血漿凝血酶調節蛋白活性功能測量的方法

2023-06-06 00:44:56 3

專利名稱：：血漿凝血酶調節蛋白活性功能測量的方法
技術領域：
：本發明涉及止血領域，特別涉及凝集失調。本申請涉及測量生物樣品中血漿凝血酶調節蛋白的功能活性的方法。利用生物樣品，特別是從患者採集的血液樣品，體內進行本發明的方法。本發明的方法允許測量血漿介質中凝血酶調節蛋白的功能活性。特別是，本發明涉及測定血漿介質中凝血酶調節蛋白功能活性的方法，例如利用生色或螢光測定方法進^"所述測定。凝血酶調節蛋白(TM)是凝血酶受體蛋白聚糖，其形成內皮細胞膜的組成部分。它部分負責內皮抗凝血劑的特性，為557個胺基酸的蛋白，由三部分組成與內吞作用的機制有關的C末端胞質內部分；疏水的膜內部分；以及由長肽鏈構成的N末端部分。後者含有4個區Ser/Thr豐富區，緊跟著是6個結構域的區，所述結構域是表皮生長因子的同源物(EGF樣)，疏水區以及最後是凝集素樣區(圖1)。1981年，OwenW.G.和EsmonCT表徵了凝血酶調節蛋白的功能活性(ProceedingsoftheNationalAcademyofScienceUSA,1981,vol.78，pages2249-52andJournalofBiologicalChemistry1981vol256,pages6632-5)，證明血漿蛋白C被凝血酶調節蛋白催化的凝血酶激活為激活的抗凝血劑蛋白C。WenDZ等1987(Biochemistry，1987,vol26，pages4350-7)在EMBL參考號BC035602下以及WeilerH.等(.I.Thromb.Haemost.2003July,1(7):151-24)表徵和鑑定了人凝血酶調節蛋白的編碼序列。TM存在於生物體所有血管(動脈、靜脈、毛細血管)和淋巴管的表面，在血管化豐富的器官如胎盤和肺中特別豐富。角質細胞、成骨細胞、腎小球膜細胞、血小板和嗜中性粒細胞也表達TMTM合成的調節主要依賴循環AMP、TNFa，IL-l和浮見黃酸。內皮細胞不分泌TM,且TM不被凝血酶降解。僅在內皮細胞的不同類型攻擊(多核彈性蛋白酶；細胞因子、巨噬細胞、脂多糖等)的作用下，內皮TM可被切割成以可溶的形式釋放入循環系統隨後經腎臟清除的片段。一旦被切割，細胞的TM就成為可溶的即血漿形式的TM,使胞質區和中孔性區被刪除(Ishiihetal，1985，JClinInvest76，2178)。對可溶的血漿TM(TMp)進行分析，構成了內皮損傷的優良標誌物。TM的主要功能是，通過各種機制對抗凝血酶的促凝血作用。當與TM結合後，凝血酶(Th)經歷了構象修飾。它喪失凝血劑特性和對血小板和纖維白蛋原的親和性。然而，它仍然可以^皮抗凝血酶III(ATIII)失活。在硫酸軟骨素存在的情況下，使TM-Th複合物的形成去偶聯。這些相互作用使TM清除在血漿中循環的Th。這種Tm-Th複合物能激活蛋白C，所述蛋白C在S蛋白存在的情況下，抑制因子Va和VIIIa;相互作用和反應的這種連續性，構成了蛋白C系統。TM-Th複合物在與內皮蛋白C受體(EPCR)結合的蛋白C激活以及與纖維蛋白溶解有關的血漿羧肽酶原TAFI(凝血酶可激活的纖維蛋白溶解抑制劑)的激活中起作用。最後，TM在ATIII的存在的情況下具有抗血栓形成活性。TM在炎症和細胞增殖/分化中的作用已經被誘發(圖2)。因此，凝血酶調節蛋白起凝集抑制劑的作用，特別是通過使蛋白C向激活的蛋白C(PCa;)的激活加速，所述激活的蛋白C自身在S蛋白輔助因子存在的情況下，使凝集因子Va和VIIIa失活。凝血酶調節蛋白的體內合成通過各種因子如AMPc、視黃素、曱狀腺激素、以及高熱而增強(ConwayEMetal,1994，JBiolChem,269，22804)。其他試劑諸如細胞因子IL-1、TNF、LPS和高半胱氨酸以及細胞內微生物(巨細胞病毒、皰滲、立克次氏體(rickettsies))，對其表達和活性具有副作用，因此導致內皮細胞促凝血活性的瞬時增加。儘管可溶TM(TMs)的水平在新生兒中很高，但無論健康受試者是20歲還是60歲，年齡在他們中無影響，但個體的性別有影響，因為已經觀察到男性具有顯著高於女性的值。與內皮攻擊有關的TMs水平的升高不但在如DIVC、糖尿病、慢性骨髓白血病、肝和腎功能不全的許多病理中已有描述，也在子癇前期、血才全'f生血小^反;鹹少'性紫瘋(thromboticthrombocytopenicpurpura)、立克-欠體病、白塞病(Behcet'sdisease)、高胱胺酸尿症(homocystinuria)中有描述。在患有月申動脈高血壓(pulmonaryarterialhypertension)的患者和處於黑素瘤過程中的患者的研究中，已經觀察到水平降低。最後，TM基因的突變已有描述並且與TMs水平的降低有關。在治療水平上，已經證明，向動物灌注重組TM有效預防血栓形成的發生。因為對凝集步驟的直接影響，特別是對蛋白C系統的激活，看起來有興趣的是能測定凝血酶調節蛋白的功能活性。現有技術已經提出了測定凝血酶調節蛋白活性的檢測，但是它們僅實現細胞系統而未實現血漿系統中凝血酶調節蛋白活性的測定。近來，(5hlinAK等(JournalofThrombosisandHemostasis，2005，3:976-982)描述了血漿介質分析法。