對人腫瘤壞死因子α具有特異性的抗體分子及其用途的製作方法

2023-06-25 21:58:31 3

專利名稱：對人腫瘤壞死因子α具有特異性的抗體分子及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種對人腫瘤壞死因子α(TNFα)的抗原決定簇具有特異性的抗體分子。本發明還涉及該抗體分子的治療用途，及生產該抗體分子的方法。
本發明涉及抗體分子。在抗體分子中，有兩個重鏈和兩個輕鏈。各重鏈和各輕鏈的N-端均有一個可變域。各個可變域是由四個構架區(FRs)組成的，該構架區與三個互補性決定區(CDRs)相交替。可變域中的殘基通常是根據Kabat等人設計的系統編號的。此系統是在Kabat等，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Department of Health and Human Services，NIH，USA(此後稱為「Kabat等(supra)」)中提出的。除非另有說明，否則將該編號系統用於本發明的說明書中。
Kabat殘基的命名並非總是與線性胺基酸殘基的編號直接相關。與嚴格的Kabat編號方式相比，相應於縮短，或插入基本可變域結構的結構性組分，構架或CDR，實際的線性胺基酸序列可包括較少的或附加的胺基酸。通過與具有「標準」Kabat編號序列抗體中的同系物的殘基進行序列對比，可確定所提供抗體殘基正確的Kabat編號。
根據Kabat編號方式，重鏈可變域的CDRs位於第31-35位(CDRH1)，50-65(CDRH2)位和95-102位(CDRH3)的殘基上。
根據Kabat編號方式，輕鏈可變域的CDRs位於第24-34位(CDRL1)，50-56位(CDRL2)和89-97位(CDRL3)殘基上。
歐洲專利申請EP-A-0239400中描述了移植了CDR的抗體的結構，該文獻還公開了一種方法，其中使用長鏈的寡核苷酸，通過定點誘變，把小鼠單克隆抗體的CDR移植到人免疫球蛋白可變域的構架區上。該CDR可確定抗體的抗原結合特異性，且其是攜帶在可變域構架區上相對較短的肽序列。
有關通過移植CDR而使單克隆抗體人源化的早期研究工作是在識別合成抗原，如NP的單克隆抗體上進行的。Verhoeyen等(Science，239，1534-1536，1988)和Riechmann等(Nature，332，323-324，1988)分別描述了通過CDR移植，使識別溶菌酶的小鼠單克隆抗體和識別人T-細胞上抗原的大鼠單克隆抗體人源化的實施例。
Riechmann等發現單獨轉移CDR(如Kabat(Kabat等(supra)和Wu等，J.Exp.Med.，132，211-250，1970)所定義的)不足以在移植了CDR的產物中提供令人滿意的抗原結合活性。人們發現，不得不改變許多構架殘基，以使它們與供體構架區的那些相對應。國際專利申請WO90/07861中描述了選擇需改變的構架殘基的草擬標準。
目前已公開了很多討論移植了CDR的(CDR-grafted)抗體的評論，包括Vaughan等(Nature Biotechnology，16，535-539，1998)。
TNFα是一種促炎細胞因子，它通過免疫系統的細胞釋放並與之相互作用。因而，TNFα是通過巨噬細胞釋放的，其中的巨噬細胞已經被革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)活化。本身，TNFα是一種重要的內源介質，其涉及與細菌性膿毒症有關的內毒素性休克的發病和發展。TNFα還可以正向調節許多人類疾病，包括慢性疾病，如類風溼性關節炎，克羅恩氏病，潰瘍性結膜炎和多發性硬化症。人TNFα的轉基因鼠可產生組成型高水平的TNFα，並發展成一種自發的，有害的，類似類風溼性關節炎的多髮型關節炎(Kaffer等，EMBO J.，10，4025-4031，1991)。因此將TNFα稱為促炎細胞因子。
在現有技術中已經描述了TNFα的單克隆抗體。Meager等，(Hybridoma，6，305-311，1987)描述了鼠科動物重組TNFα的單克隆抗體。Fendly等，(Hybridoma，6，359-370，1987)描述了鼠科動物重組TNFα的單克隆抗體在定義TNF上的中和表位中的用途。Shimamoto等(Immunology Letters，17，311-318，1988)描述了鼠科動物TNFγ的單克隆抗體，及其在預防鼠類動物內毒素性休克中的用途。此外，國際專利申請WO92/11383公開了對TNFα具有特異性的重組抗體，包括移植了CDR的抗體。Rankin等(BritishJ.Rheumatology，34，334-342，1995)描述了這種移植了CDR的抗體在治療類風溼性關節炎中的用途。US-A-5 919 452公開了抗-TNF嵌合抗體及其在治療與TNF存在有關的病狀中的用途。
人們(Beutler等，Science，234，470-474，1985)已經提出了TNFα的抗體在預防和治療內毒素性休克中的用途。Bodmer等，(Critical Care Medicine，21，S441-S446，1993)和Wherry等，(Critical Care Medicine，21，S436-S440，1993)討論了抗-TNFα抗體在治療膿毒性休克中的治療潛力。Kirschenbaum等(CriticalCare Medicine，26，1625-1626，1998)也討論了抗-TNFα抗體在治療膿毒性休克中的用途。使用抗-TNFα單克隆抗體可有效地治療膠原-誘導的關節炎(Williams等(PNAS-USA，89，9784-9788，1992))。
在類風溼性關節炎患者的滑液和外周血中可見到TNFα水平的升高。當把TNFα阻斷劑給予患類風溼性關節炎的患者時，它們可減輕炎症，改善症狀並延緩關節的損害(McKown等(ArthritisRheum.，42，1204-1208，1999)。
Feldman等(Transplantation Proceedings，30，4126-4127，1998)，Adorini等(Trends in Immunology Today，18，209-211，1997)和Feldman等(Advances in Immunology，64，283-350，1997)討論了抗-TNFα抗體在治療類風溼性關節炎和克羅恩氏病中的用途。用於這種治療的TNFα抗體通常是嵌合抗體，如US-A-5 919 452中描述的那些。
目前，已經批准了兩種TNFα阻斷產品用於治療類風溼性關節炎。首先，是Immunex Corporation銷售的EnbrelTM，稱作etanercept。它是一種含兩個p75可溶性TNF-受體域的重組融合蛋白，該TNF-受體域與人免疫球蛋白的Fc部分相連。第二，是Centocor Corporation銷售的RemicadeTM，稱作infliximab。它是一種具有鼠科動物抗-TNFα可變域和人IgG1不變域的嵌合抗體。
與導出可變域或CDR的抗體相比，現有技術中的抗-TNFα抗體分子對TNFα的親和力降低，且其通常是在哺乳動物的細胞中產生的，造價昂貴。Stephens等，(Immunology，85，668-674，1995)，GB-A-2 246570和GB-A-2 297 145描述了現有技術中的抗-TNFα抗體。
因而，需要一種治療慢性炎症疾病的抗體分子，其可以重複地使用，並可以很容易地，有效地生產。還需要一種抗體分子，其對TNFα具有高親和力，而對人具有低免疫原性。
在第一個方面中，本發明提供一種對TNFα具有特異性的抗體分子，其包含一個重鏈，其中的可變域包含一CDR(Kabat等(supra)定義的)，該CDR具有圖3(SEQ ID NO1)所列CDRH1的H1序列，圖3(SEQ ID NO2)所列CDRH2的H2』序列或圖3(SEQ ID NO7)所列CDRH2的H2序列，或圖3(SEQ ID NO3)所列CDRH3的H3序列。
本發明第一方面抗體分子的重鏈可變域包含至少一個選自H1，H2』或H2和H3(SEQ ID NO1；SEQ ID NO2或SEQ ID NO7和SEQ ID NO3)的CDR。優選地，該抗體分子的重鏈可變域中包含至少兩個，更優選全部三個CDR。
在本發明的第二個方面中，提供一種對人TNFα具有特異性的抗體分子，其包含一個輕鏈，其中的可變域含一CDR(如Kabat等(supra)所定義的)，該CDR具有圖3(SEQ ID NO4)所列CDRL1的L1序列，圖3(SEQ ID NO5)所列CDRL2的L2序列，或圖3(SEQ ID NO6)所列CDRL3的L3序列。
本發明第二方面抗體分子的輕鏈可變域包含至少一個選自L1，L2和L3(SEQ ID NO4-SEQ ID NO6)的CDR。優選地，該抗體分子的輕鏈可變域中包含至少兩個，更優選全部三個CDR。
優選本發明第一和第二方面的抗體分子分別具有一個互補的輕鏈或一個互補的重鏈。
優選地，本發明第一或第二方面的抗體分子包含一個重鏈，其中的可變域包含一CDR(Kabat等(supra)定義的)，該CDR具有圖3(SEQID NO1)所列CDRH1的H1序列，圖3(SEQ ID NO2或SEQ ID NO7)所列CDRH2的H2』或H2序列，或圖3(SEQ ID NO3)所列CDRH3的H3序列，和一個輕鏈，其中的可變域包含一CDR(如Kabat等(supra)所定義的)，該CDR具有圖3(SEQ ID NO4)所列CDRL1的L1序列，圖3(SEQ ID NO5)所列CDRL2的L2序列，或圖3(SEQ ID NO6)所列CDRL3的L3序列。
SEQ ID NO1和3-7及圖3中所列的CDR均來源於小鼠的單克隆抗體hTNF40。然而，SEQ ID NO2是由雜種CDR組成的。該雜種CDR包含部分來源於小鼠單克隆抗體hTNF40的重鏈CDR2，和部分來源於人類3組種系V區序列的重鏈CDR2。
小鼠hTNF40抗體可變域的全序列在圖6(輕鏈)(SEQ ID NO99)和圖7(重鏈)(SEQ ID NO100)中列出。下面稱此小鼠抗體為「供體抗體」。
本發明第一或第二方面的第一個優選實施例是小鼠單克隆抗體hTNF40，其具有圖6(SEQ ID NO99)和圖7(SEQ ID NO100)中分別列出的輕鏈和重鏈可變域序列。hTNF40的輕鏈不變區是κ，重鏈不變區是IgG2a。
在第二個優選實施例中，本發明第一或第二方面的抗體是一種嵌合的小鼠/人抗體分子，此處稱其為嵌合hTNF40抗體分子。該嵌合抗體分子包含小鼠單克隆抗體hTNF40(SEQ ID NO99和100)的可變域和人的不變域。優選地，該嵌合hTNF40抗體分子的輕鏈中包含人Cκ域(Hieter等，Cell，22，197-207，1980；Genebank accession numberJ00241)，重鏈中包含人γ4域(Flanagan等，Nature，300，709-713，1982)。
在第三個優選實施例中，本發明第一和第二方面的抗體是一種移植了CDR的抗體分子。此處使用的術語「移植了CDR的抗體分子」指的是這樣一種抗體分子，其中的重鏈和/或輕鏈包含一個或多個來源於供體抗體(例如，鼠科動物單克隆抗體)的CDR(包括，如果期望，一種雜種CDR)，其中的供體抗體被移植到受體抗體(例如，人的抗體)的重鏈和/或輕鏈可變區構架中。
優選地，這種移植了CDR的抗體有一個可變域，其包含人的受體構架區和上述一個或多個供體CDR。
當移植了CDR時，任一適當的受體可變區構架序列均可採用，只要注意到CDR從中衍生的供體抗體的種類/類型，包括小鼠，靈長類動物和人的構架區。用於本發明的人構架的實施例是KOL，NEWM，REI，EU，TUR，TEI，LAY和POM(Kabat等(supra))。例如，KOL和NEWM可用於重鏈，REI可用於輕鏈，EU，LAY和POM既可用於重鏈又可用於輕鏈。輕鏈的優選構架區是

圖1(SEQ ID NOS83，85，87和89)所示人類1組構架區。重鏈的優選構架區是圖2(SEQ ID NOS91，93，95和97及SEQ ID NOS106，107，108和109)分別所示的人類1組和3組的構架區。
在本發明移植了CDR的抗體中，優選將具有與供體抗體鏈同源的抗體作為受體抗體使用，其具有。受體的重鏈和輕鏈並不需要來源於相同的抗體，且可以，如果需要，包含複合鏈，其中該複合鏈具有來源於不同鏈的構架區。
且，在本發明移植了CDR的抗體中，構架區不需要具有與受體抗體的那些序列完全相同的序列。例如，可把稀有殘基變為就受體鏈的種類或類型而言更經常出現的殘基。選擇性地，可改變受體構架區中選定的殘基，以便使它們與在供體抗體相同位置發現的殘基相一致。應使這種改變保持在最小，從而恢復供體抗體的親和力。在WO91/09967中提出了一種選擇受體構架區中需改變的殘基的方案。
優選地，在本發明移植了CDR的抗體分子中，如果受體重鏈具有人類1組的構架區(圖2所示)(SEQ ID NOS91，93，95和97)，那麼除一種或多種供體CDR之外，重鏈的受體構架區還包含28，69和71位的供體殘基(根據Kabat等(supra))。
選擇性地，如果受體重鏈具有1組的構架區，那麼除一種或多種供體CDR之外，重鏈的受體構架區還包含28，38，46，67，69和71位的供體殘基(根據Kabat等(supra))。
優選地，在本發明移植了CDR的抗體分子中，如果受體重鏈具有人類3組的構架區(圖2所示)(SEQ ID NOS106，107，108和109)，那麼除一種或多種供體CDR之外，該重鏈的受體構架區還包含27，28，30，48，49，69，71，73，76和78位的供體殘基(根據Kabat等(supra))。
