一套檢測常見腸道致病菌的寡核苷酸探針及其用途的製作方法

2023-06-06 00:54:51 3

專利名稱：一套檢測常見腸道致病菌的寡核苷酸探針及其用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物檢測技術、尤其是腸道致病菌的核酸檢測技術範疇。本發明涉及一套能夠檢測李氏菌屬、副溶血性弧菌、彎曲菌屬、小腸結腸炎耶爾森氏菌、耶爾森氏菌屬、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢菌屬、沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、痢疾桿菌、產氣莢膜梭菌、變形桿菌、布魯氏菌、腸出血性大腸桿菌O157:H7和霍亂弧菌的寡核苷酸探針，該套探針的序列及用途。
背景技術：
腸道致病菌是臨床上引起以腹瀉、嘔吐為症狀傳染病的主要病原體。常見的致病菌有李氏菌屬、副溶血性弧菌、彎曲菌屬、小腸結腸炎耶爾森氏菌、耶爾森氏菌屬、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢菌屬、沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、痢疾桿菌、產氣莢膜梭菌、變形桿菌、布魯氏菌、腸出血性大腸桿菌O157:H7和霍亂弧菌等十七個種屬，其中蠟樣芽孢桿菌、炭疽桿菌等作為一類細菌進行檢出；李氏菌屬主要以單增李氏菌最為常見；耶爾森氏菌屬主要以鼠疫耶爾森氏菌和小腸結腸炎耶爾森氏菌為主；彎曲菌屬中最為常見的是空腸彎曲菌和結腸彎曲菌。這些細菌可通過食物和飲水等途徑導致大規模暴發，嚴重威脅人類的飲食安全和正常生活，並且給社會帶來了沉重的經濟負擔。據世界衛生組織(WHO)不完全統計報告，2000年全球有210萬人死於腹瀉，大部分歸因於食物和飲用水中致病菌的汙染；而且尤其是近幾年腸道疾病的實際發病率要比報告的病例數多300-500倍，全世界的患病者以達數億，並且每年的統計數值都居高不下。美國每年約有7600萬例腸道致病菌導致的疾病，其中有32500人住院治療，5000人死亡；細菌汙染造成的腸道疾病(食物中毒)也是我國食品安全和臨床診斷中最突出的問題。據國家衛生部統計，2000年共收到重大食物報告達150起，中毒6237人死亡135人；2001共發生重大食物中毒事件185起，15715人中毒，146人死亡。這些由於多種致病菌導致的腸道疾病影響的國家範圍之廣、危急健康人群之多都是其他原因引起疾病所不及的。
16S rRNA和23S rRNA在細菌的分類鑑定學上具有重要的生物學意義，在生物進化過程中比其他基因演變得慢，真細菌的16S rRNA和23S rRNA保守性強，被稱之為「細菌進化的活化石」。但是這種保守性也是相對的，也就是說在16S rRNA和23S rRNA序列上存在著每種細菌特異性的片段。通過對各種細菌的16S rDNA和23S rDNA序列進行比對的結果發現其上的序列可變區和恆定區是交錯排布的。因此本專利中分別在16S rDNA和23S rDNA序列上選取的一對引物作為通用引物，在其間選取特異性序列作為探針，對上述十七個種屬的細菌進行鑑別。
細菌性痢疾是由痢疾桿菌導致的一種疾病。在臨床上病歷較多，且傳染性強。ipaH是大質粒上編碼侵襲質粒抗原H的一段基因，其特異性的存在於痢疾桿菌中，包括志賀氏菌屬的四種致病菌和侵襲性大腸桿菌，因此針對ipaH設計引物和探針，可以對細菌性痢疾進行鑑別。
沙門氏菌是一種在臨床上常見的腸道致病菌，根據臨床症狀和生化特徵分為傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌等。其中傷寒沙門氏菌是該菌屬中最具有代表性的，它可以導致傷寒熱，在臨床上症狀不是很明顯，這就給診斷帶來一定的麻煩；而且它還是生物反恐任務中的重要項目。VipR是位於傷寒沙門氏菌染色體ViaB區域中的一種編碼調控Vi抗原表達的基因，與其他腸道致病菌中的序列進行對比，具有很高的特異性。因此選取該基因作為檢測的目的片段，設計引物和探針，在經過16S rDNA序列上的探針鑑定為沙門氏菌的前提下，進一步對傷寒沙門氏菌進行甄別。
長期以來，對於腸道致病菌的實驗室金標準鑑定手段還停留在培養、血清和生化方面等傳統的細菌學檢測水平，步驟繁瑣且需要數天才能得到結果，在一定的程度上限制了對腸道致病菌的快速鑑定，也給臨床治療帶來諸多不便。免疫學方法的應用縮短了實驗操作的時間，但是該方法也存在其實驗樣品的特殊性以及結果的假陽性率偏高等問題。近年來，PCR和核酸雜交技術的應用以其操作簡單、快速和結果直觀等特點極大地促進了細菌檢測技術的發展。對於將多數量的腸道致病菌同時進行鑑定的要求，目前常用的方法都無法達到。因此DNA晶片技術以其特有的優勢被應用到了腸道致病菌的檢測鑑定中。
