一種膽鹽水解酶及其生產方法與專用生產菌株的製作方法
2023-06-25 19:33:41
專利名稱：一種膽鹽水解酶及其生產方法與專用生產菌株的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種膽鹽水解酶及其生產方法與專用生產菌株。
背景技術：
益生菌是指對人和動物機體有益的微生物。它們通過改善腸道微生物生態平衡，控制腸道感染，降低血清膽固醇水平，提高乳糖不耐症人對乳糖的利用，並能刺激特異性或非特異性免疫反應，具有增強免疫的作用。益生菌製品的活菌代謝穩定，活性較強，通過消化道後大量存活，進入腸道後發揮益生菌作用。早在1963年人們就證實乳桿菌發酵的酸奶具有降低膽固醇的能力。許多研究也表明了一些乳桿菌能夠降低總膽固醇的含量和低密度脂蛋白膽固醇含量。攝取含有某種乳桿菌或者雙歧桿菌的酸奶能夠降低血清膽固醇的含量。
大量的研究發現，經常食用含有益生菌(主要是乳酸菌)的發酵製品有助於血清膽固醇含量的降低。Mann和Spoerry發現非洲Massai warrios部落裡的人，由於長期大量飲用由當地野生乳酸菌發酵的牛奶，血清膽固醇的含量明顯比普通人群低。這一現象引起了營養學、醫學、微生物學等各界人士的注意，從而掀起了乳酸菌降低膽固醇作用的研究熱潮。迄今為止，大量的研究發現和證實了不同種類的乳酸菌具有降低膽固醇作用的效果。
關於乳酸菌降低血清膽固醇的機理，目前尚未有明確答案。國內外研究者的觀點主要集中在以下幾點(1)乳酸菌菌體細胞直接吸收膽固醇；(2)乳酸菌降解結合態膽鹽轉變為游離態膽鹽，後者溶解度下降與膽固醇發生共沉澱；降解後的膽鹽為游離膽鹽，且其在腸道的溶解度和被吸收能力均比結合態膽鹽差，可以糞便的形式排出體外，由此導致了膽固醇的代謝加速，達到降低血清膽固醇水平的效果；(3)其他理論。
膽鹽水解酶是乳酸菌在人體內的一種代謝產物，該酶能水解結合態膽鹽，使結合膽鹽降解為游離態膽鹽，後者的溶解度比前者有所降低，因此能使膽固醇以沉澱的形式排出體外，其代謝產物為胺基酸，對人體無害。
Klaver等利用多株乳桿菌和雙歧桿菌進行的降膽固醇研究證實乳酸菌產生的膽鹽水解酶可以使結合膽鹽分解為游離膽鹽，游離膽鹽與膽固醇形成複合物共同沉澱下來，從而導致環境中膽固醇含量的降低。
Verstrate認為乳酸菌的高膽鹽水解酶活力這一特徵在降低膽固醇含量方面起著重要作用。此外，Ahn認為乳酸菌的膽鹽水解酶在降低膽固醇方面具有重要作用。
國內關於乾酪乳桿菌的研究主要是其降血脂、抗高血壓、治療過敏性疾病等保健功效上，如曹性根所申請的中國專利新穎的抗幽門螺桿菌和大腸桿菌157H7的類乾酪乳桿菌類乾酪亞種菌株的抗細菌劑(專利申請號為CN01805665.2)；熱爾韋·達諾尼公司所申請的乾酪乳桿菌在免疫刺激肽中的應用(專利申請號為CN01810051.1)；上海光明乳業股份有限公司申請的乾酪乳桿菌Bd-II菌株及其在降低血脂方面的應用(專利申請號為CN03128995.9)；乾酪乳桿菌LC2W菌株及其在抗高血壓方面的應用(專利申請號為CN03129450.2)。此外還有景嶽生物科技股份有限公司申請的新的微生物株類乾酪乳桿菌GM-080及其治療過敏相關疾病的用途(專利申請號為CN200410038566.X)。
國外關於乾酪乳桿菌的專利也主要是集中在乾酪乳桿菌作為益生菌對各種疾病的防治作用上，主要有遺傳性過敏性疾病、癌症、口臭、新陳代謝綜合症、益生菌療法等，較之國內其研究的範圍更廣泛。乾酪乳桿菌還可以作為生物保護劑，用其抑制病原菌的生長(2005024439)。Glenn；Matthew等從乳酸菌中分離得到的多肽類物質是對乳酸菌所產生的特殊功效物質的研究。而國內無任何乳酸菌產膽鹽水解酶的文章報導和專利報導。
發明內容
本發明的目的是提供一種乳酸菌膽鹽水解酶(Bile Salt Hydrolase，BSH)及其生產方法與專用生產菌株。
本發明所提供的膽鹽水解酶的專用生產菌株，是乾酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)KTx，已於2006年06月23日保藏於中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市海澱區中關村北一條13號)，保藏號為CGMCC №.1739。
乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx分離自東北普通家庭的開菲爾。在MRS培養基上，乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx的菌落為乳白色或微帶黃色，略有凸起。個體形態為不規則G+無芽孢桿菌，呈現杆狀。
本發明所提供的膽鹽水解酶，是發酵乾酪乳桿菌KTx CGMCC №.1739得到的蛋白質。
本發明所提供的生產膽鹽水解酶的方法，包括下述步驟1)發酵乾酪乳桿菌KTx CGMCC №.1739，收集菌體；
2)破碎菌體，收集蛋白，得到膽鹽水解酶。
所述方法中，所述步驟1)中發酵乾酪乳桿菌KTx CGMCC №.1739的培養基的碳源和氮源分別為葡萄糖和大豆蛋白腖。所述培養基優選為1L中含有葡萄糖2％～4％，大豆蛋白腖0.5％～3％，MnSO40.025％，牛肉膏1.00％、酵母膏0.5％、吐溫800.10％，磷酸氫二鉀0.20％，乙酸鈉0.50％，檸檬酸銨0.20％，硫酸鎂0.058％的培養基；所述百分含量均為質量百含量。
所述培養基優選為1L中含有葡萄糖添加量2％、大豆蛋白腖添加量3％、MnSO40.025％、牛肉膏1.00％、酵母膏0.5％、吐溫80 0.10％、磷酸氫二鉀0.20％、乙酸鈉0.50％、檸檬酸銨0.20％、硫酸鎂0.058％的培養基；所述百分含量均為質量百分含量。
所述方法中，所述步驟1)中發酵乾酪乳桿菌KTx CGMCC №.1739的溫度可為30～40℃，發酵時間可為10～12h，發酵培養基的初始pH值可為5.0～7.0。
所述步驟1)中所述發酵乾酪乳桿菌KTx CGMCC №.1739的溫度優選為37℃，發酵時間優選為12h、發酵培養基的初始pH值優選為6.0。
所述方法中，還包括將步驟2)獲得的膽鹽水解酶採用陰離子層析法純化，得到純化的膽鹽水解酶；所述分離條件為以DEAE-Sepharose Fast Flow為凝膠填料，0.05mol/L NaCl作為洗脫劑，收集280nm吸收峰處樣品。
本發明的乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx，發酵可產生高活性的膽鹽水解酶，其產生膽鹽水解酶活力可達8.85U/2×107cfu，純化後的比活力達到1259.84U/mg。本發明的乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx對人體具有可靠的安全性，製成活菌製劑，可省去常規發酵、提取等繁瑣工藝。本發明的乾酪乳桿菌生產的膽鹽水解酶，可以作為添加劑添加到食品或藥品中達到降膽固醇的目的，是高效、無毒副作用的新型生物功能添加劑；該膽鹽水解酶還可以以酶製劑的方式直接食用，同樣可降低膽固醇的含量。由本發明的乾酪乳桿菌生產膽鹽水解酶的方法，對設備要求低，操作簡單，成本較低，適於工業化生產。
圖1為乾酪乳桿菌KTx發酵產生的膽鹽水解酶活力隨pH值的變化。
圖2為乾酪乳桿菌KTx發酵產生的膽鹽水解酶活力隨溫度的變化。
圖3為乾酪乳桿菌KTx發酵產生的膽鹽水解酶活力隨底物濃度的變化。
圖4為乾酪乳桿菌KTx發酵產生的膽鹽水解酶的Km值。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
實施例1、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx分離和鑑定1、菌株的篩選開菲爾濾液5ml加入45ml生理鹽水(帶玻璃珠)製成菌懸液，然後10倍梯度稀釋106～108倍，取1ml傾注到平板(含有CaCO3的MRS瓊脂平板)於37℃培養24h，挑取有溶解圈的菌落置於MRS液體管中37℃增菌培養12h，Grans染色，視其純度，吸取增菌液以2％(體積比)的接種量接種於以膽固醇為唯一碳源的I號培養基(含有鹽溶液I 1L和膽固醇1.0g的培養基；鹽溶液I(g/L)KH2PO40.25；MgSO4·7H2O 0.25；FeSO45mg；NaCl 5mg；製備時，將膽固醇溶於鹽溶液I後用超聲波細胞粉粹機500w震蕩乳化20min；調pH值至7.0，121℃滅菌20min)中37℃培養20h，鄰苯二甲醛法測膽固醇剩餘量，根據I號培養基中膽固醇含量的降低，初篩獲得的具有降膽固醇功能的菌株。