優選地，在本發明移植了CDR的抗體分子中，如果受體輕鏈具有人類1組的構架區(圖1所示)(SEQ ID NOS83，85，87和89)，那麼該輕鏈的受體構架區還包含46和60位的供體殘基(根據Kabat等(supra))。
供體殘基是來源於供體抗體，即，CDR最初從中衍生的抗體的殘基。
本發明的抗體分子可包含具有全長重鏈和輕鏈的完整抗體分子；其片段，如Fab，修飾的Fab，Fab』，F(ab』)2或Fv片段；輕鏈或重鏈的單體或二聚體；單鏈抗體，例如單鏈的Fv，其中重鏈和輕鏈的可變域是通過肽鍵連接的。類似地，重鏈和輕鏈的可變域可與其它抗體適當地結合。
本發明優選的抗體分子是Fab片段。優選的Fab片段有一個重鏈和一個輕鏈，該重鏈具有SEQ ID NO111所列的序列，該輕鏈具有SEQID NO113所列的序列。優選SEQ ID NO111和SEQ ID NO113中所列的胺基酸序列分別是由SEQ ID NO110和SEQ ID NO112中所列的核苷酸序列編碼的。
選擇性地，優選本發明的抗體分子是一種修飾的Fab片段，其中的修飾是指將一個或多個胺基酸添加到片段重鏈的C-端，從而與效應分子或報導分子相連接。優選地，附加的胺基酸形成含一個或兩個半胱氨酸殘基的修飾鉸鏈區，從而可與效應分子或報導分子相連接。這種修飾的Fab片段優選具有一個重鏈和一個輕鏈，該重鏈具有SEQ IDNO115所列的序列，該輕鏈具有SEQ ID NO113所列的序列。SEQ IDNO115中所列的胺基酸序列優選是由SEQ ID NO114中所列的核苷酸序列編碼的。
優選的效應子是一種聚合物分子，其可以與修飾的Fab片段相連接，以增加它在體內的半衰期。
該聚合物分子通常可以是一種合成的或天然存在的聚合物，例如，任選取代的直鏈或支鏈的聚亞烷基，聚亞烯基或聚亞氧烷基的聚合物，或支鏈或無支鏈的多糖，例如，同-或雜-多糖。
存在於上述合成聚合物上的特殊任選取代基包括一個或多個羥基，甲基或甲氧基。合成聚合物的特殊實施例包括任選取代的直鏈或支鏈的聚(乙二醇)，聚(丙二醇)，聚(乙烯醇)或其衍生物，特別是任選取代的聚(乙二醇)，如甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物。天然存在的特殊聚合物包括乳糖，直鏈澱粉，葡聚糖，糖原或其衍生物。此處使用的「衍生物」可包括反應性衍生物，例如巰基-選擇性的反應基團，如馬來醯亞胺等。該反應基團可直接或通過連接區段與聚合物相連。我們期望在某些例子中，作為抗體片段和聚合物之間的連接基團，這種基團的殘基可形成產物的一部分。
聚合物的大小可根據需要而變化，但平均分子量通常在500Da-50000Da之間，優選在5000-4000Da，更優選25000-4000Da。聚合物的大小可根據產品的用途而選擇。因而，例如，假如想使產物離開循環，滲透組織中，例如用於治療腫瘤，可使用小分子量的聚合物，例如分子量為5000Da的聚合物。為使產物留在循環中，可使用分子量較高的聚合物，例如分子量為25000Da-40000Da的聚合物。
特別優選的聚合物包括聚亞烷基聚合物，如聚(乙二醇)或，特別是，甲氧基聚(乙二醇)或其衍生物，特別是具有約25000Da-約40000Da分子量的聚合物。
附著在修飾抗體片段上的各聚合物分子可與片段中半胱氨酸殘基的硫原子共價連接。該共價鍵通常是二硫鍵或，特別是，硫-碳鍵。
需要時，該抗體片段可具有一個或多個與其連接效應分子或報導分子。該效應分子或報導分子可通過片段中任一可利用的胺基酸側-鏈或末端胺基酸官能團，例如任一游離氨基，亞氨基，羥基或羧基與抗體片段連接。
在製備上述聚合物-修飾的抗體片段時，可將活化的聚合物用作起始材料。該活化聚合物可以是任一含巰基反應基團的聚合物，如α-滷羧酸或酯，例如，碘乙醯胺，醯亞胺，例如馬來醯亞胺，乙烯基碸或二硫化物。這種起始材料可從商業上得到(例如，從SheatwaterPolymers Inc.，Huntsville，Al，USA)或使用常規的化學方法從商業上可得到的起始物質製備。
關於連接聚(乙二醇)(PEG)部分，可參考」Poly(ethyleneglycol)Chemistry，Biotechnical and BiomedicalApplications」，1992，J.Milton Harris(ed)，Plenum Press，New York，「Poly(ethyleneglycol)Chemistry and Biological Applications」，1997，J.Milton Harris和S.Zalipsky(eds)，American ChemicalSociety，Washington DC和「Bioconjugation Protein CouplingTechniques for the Biomedical Sciences」，1998，M.Aslam和A.Dent，Grove Publishers，New York。
如果希望得到連接到效應分子或報導分子上的抗體片段，則可通過標準的化學或重組DNA方法製備，其中抗體片段是在與活化的聚合物反應之前或之後，直接或經由偶聯劑與效應分子或報導分子連接的。特殊的化學方法包括，例如，WO93/62331，WO92/22583，WO90,195和WO89/1476中描述的那些。選擇性地，如果效應分子或報導分子是一種蛋白或多肽，那麼可以使用重組DAN方法，如WO86/01533和EP-A-0392745所描述的方法得到該鍵。
優選地，本發明修飾的Fab片段是根據EP-A-0948544中公開的方法PEG化的(即，PEG(聚(乙二醇)與其共價連接)。本發明優選的抗體分子是圖13所示的PEG化的修飾Fab片段。如圖13所示，該修飾的Fab片段具有一個與修飾鉸鏈區中的單巰基共價連接的馬來醯亞胺基團。賴氨酸殘基與馬來醯亞胺基團共價連接。賴氨酸殘基的各胺基與分子量約為20,000Da的甲氧基聚(乙二醇)聚合物相連接。因此，整個效應分子總的分子量約為40,000Da。
優選地，在圖13所示的化合物中，抗體部分的重鏈具有SEQ IDNO115所列的序列，而輕鏈具有SEQ ID NO113所列的序列。此處，稱此化合物為CDP870。
本發明抗體分子的不變區，如果存在，可考慮抗體分子的建議功能，特別是根據建議的效應子功能而選擇。例如，該不變區域可以是人IgA，IgD，IgE，IgG或IgM域。特別是，當抗體分子用於治療用途並需要抗體的效應子功能時，可使用人IgG不變區域，特別是IgG1和IgG3的同種型。選擇性地，當抗體分子用於治療目的但不需要抗體的效應子功能，例如簡單的阻斷TNFα活性時，可使用IgG2和IgG4的同種型。
且，本發明的抗體分子可具有與其連接的效應分子或報導分子。例如，它可具有一個大環，用於螯合通過共價橋結構與其連接的重金屬原子，或毒素，如篦麻毒蛋白。選擇性地，可將重組DNA技術用於生產抗體分子，其中完整免疫球蛋白分子的Fc片段(CH2，CH3和鉸鏈域)，CH2和CH3域或CH3域已經被替換為，或通過肽鍵附著於，功能性的非-免疫球蛋白，如酶或毒素分子上。
本發明的抗體分子優選具有至少0.85×10-10M，更優選至少0.75×10-10M，最優選至少0.5×10-10M的結合親和力。(本發明優選的人源化抗體分子，如下所述，具有約0.5×10-10M的親和力，其比它從中衍生的鼠科動物單克隆抗體的親和力要好。鼠科動物抗體的親和力約為0.85×10-10M。)優選地，本發明的抗體分子包含輕鏈可變域hTNF40-gL1(SEQ IDNO8)和重鏈可變域gh3hTNF40.4(SEQ ID NO11)。這些輕鏈和重鏈可變域的序列分別在圖8和11中列出。
本發明還涉及本發明抗體分子的變體，其對TNFα的親和力提高。這種變體可通過許多親和力成熟方案得到，該方案包括使CDR變異(Yang等，J.Mol.Biol.，254，392-403，1995)，鏈改組(Marks等，Biol/Technology，10，779-783，1992)，使用大腸桿菌的增變菌株(Low等，J.Mol.Biol.，250，359-368，1996)，DNA改組(Patten等，Curr.Opin.Biotechnol.，8，724-733，1997)，噬菌體展示(Thompson等，J.Mol.Biol.，256，77-88，1996)和有性PCR(Crameri等，Nature，391，288-291，1998)。Vaughan等(supra)討論了這些親和力成熟的方法。
本發明還提供一種編碼本發明抗體分子重鏈和/或輕鏈的DNA序列。
優選地，該DNA序列編碼本發明抗體分子的重鏈或輕鏈。
在其中一個優選實施方案中，該DNA序列編碼輕鏈，且包含SEQ IDNO8(hTNF40-gL1)或SEQ ID NO9(h-TNF40-gL2)所列的序列或其簡併等價物。
在另一個優選實施方案中，該DNA序列編碼重鏈，且包含SEQ IDNO10(gh1hTNF40.4)或SEQ ID NO11(gh3hTNF40.4)所列的序列或其簡併等價物。
本發明的DNA序列可包含合成的DNA，例如通過化學方法生產的，cDNA，基因組DNA或其任意的組合。
本發明還涉及一種包含本發明一個或多個DNA序列的克隆或表達載體。優選地，該克隆或表達載體包含兩個DNA序列，分別編碼本發明抗體分子的輕鏈和重鏈。
在優選實施方案中，本發明提供一種含本發明DNA序列的大腸桿菌表達載體。優選地，該表達載體是圖22中所示的pTTO(CDP870)。
本發明還包含圖19所示的載體pDNAbEng-G1。
構造載體的普通方法，轉染方法和培養方法對於本領域的那些技術人員來說是熟知的。這方面的參考文獻是「Current Protocols inMolecular Biology」，1999，F.M.Ausubel(ed)，Wiley Interscience，New York和Cold Spring Harbor Publishing的Maniatis Manual。
編碼本發明抗體分子的DNA序列可通過本領域技術人員熟知的方法得到。例如，編碼部分或全部抗體重鏈和輕鏈的DNA序列可根據需要從預定的DNA序列，或根據相應的胺基酸序列而合成。
對於本領域的那些技術人員來說，編碼受體構架序列的DNA可廣泛地得到，且可以根據它們的已知胺基酸序列很容易地合成。
分子生物學的標準技術可用於製備編碼本發明抗體分子的DNA序列。可使用寡核苷酸合成技術完全或部分地合成所期望的DNA序列。還可適當地使用定點誘變及聚合酶鏈反應(PCR)技術。
任一適當的宿主細胞/載體系統均可用於表達編碼本發明抗體分子的DNA序列。細菌如大腸桿菌，及其它的微生物系統，可部分用於編碼抗體片段，如Fab和F(ab』)2片段，特別是Fv片段和單鏈抗體片段，例如，單鏈的Fvs。真核生物，如哺乳動物的宿主細胞表達系統可用於生產較大的抗體分子，包括完整抗體分子。適當的哺乳動物宿主細胞包括CHO，骨髓瘤或雜交瘤細胞。
本發明還提供一種生產本發明抗體分子的方法，包含在適於從編碼本發明抗體分子的DNA產生蛋白表達的條件下，培養含本發明載體的宿主細胞，並分離該抗體分子。
生產本發明抗體分子的優選方法包含在適於從DNA序列產生蛋白表達的條件下，培養含大腸桿菌表達載體的大腸桿菌，其中的大腸桿菌表達載體包含本發明的DNA序列，然後分離該抗體分子。該抗體分子可從細胞分泌，或通過適當的信號序列而被導向胞質。選擇性地，該抗體分子可在細胞的胞質內積聚。優選地，該抗體分子被導向胞質。根據所生產的抗體分子及所使用的方法，可使抗體分子重摺疊並接受功能性構像。使抗體分子重摺疊的方法對於本領域的那些技術人員來說是熟知的。
該抗體分子可僅僅包含一個重鏈或輕鏈的多肽，其中編碼序列的一個重鏈或輕鏈多肽需用於轉染宿主細胞。為了生產既含重鏈又含輕鏈的產物，可用兩個載體轉染細胞系，其中第一個載體編碼輕鏈的多肽，第二個載體編碼重鏈的多肽。選擇性地，可使用單個載體，該載體包括編碼輕鏈和重鏈多肽的序列。
本發明還提供一種治療或診斷組合物，其包含本發明的抗體分子及藥學上可接受的賦形劑，稀釋劑或載體。
本發明還提供一種製備治療或診斷組合物的方法，包括將本發明的抗體分子與藥學上可接受的賦形劑，稀釋劑或載體混合。
該抗體分子在治療或診斷組合物中可以是單一的活性成分，或與其它的活性成分，包括其它的抗體成分，例如抗-T細胞，抗-IFNγ或抗-LPS抗體，或非-抗體成分如黃嘌呤組合。
優選該藥物組合物包含治療有效量的本發明的抗體。此處使用的術語「治療有效量」指的是治療，改善或預防目標疾病或病症，或顯示可檢測的治療或預防效果所需的治療劑的量。對任一抗體而言，治療的有效劑量最初可在細胞培養試驗或動物模型，通常是嚙齒類動物，兔子，狗，豬或靈長類動物中進行估量。該動物模型可用於確定適宜的濃度範圍和給藥途徑。這種信息還可用於確定人的有效給藥劑量和給藥途徑。
人類受試者準確的有效量取決於疾病狀況的嚴重性，受試者的一般健康狀況，受試者的年齡，體重和性，飲食，給藥時間和頻率，藥物的組合，反應敏感性和對治療的耐受性/反應。此劑量可通過常規的試驗並在臨床醫師的判斷範圍內確定。通常，有效劑量為0.01mg/kg-50mg/kg，優選0.1mg/kg-20mg/kg，更優選約15mg/kg。如下列實施例所示，已經將1，5和20mg/kg的給藥劑量用於治療患類風溼性關節炎的患者。
可將組合物單獨給予患者，或與其它藥劑，藥物或激素一起給藥。
本發明抗體分子的給藥劑量取決於所治病症的特性，抗體分子是用於預防還是治療所存在的病症，待中和的TNFα水平高於或期望高於的水平的程度。
因而，例如，當該產品用於治療或預防慢性炎症性疾病，如類風溼性關節炎時，本發明抗體分子的適宜劑量為0.5-50mg/kg，更優選1-20mg/kg，最優選約15mg/kg。給藥頻率取決於抗體分子的半衰期及其藥效的持續時間。
