末端閉鎖的五螺旋蛋白及其用途的製作方法

2023-06-25 19:56:51 2

專利名稱：末端閉鎖的五螺旋蛋白及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物化學領域，更具體地說，涉及一種末端閉鎖的五螺旋蛋白及其用途。該種末端閉鎖的五螺旋蛋白可作為HIV膜融合的抑制劑；也可作為藥物靶物來篩選小分子抑制劑；以及作為結構明確並有完整抗原決定部位的免疫原來開發疫苗。
HIV和Ebola等包膜蛋白病毒感染細胞的首要步驟為病毒粘附到宿主細胞及病毒與細胞膜融合。該首要步驟由病毒表面的包膜糖蛋白調節。包括HIV的gp41及Ebola病毒的GP2在內的這些包膜糖蛋白也被稱為融合蛋白，它們對膜融合至關重要。融合蛋白的外部通常為由三個相同亞基組成的棒狀α-螺旋三聚體。該三聚體的每個亞基都為一個內多肽及一個外多肽的一部分，這三個亞基形成一個六螺旋束。該六螺旋束的核心為一個由N-α-螺旋組成的平行三股α-螺旋繞線。該核心的外層由三個C-α-螺旋的外層反平行地包繞。這一結構特徵為許多包膜病毒的融合調節糖蛋白所共有，例如HIV的gp41亞基，Ebola病毒的GP2亞基，流感病毒的HA2亞基，SV5副黏液病毒的F1亞基，以及MuMoLV、HTLV和SIV等逆病毒的TM亞基。上述所有病毒的融合糖蛋白都形成棒狀α-螺旋束(詳見綜述-Skehel and Wiley，Cell95，871，1998)。
當HIV感染細胞時，HIV的gp41發生下述構象改變gp41的N-螺旋區插入細胞膜，而gp41 C-螺旋區仍在病毒包膜中。通過這種重新安排，gp41將細胞膜和病毒包膜聯接到一起，從而使融合這一HIV感染的首要步驟成為可能。因此，科學家們相信阻遏gp41的膜融合功能將抑制HIV感染宿主細胞。
為了阻遏gp41的膜融合功能，科學家們已採取了許多策略。其手段之一就是集中發展相應於gp41C-螺旋區的C-多肽，並以此作為潛在的膜融合抑制劑(Jiang，S.，et al.，Nature365，113，1993，Wild，C.T.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，9770，1994)。據建議，這些C-多肽以支配性否定的方式與gp41的N-多肽區相結合，從而抑制膜融合。作為C-多肽之一的T-20目前正在臨床試驗中，並在愛滋病人中顯示出抗病毒活性(Kilby，J.M.，et al.，Nature Med.4，1302，1998)。然而，如想採用基因工程技術來生產，C-多肽又太短，工業化生產將很困難。此外，C-多肽在人體內很容易水解失效。因此，用C-多肽作為融合抑制劑面臨著穩定性和產業化的雙重挑戰。另一方面，相應於gp41 N-螺旋區的N-多肽不僅存在著同樣的穩定性和產業化問題，而且還有溶解度的障礙。如想發展小分子抑制劑，作為藥物靶物，C-多肽及N-多肽都因無明確結構而無實用價值。
因此，有必要發展穩定性好的可溶性蛋白，以實現下述目的1)作為阻遏膜融合的抑制劑；2)作為藥物靶物來篩選小分子抑制劑；3)作為結構明確並有完整抗原決定部位的免疫原來開發疫苗。
本發明的技術方案如下。
(1)一種末端閉鎖的五螺旋蛋白，它由HIV gp41蛋白的三個N-螺旋和兩個C-螺旋，以及四個內部接鏈和一或兩個末端接鏈所組成；這些內部接鏈將五個螺旋連接在一起，並且連接在某個螺旋的末端接鏈又與上述四個內部接鏈中的一個內部接鏈形成交鏈。
(2)如技術方案(1)所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其中，它的組成如下(從N-到C-)一個N-末端接鏈，第一個N-螺旋，第一個內部接鏈，第一個C-螺旋，第二個內部接鏈，第二個N-螺旋，第三個內部接鏈，第二個C-螺旋，第四個內部接鏈，第三個N-螺旋，以及一個C-末端接鏈；其中，N-末端接鏈與第二個或第四個內部接鏈形成交鏈，並且C-末端接鏈與第一個或第三個內部接鏈形成交鏈。
(3)如技術方案(2)所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其中，它的末端接鏈和內部接鏈均由胺基酸殘基組成。
(4)如技術方案(3)所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其中，它的末端接鏈和內部接鏈的交鏈是通過胺基酸殘基側鏈的相互作用而成。
(5)如技術方案(4)所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其中，它的末端接鏈和內部接鏈的交鏈的相互作用是通過共價健而成。
(6)如技術方案(5)所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其中，它的末端接鏈和內部接鏈的交鏈的共價健是二硫鍵。
(7)如技術方案(1)所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其中，它的組成如下(從N-到C-)第一個N-螺旋，第一個內部接鏈，第一個C-螺旋，第二個內部接鏈，第二個N-螺旋，第三個內部接鏈，第二個C-螺旋，第四個內部接鏈，第三個N-螺旋，以及一個C-末端接鏈；其中，C-末端接鏈與第一個或第三個內部接鏈形成交鏈。
