具有抗癌活性的核桃素及其製備方法和應用的製作方法

2023-06-25 23:00:06 1

專利名稱：具有抗癌活性的核桃素及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種具有抗癌活性的核桃素及其製備方法和應用。
背景技術：
胡桃科核桃屬(J"g〖cmsL)植物，全世界約18種，主要分布於北溫帶，我 國有5種，其枝、葉、外果皮、根皮、堅果內核及果仁可入藥。核桃對泌尿系統 結石、慢性氣管炎、皮炎、溼疹及痢疾等疾病療效很高；核桃及核桃楸的未成熟 果實或外果皮(青龍衣)具有清熱、解毒、止痢、明目的功效；該屬植物普遍具 有抗菌、抗腫瘤、鎮痛和清除自由基等藥理活性。
國內外研究表明截至目前從核桃屬植物中分離得到50多種化合物，其中萘醌 及其苷類、二芳基庚垸及其苷類化合物具有較強的抗癌及抗氧化活性。

發明內容
本發明的目的在於提供一種具有抗癌活性的新化合物核桃素和該化合物的 製備方法和應用。。
我們首次從核桃青皮中提取分離的二芳基庚垸類新化合物核桃素，具有抗癌 活性。
一種具有抗癌活性的核桃素，其特徵在於核桃素為二芳基庚烷類化合物，
具有C2qH2404的分子式，化學結構式用式(I )表示
MeO、 a z
OH
本發明提供的化合物核桃素的化學結構經過UV、 IR、 'HNMR、 13CNMR、 DEPT、 COSY、 HMQC、 HMBC、 HR-ESIMS、 X-ray等現代光譜及波譜技術的鑑定得到確認並具有以下理化常數和譜學特徵
C20H24O4，無色結晶，M.P. 182-183°C， [ ]g+7。(0.5， MeOH); HR-ESIMS:
m/z - 346.2049 [M+NH4]+， <:2必280^的計算值為346.2018; UV (MeOH) . max (Log )nm 256 (3.96)， 286(3.85)， 298 (3.81); IR(KBr) 脂xcm": 3382， 2931， 1619， 1595， 1503， 1412; CD (c = 0.0005， MeOH)」 (nm): +33.0 (206)， +16.0 (225)， -40.3 (238)， -43.9 (252)， -7.9 (272)， -38.0 (297)。 NMR譜和'3C NMR i普數據如下:'H畫R (400 MHz, CDC13, ppm): 6.75 (1H, s, H-5), 2.88 (1H, dd, / =2.0, 14.8 Hz， H-7a), 2.46 (1H, dd, J= 2.0, 14.8 Hz, H-7b), 1.93 (1H, m, H-8a), 1.65 (1H, m, H-8b), 1.80 (1H, m, H-9a), 1.43 (1H， m， H-9b)， 1.77 (1H, m, H-10a)， 1.54 (IH, m, H-lOb), 4.00 (1H, brt， /= 2.8, 9.8 Hz, H-ll), 2.22 (1H， dd ■/= 2.8, 13.8 Hz, H-12a), 1.70 (IH, dd, /= 2.8， 13.8 Hz, H-12b)， 2.91 (IH, dd， J= 2.4, 17.7 Hz, H-Da), 2.80 (IH, dd, /= 2.4, 17.7 Hz), 7.02 (IH， (!(!, /= 7.2, 2.4 Hz， H-15), 6.82 (IH, d, J = 7.2 Hz, H-16), 7.21 (IH, d， ■/ = 2.4 Hz， H-18)， 6.77 (1H， s， H-19)， 3.83 (3H， s, CH30-4)。 