新的土壤微生物、從所述土壤微生物分離的新氧化還原酶、編碼所述氧化還原酶的基因和...的製作方法
2023-06-25 18:55:21 1
專利名稱：新的土壤微生物、從所述土壤微生物分離的新氧化還原酶、編碼所述氧化還原酶的基因和 ...的製作方法
技術領域：
本文內容涉及一種從土壤分離的新的微生物，從所述微生物分離的氧化還原酶，以及利用上述物質將各種植物糖苷去糖基化並產生各種糖苷配基的方法。
背景技術：
人參(Panax ginseng C.A.Meyer)是一種草藥,在亞洲國家包括朝鮮、中國和日本其通常用於多種疾病的治療和預防。人參皂苷是人參的主要活性成分，已知具有多種生理活性，包括在中樞神經系統、心血管系統和免疫系統中的抗衰老活性、抗炎活性、抗氧化活性、抗糖尿病活性和抗腫瘤活性。迄今為止，已經分離並鑑定出超過40種人參皂苷。人參皂苷(其是具有包括糖苷配基的達瑪烷結構的糖苷)大致上可以分為原人參萜二醇和原人參萜三醇。屬於原人參萜二醇類的人參皂苷主要是Rbl、Rb2、Rc和Rd，屬於原人參萜三醇類的人參皂苷主要是Re和Rgl(參見
圖1和圖2)。 吸收後，人參皂苷通過腸道微生物代謝，已知代謝產物具有多種生理活性。例如，典型的基於原人參萜二醇的皂苷Rbl、Rb2和Re被人腸道微生物代謝為CK，基於原人參萜三醇的皂苷Re和Rgl被腸道微生物代謝為Rhl或F1，進而顯示多種生理活性。已知CK誘導預防腫瘤侵襲和形成的抗轉移或抗癌功效。並且，據報導與糖附著的對應物Rh2相比，其糖苷配基PH) (S)具有更高的生理活性。因此，已經研究將人參皂苷轉化為具有更少糖的代謝物。除了酶促法之外，已經報導了使用弱酸的水解，使用鹼的降解等等。但是，因為這些方法誘導數種副反應諸如差向異構、水合、羥化等等，所以最近研究了使用酶、腸道微生物等等轉化為活性人參皂苷的方法。但是，大部分報導的微生物是厭氧腸道微生物，在工業應用中存在限制。此外，因為大部分酶缺乏將人參皂苷轉化為糖苷配基的活性並具有它們自己的特異性，它們只適用於特定人參皂苷的生產。儘管到目前為止已對通過腸道微生物將人參皂苷Rbl的代謝物生物轉化為CK進行了大量研究，但對其糖苷配基的產生幾乎沒有研究。並且，據報導，在皂苷主鏈上具有一個糖的人參皂苷不再被微生物的酶所降解。已知糖苷配基形式的人參皂苷更容易被吸收入血流並作為活性化合物起作用。此外，作為多種人參皂苷骨架的糖苷配基的產生將為所需人參皂苷類型的特定生產提供基礎技術。因此，需要探索參與人參皂苷糖苷配基產生的酶。
發明內容
技術問題本文內容涉及提供一種新的微生物，從所述微生物分離的顯示去糖基化活性的一種新的氧化還原酶和一種使用編碼所述氧化還原酶的基因和重組蛋白產生多種人參皂苷糖苷配基、異黃酮糖苷配基或類黃酮糖苷配基的方法。技術方案在一個一般方面，提供新的根瘤菌(Rhizobium sp.)GIN611 (KCTC11708BP)或其細胞提取物。在另一個一般方面，提供一種使用根瘤菌GIN611或其細胞提取物作為生物催化劑將天然產物去糖基化的方法。在另一個一般方面，提供一種使用根瘤菌GIN611或其細胞提取物作為生物催化劑從多種糖苷產生糖苷配基的方法。在另一個一般方面，提供具有SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶或包括所述氧化還原酶的細胞提取物。在另一個一般方面，提供編碼具有SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶的DNA，具有SEQ ID N02序列的DNA，包括具有SEQ ID N02序列的DNA的重組DNA載體，用包括具有SEQ ID N02序列的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞或包括用包括具有SEQ ID N02序列的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞的細胞提取物。在另一個一般方面，提供一種與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的氧化還原酶或包括所述氧化還原酶的細胞提取物。