然而，這篇文章未提出TM的直接檢測，而必需利用針對血漿凝血酶調節蛋白的單克隆抗體的分離(isolation)和分開(separation)的第一步。實際上，在OhiinAK等所述4全測的第一步中，將可以稀釋的檢測血漿在孔內含有抗人凝血酶調節蛋白的單克隆抗體的微孔板(microplate)中孵育。在除去血漿後，洗滌微孔板的孔，以便僅保留已經與抗體結合的凝血酶調節蛋白的片段。在第二步中，向製備好的微孔板中的孔內加入獲得激活的蛋白C所需的試劑。孵育後，生色或螢光測定底物可顯示激活的蛋白C。文章的作者得出結論，設計可直接測量血漿中凝血酶調節蛋白的活性而無需凝血酶調節蛋白的分離和分開步驟的檢測，在將來是重要的。因此，當前，分析血漿凝血酶調節蛋白完全屬於可溶蛋白的抗原分析，其對應於切割的膜蛋白，所述切割的膜蛋白已經喪失了羧基末端胞質區和跨膜疏水區。TMs仍然保留了與凝血酶結合和激活蛋白C的能力，這些是定位於重複的EGF基元上的功能。利用抗凝血酶調節蛋白抗體和可溶凝血酶調節蛋白之間的免疫反應的各種檢測是可以利用的。例如，DiagnosticaStago提供了ELISA檢測，分析凝血酶調節蛋白(AserachromThrombomodulin)。體外分析凝血酶調節蛋白功能活性的問題在於本發明為將其克服而進行的提議，即提出測量生物介質特別是血漿介質中凝血酶調節蛋白的功能活性的方法，即，允許體外分析包含於含有凝血酶調節蛋白的生物介質中的可溶凝血酶調節蛋白而無需將凝血酶調節蛋白與檢測的生物介質特別是血漿的其他組分分開的方法。換句話說，本發明提出在蛋白C系統激活所需的試劑存在的情況下，用於測量生物介質特別是血漿介質中凝血酶調節蛋白的檢測。此外，本發明提出了檢測，所述檢測在生物介質特別是血漿介質中，在蛋白C激活所需的試劑的作用下，可以克服與樣品凝集有關的問題。本發明的方法以及用於實施該方法的裝置限定為用於體外進行的生物醫療研究環境中。扼要重述地，在由凝血酶調節蛋白和凝血酶(因子IIa)在血管內皮表面形成的複合物的作用下，體內發生蛋白C向PCa的激活。PCa隨後與蛋白S複合，從而使其自身結合於血小板或內皮表面上的磷脂。這些PCa-PS-磷脂複合物催化因子Va和VIIIa的失活，由此減緩凝集現象。因此，本發明涉及體外測量凝血酶調節蛋白功能活性的方法，所述測量在來自從患者採集的樣品的生物介質中進行。根據本發明的特定實施方案，可允許測量生物介質中凝血酶調節蛋白活性的樣品是血漿樣品。根據本發明另一個特定實施方案，允許測量凝血酶調節蛋白活性的樣品是全血或腦脊液(CRL)或羊水的樣品。本發明的體外分析方法包括，測量生物樣品介質中蛋白C向激活的蛋白C(PCa)的激活，所述激活在凝血酶的作用下、在凝血酶輔助因子即來自樣品的凝血酶調節蛋白存在的情況下進行。加入過量的純化的蛋白C後，進行測量。也將蛋白C系統激活所需的其他試劑以及纖維蛋白聚合抑制劑加入^^品中。特別是，本發明涉及體外測量血漿凝血酶調節蛋白功能活性的方法，所述方法包括分析血漿介質中蛋白C通過凝血酶、在凝血酶輔助因子即所述血漿凝血酶調節蛋白存在的情況下，向激活的蛋白C(PCa)的激活。為了進行這種測量，向檢測血漿中加入過量的純化的蛋白C,稱為純化的外源蛋白C，以及蛋白C系統激活所需的試劑和纖維蛋白聚合抑制劑。作為加入純化的蛋白C的替代方法，可以加入TAFI(血漿羧肽酶U,其激活受凝血酶的催化，對於凝血酶調節蛋白是依附的)以便測量其激活的TAFI激活(TAFIa)。活性的測量術語稱為凝血酶調節蛋白功能活性的測量，因為其允許通過向介質特別是檢測血漿中加入過量的蛋白C和蛋白C系統激活所需的試劑，測量生物介質特別是血漿介質中凝血酶調節蛋白的活性。將會觀察到，在測量過程中，所用的過量蛋白c足以克服與檢測介質中內源性蛋白c的存在有關的任何定量或定性不足。換句話說，術語"過量的外源蛋白c"意指，在實施本發明的過程中，以一定量加入外源蛋白c，以致其PCa激活的測量不依賴樣品中蛋白C的量。根據本發明特定實施方案，在血漿介質中進行的分析，是對從患者採集的生物樣品中獲得的血漿樣品進行的。根據本發明測量的血漿凝血酶調節蛋白是可溶蛋白(可溶凝血酶調節蛋白或TMs，術語也稱為血漿凝血酶調節蛋白TMp),其對應於切割的膜血漿凝血酶調節蛋白並因而與其胞質羧基末端區和跨膜疏水區分開。實際上，可溶凝血酶調節蛋保留了與凝血酶結合和將蛋白C激活為PCa的能力，因為這種激活功能位於蛋白的重複EGF基元上。相反，當在LCR或羊水樣品中測量凝血酶調節蛋白的活性時，凝血酶調節蛋白為完整的(未截短的)形式。取決於本發明的各種實施模式，加入到檢測血漿樣品中的蛋白C系統激活所需的試劑主要是凝血酶(特別是純化的人a凝血酶)和釣離子。鈣離子例如以CaCl2的形式提供。此外，根據本發明測量血漿凝血酶調節蛋白的活性的方法包括，向檢測樣品中加入與凝血酶竟爭並因而阻斷纖維蛋白原向纖維蛋白轉化的抑制劑。根據本發明體外測量血漿凝血酶調節蛋白功能活性的方法包括*使凝血酶調節蛋白活性檢測血漿樣品與純化的外源蛋白C、凝血酶、鈣離子和纖維蛋白聚合抑制劑接觸；*孵育獲得的介質，以便允許產生激活的蛋白C;激活的蛋白C的功能分析。在本發明測量方法的特定實施方案中，通過對底物的活性，分析所形成的激活的蛋白C的量。特別是，這種底物是酶促底物，其可以是天然的或合成的；例如，其可以是生色或焚光測定底物。用於分析PCa活性的適宜底物是蛋白底物，例如肽。