DNA晶片(DNA microarrays)是近年來發展成熟的一種高通量基因檢測技術，是分子生物學發展史上的又一重大技術突破，其特點是實驗操作和數據處理的集成化、微型化、自動化。DNA晶片的一個主要用途是多基因平行檢測，是一種發展前景廣闊的多基因大規模檢測新技術。DNA晶片技術檢測的關鍵之處在於設計、篩選一系列高特異性、高靈敏度、高穩定性的匹配探針，固定於玻璃片等固相載體上，利用樣品與探針的雜交反應，經掃描、分析後即可得出正確的結果。就本實驗而言，通過一次實驗操作就可確定樣品中腸道致病菌的種類，極大地提高了檢測效率，為臨床診斷及食品鑑定提供了簡便、快捷的技術手段。

發明內容
本發明提供了一套用於檢測常見腸道致病菌的寡核苷酸探針，包含以下各組探針的全部或為部分探針的組合，各部分的探針長度在25-50鹼基之間。
a.金黃色葡萄球菌的16S rDNA基因檢測探針b.李斯特氏菌屬的16S rDNA基因檢測探針c.腸出血性大腸桿菌O157:H7的23S rDNA基因檢測探針
d.霍亂弧菌的16S rDNA基因檢測探針e.耶爾森氏菌屬的16S rDNA基因檢測探針f.小腸結腸炎耶爾森氏菌的16S rDNA基因檢測探針g.沙門氏菌屬的16S rDNA基因檢測探針h.傷寒沙門氏菌的對Vi抗原表達基因ViaB起到正調控作用的基因VipR檢測探針i.志賀氏菌屬的16S rDNA基因檢測探針j.痢疾桿菌的大質粒上編碼侵襲質粒抗原H基因ipaH檢測探針k.副溶血性弧菌的16S rDNA基因檢測探針l.副溶血性弧菌的23S rDNA基因檢測探針m.志賀氏菌屬、沙門氏菌屬和大腸桿菌共有的16S rDNA基因檢測探針n.產氣莢膜梭菌的16S rDNA基因檢測探針o.彎曲菌屬的16S rDNA基因檢測探針p.變形桿菌的16S rDNA基因檢測探針q.蠟樣芽孢菌屬的16S rDNA基因檢測探針r.肉毒梭菌的16S rDNA基因檢測探針s.真細菌通用的16S rDNA基因檢測探針t.布魯氏菌的16S rDNA基因檢測探針本發明還提供了各部分探針的核苷酸序列，詳見表1-1。還提供了一套可以同時檢測常見腸道致病菌的寡核苷酸探針，包含上述a～t二十個部分。
本發明通過優選，進一步提供了一套特異性好，靈敏度高的探針，其中a探針為SA5，b探針為LI2和LI3，c探針為O157:H7-1和O157:H7-2，d探針為VC1，e探針為YE1，f探針為ye-2e，g探針為SHI1，h探針為V2和V3，i探針為SAL1，j探針為I-1和I-2，k探針為VP1，1探針為VP23，m探針為SS5，n探針為CP-new-1，o探針為Cam-5，p探針為PR-2，q探針為B-6，r探針為CB-1，s探針為common-2-1和common-3-1，t探針為Bru-2。
此外，本發明還提供了上述寡核苷酸探針的用途，利用一套探針可通過核酸雜交反應對樣品中的常見腸道致病菌進行檢測，尤其適用於基於基因晶片技術的檢測。利用探針還可以在鑑定出沙門氏菌和志賀氏菌的同時，進一步確定出是否為傷寒沙門氏菌和痢疾桿菌。
具體的說，本發明內容是這樣實現的根據選取的近三十種腸道致病菌及其相關近源種屬的16S rDNA、23S rDNA的全序列(每種菌至少要三種不同的Genebank序列號，以免所選區域個別鹼基出現差別)，使用clustalx1.8.msw Alignment程序將從Genebank的核酸資料庫中檢索到的近三十種細菌的16S rDNA、23S rDNA基因序列進行比對，得到鹼基對齊圖和聚類分析的結果。根據鹼基對齊圖可以劃分出16S rDNA、23S rDNA基因中的保守區和差異較大的變化區，然後再使用primer5.0軟體在保守區尋找通用引物，在變化區尋找特異性的探針，使得各個探針的Tm值及兩對引物間的Tm值基本相同。然後分別在痢疾桿菌(包括志賀氏菌屬內的四種致病菌和侵襲性大腸桿菌)的大質粒上編碼侵襲質粒抗原H基因(ipaH)上和傷寒沙門氏菌的對Vi抗原表達基因ViaB起到正調控作用的基因(VipR)上設計引物和探針，共設計91條寡核苷酸探針，探針長度在25-50鹼基之間。寡核苷酸探針序列與上述基因特定區域DNA正鏈的鹼基序列一致(探針序列見表1-1)。
利用上述的一套探針，可以通過雜交反應對樣品中的相應病原菌進行檢測，尤其適用於基於DNA晶片原理的檢測，具有較高的靈敏度和特異性。在進行基於DNA晶片原理的檢測時，需要把探針全部或其中一部分用適當的方法固定於固向載體上(如玻璃片、矽基片、聚丙烯膜、硝酸纖維素膜、尼龍膜等)，成為M×N排布的探針陣列，即為DNA晶片。然後利用優化的相應的PCR引物擴增待檢樣品中的致病菌，選擇引物的要求是能夠擴增出所有細菌的包含探針所在區域的片段。在擴增的同時引入螢光標記、生物素標記或其他合適的標記物。擴增產物作為探針檢測的靶分子，在一定條件下與晶片共保溫30分鐘至數小時，利用螢光掃描儀或其他相應的檢測設備即可以檢測到雜交信號。根據探針出現信號的位置可以判定出樣品中致病菌的種類。
除了基於DNA晶片原理的檢測外，這套探針也可以用於基於反相斑點雜交的檢測首先將探針固定於合適的載體上，提取待檢細菌核酸，並對細菌的核酸進行標記，然後，將標記好的核酸與載體上的探針進行雜交反應，最後，提供合適的儀器設備進行檢測。