13C NMR (100 MHz, CDC13, ppm): 125.5 (C-l), 125.6 (C-2), 140.2 (C-3), 148.0 (C-4), 111.2 (C-5), 130.9 (C-6), 30.0 (C-7), 26.4 (C-8), 22.7 (C-9), 39.5 (C-10), 67.3 (C-ll), 34.5 (C-12), 26.5 (C-13), 130.8 (C-14), 129.4 (C-15), 116.2 (C-16), 151.4 (C-17), 133.6 (C-18), 125.4 (C-19), 55.6 (CH3。-4)。
X單晶衍射數據晶體呈無色透明塊狀晶體，衍射實驗用晶體大小為
0.20x0.40x0.50mm，屬正交晶系，空間群為P2"A，晶胞參數.=8.136(1)， .=10.432(1)， . = 24.171(1)A。晶胞體積V:2051.5(3)A3，晶胞內分子數Z:4。 本發明的核桃素的製備方法，其特徵在於包含原料採集加工、浸膏提取、分 離純化三個步驟
A、 原料釆集加工採集核桃青皮或核桃枝葉，乾燥，粉碎；
B、 浸膏提取步驟採用70 — 95 Q/。(V/V)乙醇對原料冷浸或回流熱提得總浸
膏；
C、 分離純化步驟總浸膏用水混懸，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇進
行液液分配萃取得到Fa、 Fb、 Fc三個組分；FB組分用石油醚和丙酮以不同體積比
例混和組成的溶劑，按極性從小到大，梯度洗脫，進行普通矽膠柱色譜分離，收 集板性在6:1的組分Fb2; FB2以石油醚和丙酮按體積比4:1混和溶劑重新進行柱色
5譜分離得核桃素粗品，以石油醚和丙酮按體積比2:1組成的混和溶劑重結晶得到 核桃素。
一種含有抗癌活性的核桃素的注射劑的製備方法，其特徵在於核桃素為二 芳基庚烷類化合物，具有C2H2404的分子式，化學結構式用式(I )表示
該方法按以下步驟進行
A、 核桃素溶解在乙醇中，機械攪拌下加入氫氧化鈉或者氫氧化鉀溶液使成 鹽，待鹽類析出後過濾，無水乙醇洗滌，乾燥得到核桃素的鹽類化合物；
B、 核桃素的鹽類化合物溶解在注射溶媒中形成溶液，調節溶液的pH值，使 其在4.5 — 9範圍內，加入活性炭攪拌脫色，過濾，灌封，高壓滅菌。
本發明通過體外、體內的藥理實驗表明核桃素具有較強的抗癌活性。
本發明的優點在於
1、 從核桃青皮中提取分離到具有抗癌活性的化合物核桃素。
2、 按本發明提供的製備方法，提取分離製備核桃素，工藝簡單，方法可靠， 產率高，化合物純度好。
3、 按本發明提供的製備方法，製備核桃素的注射劑，方法簡單，製劑穩定， 便於臨床使用。


圖1為式I化合物核桃素的分子晶體結構立體圖。 圖2為式I化合物核桃素分子沿a軸方向的晶胞堆積圖
具體實施例方式
為了更清楚地理解本發明，以下結合實施例對本發明作進一步的說明，但本 發明不限於以下實施例。實施例l:核桃青皮中核桃素的提取分離
A、 原料採集加工步驟採集核桃青皮適量，陰乾，適當粉碎。
B、 浸膏提取步驟取核桃青皮5kg，加入8倍量95%乙醇，冷浸(7dx3)， 過濾，減壓回收溶劑得總浸膏200g。