在本發明特定實施方案中，所測量的激活的蛋白C的酶促底物是意味著可以分析PCa醯胺水解活性的底物。特別地，它是生色底物或螢光測定底物。可以列舉的用於本發明環境中的適宜的合成底物是合成的寡肽底物。可以提到的實例是來自DiagnosticaStago的合成底物CBS42.46(寡肽THC-Pro-Arg-pNa)。生色底物的另一個實例是底物S-2366(寡肽pyro-Glu-Pro-Arg-pNa)或S-2238(寡肽H-D-Phe-Pip-Arg-pNa)。在本發明的環境中，可以選擇各種纖維蛋白聚合抑制劑。可以列舉的實例是合成的肽抑制劑，如寡肽抑制劑H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH.AcOH(GPRP.AcOH)(來自Pentapharm的PefablocFG)。在本發明特定實施方案中，測量血漿凝血酶調節蛋白功能活性的方法包括下列步驟a)使血漿樣品與試劑1接觸，所述試劑1含有包含於可激活蛋白C系統的介質中的凝血酶，特別地包含鈣離子，試劑1還含有纖維蛋白聚合抑制劑；b)將步驟a)中得到的介質與含有純化的蛋白C的試劑2—起孵育，達足以允許蛋白C通過凝血酶激活為PCa的時段，所述凝血酶與輔助因子即包含於血漿樣品中的凝血酶調節蛋白複合；c)使步驟b)中得到的含有激活的蛋白C的介質與PCa的酶促底物接觸；d)定量PCa底物的轉化。為了實施本發明，所用的蛋白C是純化的蛋白C，例如，利用OhlinAKetal，JBiolChem,1988,263:19240-8所述方法分離的蛋白C。根據本發明的特定實施方案，所用的蛋白C是純化的人蛋白C。所用的蛋白C以0.5nM/1至2.5或甚至0.1-10|uM/l的濃度範圍提供。為了表示基本上不含其他蛋白組分和汙染物(不依賴有關其製備模式的任何參考)，蛋白C稱為"純化的"。提供的蛋白C可以是重組蛋白。用於實施本發明測量的純化和活性形式的蛋白C也可從DiagnosticaStago,EnzymeResearchLaboratories或AmericanDiagnostics獲得。在本發明方法的環境中，使提供的凝血酶與存在於檢測血漿樣品中的凝血酶調節蛋白接觸，導致凝血酶/凝血酶調節蛋白複合物的形成。提供凝血酶和釣離子的試劑，可由在含有4丐離子的緩沖液中稀釋的凝血酶構成。也可以將纖維蛋白聚合抑制劑加入到緩沖液中。也可以加入通常包含於這種類型緩衝液中的其他組分。所用的凝血酶有利地是人來源的。特別地，它是在用於製備反應介質的試劑中，活性範圍為以NIH單位表示的5-20NIH、有利地10NIH的凝血酶。由此構成的試劑允許提供的凝血酶與血漿樣品的凝血酶調節蛋白相互作用，並允許蛋白C的激活。可以列舉的所構成試劑的其他組分的實例是肝素抑制劑或另一個抗凝血劑，所述肝素抑制劑或另一個抗凝血劑在檢測樣品採集自用肝素或者另一種抗凝血劑治療的患者且檢測樣品因而具有用肝素或另一種抗凝血劑治療的患者的特徵時使用。然而，如果樣品衍生自用抗維生素K家族的抗凝血劑治療的患者，則不加入該抗凝血劑的抑制劑，因為目前無可以利用的抑制劑。作為在OwrenKoller緩衝液中稀釋樣品的替代，根據本領域技術人員已知的通常選^^標準，稀釋可以在正常血漿中進行，使所述血漿變為凝血酶調節蛋白缺陷的。隨後向這種血漿加入外源凝血酶以及純化的蛋白C和纖維蛋白聚合抑制劑，且如上文所述，當生物樣品來自用肝素治療的患者時，加入肝素抑制劑，或者如果是不同的抗凝血劑，加入另一個抑制劑。凝血酶由血漿提供。術語"凝血酶調節蛋白缺陷血漿"意指，含有小於1%這種蛋白的血漿。可以利用本身已知的任何方法，製備凝血酶調節蛋白缺陷血漿。作為實例，可以利用免疫吸附技術，其採用針對這種蛋白的抗體，例如固定於支持物上的抗體。用檸檬酸鹽處理待處理的血漿。在允許純化的蛋白C與凝血酶/凝血酶調節蛋白複合物反應的條件下，提供純化的蛋白C，從而使蛋白C激活為激活的蛋白C(PCa)形式。蛋白C正是以這種形式即PCa，與鈣離子以及磷脂和其輔助因子蛋白S相互作用，能與其底物相互作用，特別是在凝集過程中能與因子Va和VIIIa(FVa，FVIIIa)相互作用。因此，為了測量凝血酶調節蛋白的活性，可以分析因子Va的抑制。激活的蛋白C的功能活性的測量包括，獲得的試劑與激活的蛋白C的酶促底物的反應。這種底物在上文中已經做了描述；再次回憶一下，它可以是天然的或合成的底物。當它是天然的底物時，可以是血漿凝集蛋白，如FVa或FVIIIa。可選地，所測量的底物，揭示凝血酶調節蛋白的功能活性，可以是激活的TAFICTAna)或激活的TAFI的底物。當PCa的酶促底物本質上是合成的時，它可以是例如肽底物。有利地，所討論的底物是生色或焚光測定底物。特別地，它可以是可以分析PCa醯胺水解活性的底物。此類底物例如是DiagnosticaStago的合成的寡肽底物CBS42.46。其他的底物已通過實例的方式列舉。凝血酶調節蛋白功能活性定量的步驟基於PCa底物轉化的定量。這種定量可通過測量讀取窗中反應混合物的光密度進行，其測定為所選底物的函數。根據本發明特定實施方案，稀釋從由患者採集的生物樣品中獲得的血漿。作為實例，將血漿以小於20倍、例如小於10倍稀釋，特別地，將其稀釋為1/3或1/4。可以以底物壽文感性的函lt，決定進行的稀釋，即底物越敏感，稀釋可以越大。在本發明特定實施方案中，纖維蛋白聚合抑制劑是多肽抑制劑。