如果抗體分子的半衰期較短(例如2-10小時)，則可以每天給藥一次或多次。選擇性地，如果抗體分子的半衰期較長(例如2-15天)，則只需每天，每周，甚至每1個月或2個月給藥一次。
該藥物組合物還可以包含用於給予抗體的藥學上可接受的載體。該載體自身不應誘導生產對接受組合物的個體有害的抗體，且該載體應是無毒的。適宜的載體可以是大的，緩慢代謝的大分子，如蛋白，多肽，脂質體，多糖，聚乳酸，聚乙二醇酸，聚合胺基酸，胺基酸共聚物和非活性的病毒顆粒。
也可以使用藥學上可接受的鹽，例如無機酸鹽，如鹽酸鹽，氫溴酸鹽，磷酸鹽和硫酸鹽，或有機酸鹽，如醋酸鹽，丙酸鹽，丙二酸鹽和苯甲酸鹽。
治療組合物中藥學上可接受的載體還可以附帶地包含液體，如水，鹽水，甘油和乙醇。附帶地，輔助物質，如溼潤劑或乳化劑或pH緩衝物質，也可存在於這種組合物中。這種載體可將藥物組合物製成適於患者攝入的片劑，丸劑，糖衣丸劑，膠囊，液體，凝膠，糖漿，漿和混懸液。
優選的給藥形式包括適於非腸道給藥的形式，例如，通過注射或輸注，如快速濃注或連續的輸注。當產品用於注射或輸注時，它可以是油性或水性介質中的混懸液，溶液或乳狀液，且它可以包含formulatory劑，如混懸劑，防腐劑，穩定劑和/或分散劑。選擇性地，該抗體分子可以是乾燥形式，使用前用適當的無菌液體再組成。
一旦配製好後，可將本發明的組合物直接給予患者。接受治療的患者可以是動物。然而，優選將該組合物給予人類患者。
本發明的藥物組合物可通過任一途徑給藥，包括，但不限制於，靜脈內，肌內，房內，髓內，鞘內，心室內，透皮，經皮(例如，見WO98/20734)，皮下，腹膜內，鼻內，腸內，局部，舌下，陰道內或直腸給藥途徑。Hyposprays也可用於給予本發明的藥物組合物。代表性地，可將該治療組合物製備成可注射的液體溶液或混懸液。還可以製備用於注射前配製於液體賦形劑的溶液或混懸液的固體形式。
組合物的直接傳遞通常可通過皮下，腹膜內，靜脈內或肌內注射來完成，或將組合物傳遞到組織的間隙空間。還可以將該組合物給藥到損傷中。治療方案可以是單一給藥或複合給藥。
期望組合物中的活性成分是抗體分子。這樣，其在胃腸道中的降解令人懷疑。因而，如果該組合物是通過胃腸道途徑給藥，那麼該組合物需包含防止抗體降解，但一旦從胃腸道吸收則釋放該抗體的藥劑。
有關藥學上可接受載體的徹底討論見Remington’s PharmaceutiaclSciences(Mack Publishing Company，N.J.1991)。
通過基因治療給予本發明的抗體也是可以想到的。為了實現這一點，將在適當DNA組分的控制下編碼抗體分子重鏈和輕鏈的DNA序列引入到患者中，從而自DNA序列表達抗體鏈並原位裝配(in situassembly)。
本發明還提供用於治療TNFα介導的疾病的抗體分子。
本發明進一步提供本發明抗體分子在製備治療TNFα介導疾病的藥劑中的用途。
本發明的抗體分子可用於任意一種治療當中，其中希望能降低存在於人或動物體中生物活性的TNFα的水平。該TNFα可在體內循環，或以不期望的高水平存在於體內的特殊位置。
例如，TNFα水平的升高參與急性和慢性的免疫和免疫調節疾病，感染包括膿毒性，內毒素性的和心血管性休克，炎症疾病，神經變性疾病，惡性疾病和酒精誘導的肝炎。與TNFα水平升高有關的多種疾病的描述在US-A-5 919 452中提出。本發明的抗體分子可用於治療TNFα介導的疾病。可用本發明抗體分子治療的，特別相關的疾病包括膿毒症，充血性心力衰竭，膿毒性或內毒素性的休克，惡病質，成人呼吸窘迫綜合症，AIDS，變態反應，牛皮癬，TB，炎性骨疾病，血液凝聚病，燒傷，器官或組織移植後的排斥反應發作，克羅恩氏病和自身免疫疾病，如甲狀腺炎和類風溼性-和骨-關節炎。
附帶地，該抗體分子或組合物還可用於減輕在腫瘤治療過程中與TNFα產生有關的副作用；消除或減輕與使用抗-淋巴細胞抗體治療或預防移植排斥相關的休克症狀；或治療多-器官衰竭。
本發明的抗體分子優選用於治療類風溼性-或骨-關節炎。
本發明還提供一種治療患TNFα介導的疾病或具有患TNFα介導疾病風險的人或動物受試者的方法，該方法包括給予受試者有效量的本發明的抗體分子。
本發明的抗體分子還可用於診斷，例如體內診斷，及反映疾病的狀況，其中該疾病涉及TNFα水平的升高。
本發明還提供一種含雜種CDR的抗體分子，其中的CDR含截短的供體CDR序列，其中截短的供體CDR的缺失部分被不同的序列代替，並形成功能性的CDR。此處使用的術語「雜種CDR」指的是一種含供體CDR的CDR，其中在一個或多個位置，例如，在其一個或兩個末端平截該供體CDR。用不同的序列代替截短的供體CDR的缺失部分，從而形成一個完整的，功能性的CDR。與完整的供體CDR相比，該雜種CDR具有至少一個胺基酸的改變。代替CDR截短部分的序列可以是任一序列。優選地，CDR序列的非-供體部分來源於抗體，而該抗體又是抗體分子構架區從中衍生的抗體，如種系抗體序列。
人們已經發現含雜種CDR的抗體分子基本上保留了與含完整供體CDR的抗體分子相同的結合親和力。此處使用的術語」基本上相同的結合親和力」指的是與相應的含完整供體CDR的抗體分子相比，至少70％，更優選至少85％，最優選至少95％相同的結合親和力。如上所述，在某些例子中，本發明抗體的親和力可比供體抗體的親和力大很多。雜種CDR的使用提供了這樣一種有利之處，即減少了存在於抗體分子中外源(即供體)序列的量，且與相應含完整供體CDR的抗體分子相比，增加了抗體分子的結合親和力。
任一抗體分子的CDR均可以是雜種的。優選在抗體分子中重鏈的CDR2是雜種。
優選平截供體CDR的1-8個胺基酸，更優選4-6個胺基酸。進一步優選在CDR的C-端進行平截。
根據CDR截短部分的序列和代替缺失部分的不同序列的序列，可進行多種胺基酸的改變。優選進行至少2個，更優選至少3個，最優選至少4個胺基酸的改變。
本發明此方面的特殊實施方案是本發明第一方面的抗體，其中重鏈中的第二個CDR具有SEQ ID NO2所列的序列。與部分CDR從中衍生出的供體抗體相比，其對抗原的親和力更好。
本發明還提供一種核酸序列，其編碼含本發明雜種CDR的抗體分子。
本發明還提供一種含核酸序列的表達載體，其中的核酸序列編碼含本發明雜種CDR的抗體分子。
本發明還提供一種用本發明載體轉染的宿主細胞。
本發明還提供一種生產含雜種CDR的抗體分子的方法，包含培養本發明的宿主細胞，並分離該抗體分子。
下面，參考附圖並結合實施例對本發明進行進一步的描述，其中圖1表示與hTNF40輕鏈(SEQ ID NOS83-90)的構架區相比，人輕鏈1亞組的構架區；圖2表示與hTNF40重鏈(SEQ ID NOS91-98及106-109)的構架區相比，人重鏈1亞組和3亞組的構架區；圖3表示hTNF40CDR(SEQ ID NOS1-7)的胺基酸序列，其中CDR H2』是一種雜種CDR，其中C-端的六個胺基酸來源於人3亞組種系抗體的H2 CDR序列，並在胺基酸下劃線，其中該胺基酸變為由此雜交所產生的序列；圖4表示載體pMR15.1；圖5表示載體pMR14；圖6表示鼠科動物hTNF40V1(SEQ ID NO99)的核苷酸序列及預測的胺基酸序列；圖7表示鼠科動物hTNF40Vh(SEQ ID NO100)的核苷酸序列及預測的胺基酸序列；圖8表示鼠科動物hTNF40-gL1(SEQ ID NO8)的核苷酸序列及預測的胺基酸序列；圖9表示鼠科動物hTNF40-gL2(SEQ ID NO9)的核苷酸序列及預測的胺基酸序列；圖10表示鼠科動物gh1hTNF40.4(SEQ ID NO10)的核苷酸序列及預測的胺基酸序列；圖11表示鼠科動物gh3hTNF40.4(SEQ ID NO11)的核苷酸序列及預測的胺基酸序列；圖12表示載體CTIL5-gL6；圖13表示稱作CDP870的化合物的結構，該化合物包含來源於抗體hTNF40的Fab片段，其中抗體hTNF40是經由半胱氨酸殘基與賴氨醯-馬來醯亞胺鍵共價連接的，其中各個賴氨醯殘基上的氨基與甲氧基PEG殘基共價連接，其中的n約為420；圖14表示載體pTTQ9；圖15表示0mpA寡核苷酸連接物(SEQ ID NO101)的序列；圖16表示載體pACYC184；圖17表示載體pTTO-1；圖18表示載體pTTO-2；圖19表示載體pDNAbEng-G1；圖20表示寡核苷酸彈夾，該彈夾編碼大腸桿菌修飾的Fab表達的不同基因間序列(SEQ ID NO102-105)；圖21表示IGS變體的胞質修飾的Fab積聚；圖22表示載體pTTO(CDP870)；圖23表示用不同劑量的CDP870和安慰劑治療的患者的疾病活動性值(DAS)。提出中值和IQ範圍。小方塊代表安慰劑，菱形代表1mg/kg，三角形代表5mg/kg，大方塊代表20mg/kg。
圖24表示用不同劑量的安慰劑和CDP870治療的患者的觸痛關節數，腫脹關節數，疼痛值，評估員對疾病活動性的綜合評估，改進的健康評估調查表(HAQ)，C反應性蛋白(CRP)和血沉速率(ESR)。提出中值和IQ範圍。小方塊代表安慰劑，菱形代表1mg/kg，三角形代表5mg/kg，大方塊代表20mg/kg。
實施例嵌合的hTNF40抗體分子的基因克隆和表達從hTNF40雜交瘤細胞製備RNA總的RNA是按照下列描述從3×107個hTNF40雜交瘤細胞製備的。在生理鹽水中清洗細胞並在RNAzol(0.2ml/106個細胞)中將其溶解。加入氯仿(0.2ml/2ml勻漿)，用力振蕩該混合物15秒，然後將其放在冰上15分鐘。在Eppendorf離心機中離心15分鐘，使最終的水相和有機相分離，然後通過加入等體積的異丙醇使RNA從水相中沉澱出來。在冰上放置15分鐘後，通過離心使RNA成團，用70％乙醇清洗，乾燥，並將其溶解在無菌的，RNA酶游離水中。RNA的產量為400μg。hTNF40 Vh和V1的PCR克隆編碼hTNF40重鏈和輕鏈可變域的cDNA序列是使用反向轉錄酶合成的，並產生存在於總RNA中的mRNA的單鏈cDNA模板，接下來用特異性的寡核苷酸引物在cDNA上進行聚合酶鏈反應(PCR)。a)cDNA的合成cDNA是在含下列試劑的20μl反應體積內合成的50mM Tris-HClpH8.3，75mM KCl，10mM二硫蘇糖醇，3mM MgCl2，0.5mM脫氧核糖核苷磷酸鹽，20個單位的RNA酶抑制劑，75ng的任意六核苷酸引物，2μg的hTNF40 RNA和200個單位的莫洛尼鼠科動物白血病病毒反向轉錄酶。在42℃培養60分鐘後，通過在95℃加熱5分鐘而終止反應。
b)PCR使用對重鏈和輕鏈具有特異性的引物組合，使cDNA的等分試樣經歷PCR反應。重鏈和輕鏈5』引物的核苷酸序列分別在表1和2中列出。這些序列均包含，適宜的，一個從5』端啟動7個核苷酸的限制位點，序列為GCCGCCACC(SEQ ID NO12)，以使生成的mRNA，一個起始密碼子和基於已知小鼠抗體前導肽序列的20-30個核苷酸的翻譯達到最佳(Kabat等，Sequences of proteins of immunological interest，5th Edition，1991，U.S.Department of Health and Human Services，Public Health Service，National Institutes of Health)。
3』引物在表3中列出。輕鏈的引物越過抗體的J-C連接，且包含SplI酶的一個限制位點，從而促進V1 PCR片段的克隆。重鏈的3』引物是一種越過抗體J-C連接的混合物。該3』引物包括促進克隆的ApaI限制位點。引物的3』區包含一混合序列，該混合序列是以在已知小鼠抗體中發現的那些(Kabat等，1991，supra)為基礎的。
上述引物的組合可使Vh和V1的PCR產物直接被克隆適當的表達載體(見下面)，從而生產嵌合的(小鼠-人)的重鏈和輕鏈，且可使這些基因的PCR產物在哺乳動物細胞中表達，從而生產出所需同種型的嵌合抗體。
下面提出PCR的培養物(100μl)。各反應物均包含10mM Tris-HClpH8.3，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.01％w/v明膠，0.25mM脫氧核糖核苷三磷酸鹽，10pmoles的5』引物混合物(表4)，10pmoles的3』引物(CL12(輕鏈)或R2155(重鏈)(表3))，1μl的cDNA和1個單位的Taq聚合酶。在95℃培養該反應物5分鐘，然後94℃循環1分鐘，55℃循環1分鐘，72℃循環1分鐘。30次循環之後，通過在瓊脂糖膠上進行電泳而分析各反應物的等分試樣。來源於輕鏈庫1，2，和7的含5』引物混合物的輕鏈反應物產生與全長V1片段大小相同的帶，而來源於重鏈反應庫3的反應物則產生與Vh基因預期大小相同的片段。由於上述結果顯示此帶與雜交瘤細胞產生的輕鏈假基因相對應，因而沒有研究輕鏈庫1引物生產的帶。輕鏈庫7引物所產生的帶比庫2引物所產生的帶要弱，因此沒有研究它。僅研究了來源於輕鏈反應庫2的帶，其是最強的帶。
c)PCR片段的分子克隆用BstBI和SplI酶消化在輕鏈反應庫2中產生的DNA片段，通過乙醇沉澱濃縮，在1.4％瓊脂糖膠上進行電泳，回收在400個鹼基對範圍內的DNA。通過將其連接到載體pMR15.1(圖4)中而克隆該DNA，其中該載體已經被BstBI和SplI限制過了。連接之後，將混合物轉化大腸桿菌LM 1035，而來源於最終細菌群體的質粒通過用BstBI和SplI消化來篩選插入片段，具有每一種連接的插入片段的代表，進一步通過核苷酸測序分析。
在類似的方法中，在重鏈反應庫3中產生的DNA片段是用HindIII和ApaI消化的，並被克隆載體pMR14(圖5)，其中該載體已經被HindIII和ApaI限制過了。又，通過核苷酸測序分析含插入片段的代表性質粒。