在另一個一般方面，提供一種使用生物催化劑將天然產物去糖基化的方法，所述生物催化劑選自:具有SE Q ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶，包括具有SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶的細胞提取物，用包括DNA (其編碼具有SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶)的重組DNA載體轉化的宿主細胞，包含用包括DNA (其編碼具有SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶)的重組DNA載體轉化的宿主細胞的細胞提取物，用重組DNA載體(其包括具有SEQ ID N02序列的DNA)轉化的宿主細胞，用重組DNA載體(其包括具有SEQ ID N02序列的DNA)轉化的宿主細胞的細胞提取物，用包括DNA(其編碼與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的蛋白)的重組DNA載體轉化的宿主細胞，包括用包括DNA (其編碼與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的蛋白)的重組DNA載體轉化的宿主細胞的細胞提取物，與SEQID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的氧化還原酶，和包括與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的氧化還原酶的細胞提取物。在另一個一般方面，提供一種使用生物催化劑從多種糖苷產生糖苷配基的方法，所述生物催化劑選自:具有SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶，包括具有SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶的細胞提取物，用包括DNA (其編碼具有SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶)的重組DNA載體轉化的宿主細胞，包括用包括DNA(其編碼具有SEQ IDN03的胺基酸序列的氧化還原酶)的重組DNA載體轉化的宿主細胞的細胞提取物，用重組DNA載體(其包括具有SEQ ID N02序列的DNA)轉化的宿主細胞，用重組DNA載體(其包括具有SEQ ID N02序列的DNA)轉化的宿主細胞的細胞提取物，用包括DNA(其編碼與SEQ IDN03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的蛋白)的重組DNA載體轉化的宿主細胞，包括用包括DNA(其編碼與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的蛋白)的重組DNA載體轉化的宿主細胞的細胞提取物，與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的氧化還原酶，和包括與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的氧化還原酶的細胞提取物。在另一個一般情況下，提供一種製備以下物質的方法:根瘤菌GIN611的細胞提取物，包括具有SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶的細胞提取物，包括用包括DNA(其編碼具有SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶)的重組DNA載體轉化的宿主細胞的細胞提取物，包括用包括DNA (其具有SEQ ID N02的序列)的重組DNA載體轉化的宿主細胞的細胞提取物，或包括氧化還原酶(其與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性)的細胞提取物，包括通過添加人參皂苷來誘導酶表達。有益效果通常，已知人參皂苷去糖基化酶屬於葡糖苷酶家族。本發明人發現屬於氧化還原酶家族但不屬於葡糖苷酶家族的一種酶對人參皂苷具有去糖基化活性。這種新的氧化還原酶在序列上完全不同於先前已知的去糖基化酶，與氧化還原酶家族的酶具有序列相似性，並在天然存在的糖苷中通過氧化糖來誘導自發的去糖基化。附圖描述圖1顯示基於原人參職二醇(PPD)的人參阜苷。圖2顯示基於原人參職三醇(PPT)的人參阜苷。圖3描述了一種反應，其中通過去糖基化從人參皂苷化合物K(CK)產生糖苷配基PPD (S)。圖4顯示新的氧化還原酶的活性分析結果。星號代表氧化的CK，三角形代表PPD(S)0色譜圖3顯示3小時反應的結果，色譜圖4顯示12小時反應的結果。底物CK的量隨著時間減少，其中間物(氧化的CK)增加然後減少，其終產物PPD(S)始終隨著時間增加。 圖5顯示圖4中分析的氧化CK的質量分析結果。圖6比較在完全培養基和M9/人參皂苷培養基中表達的蛋白的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳結果。圖7顯示比較從在完全培養基和M9/人參皂苷培養基中培養的細胞獲得的蛋白反應性的結果。圖8顯示利用人參皂苷作為碳源生長的新的土壤微生物根瘤菌GIN611的16S DNA序列。圖9顯示由根瘤菌GIN611產生的氧化還原酶的胺基酸序列及編碼其的基因序列。圖10顯示新的氧化還原酶的反應機理。圖11顯示新的氧化還原酶對於多種人參皂苷和異黃酮的反應性分析結果。可以看出所述酶對葡萄糖具有特異反應性。圖12顯示測量camelliaside A和camelliaside B混合物的去糖基化活性的結