(8)如技術方案(1)所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其中，它的組成如下(從N-到C-)一個N-末端接鏈，第一個N-螺旋，第一個內部接鏈，第一個C-螺旋，第二個內部接鏈，第二個N-螺旋，第三個內部接鏈，第二個C-螺旋，第四個內部接鏈，第三個N-螺旋；其中，N-末端接鏈與第二個或第四個內部接鏈形成交鏈。
(9)一種末端閉鎖的五螺旋蛋白，其中，它具有的序列編碼為SEQID NO.1。
(10)技術方案(1)至(9)的任一項所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白用於製造針對HIV病毒、流感病毒、Ebola病毒、SV5副粘液病毒以及MuMoLV逆病毒、HTLV逆病毒和SIV逆病毒中任一種病毒的抗病毒疫苗或抗病毒化合物的用途。
本發明還提供了將本發明的末端閉鎖的五螺旋蛋白用於製成治療HIV感染的針劑、口服劑、直腸給藥劑和皮膚吸收劑型製劑的用途。下面說明藥物製劑、劑量和給藥形式。首先說明藥用組合物。
本發明的抗病毒的末端閉鎖的五螺旋蛋白和至少一種其它治療劑的藥用組合物，可用於治療或預防人或非人的病毒性感染。本發明的所述的聯合用藥可產生加合/協同效果。
優選藥用組合物含有末端閉鎖的五螺旋蛋白，並含有至少一種其它抗病毒劑如逆轉錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、mRNA加工的抑制劑、蛋白糖基化抑制劑、病毒吸附劑、CD4受體阻斷劑、趨化因子受體抑制劑、中和性抗體、整合酶抑制劑及其它融合抑制劑。這類治療劑包括(但不限於)核苷類似物或鏈終止劑；趨化因子受體抑制劑AMD-3100(Tremblay，C.L.etal.，2000，愛滋病雜誌(J.AIDS)125(2)99-10)。
在本發明範圍內，可與末端閉鎖的五螺旋蛋白聯合使用的其它治療劑包括(但不限於)2-脫氧-D-葡萄糖(2dGlc)、脫氧野尻黴素無環烏苷、病毒唑(virazole)、利福平(rifadin)，金剛烷胺、利福布丁(rifabutine)，更普洛韋(ganciclover、DHPG)、法昔洛韋(Famciclover)、布普洛韋(Buciclover、DHBG)、氟化碘化阿糖胞胞嘧啶(fluoroiodoaracytosine)、碘苷、三氟胸腺嘧啶核苷、阿糖腺苷(ara-A)、ara-AMP、溴乙烯基去氧尿苷、溴乙烯阿糖尿嘧啶(BV-arau)、l-b-D-阿糖呋喃糖苷-E-5-[2-溴乙烯基]尿嘧啶、金剛乙胺，羥基脲，苯乙庚二酮、二芳基脒、(S)-(對硝基苄基)-6-硫代肌苷和膦醯基甲酸鹽。本發明包括含有末端閉鎖的五螺旋蛋白和任何上述其它化合物的藥用組合物。
本發明的末端閉鎖的五螺旋蛋白用作預防性疫苗的實施方案包括給予宿主一定濃度的有效末端閉鎖的五螺旋蛋白以產生足夠中和HIV的免疫應答，如抑制HIV感染細胞的能力。可使用該領域內普通技術人員熟知的標準技術來測定免疫應答的產生。用作疫苗的末端閉鎖的五螺旋蛋白通常肌注給藥。
為增強免疫應答，所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白可和適當的添加劑配在一起。這類添加劑包括(但不限於)礦物質凝膠如氫氧化鋁；表面活性物質如溶血卵磷脂；Puronic多元醇，聚陰離子；油乳劑；以及其它潛在的人用添加劑如卡介苗(BCG)和小棒狀桿菌。給予所述疫苗製劑的途徑包括(但不限於)口服、皮內、肌內、腹膜內、靜脈、皮下和鼻內。
下面說明末端閉鎖的五螺旋蛋白的劑量。
在治療急性病毒感染的哺乳動物(包括人)時，須給予足以抑制病毒複製的有效量的末端閉鎖的五螺旋蛋白。給予本發明的有效劑量可用該領域內技術人員所周知的方法來確定，如設置生物半衰期，生物利用率及毒性等參數。例如，可按約每天0.2-10.0mg/kg的劑量輸注末端閉鎖的五螺旋蛋白，持續4～52周。優選劑量為2mg～50mg/天。最優選的劑量約為5mg-10mg/天；大約持續52周。末端閉鎖的五螺旋蛋白的給藥間隔約為每兩天一次到每天四次，最好是每天1-2次。最佳劑量是使末端閉鎖的五螺旋蛋白的血漿峰濃度達到1mg/ml-10mg/ml。可先用適宜緩衝鹽水配製20％的末端閉鎖的五螺旋蛋白無菌注射液，連續輸注，再通過HPLC測血濃度，再確定所用末端閉鎖的五螺旋蛋白的量是否可以維持所需的血濃度。
與末端閉鎖的五螺旋蛋白聯合使用的治療劑(如抗病毒劑)的有效劑量的確定以該領域技術人員所熟知的各種抗病毒劑的推薦劑量為基礎。聯合用藥的劑量優選比文獻所推薦的單獨應用的劑量約低10-50％。醫護人員須注意出現毒性反應的劑量。當出現骨髓、肝、腎功能不全或嚴重藥物相互作用時，醫生應知道如何終止及何時終止、及時中斷或調整藥物至較低劑量。反之，如未達到臨床治療效果，醫生也應知道如何提高劑量。
有效治療劑量指該組合物足以改善病人症狀或延長病人存活期的用量。這類化合物的毒性和治療效果可按標準藥學程序經細胞培養或動物實驗來確定。如確定半數致死量LD50(實驗群體中有50％致死的劑量)和半數有效量ED50(實驗群體中50％達到治療效果的劑量)。毒性和治療有效劑量的比率叫做治療指數，可用LD50/ED50的比率來表示。治療指數越大的化合物越好。從細胞實驗和動物實驗獲得的數據可推測人的劑量範圍。這類化合物的劑量最好在一定血藥濃度範圍內，即包括ED50且無毒性或毒性很低，然後再根據所採用的劑型和給藥途徑來調整劑量。從這些資料可以較精確地確定人的使用劑量。血漿中的藥物濃度可用高效液相色譜(HPLC)來測定。
下面說明藥物製劑和給藥途徑。