d)核苷酸序列的分析使用引物R1053(見表5)(其在pMR14的HCMV啟動子的3』區中作為引物)和R720(見表5)(其在人C-γ4的5』區中作為引物，並通過pMR14上的DNA插入片段測序)測序質粒DNA，其中該質粒DNA來源於許多含Vh插入片段的分離物。人們已經發現，許多克隆中的Vh插入片段的核苷酸序列除信號肽和J區不同外，均是相同的。這表明所檢驗的克隆是獨立的分離物，這是由於在PCR階段，使用了來源於寡核苷酸混合物的不同引物。抗體hTNF40(hTNF40Vh)重鏈可變域的所確定的核苷酸序列和所預測的胺基酸序列在圖7(SEQ ID NO100)中列出。
為了分析輕鏈的克隆，檢驗了用R1053(見表5)和R684(SEQ IDNO62)(其在人C-κ的5』區中作為引物，並通過pMR15.1上的DNA插入片段測序)作為引物所得到的序列。由於在庫2中反應，可類似地分析V1基因的核苷酸序列和所預測的胺基酸序列。又，人們還發現許多克隆中的V1插入片段的核苷酸序列除信號肽和J區不同之外，均是相同的，這些表明由於在PCR階段使用了來源於寡核苷酸混合物的不同引物，所檢驗的克隆是獨立的分離物。抗體hTNF40(hTNF40V1)輕鏈可變域的確定核苷酸序列和預測的胺基酸序列在圖6(SEQ IDNO99)中列出。表1小鼠重鏈5』區的寡核苷酸引物。CH1 5』ATGAAATGCAGCTGGGTCAT(G，C)TTCTT3』(SEQ ID NO13)CH2 5』ATGGGATGGAGCT(A，G)TATCAT(C，G)(C，T)TCTT3』(SEQ ID NO14)CH3 5』ATGAAG(A，T)TGTGGTTAAACTGGGTTTT3』(SEQ ID NO15)CH4 5』ATG(G，A)ACTTTGGG(T，C)TCAGCTTG(G，A)T3』(SEQ ID NO16)CH5 5』ATGGACTCCAGGCTCAATTTAGTTTT3』(SEQ ID NO17)CH6 5』ATGGCTGTC(C，T)T(G，A)G(G，C)GCT(G，A)CTCTTCTG3』(SEQ ID NO18)CH7 5』ATGG(G，A)ATGGAGC(G，T)GG(G，A)TCTTT(A，C)TCTT3』(SEQ ID NO19)CH8 5』ATGAGAGTGCTGATTCTTTTGTG3』(SEQ ID NO20)CH9 5』ATGG(C，A)TTGGGTGTGGA(A，C)CTTGCTATT3』(SEQ ID NO21)CH105』ATGGGCAGACTTACATTCTCATTCCT3』(SEQ ID NO22)CH115』ATGGATTTTGGGCTGATTTTTTTTATTG3』(SEQ ID NO23)CH125』ATGATGGTGTTAAGTCTTCTGTACCT3』(SEQ ID NO24)上述各引物均具有加入到其5』端的庫列5』GCGCGCAAGCTTGCCGCCACC3』(SEQ ID NO25)表2小鼠輕鏈5』區的寡核苷酸引物。
CL1 5』ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCT3』(SEQ ID NO26)CL2 5』ATGGAG(T，A)CAGACACACTCCTG(T，C)TATGGGT3』(SEQ ID NO27)CL3 5』ATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCT3』(SEQ ID NO28)CL4 5』ATGAGG(G，A)CCCCTGCTCAG(A，T)TT(C，T)TTGG3』(SEQ ID NO29)CL5 5』ATGGATTT(T，A)CAGGTGCAGATT(T，A)TCAGCTT3』(SEQ ID NO30)CL5A5』ATGGATTT(T，A)CA(A，G)GTGCAGATT(T，A)TCAGCTT3』(SEQ ID NO31)CL6 5』ATGAGGT(T，G)C(T，C)(T，C)TG(T，C)T(G，C)AG(T，C)T(T，C)CTG(A，G)G3』(SEQID NO32)CL7 5』ATGGGC(T，A)TCAAGATGGAGTCACA3』(SEQ ID NO33)
CL8 5』ATGTGGGGA(T，C)CT(G，T)TTT(T，C)C(A，C)(A，C)TTTTTCAAT3』(SEQ IDNO34)CL9 5』ATGGT(G，A)TCC(T，A)CA(G，C)CTCAGTTCCTT3』(SEQ ID NO35)CL10 5』ATGTATATATGTTTGTTGTCTATTTC3』(SEQ ID NO36)CL11 5』ATGGAAGCCCCAGCTCAGCTTCTCTT3』(SEQ ID NO37)CL12A5』ATG(A，G)AGT(T，C)(A，T)CAGACCCAGGTCTT(T，C)(A，G)T3』(SEQ IDNO38)CL12B5』ATGGAGACACATTCTCAGGTCTTTGT3』(SEQ ID NO39)CL13 5』ATGGATTCACAGGCCCAGGTTCTTAT3』(SEQ ID NO40)CL14 5』ATGATGAGTCCTGCCCAGTTCCTGTT3』(SEQ ID NO41)CL15 5』ATGAATTTGCCTGTTCATCTCTTGGTGCT3』(SEQ ID NO42)CL16 5』ATGGATTTTCAATTGGTCCTCATCTCCTT3』(SEQ ID NO43)CL17A5』ATGAGGTGCCTA(A，G)CT(C，G)AGTTCCTG(A，G)G3』(SEQ ID NO44)CL17B5』ATGAAGTACTCTGCTCAGTTTCTAGG3』(SEQ ID NO45)CL17C5』ATGAGGCATTCTCTTCAATTCTTGGG3』(SEQ ID NO46)上述各引物均具有加入到其5』端的序列5』GGACTGTTCGAAGCCGCCACC3』(SEQ ID NO47)。表3小鼠Vh和V1基因3』端的寡核苷酸引物。輕鏈(CL12)5』GGATACAGTTGGTGCAGCATCCGTACGTTT3』(SEQ ID NO48)重鏈(R2155)5』GCAGATGGGCCCTTCGTTGAGGCTG(A，C)(A，G)GAGAC(G，T，A)GTGA3』(SEQ ID NO49)表4a)輕鏈PCR反應的5』引物混合物庫1CL2庫2CL7庫3CL13庫4CL6庫5CL5A，CL9，CL17A庫6CL8庫7CL12A庫8CL1，CL3，CL4，CL5，CL10，CL11，CL2B，CL14，CL15，CL16，CL17B，CL17Cb)重鏈PCR反應的5』引物混合物庫1CH1，CH2，CH3，CH4庫2CH5，CH6，CH7，CH8庫3CH9，CH10，CH11，CH12表5用於核苷酸序列分析的引物R10535』GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3』(SEQ ID NO50)R720 5』GCTCTCGGAGGTGCTCCT3』(SEQ ID NO51)嵌合基因活性的評估嵌合基因的活性是通過在哺乳動物細胞中表達，純化它們，並測定新合成抗體的數量而評估的。下面描述其操作方法，及用於抗體生物特性描述的細胞和生物化學測定法。
a)嵌合hTNF40抗體分子的生產用於生物評估的嵌合抗體是通過使用磷酸鈣沉澱共-轉染成中國倉鼠卵巢(CHO)細胞之後，瞬時表達適當的重鏈和輕鏈對而生產的。
在轉染之前，使半-融合瓶的CHO-L761細胞接受胰蛋白酶作用，計算細胞數，每個T75瓶含107個細胞。
第二天，在轉染之前3個小時，改變培養基。為了進行轉染，將1.25ml各含50μg重鏈和輕鍊表達載體的0.25M CaCl2和1.25ml2×HBS(1升水中含16.36g NaCl，11.0g HEPES和0.4g Na2HPO4，並用NaOH調節pH值至7.1)混合，並立即加入到細胞的培養基中製備磷酸鈣沉澱。在37℃的CO2培養箱中培養3小時後，除去培養基和沉澱，通過在磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中加入15ml 15％的甘油1分鐘來振蕩細胞。除去甘油，用PBS洗該細胞一次，並在25ml含10mM丁酸鈉的培養基中培養48-96小時。通過結合併從蛋白A-瓊脂糖上洗脫而從培養基純化抗體。
b)ELISA為了進行ELISA，用濃度為5μg/ml的多克隆山羊抗-人Fc片段特異性抗體(Jackson Immunoresearch，code 109-006-098)的F(ab)2片段的包被緩衝液(15mM碳酸鈉，35mM碳酸氫鈉，pH6.9)4℃過夜覆蓋Nunc ELISA平板。用蒸餾水清洗5次，除去未包被的抗體。將定量的樣品和純標準品稀釋至在共軛緩衝液(0.1M Tris-HCl，pH7.0，0.1M NaCl，0.2％v/v Tween 20，0.2％w/v Hammersten酪蛋白)中的濃度約為1μg/ml。以2-倍的稀釋度在微量滴定板中滴定該樣品，使得每個孔中的最終體積達到0.1ml，室溫下振蕩培養該平板1小時。第一次培養後，用蒸餾水清洗該板10次，然後如前所述，用0.1ml，在共軛緩衝液中的稀釋度為1∶700的小鼠單克隆抗-人κ(克隆GD12)過氧化物酶綴合抗體(結合位點，密碼MP135)培養該板1小時。再次清洗平板，並向各個孔中加入底物溶液(0.1ml)。該底物溶液在10ml 0.1M醋酸鈉/檸檬酸鈉中，含150μl N，N，N，N-四甲基聯苯胺(在DMSO中的濃度為10mg/ml)，150μl過氧化氫(30％的溶液)，pH6.0。使該板展開5-10分鐘，直到630nm處的吸光度相對於最高標準約為1.0。630nm處的吸光度是使用平板閱讀器測量的，而樣品的濃度則是通過與標準的滴定曲線相對照而測定的。
c)通過BiaCore分析測定親和力常數使用BIA技術調查研究hTNF40和人TNF之間的結合相互作用。使用標準的NHS/EDC化學過程，將hTNF40不變區的親和純化山羊多克隆抗體固定在葡聚糖聚合物傳感器晶片的表面上。捕獲相對低水平(200-500RU)的hTNF40，以確保傳質效率達到最小。捕獲的hTNF40越過不同濃度的人TNF，從而評估締合動力學。注射配位體之後，緩衝液越過該表面，從而測量解離作用。計算固相hTNF40和人TNF之間相互作用的締合和解離常數，得到KD值。實施例1hTNF40的CDR-移植上面已經描述了hTNF40抗體重鏈和輕鏈可變區基因的分子克隆，及其用於生產嵌合(小鼠-人)hTNF40抗體的用途。鼠科動物hTNF40V1和Vh的核苷酸和胺基酸序列分別在圖6和7(SEQ ID NO99和100)中列出。此實施例描述hTNF40抗體的CDR-移植。hTNF40輕鏈的CDR-移植hTNF40輕鏈的構架區與四個人輕鏈亞組的構架區的序列對比(Kabat等，1991，supra)顯示了hTNF40與人輕鏈的亞組1中的抗體是最類似的。因此，為了構造移植了CDR的輕鏈，選擇與人類1組共有序列的那些構架區相對應的構架區。
鼠科動物hTNF40構架區與共有序列人類1組輕鏈的胺基酸序列的對比在圖1中列出，其顯示兩個序列之間有22個不同之處(下面劃線的部分)。就這些構架的任一不同之處對於抗原結合的貢獻進行分析，確定了2個用於研究的殘基，它們位於46和60位。根據此分析構造了兩個移植了CDR的輕鏈的譯本。第一個是hTNF40-gL1(SEQ IDNO8)，殘基46和60來源於hTNF40的輕鏈，而第二個是hTNF40-gL2(SEQ ID NO9)，除了60號殘基之外，所有殘基均是人的共有序列，而60號殘基則來源於hTNF40的輕鏈。移植了CDR的輕鏈hTNF40-gL1的結構hTNF40-gL1的結構在下面詳細給出。將下列重疊的寡核苷酸(P7982-P7986)用於聚合酶鏈反應(PCR)中，從而裝配出截短的移植輕鏈。所評估的片段缺少抗體前導序列和構架1開始的17個胺基酸。
寡1 P79825』GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCCAGTCAGAACGTAGGTACTAACGTAGCCTGGTATCAGCAAA3』(SEQ ID NO52)寡2 P79835』ATAGAGGAAAGAGGCACTGTAGATGAGGGCTTTTGGGGCTTTACCTGGTTTTTGCTGATACCAGGCTACGT3』(SEQ ID NO53)寡3 P79845』TACAGTGCCTCTTTCCTCTATAGTGGTGTACCATACAGGTTCAGCGGATCCGGTAGTGGTACTGATTTCAC3』(SEQ ID NO54)寡4 P79855』GACAGTAATAAGTGGCGAAATCTTCTGGCTGGAGGCTACTGATCGTGAGGGTGAAATCAGTACCACTACCG3』(SEQ ID NO55)寡5 P79865』ATTTCGCCACTTATTACTGTCAACAGTATAACATCTACCCACTCACATTCGGTCAGGGTACTAAAGTAGAAATCAAACGTACGGAATTC3』(SEQ ID NO56)Fwd P79815』GAATTCAGGGTCACCATCACTTGTAAAGCC3』(SEQ ID NO57)Bwd P79805』GAATTCCGTACGTTTGATTTCTACTTTAGT3』(SEQ ID NO58)，製備100μl的PCR反應物，其包含10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mMMgCl2，50mM KCl，0.01％w/v明膠，0.25mM脫氧核糖核苷三磷酸鹽，2pmoles的P7982，P7983，P7984，P7985，P7986，10pmoles的P7980，P7981和1個單位的Taq聚合酶。該反應在94℃循環1分鐘，55℃循環1分鐘，72℃循環1分鐘。30次循環之後，通過在瓊脂糖膠上進行電泳而分析各反應物，從凝膠上切除PCR片段，並用Mermaid試劑盒回收。在適當的緩衝液中用BstEII和SplI酶限制回收的片段。最後，使最終的產物經過瓊脂糖膠電泳，從凝膠切片回收270個鹼基對DNA片段，並將其連接到載體CTIL5-gL6(圖12)中，該載體已經預先用相同的酶消化過了。上述載體提供缺失抗體前導序列和構架1開始的17個胺基酸。