果O圖13顯示測量淫羊藿苷去糖基化活性的結果。最佳方式本文內容使用的術語是相關領域常用的那些，可以被本領域技術人員容易地理解。簡單描述其中一些術語。(I)人參皂苷:人參的活性成分。
(2)化合物K (CK): 20-0- β -D-吡喃葡糖基_20 (S)-原人參萜二醇。(3)人參阜昔Rh2:3_0_ β-D-卩比喃匍糖基-20 (S)-原人參職二醇。(4)人參皂苷F2:3-0- ( β -D-吡喃葡糖基)-20-0- ( β -D-吡喃葡糖基)-20⑶原
人參萜二醇。(5)人參皂苷Rbl:3-0-[(i3-D-吡喃葡糖基)(1，2)-β- -吡喃葡糖基]-20-0-[ ( β -D-卩比喃匍糖基)(1，6) - β -D-卩比喃匍糖基]~20 (S)原人參職二醇。(6)人參皂苷Rb2:3-0-[(i3-D-吡喃葡糖基)(I, 2)-β-D-吡喃葡糖基]-20-0-[(a -L-吡喃阿拉伯糖基)(1，6)-β -D-吡喃葡糖基]_20 (S)原人參萜二醇。(7)人參皂苷Rc:3-0-[(^-D-吡喃葡糖基)(I, 2)-β-D-吡喃葡糖基]-20-0-[(a -L-阿拉伯呋喃糖基)(1，6)-β -D-吡喃葡糖基]_20 (S)原人參萜二醇。(8)人參皂苷Rb3:3-0-[(i3_D-吡喃葡糖基)(1，2)-β- -吡喃葡糖基]-20-0-[ ( β -D-卩比喃木糖基)(1，6) - β -D-卩比喃匍糖基]~20 (S)原人參職二醇。(9)人參皂苷Fl: 20-0- β -D-吡喃葡糖基-20⑶-原人參萜二醇。(10)人參皂苷Re:6-0-[a-L-吡喃鼠李糖基(1，2)-@_D-吡喃葡糖基]-20-0- ( β -D-吡喃葡糖基)-20 (S)-原人參萜三醇。(11)大豆苷:黃苷元7-0-β-D-糖苷。
(12) PPD (S): 20 (S)-原人參萜二醇。(13)化合物Y:20-0-[(a-L-吡喃阿拉伯糖基)(I，6) - β-D-吡喃葡糖基]-20⑶
原人參萜二醇。(14)化合物Mc: 20-0- [( a -L-阿拉伯呋喃糖基)(1，6) - β -D-吡喃葡糖基]-20 (S)原人參萜二醇。(15)化合物Mx:20-0-[(i3-D-吡喃木糖基)(l，6)-13_D-吡喃葡糖基]-20⑶原
人參萜二醇。(16) PPT (S): 20 (S)-原人參萜三醇。(17)人參皂苷Rg2:6-0_[ a -L-吡喃鼠李糖基(1，2) - β -D-吡喃葡糖基]-20 (S)-原人參萜三醇。(18)黃苷元:7-羥基-3-(4-羥苯基)色烯_4_酮。(19)淫羊藿苷:3，4』，5，7_四羥基_8_異戊烯基黃酮_4』-Me乙醚-3-0-alpha-L-吡喃鼠李糖苷，7-0-beta-D-吡喃葡糖苷。(20)Camelliaside A:茨非醇3_0_(2_0_卩比喃半乳糖基-6-0-卩比喃鼠李糖基)批
喃葡糖苷。(21)Camelliaside B:茨非醇3_0_(2_0_卩比喃木糖基-6-0-卩比喃鼠李糖基)卩比喃
葡糖苷。(22)甘油栓:粘附到糖苷上的糖分子。(23)全細胞反應:使用全細胞且不破壞細胞或分離酶的反應。(24)氧化還原酶:催化為生物體提供能量必需的氧化和還原反應的酶。有機化合物的大部分氧化通過脫氫作用發生。(25)氧化還原酶提取物:包括通過破壞根瘤菌GIN611的細胞獲得的氧化還原酶或表達所述氧化還原酶的重組蛋白的細胞提取物。
(22)MALD1-T0F質譜:基質輔助雷射解吸電離飛行時間質譜。(26)HPLC:高效液相層析。(27)PCR:聚合酶鏈式反應；一種特異性擴增DNA區域的技術。(28) ORF:開放讀框；在起始密碼子和終止密碼子之間的序列。(29)克隆:一種技術，將DNA片段插入重組DNA克隆載體並使用獲得的重組DNA轉化宿主細胞。(30) bp:鹼基對。本文內容提供新的微生物根瘤菌GIN611或其細胞提取物。本文內容的發明人已經選擇出利用多種人參皂苷的混合物作為碳源生長的微生物並證實所述微生物具有利用人參皂苷CK作為底物的反應性。在一個實施方案中，本文內容提供一種使用根瘤菌GIN611或其細胞提取物作為生物催化劑將天然產物去糖基化的方法。天然產物可以是人參皂苷糖苷、異黃酮糖苷或類黃酮糖苷，但不限於此。在另一個實施方案中，本文內容提供一種使用根瘤菌GIN611或其細胞提取物作為生物催化劑從糖苷產生各種糖苷配基的方法。天然產物可以是人參皂苷糖苷、異黃酮糖苷或類黃酮糖苷，但不限於此。糖苷配基可以是人參皂苷糖苷配基、異黃酮糖苷配基或類黃酮糖苷配基，但不限於此。