本發明提供的探針能夠快速、準確、高效地檢測出樣品中的致病菌的種類。如果製備成相應的試劑盒，可以廣泛用於臨床細菌感染性疾病的診斷、抗菌素篩選、環境監測與評價、衛生監督與食品檢疫、細菌學分類、流行病學調查等方面。


圖1為致病菌16S rDNA引物PCR產物電泳檢測結果。1DL2000 Marker，2單增李氏菌，3空腸彎曲菌，4小腸結腸炎耶爾森氏菌，5霍亂弧菌，副溶血性弧菌，7變形桿菌，8金黃色葡萄球菌，9臘樣芽孢桿菌，10產氣莢膜梭菌，11志賀氏菌，12沙門氏菌。
圖2為致病菌23S rDNA引物PCR產物電泳檢測結果。1100bp DNA Ladder Marker，2單增李氏菌，3空腸彎曲菌，4小腸結腸炎耶爾森氏菌，5霍亂弧菌，6副溶血性弧菌，7變形桿菌，8金黃色葡萄球菌，9臘樣芽孢桿菌，10產氣莢膜梭菌，11志賀氏菌，12沙門氏菌。
圖3為16S rDNA、ipaH和23S rDNA、vipR二重PCR結果。1傷寒沙門氏菌23S rDNA引物擴增結果，2傷寒沙門氏菌vipR引物擴增結果，3傷寒沙門氏菌23S rDNA和vipR引物二重PCR擴增結果，4DL2000 Marker，5-9痢疾桿菌(志賀氏菌屬四種細菌和侵襲性大腸桿菌)16S rDNA、ipaH二重PCR擴增結果，10痢疾桿菌ipaH引物擴增結果，11痢疾桿菌16S rDNA引物擴增結果。
圖4為十七種腸道致病菌檢測基因晶片探針排列位置。
圖5為基因晶片分別與十七種腸道致病菌及其他陰性細菌的螢光標記PCR產物雜交結果。其中傷寒沙門氏菌和痢疾桿菌雜交圖均系二重PCR擴增產物雜交結果。
具體實施例方式為了進一步說明一套用於同時檢測上述十七個種屬常見腸道致病菌寡核苷酸探針的實施方式和用途，參照以下實施例進行說明。實施例是為了解釋而不是以任何方式限制本發明的範圍，本領域技術人員在權利要求的範圍內所做出的某些改變和調整也應認為屬於本發明的範圍。
實施例1.檢測十七個種屬腸道致病菌的寡核苷酸探針的篩選和優化1.檢測十七個種屬腸道致病菌的寡核苷酸探針的設計探針分別設計在細菌16S rRNA和23S rRNA以及痢疾桿菌中大質粒上編碼侵襲質粒抗原H(ipaH)和傷寒沙門氏菌調控Vi抗原表達等基因序列上，具有較高的靈敏度和特異性，寡核苷酸探針序列與上述基因特定區域DNA正鏈的鹼基序列一致(探針序列見表1-1)。探針長度在25-50鹼基之間。探針合成時在其3』端氨基修飾，用於探針與載玻片表面的活性醛基發生反應並固定到載體表面。
表1-1檢測常見腸道致病菌的寡核苷酸探針備選序列探針 探針序列 探針長名稱 (5』-3』) 度(BP)SA1aac gga cga gga gct tgc ttc tct gat gtt agc33SA2caa aag tga aag acg gtc ttg ctg tca ctt ata ga 35SA3aaa ctc tgt tat tag gga aga aca tat gtg taa gta36SA4gtg cac atc ttg acg gta cct aat cag aaa gcc acg36
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表1-2用於擴增含有探針序列靶基因片段的引物序列基因引物序列(5』---3』) 產物長度 備註名稱 (bp)16S rDNAcgc tgg cgg cag gcc taa cac atg c500 正向引物cgc ggc tgc tgg cac gga gtt agc c反向引物23S rDNAtta aat gat ggc tgc ttc taa gcc 500 正向引物acc gat agt gaa cca gta ccg tga g反向引物ipaHgtt cct tga ccg cct ttc cga tac 330 正向引物gag agt tct gac ttt atc ccg 反向引物VipRggt ttc atc att tct ggc ctc cg 337 正向引物ctc tgc tcc gtc aag atc ttt tca cc 反向引物3.寡核苷酸基因晶片的製備和探針的篩選優化將備選寡核苷酸探針純化、定量後，用基因晶片點樣儀點到醛基活化的載玻片上，製成探針微陣列。用螢光標記的PCR擴增產物與基因晶片雜交，得到各探針的雜交圖。針對不同病原菌的基因片段，根據晶片雜交結果選擇各自特異性好，靈敏度高的探針。篩選得到的探針序列見表1-3。