該連接混合物用於轉化大腸桿菌菌株LM1035及通過PCR分析得到的克隆，限制酶消化和核苷酸測序。hTNF40-gL1的V1區的核苷酸和胺基酸序列在圖8中列出(SEQ ID NO8)。移植了CDR的輕鏈hTNF40-gL2的結構使用PCR構造hTNF40-gL2(SEQ ID NO9)。下列寡核苷酸用於引入胺基酸變化。
R10535』GCTGACAGACTAACAGACTGTTCC3』(SEQ ID NO59)R53505』TCTAGATGGCACACCATCTGCTAAGTTTGATGCAGCATAGATCAGGAGCTTAGGAGC3』(SEQ ID NO60)R53495』GCAGATGGTGTGCCATCTAGATTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGACTTTACCCTAAC3』(SEQ ID NO61)R684 5』TTCAACTGCTCATCAGAT3』(SEQ ID NO62)製備各20μl的兩個反應物，每個均包含10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.01％w/v明膠，0.25mM脫氧核糖核苷三磷酸鹽，0.1μg hTNF40-gL1，6pmoles的R1053/R5350或R5349/R684和0.25個單位的Taq聚合酶。該反應在94℃循環1分鐘，55℃循環1分鐘，72℃循環1分鐘。30次循環之後，通過在瓊脂糖膠上進行電泳而分析各反應物，並從凝膠切除PCR片段，然後用Mermaid試劑盒回收。
使這些反應物的等分試樣經歷第二個PCR循環。100μl該反應物含10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.01％w/v明膠，1/5來源於第一組反應的各PCR片段，30pmoles的R1053和R684，和2.5個單位的Taq聚合酶。反應溫度如上所述。PCR之後，先用苯酚/氯仿提取該混合物，然後用氯仿提取，並用乙醇沉澱。通過離心回收乙醇沉澱，將其溶解在適當的緩衝液中，並用BstEII和SplI酶限制。最後，使最終的產物經過瓊脂糖膠電泳，從凝膠切片回收270個鹼基對DNA片段，並使其連接到載體pMR15.1(圖4)中，該載體已經預先用相同的酶消化了。
該連接混合物用於轉化大腸桿菌菌株LM1035及通過PCR分析的最終群體，限制酶消化和核苷酸測序。HTNF40-g1L2的V1區的核苷酸和胺基酸序列在圖9中列出(SEQ ID NO9)。HTNF40重鏈的CDR-移植hTNF40重鏈的CDR-移植是使用與輕鏈相同的策略完成的。hTNF40重鏈與屬於1亞組的人重鏈最類似，因此選擇人亞組1構架的共有序列來接受hTNF40重鏈的CDR。
為了調查研究同源的人構架充當CDR移植的受體構架的要求，選擇第二個構架，人類3組從而使hTNF40重鏈人源化。
hTNF40與兩個不同構架區的對比在圖2中列出，從中可看出hTNF40與32位(下面劃線的部分)的人1亞組共有序列不同，與40位的人3亞組共有序列不同(下面劃線的部分)。在分析任一結果之後，可知使用1組構架將殘基28，38，46，67和71作為供體保留在移植了CDR的重鏈gh1hTNF40.1，從而可使抗原結合。使用3組構架將殘基27，28，30，48，49，69，71，73，76和78作為供體保留在移植了CDR的重鏈，gh3hTNF40.4中。使用1組構架將殘基28，69和71作為供體保留在移植了CDR的重鏈，gh1hTNF40.4中。移植了CDR的重鏈gh1hTNF40.4的結構gh1hTNF40.4(SEQ ID NO10)是在有適當引物參與的情況下，通過使重疊的寡核苷酸經歷PCR而裝配的。下列寡核苷酸用於PCR中1組移植物寡1 P79895』GAAGCACCAGGCTTCTTAACCTCTGCTCCTGACTGGACCAGCTGCACCTGAGAGTGCACGAATTC3』(SEQ ID NO63)寡2 P79905』GGTTAAGAAGCCTGGTGCTTCCGTCAAAGTTTCGTGTAAGGCCTCAGGCTACGTGTTCACAGACATGGTA3』(SEQ ID NO64)寡3 P79915』CCAACCCATCCATTTCAGGCCTTGTCCCGGGGCCTGCTTGACCCAATTCATACCATAGTCTGTGAACACGT3』(SEQ ID NO65)寡4 P79955』GGCCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTTACATTGGAGAGCCTATTTATGTTGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGTTC3』(SEQ ID NO66)寡5 P79925』CCATGTATGCAGTGCGTTGTGGAGGTGTCTAGAGTGAACGTGAATCTGCCCTTGAA3』(SEQ ID NO67)寡6 P79935』CCACAAGCACTGCATACATGGAGCTGTCATCTCTGAGATCCGAGGACACCGCAGTGTACTAT3』(SEQ ID NO68)寡7 P79945』GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAAGATCTGTATCCTCTAGCACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3』(SEQ ID NO69)FwdP79885』GAATTCGTGCACTCTCAGGTGCAGCTGGTC3』(SEQ ID NO70)Bwd P79875』GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3』(SEQ ID NO71)類似的100μl反應物含10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，50mMKCl，0.01％w/v明膠，0.25mM脫氧核糖核苷三磷酸鹽，2pmoles的P7989，P7990，P7991，P7995，P7992，P7993和P7994，10pmoles的P7988，P7987和1個單位的Taq聚合酶。反應在94℃循環1分鐘，55℃循環1分鐘，72℃循環1分鐘。30次循環之後，先用苯酚/氯仿(1/1)提取反應物，然後用氯仿提取，並用乙醇沉澱。離心之後，將DNA溶解在適當的限制緩衝液中，並用ApaLI和KpnI消化。從瓊脂糖膠分離最終的片段，並將其連接到pMR14(圖5)中，該載體已經預先用相同的酶消化過了。當用ApaLI和KpnI使pMR14裂開時，pMR14包含人γ4重鏈不變區，該裂開的載體可接收消化的DNA，這樣所消化DNA的3』端在讀框中與編碼γ4不變區序列的5』端相連接。因此，從此載體表達的重鏈是γ4的同型。該連接混合物用於轉化大腸桿菌菌株LM1035，並通過限制消化及核苷酸序列分析篩選最終的細菌群體。在此方法中，鑑定了含gh1hTNF40.4(圖10)(SEQ ID NO10)正確序列的質粒。移植了CDR的重鏈gh3hTNF40.4的結構gh3hTNF40.4(SEQ ID NO11)是在有適當引物參與的情況下，通過使重疊的寡核苷酸經歷PCR而裝配的。下列寡核苷酸用於PCR中3組移植物寡1 P79995』GATCCGCCAGGCTGCACGAGACCGCCTCCTGACTCGACCAGCTGAACCTCAGAGTGCACGAATTC3』(SEQ ID NO72)寡2 P80005』TCTCGTGCAGCCTGGCGGATCGCTGAGATTGTCCTGTGCTGCATCTGGTTACGTCTTCACAGACTATGGAA3』(SEQ ID NO73)寡3 P80015』CCAACCCATCCATTTCAGGCCCTTTCCCGGGGCCTGCTTAACCCAATTCATTCCATAGTCTGTGAAGACGT3』(SEQ ID NO74)寡4 P79955』GGCCTGAAATGGATGGGTTGGATTAATACTTACATTGGAGAGCCTATTTATGTTGACGACTTCAAGGGCAGATTCACGTTC3』(SEQ ID NO66)寡5 P79975』GGAGGTATGCTGTTGACTTGGATGTGTCTAGAGAGAACGTGAATCTGCCCTTGAA3』(SEQ ID NO75)寡6 P79985』CCAAGTCAACAGCATACCTCCAAATGAATAGCCTGAGAGCAGAGGACACCGCAGTGTACTAT3』(SEQ ID NO76)寡7 P79935』GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCATGGCATAAGATCTGTATCCTCTAGCACAATAGTACACTGCGGTGTCCTC3』(SEQ ID NO77)Fwd P79965』GAATTCGTGCACTCTGAGGTTCAGCTGGTC3』(SEQ ID NO78)Bwd P79875』GAATTCGGTACCCTGGCCCCAGTAGTCCAT3』(SEQ ID NO71)100μl的裝配反應物含10mM Tris-HCl pH8.3，1.5mM MgCl2，50mMKCl，0.01％w/v明膠，0.25mM脫氧核糖核苷三磷酸鹽，2pmoles的P7999，P8000，P8001，P7995，P7997，P7998和P7993，10pmoles的P7996，P7987和1個單位的Taq聚合酶。反應在94℃循環1分鐘，55℃循環1分鐘，72℃循環1分鐘。30次循環之後，先用苯酚/氯仿(1/1)提取反應物，然後用氯仿提取，並用乙醇沉澱。離心之後，將DNA溶解在適當的限制緩衝液中，並用ApaLI和KpnI消化。從瓊脂糖膠上分離最終的片段，並將其連接在pMR14(圖5)中，該載體已經預先用相同的酶消化過了。pMR14包含人γ4重鏈不變區。當用ApaLI和KpnI使pMR14裂開時，該裂開的載體可接收消化的DNA，這樣所消化DNA的3』端在讀框中與編碼γ4不變區序列的5』端相連接。因此，從此載體表達的重鏈是γ4的同型。該連接混合物用於轉化大腸桿菌菌株LM1035，並通過限制消化和核苷酸序列分析篩選最終的細菌群體。在此方法中，鑑定了含gh3hTNF40.4(SEQ ID NO11)(圖11)正確序列的質粒。移植了CDR的修飾Fab片段的生產使用大腸桿菌載體pTTO-1構造基於抗體hTNF40的，移植了CDR的修飾Fab片段。將抗體hTNF40的可變區亞-克隆此載體，優化基因間的序列以製造pTTO(CDP870)。該pTTO表達載體引起可溶的，重組蛋白在大腸桿菌中的胞質積累。此質粒的主要特徵是(i)四環素抗性標記-沒有被抗性基因產物滅活的抗生素，因此保持了對含質粒細胞的選擇；(ii)低拷貝數-來源於質粒p15A的複製源，其適合含co1E1的質粒，其中co1E1得自複製子；(iii)用於轉錄克隆基因的較強的，誘導tac啟動子；(iv)lacIq基因-提供lac阻遏蛋白的基本表達，保持阻抑狀態中的tac啟動子，直到用IPTG/異乳糖誘導；(v)OmpA信號序列-提供克隆基因的胞質分泌；和(vi)OmpA信號序列至短lacZ肽的翻譯偶聯，可有效的引發翻譯。