將含有末端閉鎖的五螺旋蛋白的藥用組合物直接給予病人，或將含有末端閉鎖的五螺旋蛋白的藥用組合物與適宜的載體或賦形劑混合，以達到治療病毒感染、特別是HIV感染的劑量。本申請的化合物製劑和給藥技術為本領域技術人員所熟知。
本發明的抗病毒活性可表現出一種亞型特異性，即特異的蛋白僅對特異性的病毒有抑制作用。本發明對HIV-1最敏感，這種優點可體現在診斷試劑領域。如可利用本發明的抗HIV-1特異性來鑑別某一病毒分離株的類型(HIV-1或HIV-2)。例如在末端閉鎖的五螺旋蛋白存在的條件下，用一未知病毒株感染所分離的未感染的CD4+細胞，然後繼續培養。並對細胞上清液的逆轉錄病毒活性進行測定。如果逆轉錄病毒活性幾乎完全被抑制，則該病毒分離株含HIV-1。如果病毒活性未被抑制或僅有少量抑制，該病毒分離株可能不含HIV-1。
本發明還包括使用藥學上可接受的載體，按本文公開的和/或藥用組合物配製成適宜的劑型，用於全身給藥。正確地選用載體和適當的生產工藝，可使本發明的組合物，特別是配成溶液的組合物通過胃腸外途徑給藥，包括(但不限於)靜脈注射。所述的化合物還可採用該領域熟知的並且藥學上可接受的載體配成適宜於口服給藥的劑型。這類載體能將本發明的化合物配製成片、丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、淤漿和混懸等劑型。
本發明及上述藥用組合物可用本領域技術人員所熟知的途徑給藥。給藥途徑可包括口腔、直腸、透膜或腸道給藥；胃腸外給藥包括肌內、皮下、髓內注射、鞘內、直接心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內或眼內注射；透皮、局部用藥、陰道用藥等。劑型包括(但不限於)片劑、錠劑、散劑、懸浮劑、栓劑、溶液、膠囊、霜劑、貼劑、微泵劑。
為了方便起見，本發明涉及的藥用組合物可使用一種或多種生理學可接受的載體，並以常規方式配製成藥學上可接受的任何製劑。本發明涉及的藥用組合物可含一種或多種賦形劑和便於加工活性化合物的輔助劑。合適的製劑取決於所選的給藥途徑。為了方便注射，可將本發明的治療劑配成水溶液，如生理鹽水。對透膜給藥，製劑中應使用利於透過屏障的滲透劑，這些滲透劑是該領域內普遍熟知的。
本發明涉及的蛋白及其藥用組合物的口服製劑可用固體賦形劑磨碎成均勻的混合物，再加工成顆粒，必要時加入適宜的輔助劑，製成片劑或糖衣片的片芯。適宜的賦形劑及填料如糖；包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纖維素製品劑如玉米澱粉、小麥澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、西黃耆膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果必要，可以加入崩解劑，如交聯聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂，或藻酸或其鹽類如藻酸鈉。糖衣片芯應提供適當包衣。可採用濃縮糖溶液，溶液中可含阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol凝膠、聚乙二醇、二氧化鈦、硝基纖維素溶液及適當的有機溶劑或溶劑混合物。為了區別或標示活性化合物，可將不同組合的染料或食用色素加到片劑或糖衣片的包衣中。
用於口服的藥用組合物包括由明膠製成的裝填式膠囊，以及由明膠和一種增塑劑如甘油或山梨醇製成的密封軟膠囊。裝填式膠囊含有填充劑如乳糖、粘合劑如澱粉，和/或潤滑劑如滑石或硬脂酸鹽。也可用穩定劑來穩定活性成分。在軟膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮於適當的液體中，如脂肪油、液體石蠟或液狀聚乙二醇。此外，還可加入穩定劑。口服的所有製劑都應是方便病人服用的合適劑型。對於口腔給藥而言，所述組合物可採用片劑或錠劑等方便的形式配製。
對於吸入給藥，本發明使用的化合物可用氣霧劑噴射的形式很方便地釋放出來。可通過高壓包或噴霧器，或使用某種合適的拋射劑如二氯二氟甲烷，三氯氟代甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它適合的氣體來實現。在高壓氣霧劑的情況下，劑量單位可通過一個閥的計量釋放來確定。用作吸入器或吹氣器的明膠膠囊和藥筒可製成含有所述的蛋白和一種合適的粉末基質(如乳糖或澱粉)的混合物。
可將所述的蛋白配製成便於胃腸外給藥的劑型，如注射，包括集合藥團注射或連續靜脈滴注。便於注射的製劑可包裝成單位劑量形式，如安瓶。多劑量的製劑可包裝成單位劑多劑量的製劑可包裝成單位劑量形式，如安瓶或多劑量容器，並加入保存劑。所述組合物也可採用混懸液、溶液或以油或水為介質的乳劑形式，且可含有一定的配方劑如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。
用於胃腸外給藥的藥用組合物包括活性物質的水溶液，即水溶形式。活性物質的懸浮液也可製成適宜的油狀注射懸浮液。合適的親油溶劑或載體包括脂肪油如芝麻油、或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質體。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液粘度的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。所述懸浮液也可選擇性地包含合適的穩定劑或增加化合物溶解度的物質，以製備高濃度的溶液。粉針劑的活性成分可與適當的溶媒，如無菌去熱源注射用水配合，然後使用。
