是穩定的(Kruithof，Blood，64∶907-913(1984);Cieplak et al.，Thrombos.Haemostas.，53∶36-44(1985);Stump et al.，J.Biol.Chem.，261∶12834-12841(1986))，從而在SDS-PAGE 後遷移的分子量≥95KD。
為了測定血漿本身含有的UK酶原(以複合物形式存在)的含量，將20ml新鮮血漿(含20KIU/ml aprotinin)通過Sephadex G-75柱過濾。使血漿旦白分解為兩個主峰值(見圖19A)。在凝膠過濾前以富含UK酶原的血漿樣品校對過濾柱，37℃預培養20hr以形成複合物然後測定游離UK酶原和UK酶原HSA複合物的位置。在血纖維旦白平板上測定收集到流出物的溶解血纖維旦白的活性(如圖19A所示)。在相應於D區域的112-119號流出物中發現有游離UK酶原存在，在對應於B區域的95-100號流出物中發現有UK酶原HSA複合物存在。
此後，正常血漿用上面所說的Sephadex G-75柱凝膠過濾進行分析。血漿本身的溶解血纖維旦白活性可通過免疫沉澱和酶譜分析測定。流出物被分成四批貯存如圖19A所示。圖19B表示能測定的溶解血纖維旦白的活性主要存在於相應於具高分子量的流出部分的B貯存部分中。在這些分子中含有洗脫出的UK酶原複合物(圖19A)。在具更高分子量的A貯存部分中也發現存在有少量UK活性(如圖19B)。用UK酶原與純化的HSA培養的某些實驗中也會形成高分子量的UK酶原HSA複合物(如圖10)，可推斷複合物中含有多於1分子的HSA或UK酶原。在相當於游離UK酶原分子量的D貯存部分沒有UK活性。因此，在血漿中測得的所有UK活性者是以複合物形式存在的。由於在SDS中製備樣品時，複合物發生分解產生了在酶譜上看到分子量約為55KD的酶帶(如圖19B的酶譜)。因此觀察到的複合物不是一種UK抑制劑複合物。這種發現暗示正常血漿自身所含UK酶原的大部分是以相當於由UK酶原與HSA形成複合物的形式存在的。
假定肝臟中UK酶原分子的UK受體識別位點掩蔽在本發明所述的複合物內，因此，結合態的UK酶原的半衰期長(幾小時-幾天)。相應的游離UK酶原半衰期只有5-8分鐘。複合物中的UK酶原的溶解血纖維旦白的特性不受損失，UK酶原白蛋白複合物有希望成為治療上更合適的溶解血栓藥物。本發明應從實質上減少UK酶原的劑量，不需要不斷的注射，從而促進了治療速度。
本發明所述的UK酶原白蛋白複合物與其他血纖維旦白酶原激活劑如t-PA，UK，和UK酶原可用於治療相同的症狀。目的是溶解血管內的血凝塊(血栓)。現代的臨床病症包括心肌梗塞、深靜脈血栓形成，肺栓塞。本發明所述的複合物與合適的生物學載體基質如鹽水相混合，通過靜脈內注射引入體內。複合物與t-PA，或與UK酶原具協同效應的物質混合後更具優點。這種混和物也可通過簡單的靜脈內注射引入體內，簡化了治療程序，且可以攜帶到家裡。t-PA啟動溶解反應且很快清除，由作用時間長的UK酶原完成溶解過程。
另外，本發明的複合物能用於提高血液本身的溶解血纖維旦白的活性，從而可用於長期抑制與溶解血纖維旦白活性降低有關的心血管疾病。長期以來，人們認為血栓形成是導致動脈粥樣硬化病變的致病因素。利用本發明所述的複合物以每周或每月進行周期性靜脈內注射可抑制動脈粥樣硬化。
最後，具酶解活性的HMW-UK和白蛋白的複合物形式也有一定的臨床使用價值，因為HMW-UK是UK酶原的酶活性形式。它能與幾種血漿抑制劑反應。因此只有在這些抑制劑被消耗後，才能延長這種複合物的半衰期，因此這種複合物由於具有更長的半衰期從而比HMW或LMW-UK具有優點，由於半衰期長，降低了費用，簡化了治療程序。
實施例1用於血栓應急治療的靜脈內注射方法，將5-20mg凍幹的UK酶原白蛋白複合物與鹽水混和，使之進入注射器管腔內將丸劑注射到病人靜脈內。
實施例2快速溶解冠狀血栓的方法，將5-20mg凍幹UK酶原白蛋白複合物溶於鹽水中，與2mg UK一起注射。UK可加快溶解啟動。由於複合物半衰期長，因而可抑制血栓的重新形成，又可完全溶解已形成的血栓。
實施例3治療深血管血栓、肺血栓時，將5-20mg凍幹UK酶原白蛋白複合物溶於鹽水中，靜脈注射，如果需要可重複注射，所用的幾種注射劑量不會產生非特異性的血纖維旦白酶原的活化。