該載體用於從雙順反子信息表達修飾的Fab片段，以根據經驗從一系列目標-建立的彈夾選擇最佳的基因間序列。還描述了其在構造pTTO(CDP870)中的應用。材料和方法DNA技術用於此方案的標準方法包括DNA限制，瓊脂糖膠電泳，連接和轉化。限制酶和DNA修飾酶是從New England Biolabs或BoehringerMannheim得到的，並根據供應商的建議使用。使用GeneClean方案(BIO101)從瓊脂糖純化DNA片段。寡核苷酸是由Oswel OligonucleotideService提供的，並在40nm的等級合成。使用Qiagen的質粒DNAMini/Midi試劑盒分離質粒DNA。使用推薦的Perkin Elmer『Amplitaq』進行PCR。使用應用生物系統Taq循環測序試劑盒進行DNA測序。搖瓶誘導大腸桿菌W3110培養物是在添加了四環素(7.5μg/ml)的L-肉湯中生長的。為了進行誘導，在2L帶擋板搖瓶的200mL的L-肉湯中，將新鮮的隔夜培養物(在30℃生長)稀釋成0.1的OD600，並在30℃的軌道培養箱中生長。加入200μM，0.5的OD600的IPTG。間隔採集樣品(相對於OD標準化的)。胞質提取物在冰上冷凍培養樣品(5分鐘)，然後通過離心採集細胞。在提取緩衝液(100mM Tris.HCl，10mM EDTA，pH7.4)中重混懸後，30℃過夜培養該樣品，然後通過離心使其澄清。裝配試驗修飾Fab的濃度是通過ELISA測定的。用抗-人Fd 6045(2μg/ml的包被緩衝液，生理鹽水，每個孔100μl)4℃過夜覆蓋平板。清洗後，每個孔裝入100μl的樣品；將最初為2μg/ml的純化A5B7γ-1 Fab』用作標準樣品。越過平板在樣品共軛緩衝液(每升6.05g三氨基甲烷；2.92g NaCl；0.1ml Tween-20；1ml酪蛋白(0.2％))中連續稀釋2-倍；室溫下攪拌培養平板1小時。清洗並乾燥平板，然後加入100μl的抗-人C-κ(GD12)-過氧化物酶(在樣品共軛緩衝液中稀釋)。室溫下攪拌培養1小時。清洗並乾燥平板，然後加入100μl的底物溶液(10ml醋酸鈉/檸檬酸鈉溶液(0.1M pH6))；100μl的H2O2溶液；100μl的四甲基聯苯胺溶液(10mg/ml的二甲基sulphoxide)。加入底物後，讀4-6分鐘630nm處的吸光度。質粒pTTO-1的結構(a)pTTQ9多接頭的置換質粒pTTQ9是從Amersham獲得的，並在圖14中列出。用限制酶SalI和EcoRI消化等分試樣(2μg)，該消化是在1％瓊脂糖膠上進行的，純化大的DNA片段(4520bp)。當共同退火時，合成兩個寡核苷酸，其編碼圖15所示的OmpA多接頭區。此序列具有粘性末端，其與由pTTQ9限制所產生的SalI和EcoRI相一致。通過把此寡核苷酸「彈夾」克隆pTTQ9載體，SalI位點沒有再生，但保留了EcoRI位點。該彈夾編碼在OmpA基因的Shine Dalgarno核糖體結合位點前加上的，大腸桿菌外-膜蛋白Omp-A的信號序列的前13個胺基酸。另外，存在XabI，MunI，StyI和SplI酶的限制位點。MunI和StyI位點位於OmpA信號序列的編碼區內，並將作為基因插入的5』克隆位點。組成此彈夾的兩個寡核苷酸通過在5pmoles/μl的濃度混合，並在水浴中加熱至95℃3分鐘而共同退火，然後緩慢冷卻至室溫。將退火的序列連接到SalI/EcoRI半裂pTTQ9中。最終的質粒中間體，稱作pTQOmp，是通過DNA測序加以證實的。(b)片段的製備和連接質粒pTTO-1是通過將來源於質粒pACYC184的一個DNA片段與來源於pTQOmp的兩個片段連接而成的。質粒pACYC184從New EnglandBiolabs得到，限制性酶切圖在圖16中給出。消化等分試樣(2μg)以包括限制酶StyI，然後用綠豆核酸酶處理；通過切掉後面的5』鹼基突出端而產生平端。苯酚提取和乙醇沉澱之後，用酶PvuII限制該DNA，產生2348，1081，412和403bp的片段。2348bp的片段是在進行瓊脂糖膠電泳後純化的。此片段編碼四環素抗性標記和p15A的複製源。然後用小牛小腸鹼性磷酸酶處理該片段，以除去5』端的磷酸鹽，從而防止此分子的自身連接作用。
用酶SspI和EcoRI消化質粒pTQOmp的等分試樣(2μg)，進行瓊脂糖膠電泳後，從不需要的2040bp和170bp的片段純化2350bp的片段；此片段編碼轉錄終止子區和lacIq基因。用EcoRI和XmnI消化pTQOmp的另一個等分試樣，產生2289，1670，350和250bp的片段。凝膠純化該編碼tac啟動子，OmpA信號序列和多克隆位點的350bp的片段。
然後使用約等量的各片段連接上述三個片段，以產生質粒pTTO-1。所有的克隆連接均是通過DNA測序加以證實的。此質粒的限制性酶切圖在圖17中給出。然後通過插入編碼人Ig輕鏈κ不變域的DNA而生產質粒pTTO-2。其作為SplI-EcoRI的限制片段，是從質粒pHC132得到的，並被插入到pTTO-1的相應位點中。質粒pTTO-2在圖18中列出。將人源化的hTNF40可變區插入到pTTO-2中可變輕鏈區hTNF40gL1(SEQ ID NO8)是通過PCR從哺乳動物細胞表達pMR10.1的相應載體『拯救』得到的。OmpA的前導序列代替天然的Ig前導序列。PCR引物的序列如下所示5』引物CGCGCGGCAATTGCAGTGGCCTTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAAGCTGACATTCAAATGACCCAGAGCCC(SEQ ID NO79)3』引物TTCAACTGCTCATCAGATGG(SEQ ID NO80)在標準條件下進行PCR後，純化產物，用MunI和SplI酶消化，然後進行凝膠純化。將純化的片段插入到pTTO-2的MunI/SplI位點中，以產生輕鏈中間體pTTO(hTNF40L)。
gh3hTNF40.4的可變重鏈區是用相同的方法從載體pγ-4獲得的。PCR引物的序列如下所示5』引物
GCTATCGCAATTGCAGTGGCGCTAGCTGGTTTCGCCACCGTGGCGCAAGCTGAGGTTCAGCTGGTCGAGTCAGGAGGC(SEQ ID NO81)3』引物GCCTGAGTTCCACGACAC(SEQ ID NO82)進行PCR後，純化產物，用NheI和ApaI酶消化，然後將其亞-克隆載體pDNAbEng-G1(圖19)。通過DNA測序加以證實後，用EcoRI酶限制重鏈，並將其亞-克隆pTTO(hTNF40L)的EcoRI位點，以生產大腸桿菌的表達質粒pTTO(hTNF40)。修飾Fab表達的基因間序列的優化在pTTO載體中，修飾的Fab表達是從先編碼輕鏈然後編碼重鏈的雙順反子信息發生的。兩個基因(基因間的序列，IGS)間的DNA序列可通過影響轉錄的起始速率而影響重鏈的表達水平。例如，短的基因間序列可導致輕鏈和重鏈間的轉錄偶聯，其中在完成輕鏈合成之後，引發重鏈合成之前，翻譯核糖體不可能完全與mRNA分離。任一Shine Dalgarno(SD)核糖體結合位點(與16S rRNA同源)的『強度』還可影響SD和ATG起始密碼子之間的距離和序列組成。ATG周圍的mRNA的潛在二級結構是另一個重要的因素；當反向用於SD時，ATG應位於『環』中，而不應被限制在『莖區』中。因而通過改進IGS的長度和組成，可修飾轉錄起始的長度，和重鏈的生產水平。很可能需獲得轉錄起始的最佳速率，以使所提供修飾Fab重鏈的表達達到最大值。例如，具有一個修飾的Fab，可容許高水平的表達，但對於具有不同胺基酸序列的不同修飾Fab來說，高水平的表達可能是有毒的，這可能是由於不同的分泌或摺疊效率。由於這個原因，設計了一系列4個基因間序列(圖20)，可根據經驗確定基於hTNF40的修飾的Fab的最佳IGS。IGS1和IGS2具有非常短的基因間序列(分別-1和+1)，可提供緊密偶聯的翻譯；SD序列(下面劃線的部分)稍有不同。這兩個序列最可能提供高水平的轉錄起始。IGS3和IGS4在起始和終止密碼子(+13)之間具有較長的距離，且與它們的組成不同；IGS3具有『較強』的SD序列。研究所有序列的二級結構(使用m/fold程序)並儘可能地使其優化；然而，隨著兩個鏈翻譯的緊密偶聯，核糖體解離的缺少意味著mRNA可以不是裸露的，防止二級結構形成。IGS變體的克隆圖20所示的IGS彈夾具有側面SacI和MunI克隆位點。它們是通過退火互補的寡核苷酸對而建立的。載體片段是通過用SacI和NotI消化pTTO(hTNF40)而製備的，重鏈片段是通過用MunI和NotI消化pDNAbEngG1(hTNF40H)而製備的。然後使用兩個等量的限制片段，和各約0.05pmoles的退火寡彈夾進行三交連。其產生四個表達質粒pTTO(hTNF40 IGS-1)，pTTO(hTNF40 IGS-2)，pTTO(hTNF40 IGS-3)，pTTO(hTNF40 IGS-4)。搖瓶表達分析將上述四個質粒轉化大腸桿菌菌株W3110，和原始的表達構造，然後分析搖瓶中的表達。代表性試驗的結果在圖21中列出。不同的基因間序列提供不同的表達分布。在誘導後1小時，IGS1和IGS2迅速積累胞質的修飾Fab至最大值，之後水平又降低。IGS1的最大值更大，並更急劇地降低。如所期望的這些結構的緊密翻譯偶聯，這些結果與高水平的合成一致。IGS1較之IGS2明顯提供較高水平的重鍊表達。在這個實施例中，在1小時的峰值之後，因為胞質表達水平降低，所容許的高水平表達較差。這可在IGS1培養物(未標出)的生長分布中見到，下降之前，其在誘導後1小時達到峰值，表明細胞死亡並溶解。在水平降低之前，IGS3更緩慢地累積修飾Fab，其在誘導後2小時達到峰值，但峰值更高(325ng/ml/OD)。此培養物的生長在誘導後又繼續了3個小時，並達到更高的峰值生物量(未標出)。其與低水平的重鏈合成相一致。IGS4仍然以較低的速率積累材料，但與其他三個結構相比，其不能達到其它3個結構的峰值產率。所有IGS變體均顯著out-完成原始載體。有關不同的IGS序列提供不同的翻譯初始速率的假設是通過這些試驗結果支持的。對於hTNF40-修飾的Fab來說，似乎高速率的重鏈翻譯初始耐受較差，因此其不是最佳的。IGS3提供的較低速率產生較好的生長特性，和超時的較好的產率累積。
對比發酵罐中的產率，IGS3結構的產率最高，並將其稱為pTTO(CDP870)-見圖22。
由質粒pTTO(CDP870)編碼的重鏈具有SEQ ID NO115所列的序列，輕鏈具有SEQ ID NO113所列的序列。移植了CDR的，hTNF40基-修飾Fab的PEG化作用純化的修飾Fab與支鏈的PEG分子位點-特異性綴合。其可以通過活化修飾Fab的截短鉸鏈區中的單一半胱氨酸殘基，接著按照上述(A.P.Chapman等，nature Biotechnology 17，780-783，1999)與(PEG)-賴氨醯馬來醯亞胺反應而獲得。該PEG化的分子在圖13中列出，並將其稱為化合物CDP870。PEG化的移植了CDR的，hTNF40基修飾Fab(CDP870)在治療類風溼性關節炎中的功效。
CDP870具有約11天的較長半衰期。
我們評估了靜脈內CDP870在患RA患者的隨機，雙盲，安慰劑-對照，給藥逐漸升高試驗中的安全性和功效。方法患者患者的年齡在18-75步之間，滿足1987年修訂的類風溼性關節炎(RA)的American College of Rheumatology(ACR)診斷標準，上述患者是從位於倫敦，劍橋，諾福克和Norwich(英國)的風溼病診所的門診病人中徵募的。要求患者具有由至少3個下列標準定義的臨床活性疾病≥6個疼痛或觸痛的關節；≥45分鐘的早晨的強直；及血沉速率(ESR)≥28mm/hr。它們必須至少對一種疾病改善抗-類風溼藥物(DRARD)沒有良好的反應，且至少已經4周沒有治療。如果潑尼松龍的給藥劑量≥7.5mg/day，則可以給皮質類固醇。懷孕的婦女，哺乳的婦女和未使用有效的避孕方法，可能分娩的婦女被排除在外。具有惡性腫瘤既往史，伴發嚴重的不可控制的內科病症，TNFα-中和治療失敗的既往史，或對聚乙二醇過敏的患者被排除在外。書面提供的同意書是在登記之前從各患者處得到的。該研究由地方研究倫理委員會證實。治療方案將36名RA患者分成3組，每位患者均接受給藥劑量逐漸增加的試驗藥物(1，5或20mg/kg)。把每組的12個人隨機的分成8個人接受CDP870，4個人接受安慰劑。靜脈內單獨輸注CDP870(總量100ml)超過60分鐘。類似地，將100ml安慰劑(醋酸鈉緩衝液)靜脈內單獨輸注超過60分鐘。在門診病人的基礎上提供治療。8周之後，所有的患者均有機會開放地接受5或20mg/kg的CDP870的輸注。臨床評估根據世界衛生組織和International League of Associations forRheumatology(Boers等，J.Rheumatol-Supplement，41，86-89，1994)和European League Against Rheumatism(EULAR)(Scott等，Clin.Exp.Rheumatol.，10，521-525，1992)用28個關節計數組合的核心數據評估RA的疾病活動性。通過疾病活動性值(Prevoo等，Arthritis Rheum.，38，44-48，1995)和ACR反應標準(Felson等，Arthritis Rheum.，38，727-735，1995)評估疾病活動性的變化。在治療前和治療後的第1，2，4，6和8周進行評估。而且還評估患者對所研究藥物的耐受性和安全性。並且評估了Haematology，生物化學，抗-CDP870抗體和不利事件。CDP870的血漿濃度和抗-CDP870的抗體CDP870是通過酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測量的。在用重組人TNFα(Strathmann Biotech GmbH，Hannover)包被的微量滴定平板(Nunc)中培養患者血漿的連續稀釋液。用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗-人κ輕鏈(Cappel，ICN)，和四甲基聯苯胺(TMB)底物顯示捕獲的CDP870。