所述的化合物也可配製成直腸給藥製劑如栓劑或滯留灌腸劑。可用常規基質如可可脂或其它甘油酯配製。
除了已描述過的製劑外，還可將所述的蛋白或藥用組合物配成長效製劑。這種長效製劑可採用皮下或肌肉植入法或肌注給藥。因此，所述蛋白及其衍生物或藥用組合物可用合適的聚合物或疏水物質(如油乳劑)或離子交換樹脂、或微溶的衍生物如微溶鹽來配製。
本發明的疏水化合物的藥物載體為含苄醇，非極性表面活性劑，與水混溶的有機聚合物和水相的共溶體系。該共溶體系可為VPD共溶體系。VPD是一種由3％(重量/容量W/V)苄醇溶液，8％(W/V)的非極性表面活性劑多乙氧基醚，及65％(W/V)的聚乙二醇300在無水乙醇中組成的溶液。而VPD共溶體系(VPD5W)由1∶1稀釋的VPD與5％的葡萄糖在水溶液中配成。這種共溶體系能較好地溶解疏水性化合物，而體系本身對全身給藥的毒性很低。在不破壞其溶解度和毒性的情況下，共溶體系的比例可有較大的變化。而且，共溶成分的同一性也可以變化，如可用其它低毒性的非極性表面活性劑來取代多乙氧基醚；聚乙二醇的所佔比例也可改變；其它生物相容的聚合物也可取代聚乙二醇，如聚乙烯吡咯烷酮；其它糖或多糖可代替葡萄糖。
所述的藥用組合物也可包括適當的固相或凝膠相載體式賦形劑。這類載體或賦形劑包括(但不限於)碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、澱粉、纖維素衍生物、明膠及聚合物如聚乙二醇。適於本發明的藥用組合物也包括為達到治療目的所用的有效量的活性成分的組合物。有效量的確定方法為本領域技術人員所熟知。
與本領域的同類現有技術相比，本發明具有如下有益效果1.穩定性好，因此有效作用的時間長，從而可以減少用藥次數；
2.對病毒融合作用的抑制效果好，因此可以減少單次用藥的劑量；3.既可作為HIV膜融合的抑制劑；也可作為藥物靶物來篩選小分子抑制劑；以及作為結構明確並有完整抗原決定部位的免疫原來開發疫苗。
對附圖的簡要說明

圖1a與1b表示五螺旋蛋白的設計與結構。圖1a是五螺旋蛋白的設計草圖。核心部分有3個N-螺旋(內層)和2個C-螺旋(外層)，由4個內部接鏈結合在一起。圖1b是五螺旋蛋白的仰視、側視和俯視圖。虛線標明了缺失天然HIV gp41的第三個C-螺旋部位。缺失的C-螺旋暴露了α-螺旋束的內核上的結合部位。因而使五螺旋蛋白具有模擬HIV gp41內核的功能。
圖2表示末端閉鎖的五螺旋蛋白的設計草圖。該圖顯示引進了位於五螺旋蛋白每端的兩個半胱氨酸，其中一對來自於N-末端和第二內部接鏈，另一對來自於C-末端和第三內部接鏈。
圖3表示末端閉鎖的五螺旋蛋白從Superdex-75色譜分離柱洗脫的特徵峰圖。其分子量為23.4k道爾頓，並表明末端閉鎖的五螺旋蛋白可溶。分子量與洗脫峰(13.2ml)的一致性表明末端閉鎖的五螺旋蛋白可再摺疊。
圖4表示末端閉鎖的五螺旋蛋白的二向色性圖譜(CD圖譜)。圖示其具有典型的α-螺旋結構的CD圖譜，且表明末端閉鎖的五螺旋蛋白呈正確的再摺疊。
圖5a與5b表示末端閉鎖的五螺旋蛋白與天然gp41(N36C34)的穩定性比較。圖5a是天然型gp41(N36C34)在PBS溶液中的熔融曲線，熔點僅53℃。圖5b是末端閉鎖的五螺旋蛋白在3M GuHCl的PBS溶液中的熔融曲線，熔點為69℃。
圖6表示末端閉鎖的五螺旋蛋白對HIV病毒感染的抑制活性。據病毒-細胞融合分析，從HXB2(CXCR4)衍生的末端閉鎖的五螺旋對HIV JRFL(CCR5)病毒的50％抑制濃度(EC50)為0.75nM，而對HIV HXB2病毒的50％抑制濃度(EC50)為15.03nM。證明末端閉鎖的五螺旋蛋白對HIV病毒感染的抑制活性是廣譜的。
下面結合附圖詳細地描述本發明。
除C-多肽外，融合蛋白的內核對開發抑制劑和藥物靶物也是非常有吸引力的候選者(Wild，C.T.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，10537，1992)。當gp41的N-多肽與其C-多肽區結合時，N-多肽也應能抑制膜融合。然而，如果在結構的外部無外層多肽(C-多肽區)，僅由三個內部多肽(N-多肽區)形成的內核本身通常既不穩定，也不易溶解。為此，用N-多肽發展融合抑制劑或藥物靶物的難度相當大。
為了獲得穩定易溶的融合蛋白內核，本發明人設計了一個由三個內部多肽(N-多肽)和兩個外部多肽(C-多肽)組成並由接鏈結合的五螺旋束(見圖1a)。此蛋白被稱為五螺旋蛋白。這個五螺旋蛋白具有與天然gp41同樣的內核(都由三個N-螺旋組成)，但僅有兩個C-螺旋，因此在gp41的C-螺旋部位產生了一個空位點(見圖1b)。五螺旋蛋白上的這個空位點對gp41 C-螺旋具有高親和力。為此，發明人建議這個五螺旋蛋白可能有許多不同的用途，包括作為膜融合抑制劑，HIV疫苗以及篩選其它抑制劑的工具。
五螺旋蛋白的初步分析數據提示雖然它本身比N-螺旋穩定，但對許多想要開發的用途來說，五螺旋蛋白還不夠穩定。由於其N-末端和C-末端仍然開放，此五螺旋蛋白可能容易鬆開並失去其構象。該構象的必要性不僅在於與gp41的C-區結合，還體現在與小分子抑制劑結合及激發抗HIV感染的中和性抗體等其它方面。因此，本發明人推理如果五螺旋蛋白的兩端都被閉鎖，其穩定性和溶解度都將大大改善，從而使其更適於上述提議的用途。