將初篩後獲得的能降膽固醇的菌株，用牛津杯法接種於含有0.3％的牛磺膽鹽、0.1％膽固醇、0.2％CaCl2的MRS瓊脂培養基中(1L中含有牛肉膏10g，酵母提取物5g，蛋白腖10g，葡萄糖20g，檸檬酸二銨2g，乙酸鈉5g，吐溫801mL，K2HPO42g，MnSO40.25g，MgSO4·7H2O 0.58g，瓊脂15g)在牛津杯中加入0.1ml的MRS培養菌液，於37℃厭氧罐中培養72h後觀察牛津杯周圍是否有不透明的沉澱圈產生。以不含牛磺膽鹽、0.1％膽固醇、0.2％CaCl2的MRS瓊脂培養基作為對照。將牛津杯周圍白色沉澱物輕輕刮下，溶解於少量蒸餾水的試管中，滴加茚三酮顯色液，觀察是否有藍紫色反應，以此初步確定菌株是否產生膽鹽水解酶。通過實驗獲得一株產膽鹽水解酶的菌株，命名為KTx。將茚三酮反應陽性的菌株劃線接種於MRS斜面試管，培養後保存備用。
2、菌株KTx的鑑定將步驟1獲得的產膽鹽水解酶的菌株KTx，接種於MRS液體培養基中37℃培養，進行下述鑑定。
糖醇類發酵試驗，接觸酶(H2O2酶)試驗，硝酸鹽還原試驗，甲基紅試驗，V-P試驗，耐鹽試驗(7.5％NaCl)，不同溫度試驗(10℃、30℃、40℃)。
鑑定結果如表1所示。結果表明，菌株KTx為乳桿菌屬。進一步採用Biolog全自動微生物鑑定儀分析鑑定，表明，菌株KTx為Lactobacillus casei，即乾酪乳桿菌。該菌株已於2006年06月23日保藏於中國微生物菌種保藏管委理員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市海澱區中關村北一條13號)，保藏號為CGMCC №.1739。在MRS培養基上，乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx的菌落為乳白色或微帶黃色，略有凸起。個體形態為不規則G+無芽孢桿菌，呈現杆狀。
表1.菌株KTx屬的鑑定指標與鑑定結果
注「+」表示反應陽性，「-」表示反應陰性。
實施例2、乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx的發酵條件的優化以及發酵獲得的膽鹽水解酶的檢測一、乾酪乳桿菌(Lac tobacillus casei)KTx的發酵條件的優化1、基本培養基的選擇將乾酪乳桿菌KTx CGMCC №.1739採用2％(V/V)的接種量，分別接種在MRS液體培養基，改良MRS液體培養基(MRS培養基加質量含量為3～4‰玉米漿和質量含量為0.3～0.4‰的半胱氨酸鹽酸鹽)，MRS肉湯培養基(MRS-broth液體培養基)(胰蛋白腖5g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖10g，檸檬酸三銨1g，乙酸鈉2.5g，吐溫800 .5mL，Na2HPO41g，MnSO40.025g，MgSO4·7H2O0.05g，蒸餾水500mL)，在37℃下培養12h後，測其生長量以及產膽鹽水解酶的量，產膽鹽水解酶的量按照下述膽鹽水解酶的提取和檢測方法測量。
膽鹽水解酶的提取和檢測方法將乾酪乳桿菌KTx CGMCC №.1739的發酵液在4℃下冷凍離心收集沉澱；用無菌生理鹽水洗滌菌體沉澱，10000rpm(10750g)離心，收集菌體沉澱；加入到0.1mol/L pH6.5磷酸緩衝液，菌液濃度調到A600nm為1；菌體懸浮液在冰浴中進行超聲波破碎，500w，3min/5ml，收集粗酶液。將0.1ml粗酶液加入1.8ml的磷酸鈉緩衝液(pH6.0)和0.1ml的結合膽鹽(6mmol/L牛磺膽酸鈉)，振蕩1min混勻，混合物在37℃培養30min加入三氯乙酸中止反應(0.5ml反應液/0.5ml的三氯乙酸)，然後4℃，10000rpm離心10min。取反應上清液1ml，加入1ml pH5.4，2mol/L醋酸緩衝液和1ml茚三酮顯色液，混勻後在100℃沸水浴中加熱15min，冷卻，室溫放置5min後，加入3ml 60％乙醇稀釋，搖勻後測定A570nm，生成的顏色在60min內穩定。每分鐘生成1mmol的胺基酸定義為一個酶活力單位。