表1-3檢測常見腸道致病菌的寡核苷酸探針優化序列探針探針序列 探針長度名稱 (BP)SA5 aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gta 36LI2 tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gct 36LI3 tag aga aga aca agg ata aga gta act gct tgt ccc 36VC1 cag cac aga gga act tgt tcc ttg ggt ggc gag 33YE1 gcg gca gcg gga agt agt tta cta ctt tgc cgg 33ye-2ecat aaa ggt taa taa cct ttg tga ttg acg t 31SHI1 ggg agt aaa gtt aat acc ttt gct cat tga 30V-2 ctt caa taa tgc cag cag ctc caa ccc cga aat aga ta38
V-3aca ggc tgt agc gat tta ggt tca caa aca aat aat tt 38SAL1 ggt gtt gtg gtt aat aac cgc agc aat tga 30I-1gaa ggc ctt ttc gat aat gat acc ggc gct ctg ctc tcc c 40I-2gga ccg tgt cgc gct cac atg gaa caa tct ccg gaa aac cct 42VP1aaa cga gtt atc tga acc ttc ggg gaa cga taa cgg 36VP23 ggt acg cag tca cag gac aaa gcc 24H7-1 gca gtc acc cca taa aag agg ct 23H7-2 tca ccc cat aaa aga ggc tcc cac tgc 27SS5ggt ttc agg ttc ttt ttc act ccc ctc gcc g 31CP-new-1 atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat gga 48cccCam-5 ctc ctt ttc tta ggg aag aat tct gac ggt acc taa gga at 41pr-2 cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga 36CB-1 tat aag aga atc gca tga ttt tct tat cca aag att tat 39com21 act gag aca cgg tcc aga ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat 49attgcom31 cac act gga act gag aca cgg tcg aga ctc cta cgg ga 38Bru-2 cgt acc att tgc tac gga ata act cag gga aac ttg tg 38B-6tgc tag ttg aat aag ctg gca cct tga cg 29實施例2.寡核苷酸探針的特異性和靈敏度評價1.基因晶片製備 將寡核苷酸探針用點樣液(6×SSC，0.1％SDS)稀釋至終濃度50μmol/L，取5ul轉移至384孔板。用Cartesian晶片製備儀將探針點到醛基片上(探針排列見附圖4，晶片分別與十七個種屬腸道致病菌的螢光標記PCR產物雜交結果見附圖5)。在該探針微陣列中，以螢光引物的反向互補序列作為陽性對照，以無關隨機序列作為陰性探針對照，以不含探針的空白點樣液做為陰性對照。探針序列見表2-1。
表2-1常見腸道致病菌的檢測基因晶片探針序列探針名稱 探針序列探針長度(BP)SA5aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gta36LI2tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gct36
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以上實施例的技術要點如下1.寡核苷酸合成寡核苷酸(引物或探針)採用標準亞磷醯胺化學方法在自動合成儀(ABI8909)上合成。所有螢光引物在合成中用Cy3亞磷醯化試劑在5』端進行標記。所有寡核苷酸探針在3′端進行氨基修飾，氨基與探針序列之間以間隔臂(聚乙二醇磷醯化試劑)相連。合成完畢用濃氨水55℃作用15小時脫保護/切割，OPC柱純化。紫外定量，凍存備用。
2.多重PCR擴增20ul常規PCR反應體系中，正、反向引物濃度均0.5μM，dNTP為100μM，1U Taq DNA聚合酶，1×PCR反應緩衝液，50-100ng模板DNA；擴增條件為預變性(94℃，5min)；35個循環變性(94℃，30sec)，退火(56℃，30sec)延伸(72℃，30sec)；延伸(72℃，5min)；4℃，∞。