使用生物素化的CDP870作為第二層的雙抗原夾層ELISA篩選CDP870的抗體(1/10的血漿稀釋度)。使用HRP-鏈黴抗生物素和TMB底物顯示束縛抗體。使用超免疫兔IgG標準校準該測定法。1個單位的活動性等於1μg兔的標準。統計分析該研究實質上是探察性的，樣品的多少是根據先前相似藥劑的經驗而確定的。CDP870的功效可通過計算疾病活動性值(DAS)和ACR20/50來分析，其使用閉合的試驗方法治療。疾病的活動性值是按照下列公式計算的DAS＝0.555x(28個觸痛關節)的平方根+0.284x(28個腫脹關節)的平方根+0.7xIn(ESR)+0.0142x(患者的綜合評估)。首先，將活性組與安慰劑組進行對比。如果此對比在5％水平是顯著的，則將各給藥組與安慰劑組對比。所有的對比是雙尾的具有5％顯著水平的。所有的P值均來源於探察性的分析，且不應用於推論解釋。結果統計學徵募36個患RA的患者。它們的統計數據在表6中給出。平均年齡56歲，30名患者為女性。患RA的平均時間為13年，21名患者的類風溼因子顯陽性。不同組的患者具有相似的統計特性。在盲給藥時，6/12用安慰劑治療的患者因為給藥後RA≥4，疾病惡化而退出本研究。2/24用CDP870治療的患者退出，均為1mg/kg組的，其在給藥之後＞4周，RA惡化。其差值在統計學上是顯著的(p＝0.009，Fisher精確試驗)。表6統計數據(平均值±標準偏差)性別 年齡 疾病的類風溼因子 以前DMARD數(MF)持續時間 的數安慰劑 12 1.11 51±8 12±8 8(67％) 5±11mg/kg 817 59±4 12±7 4(50％) 4±15mg/kg 826 54±13 13±5 5(63％) 5±220mg/kg 82.6 61±11 14±13 4(50％) 4±2臨床功效在給安慰劑，1，5和20mg/kg的CDP870(聯合治療效果p＝0.012)之後第4周，ACR20提高的患者的比例分別為16.7，50，87.5和62.5％，給藥後第8周的比例分別為16.7，25，75和75％(p＝0.032)。在給安慰劑，1，5和20mg/kg的CDP870(聯合治療效果p＝0.001)之後第4周，DAS值(中值)降低的比例分別為0.15，1.14，1.91和1.95％，給藥後第8周的比例分別為0.31，0.09，2.09和1.76％(p＝0.008)(圖23)。世界衛生組織和International League of Associations forRheumatology各成員核心數據值的改變在圖24中列出。
給予CDP870的開放標記劑量後，可獲得相似的有益效果。上述36個該研究招募的患者，其中的32個患者接受CDP870的第二次輸注。第一次輸注5和20mg/kg CDP後第4周，ACR20提高的患者的比例為72.2和55.6％，在第8周後為55.6和66.7％。不利的結果該治療可較好地耐受，且沒有與輸注相關的反應產生。沒有關於變態反應或皮疹的報導。在雙-盲階段，在安慰劑，1，5和20mg/kg組中分別有19，38，8和14個不利事件。最普遍的是5個患者中有9次頭痛發作(安慰劑組1個，1mg/kg組3個，20mg/kg組1個)。一個接受安慰劑的患者和三個接受CDP870的患者(1個為5mg/kg，2個為20mg/kg)有較弱的呼吸道感染。據報導這些為輕度或中度。他們是用口服抗生素治療的，且症狀在1-2周後消退。1和5mg/kg組的三個患者和20mg/kg組的一個患者在用CDP870治療之後1-2個月出現泌尿道感染。還有一個嚴重的不利事件是患者在用1mg/kg的劑量輸注3天後，出現頸部疼痛。在4個患者中可見到抗-核抗體的增加安慰劑組1個(低1/40)，1mg/kg組2個(低1/40，低1/80)，20mg/kg組1個(低1/40)。抗-DNA或抗-心脂質抗體沒有變化。CDP870的血漿濃度和抗-CDP870的水平對於CDP870的所有給藥水平來說，峰值血漿濃度出現在輸注結束的時候，且血漿濃度水平隨著給藥的比例而緩慢降低。CDP870的血漿濃度與先前在志願者中觀察到的非常相似，所計算的半衰期約為14天。再-給藥時，觀察到單一給藥輸注的相似分布。
單獨靜脈內輸注後，抗-CDP870水平較低或檢測不到。討論中和TNFα對於RA來說是一種有效的治療策略。目前，這種治療還需要使用生物製劑，如嵌合mAb或可溶性受體/人Fc融合蛋白，但其成本較高。治療性的TNFα中和劑需要結合具有高親和力的TNFα，且其具有較長的血漿半衰期，低抗原性和高耐受性及安全性。且它需要接近所有從阻斷TNFα受益的RA患者。可達到這些目的的其中一個技術是與大腸桿菌中產生的TNFα結合抗體片段的聚乙二醇相綴合。在初步研究中，我們發現CDP870，PEG化的，抗-TNFα，修飾的Fab，是有效的，且RA患者可很好地耐受。
體外研究證實CDP870具有與鼠科動物抗-TNFα親代抗體相似的TNFα中和活性。此研究證實CDP870可減輕炎症，並改善RA的症狀。將通過ACR20反應標準所測量的5和20mg/kg組(75％，75％)對臨床的改善作用與etanercept(60％)(Moreland等，AnnalsInt.Med.，130，478-486，1999)和infliximab(50％)(Maini等，Lancet，354，1932-1939，1999)相對照。在中間和最高給藥水平進行試驗，與前面其它的mAbs(Elliott等，Lancet，344，1105-1110，1994和Rankin等，Br.J.Rheumatol.，34，334-342，1995)相比，其治療效果可持續8周。先前的研究已經證實抗-TNFα抗體的治療效果與它的血漿半衰期和循環抗體的產生有關(Maini等，ArthritisRheum，38，(增刊)S186 1995(摘要))。我們的研究則顯不CDP870的血漿半衰期為14天，與全抗體的血漿半衰期相等(Rankin等，(supra))，比未綴合的Fab片段的半衰期要長得多。此外，CDP870所產生抗體反應的水平非常低。
本研究的其中一個重要目的是為了檢測給予此PEG化Fab的耐受性和安全性。在我們的研究中，CDP870顯示了良好的耐受性。雖然進一步的研究還需要評估其長期毒性，但現有技術已經報導過了與etanercept和infliximab有關的脫髓鞘性疾病，感染和皮疹。
總之，CDP870可有效的治療RA，且其在此短期研究中可很好地耐受。
應當理解，上述實施例僅僅是舉例說明，不能用來限制本發明的範圍，本發明的範圍在下列權利要求中限定。
序列表110CELLTECH CHIROSCIENCE LIMITED120生物製品130P021741GB140141160115170PatentIn Ver.2.121012115212PRT213人工序列220223人工序列hTNF40 CDRH1的描述4001Asp Tyr Gly Met Asn1 5210221117212PRT213人工序列220223人工序列hTNF40/人類雜交CDRH2的描述4002Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val Lys1 5 10 15Gly21032119212PRT213人工序列220223人工序列hTNF40 CDRH3的描述4003Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr1 5210421111212PRT213人工序列220223人工序列hTNF40 CDRL1的描述4004Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala1 5 1021052117212PRT213人工序列220223人工序列hTNF40 CDRL2的描述4005Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser1 521062119212PRT213人工序列220223人工序列hTNF40 CDRL3的描述4006Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu Thr1 5210721117212PRT213人工序列220223人工序列hTNF40 CDRH2的描述4007Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Val Asp Asp Phe Lys1 5 10 15Gly2108211321212DNA213人工序列220221CDS222(1)..(321)220223人工序列hTNF40-gL1的描述4008gac att caa atg acc cag agc cca tcc agc ctg agc gca tct gta gga 48Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15gac cgg gtc acc atc 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Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly130 135 140Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn145 150 155 160Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln165 170 175Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser180 185 190Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser195 200 205Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val210 215210112211642212DNA213人工序列220223Fab的移植輕鏈和修飾的Fab400112gacattcaaa tgacccagag cccatccagc ctgagcgcat ctgtaggaga ccgggtcacc 60atcacttgta aagccagtca gaacgtaggt actaacgtag cctggtatca gcaaaaacca 120ggtaaagccc caaaagccct catctacagt gcctctttcc tctatagtgg tgtaccatac 180aggttcagcg gatccggtag tggtactgat ttcaccctca cgatcagtag cctccagcca 240gaagatttcg ccacttatta ctgtcaacag tataacatct acccactcac attcggtcag 300ggtactaaag tagaaatcaa acgtacggta gcggccccat ctgtcttcat cttcccgcca 360tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600ctgagctcac cagtaacaaa aagctttaat agaggagagt gt 642210113211214212PRT213人工序列220223Fab的移植輕鏈和修飾的Fab400113Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn20 25 30Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ala Leu Ile35 40 45Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ile Tyr Pro Leu85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala100 105 110Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly115 120 125Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala130 135 140Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln145 150 155 160Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser165 170 175Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr180 185 190Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser195 200 205Phe Asn Arg Gly Glu Cys210210114211687212DNA213人工序列220223修飾Fab的移植重鏈400114gaggttcagc tggtcgagtc aggaggcggt ctcgtgcagc ctggcggatc actgagattg 60tcctgtgctg catctggtta cgtcttcaca gactatggaa tgaattgggt tagacaggcc 120ccgggaaagg gcctggaatg gatgggttgg attaatactt acattggaga gcctatttat 180gctgacagcg tcaagggcag attcacgttc tctctagaca catccaagtc aacagcatac 240ctccaaatga atagcctgag agcagaggac accgcagtgt actattgtgc tagaggatac 300agatcttatg ccatggacta ctggggccag ggtaccctag tcacagtctc ctcagcttcc 360accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtcgaca agaaagttga gcccaaatct 660tgtgacaaaa ctcacacatg cgccgcg 687210115211229212PRT213人工序列220223修飾Fab的移植重鏈400115Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Val Phe Thr Asp Tyr20 25 30Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ile Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Lys Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Tyr Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr100 105 110Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro115 120 125Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly130 135 140Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn145 150 155 160Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln165 170 175Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser180 185 190Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser195 200 205Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr210 215 220His Thr Cys Ala Ala22權利要求