結果表明，MRS肉湯培養基中培養的乾酪乳桿菌KTx，其生長量最大，產膽鹽水解酶的量最大，表明MRS肉湯培養基(MRS-broth液體培養基)為最適宜生產膽鹽水解酶的基本培養基。
2、pH值的優選以MRS肉湯培養基為基本培養基，分別以pH值為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0或7.0為初始pH值，按照接種量2％(1.0×105cfu/ml培養基)的量接種乾酪乳桿菌KTx，在37℃下培養12小時後，按照步驟1所述的方法提取膽鹽水解酶，並檢測膽鹽水解酶的活力，結果表明當初始pH為6.0時，培養乾酪乳桿菌KTx獲得的膽鹽水解酶的活力最高。
3、溫度條件的優選以MRS肉湯培養基為基本培養基，初始pH值為6.0，接種量為2.0％(1.0×105cfu/ml培養基)分別以發酵溫度為42℃、37℃、35℃、30℃或25℃培養乾酪乳桿菌KTx，培養12小時後，按照步驟1所述的方法提取膽鹽水解酶，並檢測膽鹽水解酶的活力，結果表明當發酵溫度為37℃時，培養乾酪乳桿菌KTx獲得的膽鹽水解酶的活力最高。
4、接種量的優選以MRS肉湯培養基為基本培養基，初始pH值為6.0，接種量分別為0.5％(2.5×104cfu/ml發酵液)、1.0％(5.0×104cfu/ml發酵液)、2.0％(1.0×105cfu/ml發酵液)、3.0％(1.5×105cfu/ml發酵液)或4.0％(2.0×105cfu/ml發酵液)，在37℃培養乾酪乳桿菌KTx，12小時後，按照步驟1所述的方法提取膽鹽水解酶，並檢測膽鹽水解酶的活力，結果表明接種量為2％時，膽鹽水解酶的活力最高，說明2％為最適接種量。
通過上述步驟1、2和3的試驗，確定了最佳的培養溫度37℃、培養基的初始pH值6.0和接種量2.0％。
5、培養基成分的確定分別對比不同種類的碳源(葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、半乳糖、蜜二糖、果糖、纖維二糖、棉籽糖和山梨醇)、氮源(大豆蛋白腖、普通蛋白腖、聚蛋白腖、胰蛋白腖、酪蛋白腖)、表面活性劑(吐溫80、吐溫20和聚乙二醇)對膽鹽水解酶活力的影響，確定最佳培養基成分。實驗結果表明最佳的碳源、氮源、表面活性劑分別為葡萄糖、大豆蛋白腖、吐溫80。
根據上述培養基成分選擇的結果，以葡萄糖添加量、大豆蛋白腖添加量、培養溫度和接種量為因素，設計四元四次正交實驗(表2)，其它的因素(培養條件)根據上述實驗得到的結論設置。按照表2的因素實驗發酵得到的發酵液，按照步驟1所述的方法檢測按照步驟1所述的方法提取膽鹽水解酶粗酶液，檢測膽鹽水解酶的活力。
表2.四元四次正交設計因素水平表
結果表明，乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx接種於培養基為1L中含有葡萄糖添加量2％、大豆蛋白腖添加量3％、MnSO40.025％、牛肉膏1.00％、酵母膏0.5％、吐溫80 0.10％、磷酸氫二鉀0.20％、乙酸鈉0.50％、檸檬酸銨0.20％、硫酸鎂0.058％，培養溫度37℃，接種量2％，初始pH值為6.0，培養12小時的條件下的發酵液(109cfu/ml發酵液)酶活最高，膽鹽水解酶的酶活力為8.85U/2×107cfu，是優化前(MRS培養基37℃培養12小時，接種量2％(1.0×105cfu/ml培養基)，培養結束，膽鹽水解酶活力達到0.66U/2×107cfu)的13.4倍。