本發明提供了一個末端閉鎖的五螺旋蛋白，該蛋白的組成為HIVgp41的三個N-螺旋和兩個C-螺旋，以及四個內部接鏈和一或兩個末端接鏈；這些螺旋由內部接鏈結合在一起，並由一個末端接鏈結合到一個螺旋上，該末端接鏈能與四個內部接鏈中的一個形成交鏈。
上文所述的「N-螺旋」和「C-螺旋」分別指多肽序列相應於HIV gp41亞基的N-多肽部分和C-多肽部分。
上文所述的「五螺旋蛋白」指通過基因工程產生的蛋白，它包括三個N-螺旋和兩個C-螺旋，並通過內部接鏈連在一起。
上文所述的「末端閉鎖的五螺旋蛋白」指由一或兩個末端接鏈連接的五螺旋蛋白；該末端接鏈又與其中一個內部接鏈交叉結合在一起。該五螺旋蛋白的閉鎖可以發生在任何一端或雙端。
蛋白是由一些胺基酸經肽鍵聯接而成的，肽鍵則是通過一個胺基酸的α-羧基與另一個胺基酸的α-氨基反應形成的。如上所述，「交鏈」指非肽鍵的其它化學鍵。這些化學鍵可以是共價鍵、離子鍵或具有類似強度的其它鍵。
上文所述的「內部接鏈」指聯接兩個螺旋(最好是N-螺旋和C-螺旋)的接鏈。
上文所述的「末端接鏈」指僅僅聯接一個螺旋(最好是N-螺旋)並能與其中一個內部接鏈交叉聯接的接鏈。
只要可以保留末端閉鎖的五螺旋蛋白的構象並形成內部接鏈和末端接鏈之間交鏈，不論是內部接鏈還是末端接鏈都可具有任意長度或組成。接鏈最好是由胺基酸殘基組成。
只要保留與HIV gp41蛋白與C-多肽區結構互補的表面(最好是能與C-多肽區結合)，此末端閉鎖的五螺旋蛋白的胺基酸序列可被改變。為進一步增加此蛋白的穩定性和水溶性，改變序列也許有必要。
在本發明所首選的具體表述中，此五螺旋蛋白的組成如下(從N-到C-)一個N-末端接鏈，第一個N-螺旋，第一個內部接鏈，第一個C-螺旋，第二個內部接鏈，第二個N-螺旋，第三個內部接鏈，第二個C-螺旋，第四個內部接鏈，第三個N-螺旋，以及一個C-末端接鏈；其中N-末端接鏈與第二個或第四個內部接鏈形成交鏈，並且C-末端接鏈與第一個或第三個內部接鏈形成交鏈。
在本發明所首選的具體表述中，兩個末端接鏈均由胺基酸殘基組成。這些接鏈的長度可從一個胺基酸殘基到幾個胺基酸殘基不等，但最好多於一個胺基酸。換言之，這些接鏈最好是多肽。末端接鏈的長度應隨著與之交鏈的內部接鏈的長度而改變。內部接鏈和末端接鏈的長度應長到可在接鏈間形成化學鍵並能保持五螺旋蛋白構象的程度。另一方面，這些接鏈還應短至能以反向方式」鎖住」N-多肽和C-多肽的程度。如果這些接鏈太長，交鏈將不能防止N-多肽和C-多肽的解聚。
根據本發明首選的具體表述，該五螺旋蛋白的末端接鏈通過胺基酸殘基側鏈的相互作用與內部接鏈交鏈。被交鏈的胺基酸殘基可為末端接鏈或內部接鏈中任何位置的胺基酸殘基。但更為理想的是，內部接鏈被交鏈的胺基酸殘基應位於內部接鏈的中間，而末端接鏈被交鏈的胺基酸殘基最好是末端胺基酸殘基。末端接鏈及其相應的內部接鏈應至少有一個能形成側鏈交鏈的胺基酸殘基。
交鏈也能在內部接鏈中的胺基酸殘基側鏈與末端接鏈中的末端胺基酸的α-羧基或α-氨基之間形成。
根據本發明首選的進一步具體表述，此末端閉鎖的五螺旋蛋白的末端接鏈通過一個共價鍵與內部接鏈形成交鏈。
根據本發明首選的最佳具體表述，五螺旋蛋白的末端接鏈通過一個很強的共價鍵——二硫鍵與內部接鏈形成交鏈。在兩個半胱氨酸殘基的側鏈之間形成的二硫鍵(S-S)是在一個或兩個多肽的兩個不同片段中的最常見的交鏈方式。兩個半胱氨酸殘基的硫醇基(SH)被氧化形成二硫基(S-S)，從而導致兩個半胱氨酸殘基被聯在一起，形成為所謂的胱氨酸(Cys-S-S-Cys)。
二硫鍵能在一個分子內(即一個單多肽鏈內)形成，也可在分子間(即兩個多肽鏈之間)形成。分子內二硫鍵能穩定蛋白的三級結構，而分子間的二硫鍵則涉及蛋白四級結構的穩定性。二硫鍵的數量越多，蛋白受洗滌劑、熱等其它影響而導致變性的可能性就越小。因此，將一些二硫鍵引入五螺旋蛋白應能增加其在體內和在體外的穩定性。
二硫鍵的形成發生在真核細胞的內質網和原核生物的胞質間隙。二巰基硫羥基的取代和二硫鍵的形成是由硫羥-二巰氧化還原酶催化的。在真核細胞中，此過程由蛋白二硫基同化酶(PDI)所催化；原核生物的催化酶則為dsbA。PDI和dsbA的活性部位與硫基還原酶的活性部位具有結構類似的結構。
氧化是形成二硫鍵的必要條件。真核細胞的內質網比外周的細胞漿的氧化程度高。這種高氧化環境是靠氧化型穀胱甘肽與還原型穀胱甘肽之間的高比率來維持的。因此，真核細胞的大多數分泌蛋白都有二硫鍵，而大部分胞漿蛋白則無二硫鍵。由於缺乏還原勢來維持硫原子的還原性，細胞外蛋白中的半胱氨酸殘基通常由二硫鍵交鏈。因此，末端閉鎖的五螺旋蛋白既可用於細胞外的條件，也可用於體外條件。
各種氧化劑如氧(空氣)、二甲亞碸、氧化型穀胱甘肽、氰鐵酸鉀及三氟乙醯鉈都曾被用於巰基-二硫基的轉化。在體外，半胱氨酸殘基的氧化和二硫鍵的形成可由空氣中的氧氣來催化。另一方面，雖然二硫鍵是一種很強的共價鍵，但它卻能被象β-巰基乙醇(HSCH2CH2OH)這樣適當的還原劑所破壞。為了抑制純化中二硫鍵的形成，可加入抗壞血酸(維生素-C)或二硫赤蘚糖醇(DTT)，以防止半胱氨酸被空氣中的氧所氧化。因此，可用適當的氧化劑和還原劑來控制五螺旋蛋白中二硫鍵的形成。
如上所述，基於棒狀融合蛋白的結構信息，可以用各種方式在每端引入兩個半胱氨酸來使N-末端和C-末端閉鎖。半胱氨酸的引入也可通過其它方式來實現，但下述設計更為理想。
如圖2所描述，在一個末端閉鎖的五螺旋蛋白的頂端，在N-末端接鏈上的半胱氨酸與第二個內部接鏈上的半胱氨酸配對。在尾端，C-末端接鏈的半胱氨酸與第三個內部接鏈上的半胱氨酸配對。