多重不對稱PCR反應中，四對引物之間濃度的改變對目的基因的擴增效率有明顯的影響，每個基因的正向與反向螢光引物的比例和雜交信號的強弱密切相關。經過多次實驗優化，使一個反應管中四個產物均能達到相近而且較好的擴增效率和雜交信號。優化的結果為兩套二重PCR反應中16S rDNA、ipaH和23S rDNA、vipR基因的正向引物濃度分別為0.25μM、0.25μM，反向螢光標記引物濃度分別為0.75μM、0.75μM。20ul反應體系中，dNTP為200μM，MgCl2為3mmol，2U TaqDNA聚合酶，1×PCR反應緩衝液；擴增條件為預變性(94℃，5min)；40個循環變性(94℃，30sec)，退火(56℃，30sec)延伸(72℃，30sec/)；延伸(72℃，5min/)。
3.常見腸道致病菌寡核苷酸晶片製備 寡核苷酸探針用點樣液(6×SSC，0.1％SDS)稀釋至終濃度50μmol/L，取5ul轉移至384孔板。用Cartesian晶片製備儀將探針點到醛基片(Telechem)上，點樣儀內保持溫度為23℃，相對溼度大於85％。寡核苷酸晶片製備完畢後，置於載玻片盒內室溫放置備用。點樣後的晶片在使用前至少在室溫放置24h。
4.常見腸道致病菌寡核苷酸晶片雜交與檢測4.1寡核苷酸基因晶片預處理 寡核苷酸晶片用0.2％SDS清洗2次，接著以水清洗2次，晾乾後用於雜交。
4.2雜交和雜交後處理 螢光標記的PCR產物變性(98℃、5min，冰浴、5min)後與雜交液(5×SSC，5％甲醯胺，0.1％SDS)混勻，取12μ1轉移至晶片反應區，晶片置於雜交盒內，連同雜交盒浸入50℃水浴中反應60分鐘，雜交後的晶片依次在洗液A(1×SSC，0.2％SDS)，洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)中於室溫各洗滌1min。置室溫晾乾。
4.3掃描和結果判定 晶片用晶片掃描儀GenePix 4000B進行掃描，用GenePix Pro 4.0軟體分析結果。
表2-2應用基因晶片檢測146株腸道菌結果


序列表110中國人民解放軍軍事醫學科學院放射醫學研究所120一套用於檢測常見腸道致病菌的寡核苷酸探針及其用途16091210121133212DNA213人工序列4001aac gga cga gga gct tgc ttc tct gat gtt agc 33210221135212DNA213人工序列4002caa aag tga aag acg gtc ttg ctg tca ctt ata ga 35210321136212DNA213人工序列4003aaa ctc tgt tat tag gga aga aca tat gtg taa gta 36210421136212DNA213人工序列4004gtg cac atc ttg acg gta cct aat cag aaa gcc acg 36210521136212DNA213人工序列4005aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gta 36210621136212DNA213人工序列4006tga cta ctt gta agc aca cgg ttt cag gtt cta ttt 36
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權利要求
1.一套用於檢測常見腸道致病菌的寡核苷酸探針，其特徵在於包含以下各組探針的全部或部分探針的組合，各部分的探針長度在25-50鹼基之間。a.金黃色葡萄球菌的16S rDNA基因檢測探針b.李斯特氏菌屬的16S rDNA基因檢測探針c.腸出血性大腸桿菌O157H7的23S rDNA基因檢測探針d.霍亂弧菌的16S rDNA基因檢測探針e.耶爾森氏菌屬的16S rDNA基因檢測探針f.小腸結腸炎耶爾森氏菌的16S rDNA基因檢測探針g.沙門氏菌屬的16S rDNA基因檢測探針h.傷寒沙門氏菌的對Vi抗原表達基因ViaB起到正調控作用的基因VipR檢測探針i.志賀氏菌屬的16S rDNA基因檢測探針j.痢疾桿菌的大質粒上編碼侵襲質粒抗原H基因ipaH檢測探針k.副溶血性弧菌的16S rDNA基因檢測探針l.副溶血性弧菌的23S rDNA基因檢測探針m.志賀氏菌屬、沙門氏菌屬和大腸桿菌共有的16S rDNA基因檢測探針n.產氣莢膜梭菌的16S rDNA基因檢測探針o.彎曲菌屬的16S rDNA基因檢測探針p.變形桿菌的16S rDNA基因檢測探針q.蠟樣芽孢菌屬的16S rDNA基因檢測探針r.肉毒梭菌的16S rDNA基因檢測探針s.真細菌通用的16S rDNA基因檢測探針t.布魯氏菌的16S rDNA基因檢測探針。