特別的，它可以是多肽H-Gly-Pro-Arg-Pro-OH.AcOH(GPRRAcOH)(Penta-pharm的PefablocFG)。這種抑制劑可以以血漿樣品稀釋函數選褲，l-15g/l的濃度用於分析反應中。作為實例，當血漿稀釋1/3時，利用10g/l的這種抑制劑是有利的。在本發明另一個實施方案中，纖維蛋白聚合抑制劑是上文所述的纖維蛋白原抗體。根據本發明特定實施方案，凝血酶調節蛋白功能活性的測量包括使用具有下列組成的凝血酶緩沖液NaCl(0.15mmol/L[毫摩/升])、Tris(20mmol/L)、CaCl2(2.5mmol/L)、BSA(5mg/ml),以及肝素抑制劑，例如聚凝胺(IOg/1),當血漿樣品衍生自用肝素治療的患者時。可以使用適宜稀釋凝血酶的任何其他緩衝液。當激活的蛋白C的酶促底物是CBS42.46或任何其他酶促底物特別是合成的底物時，可在405nm的波長下、在6-500秒的讀取窗中讀取光密度。可選地，在405nm的波長下在6-200s的窗中記錄光密度。底物特別是CBS42.46的濃度在待加入反應介質的試劑中為例如2.5jiM/ml。孵育鈣離子存在下與凝血酶接觸的血漿和蛋白C的步驟，可進行約1-120分鐘、例如約600秒的時段。因此，在本發明特定實施方案中，測量PCa功能活性的方法在下列條件下進行*對於步驟a)，使稀釋至1/3的70)il血漿樣品與40^NIH凝血酶接觸，所述NIH凝血酶在纖維蛋白聚合抑制劑如GPRP.AcOH(10g/l)存在的情況下經緩沖液稀釋，所述緩衝液含有NaCl(0.15mmol/L)、Tris(20mmol/L)、CaCl2(2.5mmol/L)、BSA(5mg/ml),並且當血漿樣品衍生自用肝素治療的患者時，含有肝素抑制劑如聚凝胺(10g/1)。*對於步驟b),將30pl純化的蛋白C與步驟a)中得到的介質一起孵育600s;參對於步驟c)，110pl激活的蛋白C的酶促底物，如(在試劑中)濃度為2.5laM/ml的CBS42.46,並通過在405nm的波長下，在6-500s的時間段內讀取光密度，測定轉化的酶促底物的量。在本發明特定實施方案中，與測量內對照的相同活性平行的是測量血漿凝血酶調節蛋白的功能活性。這種對照可由以與樣品相同的方式處理的標準血漿產生。為了實施本方法，待提供給反應介質的試劑的量和/或濃度，與血漿、凝血酶、純化的蛋白C、纖維蛋白聚合抑制劑以及底物的量和/或濃度一樣，可以根據本申請給出的附圖、特別是以每種試劑或其活性的濃度函數而變化。優選地，反應的各種試劑的各自終濃度在反應介質中基本上是保守的。術語"終濃度"意指試劑被引入時，所述試劑在發揮其作用的介質中的濃度。技術人員可以根據所選試劑的功能調整濃度和活性。通過說明，應該指出，試劑的濃度或活性可以以相對於包含在本申請中的說明的正負50%的量變化，例如，正負20%的量或正負10%的量。這種變化可以涉及一種試劑，而獨立於其他試劑。為了定量凝血酶調節蛋白的功能活性，根據本發明特定實施方案，本發明提出將獲得的反應的結果、例如記錄的光密度值與由校準曲線得到的值進行比較。這種標準曲線例如是通過下列方式由測量凝血酶調節蛋白功能活性獲得的參在OwrenKoller緩沖液中稀釋的標準血漿樣品，例如，含有常規統計量、術語稱為正常量的內源和外源凝集途徑中的已知凝集因子的血漿。它可以從正常血漿樣品或從混合的正常血漿樣品或從單獨檢測的樣品中獲得，以便隨後測定所獲得的凝血酶調節蛋白活性單個值的平均值。凝集因子統計上正常的值位於本領域技術人員所知手冊給出的範圍。作為實例，認為正常的血漿為這樣的血漿，即所述血漿在纖維蛋白原檢測中產生正常的結果，激活的腦磷脂時間(CTA)、凝血酶時間(TT)、PC和因子V。在這,泉上,也可以參考"Howtodefineanddeterminereferenceintervalsintheclinicallaboratory:ApprovedGuidelines(如何在臨床實馬全室中定義和測定參考範圍許可的指導方針)-SecondEdition(第二版)，NCCLS文件C28-A2(ISBN1-56238-406-6)NCCLS-USA2000"中定義的標準；或者*加入漸增量的純化的TM的、凝血酶調節蛋白耗盡的血漿。利用本身已知的任何方法，可以將其獲得，例如利用抗凝血酶調節蛋白抗體，通過免疫吸附，在加入純化的TM前進行TM的耗盡。可以形成稀釋範圍的來自正常血漿池(pool)的正常血漿或加入漸增量TM的TM缺陷血漿。加入血漿樣品以便建立校準曲線的凝血酶調節蛋白可以是完整的或可溶的。也可以涉及截短的可溶重組凝血酶調節蛋白分子，如由BerlexBiosciences(SanFrancisco,USA)推向市場的Solulin⑧。這種分子可以用作產生內對照或產生校準曲線的標準品。根據可以經歷TM活性測量檢測的患者的特徵，可以調整用於獲得對照值的血漿樣品的選擇。因此，選擇作為對照的血漿樣品有利地採集自具有與檢測患者的有關年齡、性別、身體質量指數以及適當時，菸草或酒精攝入水平的特徵近似的特4正的個體。本發明也涉及測量血漿介質中血漿凝血酶調節蛋白活性的試劑盒，所述試劑盒含有參含有在緩沖液中稀釋的凝血酶的試劑1,所述緩衝液含有纖維蛋白聚合抑制劑並含有鈣離子，且如果需要，含有肝素抑制劑；參試劑2，含有純化的蛋白C,或可選地，TAFI(凝血酶可激活的纖維蛋白水解抑制劑)；*含有激活的蛋白C的酶促底物或TAFI的特異性底物的試劑3。