C、 分離步驟將200 g浸膏渾懸於1000 ml水中，用300 ml石油醚(60-90。C ) 萃取3次，回收溶劑的浸膏FA20 g，剩餘物用300 ml乙酸乙酯萃取3次，回收 溶劑得浸膏FB30g，剩餘物用300 ml正丁醇萃取3次得浸膏FD40 g。將乙酸乙 酷Fb部分浸膏用30g矽膠(100-200目)拌樣，600 g矽膠(200-300目)上普 通玻璃層析柱，石油醚(60-90°C):丙酮(10:1 -2:1)進行梯度洗脫，500ml為 一流份，回收溶劑，用薄層色譜在紫外燈(UV)下或噴以5%的硫酸乙醇溶液， 加熱顯色後合併相同組分，得FB,(4g， 10:1)、 FB2(5g， 6:1)、 FB3(3g， 2:1)、三 個組分。組分Fb2用5 g矽膠(100-200目)拌樣，40 g矽膠(200-300目)上 普通玻璃層析柱，石油醚(60-90'C):丙酮(4:l)洗脫，用薄層色譜在紫外燈(UV) 下或噴以5°/。的硫酸乙醇溶液，加熱顯色後合併相同組分得核桃素25 mg。
實施例2:核桃青皮中核桃素的提取分離
A、 原料採集加工步驟採集核桃青皮適量，陰乾，適當粉碎。
B、 浸膏提取步驟取核桃青皮5kg，加入10倍量95%乙醇，回流熱提(2 hx3)，過濾，減壓回收溶劑得總浸膏250g。
C、 分離步驟將250g浸膏渾懸於1000ml水中，用300ml石油醚(60-9(TC) 萃取3次，回收溶劑的浸膏30g。將浸膏用40 g矽膠(100-200目)拌樣，400 g 矽膠(200-300目)上普通玻璃層析柱，石油醚(60-90°C):丙酮(10:1 -2:1) 進行梯度洗脫，500ml為一流份，回收溶劑，用薄層色譜在紫外燈(UV)下或 噴以5%的硫酸乙醇溶液，加熱顯色後合併相同組分，得Fl(5g， 10:1)、 F2(10 g， 8:1)、 F3 (7 g， 6:1)、 F4 (20 g, 2:1)四個組分。組分F3用5 g矽膠(100-200目) 拌樣，40 g矽膠(200-300目)上普通玻璃層析柱，石油醚(60-卯。C ):丙酮(6:1) 洗脫，用薄層色譜在紫外燈(UV)下或噴以5%的硫酸乙醇溶液，加熱顯色後 合併相同組分得核桃素30 mg。
實施例3:核桃素對人肝癌細胞HepG2和人肝癌細胞BEL—7402的體外細 胞毒作用A、 製備人肝癌細胞株HepG2和人肝癌細胞BEL—7402的懸液0.25%胰蛋 白酶消化，用培養液配成8xl(^個細胞/ml細胞懸液；接種細胞每孔10p L接
種於96孔板中；
B、 預培養37°C， 5。/。C02及飽和溼度下培養24h;
C、 將藥物核桃素按0.2、 0.4、 0.6、 1.2、 1.6、 2.0 mol/ml濃度加藥，每 孔100 L，每個濃度設三個復孔。37°C， 5。/。C02及飽和溼度下繼續培養24h;
D、 24h後，取出培養板，每孔加入50% (質量/體積)的三氯乙酸(TCA) 50 L 固定細胞，TCA的終濃度為10%，加在每孔液面上，在4。C冰箱中放置lh;培 養板各孔用去離子水洗滌5次，去除TCA，在空氣中乾燥後，每孔加0.4%的 SRB100 L，室溫下放置10-30min，棄去各孔內液體後用1%乙酸洗滌5次， 去除未結合的染料，空氣中乾燥後用pH為10.5， 10mmol/L三羥甲基胺基甲烷 溶解，在平板振蕩器上振蕩5 min，在酶聯免疫檢測儀490 nm波長下測定OD值， 用空白對照調零，將所獲腫瘤細胞生長抑制率定義為藥物對腫瘤細胞的體外抑制 率。測定藥物核桃素C對人肝癌細胞株HepG2和人肝癌細胞BEL—7402的IC50 分別為0.025 mol/ml和0.03^ mol/ml。
實施例4:核桃素的二鈉鹽及其注射劑的製備
A、 500 mg核桃素加熱溶解在100 ml 95%乙醇中，機械攪拌下點滴加入4 ^的氫氧化鈉溶液3ml，攪拌。
B、 待核桃素的鈉鹽析出白色固體後，抽濾，無水乙醇20 ml洗滌3次，幹 燥後即得產物539mg，產率95%。
C、 核桃素二鈉鹽240 mg，溶解在10ml的生理鹽水中，用4%的氫氧化鈉 溶液調節pH準確測定在8.9，加入含量在0.2%的活性碳，攪拌脫色，抽濾，灌 封，高壓滅菌。