將在上述最優培養條件下得到的乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx發酵液，按照步驟1的方法提取得到粗酶液，將得到的粗酶液中加入固體硫酸銨，使其飽和度分別達到10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，每加完一次硫酸銨後，將粗酶液於冰箱內放置24h，然後於10000rpm，離心20min，將每次的沉澱離心分別收集，用約2倍體積的50mmol/L，pH6.5的磷酸鈉緩衝液溶解後，裝入透析袋中，於相同的緩衝液中透析至透析液經BaCl2無沉澱為止(每隔12h換一次緩衝液至透析完全)，分別測定酶活力與蛋白濃度，計算比活力(U/mg)，結果表明，70％硫酸銨分離沉澱效果最佳，上清液中的蛋白含量最少，說明70％的飽和硫酸銨能最大程度沉澱蛋白，合併比活力高的部分，並用聚乙二醇20000吸取透析帶內的水分，達到樣品濃縮1～2倍，做進一步純化；然後採用陰離子層析柱進行純化，所述凝膠層析法的分離條件為以DEAE-Sepharose Fast Flow為凝膠填料，加樣0.5mL，0.05mol/L NaCl作為洗脫劑，以1mL/min的流速洗脫，收集280nm吸收峰處樣品，得到乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx的膽鹽水解酶的純品，採用SDS-PAGE電泳檢測純度。經檢測膽鹽水解酶的電泳圖譜為一條帶，分子量為30kDa。比活力可達到1259.84(U/mg)，純度是原粗酶液的17倍。
二、膽鹽水解酶特性研究(1)酶的最佳反應pH按照步驟一中的步驟1的方法測步驟一純化獲得的粗酶液的酶活，其中，將粗酶液稀釋後，分別取1ml加在不同pH(pH 4.0～8.0)的緩衝液中，37℃保溫30min。結果如圖1所示，表明BSH的最適pH為6.0，反應條件為偏酸性。說明了酶的最適反應pH值和產酶的最適pH值相一致。
(2)酶的最適反應溫度的測定按照步驟一中的步驟1的方法測定步驟一純化獲得的粗酶液在不同反應溫度下的酶活。其中，將粗酶液稀釋後，分別取1ml加入到提前置於10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃的水浴中預熱10min的磷酸緩衝液、結合膽鹽混合液中，保溫30min，即使酶反應溫度分別為10℃，20℃，30℃，40℃，50℃，60℃，70℃，測定酶活。結果如圖2所示，表明酶的最適反應溫度為30～40℃。
(3)最適底物濃度的測定按照步驟一中的步驟1的方法測步驟一純化獲得的粗酶液的酶活。將底物牛磺膽酸鈉配製成濃度分別為4mmol/L，5mmol/L，6mmol/L，7mmol/L，8mmol/L的溶液，然後每管加入1ml經稀釋後的步驟一純化獲得的粗酶液，37℃保溫30min，反應結束後測酶活。結果如圖3所示，結果表明乾酪乳桿菌KTx發酵產生的膽鹽水解酶的最適底物濃度為6mmol/L。
(4)化學抑制劑對酶活性的影響按照步驟一中的步驟1的方法測步驟一純化獲得的膽鹽水解酶粗酶液的酶活。在底物中分別加入0.5％EDTA、1％SDS、4mol/L尿素，每管加入經過稀釋的粗酶液1ml，以不加化學試劑的反應體系為對照，於37℃水浴保溫30min，測定酶活。結果如表3所示，EDTA和SDS對乾酪乳桿菌KTx發酵產生的膽鹽水解酶的影響不大，而尿素的加入，完全抑制了乾酪乳桿菌KTx發酵產生的膽鹽水解酶的酶活。
表3.不同抑制劑對酶活的影響
(5)金屬離子對酶活的影響按照步驟一中的步驟1的方法測步驟一純化獲得的膽鹽水解酶粗酶液的酶活。將Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe3+、AL3+、Zn2+、Mn2+均以30mmol/L的濃度添加到反應體系(含1ml稀釋的粗酶液)中，其他反應條件不變，以不加金屬離子的反應液為對照，測酶活。結果如表4所示。
表4.不同激活劑對酶活的影響
(6)動力學常數的測定按照步驟一中的步驟1的方法測步驟一純化獲得的膽鹽水解酶粗酶液的酶活。在不同底物濃度(表5所示)的反應體系中，37℃反應5min，測定A570nm，以計算酶反應的初速度，1/V對1/[S](1/V是縱軸)作Lineweaver-Burk雙倒數圖，外推至與橫軸相交，橫軸截距(-X)即為1/Km值。用Michaelie-Menten方程(米氏方程)可以確定酶反應速度和底物濃度之間的定量關係，並滿足雙曲線的特徵[汪家政、範明主編.蛋白質技術手冊.科學出版社.200.4]。