對TAFI活性的分析由測量TAFIa(激活的TAFI)組成，這已有描述，例如在利用衍生於芳基偶氮曱酸基化合物的TAFIa的生色底物的專利WO-03/004516中。根據本發明特定實施方案，試劑盒的特徵在於，試劑1主要含有下列化合物NaCl(0.15mmol/L)、Tris(20mmol/L)、CaCl2(2.5mmol/L)、BSA(5mg/ml),以及對於來自用肝素或另一個抗凝血劑治療的患者的血漿樣品，還含有肝素或所述抗凝血劑的抑制劑如凝聚胺(10g/1)，以及纖維蛋白聚合抑制劑。根據本發明特定實施方案，纖維蛋白聚合抑制劑是以l-15g/l的濃度使用的GPRP.AcOH。以檢測血漿的稀釋程度的函數確定濃度。作為實例，當血漿稀釋三分之一時，使用10g/1的GPRP.AcOH。使用這種抑制劑的特性和條件在上文已有描述。本發明還涉及上文限定的試劑盒，其中纖維蛋白聚合抑制劑是抗纖維蛋白原抗體。在特定實施方案中，試劑盒還含有根據本發明的指示所限定的內對照。根據特定實施方案，試劑盒還可以含有凝血酶調節蛋白功能活性的校準曲線，或用於產生這種曲線的裝置。本發明也涉及體外檢測凝集異常的方法，包括如本發明所述測量血漿介質中凝血酶調節蛋白的功能活性。它可以涉及檢測凝血酶調節蛋白功能活性水平的增加或該水平的減少。在成年受試者中，凝血酶調節蛋白水平中的異常變化(增加或減少)是血栓形成或內皮損傷風險的標誌物。根據本方法的特定實施方案，將血漿介質中凝血酶調節蛋白的所測量的功能活性與利用標準血漿測量的這種活性的值進行比較。根據本發明特定實施方案，獲得的值，術語稱為標準值或正常值，是在分析凝血酶調節蛋白對標準血漿樣品的功能活性後獲得的。根據本發明特定實施方案，所述的標準值是從凝血酶調節蛋白功能活性值建立的，所述值是利用單獨分析的正常血漿樣品(標樣)測量的。本申請所述的裝置、方法和試劑盒可用於檢測可能與臨床症狀有關的凝血酶調節蛋白水平的增加。因此，凝血酶調節蛋白水平的增加可與彌散性血管內凝血(DIVC)、糖尿病、慢性骨髓白血病、肝和腎功能不全、子癇前期、血栓性血小板減少性紫癜、立克次氏體病、白塞病、高胱胺酸尿症或流產的症狀有關。根據本發明另一個特定實施方案，裝置、方法和試劑盒可用於檢測可能與臨床症狀有關的凝血酶調節蛋白水平的減少。這些症狀可以是肺動脈高血壓的或黑素瘤的或其他的症狀。在本發明另一個實施方案中，所述的裝置、方法和試劑盒用於檢測與凝血酶調節蛋白基因突變有關的凝血酶調節蛋白水平的減少。根據下列實施例和附圖，本發明的其他特徵和優勢將變得明顯，所述下列實施例特別說明與病理狀態有關的凝血酶調節蛋白水平的變化。圖1:凝血酶調節蛋白組織結構圖解EGF二表皮生長因子(EGF樣)。凝血酶調節蛋白的序列在WeilerH和IsermannBH2003年的文章(JournalofThrombosisandHaemostasis,vol1,pages1515-1524)中有描述；圖2:凝血酶調節蛋白活性圖解PC:蛋白C;PCa:激活的蛋白C;Th:凝血酶；ATIII-Th:抗凝血酶III-凝血酶複合物；EPCR-PC:內皮蛋白C受體-蛋白C;TAFI:凝血酶可激活的纖維蛋白水解抑制劑；TAFIa:激活的TAFI;TM:凝血酶調節蛋白；V:因子V;Va:激活的因子V;圖3:說明分析特異性的曲線(DefTM:TM缺陷)；圖4:病理血漿和正常血漿的檢測；圖5:作為凝血酶調節蛋白濃度的函數的凝血酶調節蛋白活性的測量(DDO)校準曲線；圖6:作為樣品中蛋白C量的函數的凝血酶調節蛋白活性敏感性的測量；圖7:樣品因子II的敏感性；圖8:樣品中TAFI量的敏感性；圖9:穩定性評估；圖10:來自正常妊娠或患有併發症婦女的血漿樣品的磷脂濃度和TMa活性的測量；圖11:與心肌梗塞(MI)有關的凝血酶調節蛋白的活性；圖12:已經經歷異源移植的患者凝血酶調節蛋白的變化。檢測來自狀況變為併發症患者的樣品和來自狀況改善患者的樣品的TMa活性。產生這些結果的條件在實施例中進行了描述。實施例1.分析方法按如下分析70(il稀釋1/3的血漿樣品的凝血酶調節蛋白功能活性。A)待提供於反應介質的試劑*40pl的10NIH凝血酶，其溶於由下列組成的凝血酶緩衝液(即在介質中最終是1.6NIH):0.15mmol/LNaCl20mmol/LTris2.5mmol/LCaCl25mg/mlBSA10g/1GPRP.AcOH(纖維蛋白聚合抑制劑)2ml/l凝聚胺，10g/1*30jal純化的蛋白C,100|ug/ml,溶解於1ml蒸餾水中*110piPCa的合成底物(來自DiagnosticaStago的CBS42.46,2.5^M/ml)，溶解於6ml蒸餾水/水蛭素，20ATU)(即介質終濃度1.10nM/ml)。B)蛋白C的激活和PCa分析使血漿樣品與凝血酶在凝血酶緩衝液中接觸，並在37。C下與蛋白C一起孵育約600秒的時段，以便激活蛋白C。使獲得的介質與合成的底物接觸。隨後通過在405腿下讀取6-500秒的讀取窗中的光密度，在37°C下測定PCa的醯胺水解活性。C)4企查測量的特異性通過將用正常血漿池獲得的活性與用加入了純化的TM(例如來自美國Diagnostica或HaematologicTechnologiesInc)的TM在夾陷血)泉獲4尋的活性進行比較，證實PCa活性的光密度測量的特異性。