根據該應用的一種具體表述，此末端閉鎖的五螺旋蛋白具有序列編碼為SEQ ID NO.1，並如下所示MCGGGSQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQASGGSGGSWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLSGGCGGSQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQASGGCGGSWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLSGGSGGSQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQASGGGC(SEQ ID NO.1)以上是單字碼序列，且劃線部份代表末端接鏈和內部接鏈。
在帶有靈活內部接鏈的每端或一末端的兩個半胱氨酸之間的距離應足夠近，才能形成以共價鍵聯接的二硫鍵，從而使末端閉鎖。由於內部接鏈和末端接鏈的靈活性和長度，二硫鍵的形成應該不改變蛋白的構象。此外，這些接鏈的長度不應長至將N-末端和C-末端鎖到一起的程度。因此，末端閉鎖的五螺旋蛋白束將能保持摺疊狀態，以便有效地增加其穩定性和水溶性。
要想合成含二硫鍵的蛋白，可首先用基因工程技術產生含半胱氨酸的序列，然後再將硫醇基氧化形成二硫鍵。如果只有一對半胱氨酸，二硫鍵的形成將很簡單。如果有一對以上的半胱氨酸，二硫鍵的形成就變得複雜起來。如果要將五螺旋蛋白的兩端閉鎖，需要兩對半胱氨酸。可按下述方法來避免半胱氨酸的錯配。先合成蛋白，再用尿素打開，並用DTT等還原劑來防止半胱氨酸被空氣中的氧所氧化。然後除去尿素，進行直接稀釋或凝膠過濾。在蛋白被摺疊後，兩個二硫鍵就形成了，這是因為在此棒狀蛋白每端的每對半胱氨酸都離得很近。如圖2所闡明，在五螺旋蛋白正確摺疊及接鏈長度適當的條件下，只能形成所想要的二硫鍵，蛋白末端也將被正確地閉鎖。
Ellman試驗可用來測量殘留硫醇基的數量，從而監測半胱氨酸的氧化及二硫鍵形成的程度，反向色譜(RP-HPLC)可用來監測氧化的進度。
可用常規技術來克隆相應於上述設計蛋白的基因編碼，並將其以可溶性蛋白或包涵體的形式表達到細菌、昆蟲細胞、酵母或哺乳動物細胞中。如果以包涵體的形式表達蛋白，可將包涵體溶於8M尿素或6M鹽酸胍，加5mM DTT，並通過直接稀釋，逐漸透析或凝膠過濾的方法將蛋白重新摺疊。只有在正確穩定的蛋白重新摺疊後，二硫鍵才能形成。可加入鐵鹽來促進蛋白內二硫鍵的形成。
末端閉鎖的五螺旋蛋白內的交鏈也可以是二硫鍵之外的共價鍵。例如，交鏈可在一個原膠原蛋白分子內發生，兩個賴氨酸殘基被氧化成醛基賴氨酸，一個醛，然後再縮合成lysinonorleucine(在原膠原蛋白分子的非螺旋N-區形式)。賴氨酸的氧化是由賴氨醯氧化酶催化的。隨著賴氨酸被引入末端接鏈及相應的內部接鏈，可在適宜的條件下用此交鏈閉鎖並穩定五螺旋蛋白。
半胱氨酸以外的胺基酸殘基之間的交鏈可能不會自發形成。在五螺旋蛋白被合成後，可能要用化學試劑和酶來進一步處理，才能形成交鏈和末端閉鎖的蛋白。
這些重組蛋白可被用於(但不局限於)下述一些方面末端閉鎖的五螺旋蛋白可被用作融合抑制劑來阻止病毒入侵。業已證明，末端閉鎖的五螺旋蛋白能抑制HIV與宿主細胞膜融合(見實施例3)。由於這些重組蛋白既穩定又可溶，它們本身就能作為候選藥物來阻止病毒膜融合。這些蛋白將通過注射途徑來給藥。
末端閉鎖的五螺旋蛋白可被用於疫苗。這些重組蛋白具有象天然病毒融合蛋白那樣高度守恆的抗原決定部位。用這些重組蛋白引發的抗體將攻擊天然病毒的表面蛋白，從而抵禦病毒對宿主細胞的感染。
末端閉鎖的五螺旋蛋白也可被用作篩選抗愛滋病藥物的工具。這些可溶性重組蛋白還被用作藥物靶物來鑑別和設計抑制病毒進入細胞的藥物。例如，這些可溶性重組蛋白可被用作高通量分子文庫篩選小分子抑制劑的靶物。可以用某種技術產生被標記的HIV gp41的C-多肽(例如在C-多肽的一端進行螢光標記)。通過監測帶標記的C-多肽與末端閉鎖的五螺旋蛋白之間結合力的幹擾程度，可篩選大容量小分子文庫，從而發現小分子藥物導物。
雖然人類感染絲狀病毒、Ebola病毒、Marburg病毒是比較罕見的，但由此引起的出血熱與高死亡率有關。基因組測序已鑑別出四個Ebola病毒的亞型，它們分別為Zaire、Sudan、Ivory Coast和Reston。它們的單包膜糖蛋白(GP)被合成為單鏈前體，並一起被翻譯及運轉到內質網腔，然後在內質網腔形成三聚體。在翻譯之後，它們又被切割成與HIV的gp120和gp41相似的兩條鏈(GP1 and GP2)。GP2融合亞基的外表區域也是具有高度α-螺旋性及棒狀構象的三聚體。然而GP2本身的內核並不穩定。設計HIV gp41抑制劑的策略也可被用來設計穩定可溶的GP2抑制劑，因為這些抑制劑的結構與GP2的內核相仿。這些基因工程蛋白也能被用作阻斷Ebola病毒的抑制劑，用作引發對抗Ebola病毒感染免疫反應的疫苗，以及用作鑑別和設計抑制Ebola病毒進入細胞的藥物的靶物。
上述同樣策略也適於下述藥物的設計抗流感病毒HA2亞基的藥物，抗SV5副黏液病毒的F1亞基的藥物，以及MuMoLV、HTLV和SIV等逆病毒的TM亞基。在所有這些情況下，融合糖蛋白都形成一個棒狀的α-螺旋束。五螺旋蛋白束的N-末端和C-末端都能閉鎖，從而使其穩定可溶，這與通過引入半胱氨酸來形成二硫鍵來模仿其相應的內核很相似。