測得的數據如表5所示，根據表5作圖，結果如圖4所示，由圖4結合米氏方程，計算得到膽鹽水解酶在本試驗條件下的動力學常數Km為4.57mmol/L。
表5.Km值的測定
權利要求
1.乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC №.1739。
2.一種膽鹽水解酶，是發酵權利要求1所述的乾酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)KTx CGMCC №.1739得到的產物。
3.一種生產膽鹽水解酶的方法，包括下述步驟1)發酵乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC №.1739，收集菌體；2)破碎菌體，收集蛋白，得到膽鹽水解酶。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述步驟1)中發酵乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC №.1739的培養基的碳源和氮源分別為葡萄糖和大豆蛋白腖。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於所述培養基為1L中含有葡萄糖2％～4％，大豆蛋白腖0.5％～3％，MnSO40.025％，牛肉膏1.00％、酵母膏0.5％、吐溫80 0.10％，磷酸氫二鉀0.20％，乙酸鈉0.50％，檸檬酸銨0.20％，硫酸鎂0.058％的培養基；所述百分含量均為質量百分含量。
6.根據權利要求5所述的方法，其特徵在於所述培養基為1L中含有葡萄糖2％、大豆蛋白腖3％、MnSO40.025％、牛肉膏1.00％、酵母膏0.5％、吐溫80 0.10％、磷酸氫二鉀0.20％、乙酸鈉0.50％、檸檬酸銨0.20％、硫酸鎂0.058％的培養基；所述百分含量均為質量百分含量。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述步驟1)中發酵乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC №.1739的發酵溫度為30～37℃，發酵時間為10～12h，發酵培養基的初始pH值為5.0～7.0。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於所述發酵溫度為37℃，發酵時間為12h、發酵培養基的初始pH值為6.0。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述方法中，還包括將步驟2)獲得的膽鹽水解酶採用陰離子層析法純化，得到純化的膽鹽水解酶；所述分離條件為以DEAE-Sepharose Fast Flow為凝膠填料，0.05mol/L NaCl作為洗脫劑，收集280nm吸收峰處樣品。
全文摘要
本發明公開了一種乳酸菌膽鹽水解酶及其生產方法與專用生產菌株。該膽鹽水解酶，是發酵其專用生產菌株－乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC№.1739得到的。該生產膽鹽水解酶的方法，包括下述步驟1)發酵乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx CGMCC№.1739，收集菌體；2)將步驟1)得到的菌體用磷酸緩衝液懸浮，在冰浴中進行超聲波破碎，收集得到粗酶液，用硫酸銨沉澱蛋白後，離心收集得到膽鹽水解酶。本發明的生產膽鹽水解酶的乾酪乳桿菌(Lactobacillus casei)KTx，發酵可產生大量的膽鹽水解酶，由該菌株生產的膽鹽水解酶具有很高的活性。
文檔編號C12N9/14GK1908158SQ20061011269
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月30日 優先權日2006年8月30日
發明者李平蘭, 王玉文, 王延祥, 周偉, 劉慧 , 李偉欣, 靳志強 申請人:中國農業大學