結果顯示於圖3中並證實了分析的特異性。D)鬥全查可重複性進行可重複性測量，並將結果顯示於表l-3中。E)PCa活性的l直利用本發明的方法，分析43個正常血漿的凝血酶調節蛋白活性。光密度測量和相應的TM活性百分比顯示於表4中。可以認為這些測量值是凝血酶調節蛋白功能活性正常值的指標。tableseeoriginaldocumentpage21認為100%的TM功能活性是被任意地限定為TM的量，在2.5mmol/LCa"離子存在的情況下，當凝血酶和PC濃度分別為10NIH和100jig/ml時，所述TM的量導致0.03pmol/1的PCa形成。此外，利用本發明的方法，分析由生物樣品獲得的血漿的TM功能活性，所述生物樣品採集自患有已鑑定病理的患者。利用上文提到的生色檢測和合成的底物，在STA-R分析儀(DiagnosticaStago,France)中進行測量。檢測內和檢測間Cts值分別<4%和<5%。對才全測的響應在0%至200%是線性的。作為TM活性的百分比，結果如下糖尿病(n=15):130%±28;癌症(n=10):155±60;敗血症(n=12):173%±56;多發性創傷(n二20):185%±62。這些結果顯示於圖4中。II校準曲線製備的實例為了產生給出凝血酶調節蛋白功能活性的校準曲線，利用如下*稀釋正常血漿池，以OwrenKoller緩衝液或凝血酶調節蛋白缺陷；*或對具有純化的凝血酶調節蛋白的凝血酶調節蛋白缺陷血漿進行過量加樣；*或通過將100%凝血酶調節蛋白活性的水平任意地限定為凝血酶調節蛋白的水平，在2.5mmol/LCa"+存在的情況下，當凝血酶的濃度為10NIH且PC的濃度為100嗎/ml時，所述凝血酶調節蛋白的水平導致0.03|uml/l的PCa產生。檢測配製中稀釋1/3的每種血漿。利用上文限定的標準，測定加入血漿池中的對應於凝血酶調節蛋白200%、150%、100%、50%、25%、12.5%以及0%活性的TM濃度。針對PCa合成的底物即CBS42.46，測定凝血酶調節蛋白的活性。PCa的醯胺水解活性通過405nm波長下對-硝基苯胺的釋放(黃色)測量。在405nm波長下，在6-500秒的讀取窗中，測定對應於凝血酶調節蛋白活性的每個值(作為百分比)的光密度。校準曲線顯示於圖5中。III評估分析對各種血漿凝集蛋白或對幹擾凝集的試劑的敏感性A)對肝素的敏感性通過在上文所述的分析條件下，向分析的血漿中加入濃度漸增的肝素4丐(calciparine⑧)，測定每文感性。肝素鈣的影響描述於下文的表6中，iU正明對TM的功能活性幾乎不具影響。表6對肝素的敏感性tableseeoriginaldocumentpage22B)對包含於血漿樣品中蛋白C的水平的敏感性利用上文所述方法，分析含有預定可變濃度的蛋白C的血漿。^口下*蛋白C缺陷血漿(欄O);*來自各種程度蛋白C缺陷池的血漿(欄12.5-50);*來自正常池(GK(GeorgesKing)池)的血漿(欄100)。結果(表7和圖6)表明，樣品中PC的水平對TM功能活性的值幾乎不具影響。表7對樣品(l)中蛋白C量的敏感性tableseeoriginaldocumentpage230=DefPCClinisys12.5-504/DefPc100=GK池150-300=池/純化的PCC)對包含於血漿樣品中因子II水平的敏感性利用上文所述方法，分析預定可變濃度的因子II的血漿。^口下*因子II缺陷血漿(欄O);*來自各種程度因子II缺陷池的血漿(欄25-87.5);來自正常池(GK池)的血漿(欄100);結果(表8和圖7)表明，樣品中FII的水平對TM功能活性的值幾乎不具影響。表8tableseeoriginaldocumentpage230=DefIIGK25-87.5=池/DefII100=GK池D)對包含於血漿樣品中TAFI的水平的敏感性利用上文所述方法，分析含有預定的可變濃度的TAFI的血漿。*TAFI缺陷血漿；*來自各種程度TAFI缺陷池的血漿；*來自正常池的血漿(GK池)。結果(表9和圖8)表明，樣品中TAFI的水平對TM功能活性的值幾乎不具影響。表9對樣品(l)中TAFI水平的敏感性tableseeoriginaldocumentpage24E)穩定性評估為了評估反應的穩定性，間隔一段時間後，重複TM功能活性分析。每隔4小時對相同樣品進行的分析表明，值具有正確的穩定性(表10和圖9)。表IOtableseeoriginaldocumentpage243PIN725-17是由Manchester提供的正常血漿，並對應於批次725-17。F)讀取窗為了在6-500秒、隨後在6-200秒的窗口內記錄，調整光密度讀取窗。獲得的各種血漿的結果基本上是相等的(表11)。IV凝血酶調節蛋白活性的增加和孕婦胎兒早期喪失之間的相關性早期胎兒喪失是嚴重的臨床問題，其經常不能適當地解釋或檢測。除了解剖學、染色體和激素原因外，抗磷脂綜合症(APS)是目前為止可以診斷的單個常見原因。提出的解釋流產的機制之一是由於子宮胎盤血栓形成導致的組織缺氧。凝血酶調節蛋白是血栓形成中重要的標誌物。在患有早期流產患者的對照研究中，基於凝血酶調節蛋白通過凝血酶促進蛋白C激活的能力，進行本發明的凝血酶調節蛋白活性檢測。