下面提供幾個實施例來進一步闡明，但這些例證並不旨在限定本發明的範圍。
2.蛋白表達編碼該末端閉鎖的五螺旋蛋白的片段進一步亞克隆至pRSET(Invitrogen)表達載體，並導入大腸桿菌BL21 DE3/pUBS。在LB/氨苄培養基和37°的條件下，當A595＝0.5時，加入0.1mM IPTG，細胞繼續在37°下培養3小時。然後在每分鐘5000轉離心速度下離心15分鐘。倒掉上清夜，剩下的沉澱物放在負20°下保存。
3.蛋白打開細菌在PBS溶液中用超聲打粹，可溶部分在每分鐘6000轉(T.45 rotor，Beckman)離心40分鐘。包涵體(Inclusion bodies)用PBS/0.5％ TritonX-100洗3次，再用PBS洗1次，然後溶解於8M的尿素和5mM DTT中。稀釋該溶液至1mg/ml，加熱至100度，保持30分，然後室溫置放30分使蛋白完全打開。
4.純化/再摺疊和末端閉鎖使用膠透色譜Superdex-75過濾柱(Pharmacia)，用PBS緩衝液，在pH7.0的條件下將蛋白再摺疊並純化。通過膠透色譜，蛋白緩衝液可交換。去掉尿素，蛋白將再摺疊。只有當杆狀蛋白適當的再摺疊，位於末端接鏈與另一個內部接鏈之間的雙硫鍵才會自動形成。
色譜分離柱洗脫的特徵峰參見圖3。峰值出現在13.5毫升，這同基於23.4kD的末端閉鎖的五螺旋蛋白分子量而計算出的洗脫體積相一致。這說明末端閉鎖的五螺旋蛋白是可溶的，且再摺疊結構正確。實施例2 末端閉鎖的五螺旋與GP41的穩定性比較末端閉鎖的五螺旋蛋白的CD色譜(見圖4)是在濃度為1mg/ml，PBS緩衝液，pH7.0的條件下，及20℃和1毫米的小杯裡，用帶溫電控制器的AVIV623DS spectro-polarimeter記錄的。它表現了典型的α-螺旋結構的CD譜，這就是預期的末端閉鎖的五螺旋蛋白再摺疊後的α-螺旋束結構。
熱力學穩定性的測定範圍在25-95℃，CD的波長222nm，濃度為0.4mg/ml(見圖5a和5b)。天然gp41的6個α-螺旋束(N36胺基酸殘基35-70；C34胺基酸殘基117-150)是在PBS緩衝液，pH7.0的條件下測定的，而末端閉鎖的五螺旋蛋白是在PBS緩衝液並含3M GuHCl，pH7.0的條件下測定的。濃度是用色譜OD值為280，消光係數59 580/M/cm條件下確定的。而天然型gp41(N36C34)在PBS溶液中的熔點僅53℃，而末端閉鎖的五螺旋蛋白在含3M的GuHCl的PBS溶液中的熔點為69℃，遠比天然型gp41的熔點高。所以末端閉鎖的五螺旋蛋白比天然型gp41更穩定。這項實驗進一步證明末端閉鎖的五螺旋蛋白正確地再摺疊，並且末端雙硫鍵已形成。實施例3 末端閉鎖的五螺旋蛋白對HIV病毒的抑制活性末端閉鎖的五螺旋蛋白對HIV病毒的抑制活性是通過HIV螢光素酶鑑定法而確定的。病毒是通過用HIV-1的染色體(含經移碼突變env和替代nef基因(NL43LucR-E-)的螢光素酶基因)和含有HXB2或JRFL gp160基因的pCMV-HXB2或PEBB-JRFL表達載體一同轉染到293T細胞來產生的。因為染色體上缺少env基因，病毒感染後只能存活一代。細胞殘片用低速離心去除。上清液中的病毒用來感染HOS-CD4(HXB2)或者HOS-CD4-CCR5(JRFL)細胞(來自N.Landau，美國NIH愛滋病試劑中心)。感染兩天後，裂解細胞，測定螢光素酶的活性。IC50值(半量病毒被抑制的末端閉鎖的五螺旋蛋白的濃度)是把數據擬合Langmuir方程式來計算的，[y＝k/(1+[末端閉鎖的五螺旋蛋白]/IC50)]，其中y＝螢光素酶的活性，k是定標常數。
為了測定末端閉鎖的五螺旋蛋白對gp41介導的細胞膜融合的抑制，我們使用的方法是如上所述的病毒-細胞融合鑑定法(見圖6所示)。在病毒-細胞融合鑑定法中，末端閉鎖的五螺旋蛋白對HIV HXB2病毒(實三角)的EC50值是15.03+/-1.41nM；而對HIV JRFL病毒(實方型)的EC50值是0.75+/-0.11nM。在治療愛滋病過程中最主要的問題是由於HIV病毒高突變性而產生的耐藥性。我們使用的末端閉鎖的五螺旋蛋白源於HIVHXB2(該病毒使用CXCR4為輔助受體)。而末端閉鎖的五螺旋蛋白對以CCR5為輔助受體的HIV JRFL的抗病毒活性更強。所以末端閉鎖的五螺旋蛋白具有廣譜的抗HIV病毒活性。
序列表110 周根發120 末端閉鎖的五螺旋蛋白及其用途130 PF020076CNI Deng Dingji，Zhongzi Law Office160 1170 PatentIn version 3.1210 1211 215212 PRT213 人類免疫缺陷病毒220221 DISULFID222 (2)..