人參皂苷糖苷不特別限定，但可以選自例如人參皂苷化合物K(CK)、人參皂苷Rh2、人參皂苷F2、人參皂苷Rb 1、人參皂苷Rb2、人參皂苷Re、人參皂苷Rb3、人參皂苷Fl和人參皂苷Re。特別地，其可以是人參皂苷化合物K(CK)。人參皂苷糖苷配基不特別限定，但可以選自例如人參皂苷Pro (S)、人參皂苷化合物Y、人參皂苷Me、人參皂苷化合物Mx、人參皂苷PPT (S)和人參皂苷Rg2。特別地，其可以是人參皂苷PPD (S)。人參皂苷糖苷和人參皂苷糖苷配基概述於表I。表I
權利要求
1.新的根瘤菌61恥110((1'(117088 )。
2.權利要求I的根瘤菌GIN611的細胞提取物。
3.一種利用權利要求I的根瘤菌GIN611或權利要求2的細胞提取物作為生物催化劑將天然產物去糖基化的方法。
4.權利要求3的將天然產物去糖基化的方法，其中所述天然產物是人參皂苷糖苷、異黃酮糖苷或類黃酮糖苷。
5.權利要求3的將天然產物去糖基化的方法，其中所述天然產物選自人參皂苷化合物K(CK)、人參皂苷Rh2、人參皂苷F2、人參皂苷Rb I、人參皂苷Rb2、人參皂苷Re、人參皂苷Rb3、人參阜苷F1、人參阜苷Re、大豆苷、淫羊藿苷、camelliaside A和camelliaside B。
6.權利要求3的將天然產物去糖基化的方法，其中所述去糖基化的天然產物的糖選自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖，並且所述糖通過氧化降解。
7.權利要求6的將天然產物去糖基化的方法，其中通過氧化葡萄糖殘基的3-羥基(OH)基團將葡萄糖降解。
8.一種從人參皂苷糖苷、異黃酮糖苷或類黃酮糖苷產生人參皂苷糖苷配基、異黃酮糖苷配基或類黃酮糖苷配基的方法，所述方法使用權利要求I的根瘤菌GIN611或權利要求2的細胞提取物作為生物催化劑。
9.一種氧化還原酶，其包含SEQ ID N03的胺基酸序列。
10.一種細胞提取物，其包括權利要求9的氧化還原酶。
11.一種DNA，其編碼權利要求9的氧化還原酶。
12.權利要求11的DNA，其包含SEQID N02的序列。
13.一種重組DNA載體，其包含權利要求11或12的DNA。
14.一種用權利要求13的重組DNA載體轉化的宿主細胞。
15.一種細胞提取物，其包括權利要求14的宿主細胞。
16.一種氧化還原酶，其與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有對天然產物的去糖基化活性。
17.權利要求16的氧化還原酶，其中所述天然產物是人參皂苷糖苷、異黃酮糖苷或類黃酮糖苷。
18.權利要求16的氧化還原酶，其中所述天然產物選自人參皂苷化合物K(CK)、人參皂苷Rh2、人參皂苷F2、人參皂苷此1、人參皂苷此2、人參皂苷此、人參皂苷此3、人參皂苷卩1、人參阜苷Re、大豆苷、淫羊藿苷、camelliaside A和camelliaside B。
19.權利要求16的氧化還原酶，其中所述糖選自葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和木糖，並且所述糖通過氧化降解。
20.權利要求16的氧化還原酶，其從人參皂苷糖苷、異黃酮糖苷或類黃酮糖苷產生人參皂苷糖苷配基、異黃酮糖苷配基或類黃酮糖苷配基。
21.權利要求16的氧化還原酶，其中所述氧化還原酶來源於土壤桿菌屬(Agrobacterium sp.)、鞘氨醇桿菌屬(Sphingobacterium sp.)或狹長平胞屬(Stenotrophomonas sp.)。
22.一種細胞提取物，其包括權利要求16的氧化還原酶。
23.一種使用生物催化劑將天然產物去糖基化的方法，所述生物催化劑選自包括SEQID N03的胺基酸序列的氧化還原酶，包括包含SEQID N03的胺基酸序列的氧化還原酶的細胞提取物，用包含編碼包含SEQID N03的胺基酸序列的氧化還原酶的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞，包括用包含編碼包含SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞的細胞提取物，用包含括SEQ ID N02的序列的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞，用包含包括SEQ ID N02的序列的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞的細胞提取物，用包含編碼與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的蛋白的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞，包括用包含編碼與SEQ IDN03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的蛋白的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞的細胞提取物，與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的氧化還原酶，以及包括與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的氧化還原酶的細胞提取物。