將從無血栓形成史且患有早期流產(與APS無關)患者(N-35)懷孕的最初三個月採集的血液樣品中獲得的結果，與從正常懷孕的相似年齡組婦女(N二37)懷孕的最初三個月獲得的樣品中獲得的結果以及未懷孕的正常患者(N二32)的結果進行比較。流產後立即從患者組採集血液樣品。將所有的血液樣品(在109MN的檸檬酸鹽中1:10)攪拌2次，並將血漿在-80。C冷凍，直到aPTT和凝血酶調節蛋白活性鬥企測(DiagnosticaStago,France)。相對於正常妊娠的120±10%和流產的158±14%，對照的凝血酶調節蛋白活性檢測的平均值為106±12%(p小於0.001)。儘管為了測定這種檢測的能力和特異性，需要補充研究，但這種參數的測定可以證明是輔助檢測處於流產風險中的婦女的有用的工具。凝血酶調節蛋白活性看起來是妊娠期高血壓綜合症有利的早期預測標誌物，在處於風險的婦女中，其可允許用於預防更嚴重的臨床表現的藥物幹預。表lltableseeoriginaldocumentpage25V凝血酶調節蛋白活性和妊娠併發症之間的相關性妊娠期併發症與NK(天然殺傷)細胞的活性和子宮胎盤血栓形成有關。促凝血磷酯(PPL)可以在血管破壞的情況下調節NK活性和TMa增加的作用。利用基於因子Xa(XaCT-Xa凝結時間)的凝集檢測測量PPLs的濃度以及測量TMa的活性是有利的，因為這些檢測是檢測易經歷妊娠併發症的婦女的預測標誌物。檢測來自在妊娠期經歷了併發症(與抗磷脂綜合症無關)的無血栓形成史的婦女(35)、正常妊娠的相同年齡組的婦女(37)、無確定的病理且未懷孕的婦女(32)的血液樣品。處理樣品，以收集在檢測前儲藏於-80。C的血漿。在XaCT檢測中，測量PPLs。縮短的凝結時間反映了PPL濃度的增力口。基於能促進蛋白C激活的能力(如上文所述)，在生色檢測中測量TMa活性。對三種類型的樣品獲得的結果(圖IO)的比較表明l)對於XaCT檢觀'J:具併發症妊娠的患者、正常妊娠以及對照的平均值分別為35.2±11.8s、50.6±8.6s和55±9.2s(p<0.001);2)對於TMa活性檢測具有併發症妊娠、正常妊娠以及對照的平均值分別為169%±24、119%±16和106%±16(p<0.05)。因此，看起來XaCT檢測和TMa檢測兩者作為檢測在妊娠期處於併發症風險婦女的預測標誌物是有利的。VI凝血酶調節蛋白活性的增加和心肌梗塞的相關性測量正常血漿池和從患有心肌梗塞(MI)的存活患者採集的血漿樣品和從因MI死亡的患者採集的血液樣品中的凝血酶調節蛋白活性。在上文I所述的條件下，進行測量。結果表明，在MI的情況下，凝血酶調節蛋白活性實質增加。tableseeoriginaldocumentpage26VII凝血酶調節蛋白活性和骨髓異源移植測量從經歷了骨髓異源移植的患者(小孩)採集的血漿樣品的凝血酶調節蛋白活性。根據移植後樣品採集的階段，移植後TM活性不同。根據移植是發展了併發症或還是相反有利地，觀察到TM活性變化的差異。權利要求1.體外測量凝血酶調節蛋白功能活性的方法，所述方法包括分析來自生物樣品的生物介質中，蛋白C在凝血酶輔助因子即所述凝血酶調節蛋白存在下，通過凝血酶向激活的蛋白C(PCa)的激活，所述方法包括向所述血漿樣品中加入所述蛋白C系統激活所需的試劑、加入純化的蛋白C以及還加入纖維蛋白聚合抑制劑。2.如權利要求1所述的體外測量凝血酶調節蛋白功能活性的方法，其中所分析的凝血酶調節蛋白是血漿凝血酶調節蛋白，所述生物樣品是血漿樣品，所述分析在血漿介質中進行。3.如權利要求1或2所述的方法，其中為了所述激活蛋白C系統，加入;疑血酶和4丐離子。4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中利用酶促底物測定所述激活的蛋白C的活性。5.如權利要求4所述的方法，其中利用PCa的生色或螢光測定底物，分析所述激活的蛋白C的醯胺水解活性。6.如權利要求5所述的方法，其中分析由合成的底物CBS42.46釋放的對-硝基苯胺。7.如權利要求4所述方法，其中分析凝集的血漿蛋白，例如因子Va、因子VIIIa或TAFIa，對所述凝集的血漿蛋白的抑制依賴PCa。8.如權利要求2-7中任一項所述的方法，包括下列步驟a)使血漿樣品與試劑l接觸，所述試劑l含有能夠激活所述蛋白C系統的介質所含的凝血酶，特別地含有鈣離子，所述試劑1.還含有纖維蛋白聚合抑制劑；b)將步驟a)中得到的介質與含有純化的蛋白C的試劑2孵育足以允許所述蛋白C激活為PCa的時段，所述激活藉助與輔助因子、即包含在所述血漿樣品中的凝血酶調節蛋白複合的凝血酶；c)使步驟b)中得到的含有激活的蛋白C的介質與PCa的酶促底物接觸；d)檢測所述PCa底物的轉化。9.如權利要求2-8中任一項所述的方法，其中稀釋所述血漿樣品，例如稀釋1/3。10.如權利要求1-8中任一項所述的方法，其中所述纖維蛋白聚合抑制劑是多肽抑制劑，例如H-GlyProArgPro-OH.AcOH(GPRP.Ac-OH)。11.如權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述纖維蛋白聚合抑制劑是抗纖維蛋白原抗體。12.如權利要求8-11中任一項所述的方法，其中凝血酶緩衝液主要含有下列化合物NaCl(0.15mmol/L)、Tris(20mmol/L)、CaCl2(2.5mmol/L)、BSA(5mg/ml);以及當所述血漿樣品具有用肝素治療的患者的特徵時，還含有肝素抑制劑，如聚凝胺(10g/1)。