1.一種對人TNFα具有特異性的抗體分子，其包含一個重鏈，其中的可變域包含一CDR，該CDR具有圖3(SEQ ID NO1)所列CDRH1的H1序列，圖3(SEQ ID NO2)所列CDRH2的H2』序列，圖3(SEQ IDNO7)所列CDRH2的H2序列，或圖3(SEQ ID NO3)所列CDRH3的H3序列。
2.一種對人TNFα具有特異性的抗體分子，其包含一個輕鏈，其中的可變域包含一CDR，該CDR具有圖3(SEQ ID NO4)所列CDRL1的L1序列，圖3(SEQ ID NO5)所列CDRL2的L2序列，圖3(SEQ IDNO6)所列CDRL3的L3序列。
3.如權利要求1或權利要求2的抗體分子，其包含一個重鏈，其中的可變域包含一CDR，該CDR具有SEQ ID NO1所列的CDRH1的序列，SEQ ID NO2或SEQ ID NO7所列的CDRH2的序列，SEQ ID NO3所列的CDRH3的序列，和一個輕鏈，其中的可變域包含一CDR，該CDR具有SEQ ID NO4所列的CDRL1的序列，SEQ ID NO5所列的CDRL2的序列和SEQ ID NO6所列的CDRL3的序列。
4.如權利要求3的抗體分子，其包含CDRH1的SEQ ID NO1，CDRH2的SEQ ID NO2或SEQ ID NO7，CDRH3的SEQ ID NO3，CDRL1的SEQID NO4，CDRL2的SEQ ID NO5，CDRL3的SEQ ID NO6。
5.如權利要求1-4中任意一項的抗體分子，其包含CDRH2的SEQ IDNO2。
6.如權利要求1-5中任意一項的抗體分子，其是一種移植了CDR的抗體分子(CDR-grafted antibody Molecule)。
7.如權利要求6的抗體分子，其中的可變域包含人受體構架區和非-人的供體CDRs。
8.如權利要求7的抗體分子，其中重鏈可變域的人受體構架區是以人類1組共有序列為基礎的，且包含28，69和71位的非-人供體殘基。
9.如權利要求7的抗體分子，其中重鏈可變域的人受體構架區是以人類1組共有序列為基礎的，且包含28，38，46，67，69和71位的非-人供體殘基。
10.如權利要求7的抗體分子，其中重鏈可變域的人受體構架區是以人類3組共有序列為基礎的，且包含27，28，30，48，49，69，71，73，76和78位的非-人供體殘基。
11.如權利要求7-10中任意一項的抗體分子，其中輕鏈可變域的人受體構架區是以人類1組共有序列為基礎的，且包含46和60位的非-人供體殘基。
12.如權利要求1-11中任意一項的抗體分子，其包含輕鏈可變域hTNF40-gL1(SEQ ID NO8)和重鏈可變域gh3hTNF40.4(SEQ ID NO11)。
13.如權利要求1-12中任意一項的抗體分子，其是一種Fab片段。
14.如權利要求12和13的抗體分子，其是一種Fab片段，其中包含一個具有SEQ ID NO111所列序列的重鏈和一個具有SEQ IDNO113所列序列的輕鏈。
15.如權利要求1-12任意一項的抗體分子，其是一種修飾的Fab片段，該片段重鏈的C-端具有一個或多個胺基酸，允許與效應分子或報導分子相連接。
16.如權利要求15的抗體分子，其中附加的胺基酸形成含一個或兩個半胱氨酸殘基的修飾鉸鏈區，效應分子或報導分子與之相連接。
17.如權利要求12的抗體分子，其是一種修飾的Fab片段，該片段含一個具有SEQ ID NO115所列序列的重鏈，和一個具有SEQ IDNO113所列序列的輕鏈。
18.一種對人TNFα具有特異性的抗體分子，其具有一個含SEQ IDNO113所列序列的輕鏈。
19.一種對人TNFα具有特異性的抗體分子，其具有一個由SEQ IDNO113所列序列組成的輕鏈。
20.一種對人TNFα具有特異性的抗體分子，其具有一個含SEQ IDNO115所列序列的重鏈。
21.一種對人TNFα具有特異性的抗體分子，其具有一個由SEQ IDNO115所列序列組成的重鏈。
22.一種對人TNFα具有特異性的抗體分子，其具有一個含SEQ IDNO113所列序列的輕鏈，和一個含SEQ ID NO115所列序列的重鏈。
23.一種對人TNFα具有特異性的抗體分子，其具有一個由SEQ IDNO113所列序列組成的輕鏈，和一個由SEQ ID NO115所列序列組成的重鏈。
24.如權利要求1-23任意一項抗體分子的變體，其對TNFα的親和力增加。
25.如權利要求24的變體，其是通過親和力成熟方案得到的。
26.如權利要求1-3中任意一項的抗體，其是鼠抗-TNFα的單克隆抗體hTNF40。
27.如權利要求1-3中任意一項的抗體分子，其是一種嵌合抗體分子，其中含權利要求26的單克隆抗體的輕鏈可變域和重鏈可變域。
28.一種含權利要求15-23中任意一項抗體分子的化合物，具有共價連接到抗體分子重鏈C-端的一個胺基酸上或抗體分子重鏈C-端的效應分子或報導分子。
29.如權利要求28的化合物，其包含一種效應分子。
30.如權利要求29的化合物，其中的效應分子包含一種或多種聚合物。
31.如權利要求30的化合物，其中的一種或多種聚合物是任選取代的直鏈或支鏈聚亞烷基，聚亞烯基或聚亞氧烷基的聚合物，或支鏈或無支鏈的多糖。
32.如權利要求31的化合物，其中的一種或多種聚合物是甲氧基聚(乙二醇)。
33.一種含權利要求17的抗體分子的化合物，其中位於抗體分子重鏈C-端的其中一個半胱氨酸殘基與賴氨醯-馬來醯亞胺基相連接，其中各個賴氨醯殘基的氨基共價連接到具有約20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)上。
34.一種含對人TNFα具有特異性的抗體分子的化合物，其具有一個含SEQ ID NO113所列序列的輕鏈，和一個含SEQ ID NO115所列序列的重鏈，位於抗體分子重鏈C-端的其中一個半胱氨酸殘基與一種或多種合成或天然存在的聚合物相連接。
35.一種含對人TNFα具有特異性的抗體分子的化合物，其具有一個由SEQ ID NO113所列序列組成的輕鏈，和一個由SEQ ID NO115所列序列組成的重鏈，位於抗體分子重鏈C-端的其中一個半胱氨酸殘基與一種或多種合成或天然存在的聚合物相連接。
36.一種含對人TNFα具有特異性的抗體分子的化合物，其具有一個含SEQ ID NO113所列序列的輕鏈，位於抗體分子重鏈C-端的其中一個半胱氨酸殘基與賴氨醯-馬來醯亞胺基相連接，其中各個賴氨醯殘基的氨基共價連接到具有約20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)殘基上。
37.一種含對人TNFα具有特異性的抗體分子的化合物，其具有一個由SEQ ID NO113所列序列組成的輕鏈，位於抗體分子重鏈C-端的其中一個半胱氨酸殘基與賴氨醯-馬來醯亞胺基相連接，其中各個賴氨醯殘基的氨基共價連接到具有約20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)殘基上。
38.一種含對人TNFα具有特異性的抗體分子的化合物，其具有一個含SEQ ID NO115所列序列的重鏈，位於抗體分子重鏈C-端的其中一個半胱氨酸殘基與賴氨醯-馬來醯亞胺基相連接，其中各個賴氨醯殘基的氨基共價連接到具有約20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)殘基上。
39.一種含對人TNFα具有特異性的抗體分子的化合物，其具有一個由SEQ ID NO115所列序列組成的重鏈，位於抗體分子重鏈C-端的其中一個半胱氨酸殘基與賴氨醯-馬來醯亞胺基相連接，其中各個賴氨醯殘基的氨基共價連接到具有約20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)殘基上。
40.一種含對人TNFα具有特異性的抗體分子的化合物，其具有一個含SEQ ID NO113所列序列的輕鏈和一個含SEQ ID NO115所列序列的重鏈，位於抗體分子重鏈C-端的其中一個半胱氨酸殘基與賴氨醯-馬來醯亞胺基相連接，其中各個賴氨醯殘基的氨基共價連接到具有約20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)殘基上。
41.一種含對人TNFα具有特異性的抗體分子的化合物，其具有一個由SEQ ID NO113所列序列組成的輕鏈和一個由SEQ ID NO115所列序列組成的重鏈，位於抗體分子重鏈C-端的其中一個半胱氨酸殘基與賴氨醯-馬來醯亞胺基相連接，其中各個賴氨醯殘基的氨基共價連接到具有約20,000Da分子量的甲氧基聚(乙二醇)殘基上。
42.一種含雜種CDR的抗體分子，該雜種CDR包含截短的供體CDR序列，其中供體CDR的缺失部分可用不同的序列代替，並形成一功能性的CDR。
43.如權利要求42的抗體分子，其中CDR序列的缺失部分來源於這樣的抗體抗體分子的構架區衍生於該抗體。
44.如權利要求43的抗體分子，其中CDR序列的缺失部分衍生於具有共有序列構架區的種系抗體。
45.如權利要求42-44中任意一項的抗體分子，其中在抗體分子中的重鏈的CDRH2是雜種的。
46.如權利要求42-45中任意一項的抗體分子，其中平截供體CDR的1-8個胺基酸。
47.如權利要求46的抗體分子，其中平截4-6個胺基酸。
48.如權利要求42-47中任意一項的抗體分子，其中在CDR的C-端進行平截。
49.一種編碼權利要求1-27和42-48中任意一項抗體分子的重鏈和/或輕鏈的DNA序列。
50.如權利要求49的DNA序列，其包含SEQ ID NO8或10所列的序列。
51.如權利要求49的DNA序列，其包含SEQ ID NO10或11所列的序列。
52.如權利要求49的DNA序列，其包含SEQ ID NO110，112或114所列的序列。
53.一種含權利要求49-52中任意一項DNA序列的克隆或表達載體。
54.一種含權利要求49-52中任意一項DNA序列的大腸桿菌表達載體。
55.如權利要求54的大腸桿菌表達載體，其是pTTO(CDP870)。
56.一種用權利要求53-55任意一項載體轉化的宿主細胞。
57.一種生產權利要求1-27和42-48中任意一項抗體分子的方法，包含培養權利要求56的宿主細胞，並分離該抗體分子。
58.一種生產權利要求1-27和42-48中任意一項抗體分子的方法，包括培養含大腸桿菌表達載體的大腸桿菌，其中該大腸桿菌表達載體含權利要求53-55中任意一項的DNA序列，並分離該抗體分子。
59.如權利要求58的方法，其中該抗體分子被導向胞質。
60.一種治療或診斷組合物，其包含權利要求1-27和42-48中任意一項的抗體分子或權利要求28-41中任意一項的化合物。
61.對人TNFα具有特異性的，權利要求1-27和42-48中任意一項的抗體分子，或權利要求28-41中任意一項的化合物在治療TNFα介導的病狀中的用途。
62.權利要求61的抗體分子或化合物在治療類風溼性關節炎或骨關節炎中的用途。
63.對人TNFα具有特異性的，權利要求1-27和42-48中任意一項的抗體分子，或權利要求28-41中任意一項的化合物在製備治療TNFα介導的病狀的藥物中的用途。
64.如權利要求63的用途，其中的病狀是類風溼性關節炎或骨關節炎。
65.圖19所示的載體pDNAbEng-G1。
66.圖22所示的載體pTTO(CDP870)。
67.一種具有SEQ ID NO1-7中任意一個所列胺基酸序列的多肽。
全文摘要
本發明公開了一種抗體分子,其包含主少一種來源於小鼠單克隆抗體的,對人TNFα具有特異性的CDR。本發明還公開了一種移植了CDR的抗體,其中至少一種CDR是雜種CDR。本發明進一步公開了編碼抗體分子鏈的DNA序列,載體,轉化的宿主細胞,及抗體分子在治療TNFα介導的疾病中的用途。
文檔編號A61P37/06GK1383450SQ01801629
公開日2002年12月4日 申請日期2001年6月5日 優先權日2000年6月6日
發明者D·S·阿斯瓦爾, D·T·布勞恩, A·N·C·維爾, A·G·波普萊維爾, A·P·查普曼, D·J·金 申請人:細胞技術研究及開發有限公司