2.如權利要求1所述的一套寡核苷酸探針，其中a探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條SA1aac gga cga gga gct tgc ttc tct gat gtt agcSA2caa aag tga aag acg gtc ttg ctg tca ctt ata gaSA3aaa ctc tgt tat tag gga aga aca tat gtg taa gtaSA4gtg cac atc ttg acg gta cct aat cag aaa gcc acgSA5aca tat gtg taa gta act gtg cac atc ttg acg gtaSA-6 tga cta ctt gta agc aca cgg ttt cag gtt cta tttSA-7 aat att ttg aac cgc atg gtt caa aag tga aagSA-8tac gac caa ata cta aacSA-9caa taa tca tca ctt gag gcb探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條LI1 aac gga gga aga gct tgc tct tcc aaa gtt agtLI2 tgt tgt tag aga aga aca agg ata aga gta act gctLI3 tag aga aga aca agg ata aga gta act gct tgt cccLis-23 gtg gca tgc gcc aca ctt tat cc探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條H7-1gca gtc acc cca taa aag agg ctH7-2tca ccc cat aaa aga ggc tcc cac tgcd探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條VC1 cag cac aga gga act tgt tcc ttg ggt ggc gage探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條YE1 gcg gca gcg gga agt agt tta cta ctt tgc cggye-3agg ggt tga gtt taa tac gct caa tca ttgf探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條ye-2e cat aaa ggt taa taa cct ttg tga ttg acg tg探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條SHI1ggg agt aaa gtt aat acc ttt gct cat tgah探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條V-1 aaa tag ata tca ttc gga ggc cagV-2 ctt caa taa tgc cag cag ctc caa ccc cga aat aga taV-3 aca ggc tgt agc gat tta ggt tca caa aca aat aat ttV-4 tag tcg cga act tga aat gat aac gV-5 cat ttc tga taa tat cct gga ctg atg ttg ccgi探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條SAL1ggt gtt gtg gtt aat aac cgc agc aat tgaj探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條I-1 gaa ggc ctt ttc gat aat gat acc ggc gct ctg ctc tcc cI-2 gga ccg tgt cgc gct cac atg gaa caa tct ccg gaa aac cctI-3 agt ctt tcg ctg ttg ctg ctg atg cca cI-4 cct ctg cgg agc ttc gac agc agt ctt tcg ctg ttI-5 ata ccg tct ctg cac gca ata cct ccg gat tcc gtI-6 tcc gga ttc cgt gaa cag gtc gct gca tgg ctk探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條VP1 aaa cga gtt atc tga acc ttc ggg gaa cga taa cgg1探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條VP23 ggt acg cag tca cag gac aaa gccm探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條SS3 tgt ctg gga