13.如權利要求10或12任一項所述的方法，其中根據對所述血漿樣品的稀釋，加入濃度為1-15g/1的所述纖維蛋白聚合抑制劑GPRP.AcOH。14.如權利要求8-13中任一項所述的方法，其中所述激活的蛋白C的所述酶促底物是寡肽THC-Pro-Arg-pNa。15.如權利要求4-14中任一項所述的方法，其中通過記錄光密度，進行所述PCa酶促底物轉化的定量測量。16.如權利要求8-15中任一項所述的方法，其中在下列條件下使用反應中所用的組分參對於步驟a),使70inl稀釋1/3的血漿樣品與40nl在緩衝液中稀釋的10NIH凝血酶接觸，所述緩衝液含有NaCl(0.15mmol/L)、Tris(20mmol/L)、CaCl2(2.5mmol/L)、BSA(5mg/ml)，並且是在纖維蛋白聚合抑制劑例如GPRP.AcOH(10g/l)存在下，以及當所述血漿樣品衍生自用肝素治療的患者，還含有肝素抑制劑如聚凝胺(IOg/l);參對於步驟b)，將30pl純化的蛋白C與步驟a)中得到的介質孵育600秒；參對於步驟c),llO(il所述激活的蛋白C的酶促底物，通過在405nm波長下讀取6-500s時段內的光密度，測定轉化的酶促底物的量。17.如權利要求1-16中任一項所述的方法，其中所述方法還包括分析內對照。18.如權利要求1-17中任一項所述的方法，其中將獲得的所述光密度的值與校準曲線進行比較。19.如權利要求8-18中任一項所述的方法，其中所述試劑是包含於凝血酶調節蛋白缺陷血漿中的凝血酶，已向所述血漿加入纖維蛋白聚合抑制劑，並且當所述檢測的血漿具有用抗凝血劑治療的患者的特徵時，還加入所述抗凝血劑的抑制劑。20.功能性測量生物介質、特別是血漿介質中凝血酶調節蛋白活性的試劑盒，含有*試劑1，包含在含有纖維蛋白聚合抑制劑以及含有鈣離子的緩衝液中稀釋的凝血酶；*試劑2，含有純化的蛋白C;參如果需要，試劑3,含有激活的蛋白C的酶促底物。21.如權利要求20所述的試劑盒，其中所述試劑l主要含有下列化合物NaCl(0.15mmol/L)、Tris(20mmol/L)、CaCl2(2.5mmol/L)、BSA(5mg/ml)，以及當所述血漿樣品衍生自用肝素治療的患者時，還含有肝素抑制劑如聚凝胺(10g/1),以及纖維蛋白聚合抑制劑。22.如權利要求20或21所述的試劑盒，其中所述纖維蛋白聚合抑制劑是以1-15g/1的濃度使用的GPRP.AcOH。23.功能性測量生物介質、特別是血漿介質中凝血酶調節蛋白活性的試劑盒，含有*試劑1,含有在含有纖維蛋白聚合抑制劑以及含有鈣的緩衝液中稀釋的凝血酶；*試劑2,含有TAFI;以及如果需要*試劑3,含有TAFI的底物。24.如權利要求20-24中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒還含有內對照。25.如權利要求19-23中任一項所述的試劑盒，其中所述試劑盒含有凝血酶調節蛋白功能活性的校準曲線。26.體外檢測凝集異常的方法，包括測量權利要求2-20中任一項所述的血漿凝血酶調節蛋白功能活性。27.如權利要求25所述的方法，包括將測量的凝血酶調節蛋白功能活性水平與所述活性的正常值進行比較。28.如權利要求27所述的方法，其中所述正常值是在分析正常血漿樣品池的凝血酶調節蛋白功能活性後獲得的。29.如權利要求27所述的方法，其中所述正常值是由對單個分析的正常血漿樣品測量的凝血酶調節蛋白功能活性的值建立的。30.如權利要求1-19或26-29中任一項所述的方法，所述方法用於檢測與彌散性血管內凝血(DIVC)、糖尿病、慢性骨髓白血病、肝和腎功能不全、子癇前期、血栓性血小板減少性紫癜、立克次氏體病、白塞病、高胱胺亂豕症和流產的症狀有關的凝血酶調節蛋白水平的升高。31.如權利要求1-19或26-29中任一項所述的方法，所述方法用於檢測與肺動脈高血壓或黑素瘤的症狀有關的凝血酶調節蛋白水平的降低。32.如權利要求1-19或26-29中任一項所述的方法，所述方法用於檢測與凝血酶調節蛋白基因突變有關的凝血酶調節蛋白水平的降低。33.如權利要求20-25中任一項所述的試劑盒，所述試劑盒用於檢測與彌散性血管內凝血(DIVC)、糖尿病、慢性骨髓白血病、肝和腎功能不全、子癇前期、血栓性血小板減少性紫癜、立克次氏體病、白塞病、高胱胺酸尿症和流產的症狀有關的凝血酶調節蛋白水平的升高。34.如權利要求20-25中任一項所述的試劑盒，所述試劑盒用於檢測與肺動脈高血壓或黑素瘤的症狀有關的凝血酶調節蛋白水平的降低.，35.如權利要求20-25中任一項所述的試列盒，所述試別盒用於檢測與凝血酶調節蛋白基因突變冇關的凝血酶調$蛋白水平的降低t全文摘要本發明涉及體外測量凝血調節蛋白功能活性的方法，其中所述方法包括定量來自生物樣品的生物介質中，蛋白C在凝血酶輔助因子即凝血調節蛋白存在下，通過凝血酶向激活的蛋白C(PCa)的激活，所述方法包括向樣品血漿中加入蛋白C系統激活所需的試劑、加入純化的蛋白C並且還加入纖維蛋白聚合抑制劑。本發明還涉及該方法在檢測凝集病理中的應用。文檔編號C12Q1/56GK101605907SQ200780044311公開日2009年12月16日申請日期2007年11月28日優先權日2006年11月29日發明者奧雷莉·盧梭,派屈克·萬德丹申請人:斯塔戈診斷公司