(215)223 與殘基87配對的殘基2；與殘基215配對的殘基130400 1Met Cys Gly Gly Gly Ser Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln1 5 10 15Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu20 25 30Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly35 40 45Ser Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile50 55 60His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln65 70 75 80Glu Leu Leu Ser Gly Gly Cys Gly Gly Ser Gln Leu Leu Ser Gly Ile85 90 95Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala lle Glu Ala Gln Gln His100 105 110Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Ser Gly115 120 125Gly Cys Gly Gly Ser Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr130 135 140Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu145 150 155 160Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Leu165 170 175Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu180 185190Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu195 200 205Gln Ala Ser Gly Gly Gly Cys210 21權利要求
1.一種末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特徵在於，它由HIV gp41蛋白的三個N-螺旋和兩個C-螺旋，以及四個內部接鏈和一或兩個末端接鏈所組成；這些內部接鏈將五個螺旋連接在一起，並且連接在某個螺旋的末端接鏈又與上述四個內部接鏈中的一個內部接鏈形成交鏈。
2.如權利要求1所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特徵在於，它的組成如下一個N-末端接鏈，第一個N-螺旋，第一個內部接鏈，第一個C-螺旋，第二個內部接鏈，第二個N-螺旋，第三個內部接鏈，第二個C-螺旋，第四個內部接鏈，第三個N-螺旋，以及一個C-末端接鏈；其中，N-末端接鏈與第二個或第四個內部接鏈形成交鏈，並且C-末端接鏈與第一個或第三個內部接鏈形成交鏈。
3.如權利要求2所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特徵在於，它的末端接鏈和內部接鏈均由胺基酸殘基組成。
4.如權利要求3所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特徵在於，它的末端接鏈和內部接鏈的交鏈是通過胺基酸殘基側鏈的相互作用而成。
5.如權利要求4所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特徵在於，它的末端接鏈和內部接鏈的交鏈的相互作用是通過共價健而成。
6.如權利要求5所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特徵在於，它的末端接鏈和內部接鏈的交鏈的共價健是二硫鍵。
7.如權利要求1所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特徵在於，它的組成如下第一個N-螺旋，第一個內部接鏈，第一個C-螺旋，第二個內部接鏈，第二個N-螺旋，第三個內部接鏈，第二個C-螺旋，第四個內部接鏈，第三個N-螺旋，以及一個C-末端接鏈；其中，C-末端接鏈與第一個或第三個內部接鏈形成交鏈。
8.如權利要求1所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特徵在於，它的組成如下一個N-末端接鏈，第一個N-螺旋，第一個內部接鏈，第一個C-螺旋，第二個內部接鏈，第二個N-螺旋，第三個內部接鏈，第二個C-螺旋，第四個內部接鏈，第三個N-螺旋；其中，N-末端接鏈與第二個或第四個內部接鏈形成交鏈。
9.一種末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特徵在於，它具有的序列編碼為SEQ ID NO.1。
10.權利要求1至9的任一項所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白用於製造針對HIV病毒、流感病毒、Ebola病毒、SV5副粘液病毒以及MuMoLV逆病毒、HTLV逆病毒和SIV逆病毒中任一種病毒的抗病毒疫苗或抗病毒化合物的用途。
全文摘要
本發明提供一種末端閉鎖的五螺旋蛋白，它由HIV gp41蛋白的三個N－螺旋和兩個C－螺旋，以及四個內部接鏈和一或兩個末端接鏈組成；這些內部接鏈將五個螺旋連接在一起，並且連接在某個螺旋的末端接鏈又與上述四個內部接鏈中的一個內部接鏈形成交鏈。並且，該末端閉鎖的五螺旋蛋白的序列編碼為SEQ ID NO.∶1。本發明可作為HIV膜融合的抑制劑；也可作為藥物靶物來篩選小分子抑制劑；以及作為結構明確並具有完整抗原決定部位的免疫原來開發疫苗。
文檔編號A61K38/16GK1410448SQ0214600
公開日2003年4月16日 申請日期2002年10月23日 優先權日2002年10月23日
發明者周根發 申請人:周根發