實施例5:核桃素對小鼠S180肉瘤體內抑瘤活性
A、 S180帶瘤動物的移植和接種取傳代接種後9-10d齡S180荷瘤小鼠，無 菌抽取小鼠腹腔內瘤細胞，置於冰水浴，用冰冷的生理鹽水(含100U/ml青黴素和 100mg/L鏈黴素)將抽取的S180細胞濃度調至1.0xl(^個/ml。在小鼠右前肢腋窩皮 下注射0.2 ml冷卻的細胞懸液，細胞總數為2.0><106個/只。
B、 分組及給藥將接種了S180的小鼠按體重隨機分為5組，每組16隻，即
8模型對照組、HT低劑量組、HT中劑量組、HT高劑量組。另設空白對照組，空白 對照組不接種腫瘤細胞，每日ip.生理鹽水；模型對照組，每日ip.生理鹽水；低、 中、高劑量組，每日分別以15mg/kg、 30mg/kg、 60mg/kg的劑量ip.核桃素二鈉鹽 注射劑；陽性對照組，每2日i.p.環磷醯胺(CTX)—次，劑量為30mg/kg。連續給藥 12天，第13天全部小鼠頸椎脫臼處死，取瘤塊稱重，按下式計算抑瘤率抑瘤率 (%)=(模型對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重)/模型對照組平均瘤重><100%。
C、結果經統計分析，核桃素二鈉鹽對S180肉瘤的抑瘤率分別為高劑量組 66.1%，中劑量組45.7%，低劑量組19.5%。該結果表明核桃素C對小鼠S180肉瘤 有一定的抑制作用，對S180荷瘤小鼠的體重增長、肝指數、腎指數、胸腺指數、 脾臟指數均沒有明顯影響。
權利要求
1、一種具有抗癌活性的核桃素，其特徵在於核桃素為二芳基庚烷類化合物，具有C20H24O4的分子式，化學結構式用式(I)表示
2、 如權利要求l所述核桃素的製備方法，其特徵在於包含原料採集加工、浸 膏提取、分離純化三個步驟A、 原料採集加工採集核桃青皮或核桃枝葉，乾燥，粉碎；B、 浸膏提取步驟採用70—95 c/。(V/V)乙醇對原料冷浸或回流熱提得總浸C、 分離純化步驟總浸膏用水混懸，依次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇進 行液液分配萃取得到Fa、 FB、 Fc三個組分；FB組分用石油醚和丙酮以不同體積比例混和組成的溶劑，按極性從小到大，梯度洗脫，進行普通矽膠柱色譜分離，收集扱性在6:1的組分Fb2; FB2以石油醚和丙酮按體積比4:1混和溶劑重新進行柱色 譜分離得核桃素粗品，以石油醚和丙酮按體積比2:1組成的混和溶劑重結晶得到 核桃素。
3、 一種含有抗癌活性的核桃素的注射劑的製備方法，其特徵在於核桃素為二芳基庚烷類化合物，具有C2H2404的分子式，化學結構式用式(I )表示formula see original document page 2( I )該方法按以下步驟進行A、 核桃素溶解在乙醇中，機械攪拌下加入氫氧化鈉或者氫氧化鉀溶液使成 鹽，待鹽類析出後過濾，無水乙醇洗滌，乾燥得到核桃素的鹽類化合物；B、 核桃素的鹽類化合物溶解在注射溶媒中形成溶液，調節溶液的pH值，使其在4.5—9範圍內，加入活性炭攪拌脫色，過濾，灌封，高壓滅菌。
全文摘要
本發明公開了一種具有抗癌活性的核桃素及其製備方法和應用。核桃素為二芳基庚烷類化合物，具有C20H24O4的分子式，化學結構式用式(I)表示。通過體內外藥理活性研究表明該化合物具有較強的抗癌活性，可望開發以核桃素為原料的抗癌新藥。
文檔編號C07C43/00GK101456797SQ200710305980
公開日2009年6月17日 申請日期2007年12月13日 優先權日2007年12月13日
發明者柳軍璽, 邸多隆, 黃新異 申請人:中國科學院蘭州化學物理研究所