aac tgc ctg atg gag gSS4 cgt cgc aag acc aaa gag ggg gac ctt cgg gSS5 ggt ttc agg ttc ttt ttc act ccc ctc gcc gSS6 aac ctg ccc atg gct aga tca ccg ggt ttc ggg tct ata ccc tSS7 aat ttt tca aca tta gtc ggt tcg gtc ctc cag tta gtgSS8 cct ctt gcc atc gga tgt gcc cag atgn探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條CP-1 cga gct caa agt atg tCP-2 gcc gag ctc aaa gta tgtCP-3 gcc gag ctc aaa gta tgt ggc attCP-4 act act cat act cga cgc tag cCP-5 gtg ata agg ttc ggt aag cgc tat gccCP-6 ggc ata gcg ctt acc gaa cct tat caccp-16aag atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat cCP-16-1 aag atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat cgc tat gCP1 gaa aga tgg cat cat cat tca acc aaa gga gca atcCP-new-1 atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat gga cccCP-new-2 atg gca tca tca ttc aac caa agg agc aat ccg cta tga gat ggao探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條Cam-1act cct gct taa cac aag ttg agt agCam-2tcg gtg tag gat gag act ata tagCam-3act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg gCam-4ggt ata gtt aat ctg ccc tac aca agaCam-5ctc ctt ttc tta ggg aag aat tct gac ggt acc taa gga atCam-6act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agCam-7gat ttg cct gta taa cct cct acg acc tta gac tagCam-8cgg agt aaa tcc taa tac aaa gct aac caCam-9ttc tat cca tcc gaa gac ttc aaa aag cct tCam-3-1 act cct gct taa cac aag ttg agt agg gaa agt ttt tcg gCam-1act cct gct taa cac aag ttg agt agp探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條PR1 taa cag gag aaa gct tgc ttt ctt gct gacPR-2 cgt cga gtt cac aat aac agc atc ttc agapr-2 cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tgapr-3 cga gcg gta aca gga gaa agc ttg ctt tpr-4 gta aca gga gaa agc ttg ctt tct tgc tga cga gcpr-5 gtc tac gga cca aag cag ggg ctc ttc gga cct tgcpr-6 gtg ata aag tta ata cct tta tca att gpr-7 att gcg taa cag aga gaa agc ttg ctt tct tgc tgapr-8 att gcg taa cag aga gaa agc ttg ctt tpr-9 taa cag aga gaa agc ttg ctt tct tgc tga ctg agcpr-10gtg ata aag tta ata cct ttg tca att gq探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條B-1 cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaa ttg aaa ggcB-2 gga taa cat ttt gaa ccg cat ggt tcg aaaB-3 ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt cB-4 tgc tag ttg aat aag ctg gca cctB-5 ggc ttc ggc tgt cac tta tgg atg gac ccg cgt cB-6 tgc tag ttg aat aag ctg gca cct tga cgB-41 tgc gta gcc gac ctg aga ggg tgtr探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條CB-1 tat aag aga atc gca tga ttt tct tat cca aag att tatCB-2 atg aag ctt cct tcg gga agt gga tta gcg gcCB-3 ggg ata gcc ttc cga aag gaa gat taa tacs探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條common-1 cca gac tcc tac ggg agg cag cag tcommon-2 ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aatcommon-3 cac act gga act gag aca cgg tccommon-2-1 act gag aca cgg tcc aga ctc cta cgg gag gca gca gta ggg aat attgcommon-3-1 cac act gga act gag aca cgg tcg aga ctc cta cgg gat探針選自下列寡核苷酸序列中的1條或數條Bru-1 gtg ccc ttc ggg gga aag att tat cgg caa atg atc ggc ccg cgt tBru-2 cgt acc att tgc tac gga ata act cag gga aac ttg tg 。
3.如權利要求1所述的一套寡核苷酸探針，其特徵在於同時包含a～t二十組探針。
4.如權利要求3所述的一套寡核苷酸探針，其中a探針為SA5，b探針為LI2和LI3，c探針為O157H7-1和O157H7-2，d探針為VC1，e探針為YE1，f探針為ye-2e，g探針為SHI1，h探針為V2和V3，i探針為SAL1，j探針為I-1和I-2，k探針為VP1，l探針為VP23，m探針為SS5，n探針為CP-new-1，o探針為Cam-5，p探針為PR-2，q探針為B-6，r探針為CB-1，s探針為common-2-1和common-3-1，t探針為Bru-2。
5.權利要求1～4所述的任一寡核苷酸探針的用途，其特徵在於利用探針可對樣品中的常見腸道致病菌的相應基因進行檢測，尤其適用於基於基因晶片技術的檢測。
6.權利要求5所述的寡核苷酸探針的用途，其特徵在於利用探針可以檢測出十七種常見腸道致病菌以及對痢疾桿菌和傷寒沙門氏菌進行區分。
7.權利要求5所述的寡核苷酸探針的用途，其特徵在於該檢測可用於臨床疾病診斷、抗菌素篩選、環境監測與評價、衛生監督與進出口食品檢疫、細菌學分類與流行病學調查、生物戰劑檢測等。
全文摘要
一套用於檢測常見腸道致病菌的寡核苷酸探針及其用途，屬於微生物檢測領域(生物工程類檢測產品)。探針分別設計在細菌16S rRNA和23S rRNA以及痢疾桿菌中大質粒上編碼侵襲質粒抗原H(ipaH)和傷寒沙門氏菌調控Vi抗原表達(VipR)等基因序列上，探針長度在25－50鹼基之間，具有較高的靈敏度和特異性。適用於基於核酸雜交原理的檢測技術，尤其適用於基因晶片原理的檢測。在一定的使用條件下，能夠檢測出實驗樣品中的李氏菌屬、副溶血性弧菌、彎曲菌屬、小腸結腸炎耶爾森氏菌、耶爾森氏菌屬、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌、蠟樣芽孢菌屬、沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、志賀氏菌、痢疾桿菌、產氣莢膜梭菌、變形桿菌、布魯氏菌、腸出血性大腸桿菌O157H7和霍亂弧菌。可用於多種方面，如疾病診斷、環境檢測、食物中毒檢測、進出口食品檢疫、細菌學分類、流行病學調查、生物戰劑檢測等。
文檔編號C12Q1/68GK1683565SQ20051005520
公開日2005年10月19日 申請日期2005年3月15日 優先權日2005年3月15日
發明者王升啟, 金大智, 文思遠, 陳蘇紅 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院放射醫學研究所