實施例4t-PA與凍幹UK酶原白蛋白複合物組成的協同結合物通過靜脈注射治療血栓時，將5-20mg t-PA與5-20mg UK酶原白蛋白複合物混和，通過簡單的靜脈注射引入體內，t-PA將很快被清除，而複合物將留在血液循環中，以完全溶解血栓，抑制血栓再形成，不降低特效。
實施例5快速溶解冠狀血栓的另一種方法，將約5-20mg凍幹UK酶原白蛋白複合物與大約30mg/hr凍幹t-PA溶於鹽水中一起注射。
實施例6由於UK酶原白蛋白複合物具有特長的半衰期，因而可用於抑制血栓的形成。用於這種治療時，只需使用小劑量，如每星期1-5mg。
實施例7活化的HMW-UK白蛋白複合物是HMW或LMW-UK的更經濟的取代物。
實施例8治療深血管血栓，大約5-20mg凍幹UK酶原HSA複合物溶於鹽水中，單獨或與t-PA一起注入體內。
實施例9對反覆無常的心絞病或即將發生的心肌梗塞的治療，用5-10mg UK酶原HSA複合物丸藥靜脈注射。用於這方面治療時，具有長半衰期的血纖維旦白激活劑特別有用，因為它在臨床使用時能維持幾天。
實施例10用另外的血纖維溶酶旦白酶原激活劑在percutaneous transluminal血管成形術的或急性的溶解血栓的治療之後以預防血栓的再形成。只需相對低劑量本發明所述的UK酶原HSA複合物就足夠了。例小於10mg。
實施例11用於血纖維旦白溶解活性受抑制而產生的心血管病變的預防。利用該複合物周期性地注射可提高溶解血纖維旦白活性。例如每月注射1-5mg UK酶原與HSA的複合物。
權利要求
1.一種純化的血纖維旦白溶酶原激活複合物，其特徵在於由純尿激酶原通過一個二硫鍵與人血清白蛋白共價結合產生的。該二硫鍵是由所說的UK酶原的一個AA殘基的一個S原子與所說的人血清白蛋白的一個AA殘基的一個S原子形成的。
2.根據權利要求1所說的激活複合物，其中所說的二硫鍵連接是在所說的人血清白蛋白的一個半胱AA殘基和所說的UK酶原的一個胱AA殘基之間形成。
3.根據權利要求1所說的激活複合物，其中所說的UK酶原的胱AA殘基是在A鏈UK酶原的氨基末端。
4.根據權利要求1所說的激活複合物，其中所說的二硫鍵連接形成是在旦白質二硫同分異構酶(PDI)存在時發生。
5.根據權利要求1所說的激活複合物，其中所說的複合物是指與(存在於健康人體血液中)UK酶原和人血清白蛋白形成的複合物具相同的分子結構的複合物。
6.根據權利要求2所說的激活複合物，其中所說的二硫鍵連接是與人血清白蛋白相同半胱AA殘基和UK酶原相同胱AA殘基之間形成的，如在健康人體血液中的UK酶原HSA複合物中形成的二硫鍵。
7.根據權利要求1或6所述的激活複合物，其中所說的UK酶原是指重組產生的UK酶原。
8.根據權利要求1所述的激活複合物，其中所述的UK酶原和人血清白蛋白是重組產生的。
9.根據權利要求1所述的激活複合物，其中所說的UK酶原是具溶解血纖維旦白活性的UK酶原片段，在UK酶原肽鏈氨基末端的11，31，33，39，51，53或63位任一胺基酸含有一個半胱AA殘基。
10.根據權利要求1所說的激活複合物，其中所說的UK酶原是指具溶解血纖維旦白活性的尿激酶酶原形式，含有相當尿激酶的第1-45位胺基酸殘基的一條AA鏈。
11.權利要求1所述激活複合物組成治療組合物，特徵是與一種藥理學上可接受的載體基質相混和。
12.溶解病人體內血栓的治療方法，包括將一定的溶解血栓劑量的權利要求11所說的藥劑組合物引入病人體內。
13.病人體內心血管病變如粥樣動脈硬化症的治療或預防方法，包括將一定劑量的權利要求11所說的藥劑組合物引入病人體內，使病人體內溶解血纖維旦白活性水平有足夠的提高。
14.製備權利要求1所說的溶血栓激活劑複合物的方法，包括在合適的條件下培養純人血清白蛋白和純尿激酶，給以足夠時間形成所說的複合物。
15.根據權利要求14的方法，其特徵進一步包括以二硫蘇糖醇預處理人血清白蛋白，使之恢復硫醇形式。
16.根據權利要求14或15的方法，其特徵還包括在培養過程中加入旦白質二硫同分異構酶。
全文摘要
一種尿激酶酶原複合物，由尿激酶酶原通過一個二硫鍵與人血清白蛋白共價連接形成，該複合物激活血纖維蛋白溶酶原溶解血纖維蛋白該複合物在血漿中半衰期比UK酶原本身更長。
文檔編號A61P7/02GK1049865SQ90103940
公開日1991年3月13日 申請日期1990年4月13日 優先權日1989年4月13日
發明者維克託·古列維奇, 傑羅米·布雷頓 申請人:血管實驗室有限公司