24.權利要求23的將天然產物去糖基化的方法，其中所述天然產物是人參皂苷糖苷、異黃酮糖苷或類黃酮糖苷。
25.權利要求23的將天然產物去糖基化的方法，其中所述天然產物選自人參皂苷化合物K(CK)、人參皂苷Rh2、人參皂苷F2、人參皂苷Rb I、人參皂苷Rb2、人參皂苷Re、人參皂苷Rb3、人參阜苷F1、人參阜苷Re、大豆苷、淫羊藿苷、camelliaside A和camelliaside B。
26.權利要求23的將天然產物去糖基化的方法，其中所述去糖基化的天然產物的糖是葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖或木糖，並且所述糖通過氧化降解。
27.一種使用生物催化劑從人參皂苷糖苷、異黃酮糖苷或類黃酮糖苷產生人參皂苷糖苷配基、異黃酮糖苷配基或類黃酮糖苷配基的方法，所述生物催化劑選自包含SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶，包括包含SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶的細胞提取物，用包含編碼包含SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞，包括用包含編碼包含SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞的細胞提取物，用包含包含SEQ IDN02的序列的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞，用包含包含SEQ IDN02的序列的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞的細胞提取物，用包含編碼與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的蛋白的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞，包括用包含編碼與SEQID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的蛋白的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞的細胞提取物，與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的氧化還原酶，以及包含與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的氧化還原酶的細胞提取物。
28.一種製備下列細胞提取物的方法，包括通過添加人參皂苷來誘導酶表達根瘤菌GIN611的細胞提取物，包括包含SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶的細胞提取物，包括用包含編碼包含SEQ ID N03的胺基酸序列的氧化還原酶的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞的細胞提取物，包括用包含包括SEQ ID N02的序列的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞的細胞提取物，包括用包含編碼與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的蛋白的DNA的重組DNA載體轉化的宿主細胞的細胞提取物，或包含與SEQ ID N03的序列具有至少60%的序列相同性並具有去糖基化活性的氧化還原酶的細胞提取物。
全文摘要
本發明涉及新的根瘤菌GIN611KCTC11708BP或其細胞提取物，顯示糖酵解活性的新氧化還原酶，編碼所述氧化還原酶的基因，包括重組載體蛋白的重組菌株，或編碼重組蛋白的表達載體，以及使用上述物質作為生物催化劑將天然產物糖酵解的方法。本發明還涉及一種使用上述物質從各種天然產物產生糖苷配基的方法。從本發明新的微生物分離的新氧化還原酶不屬於葡糖苷酶類，但屬於氧化還原酶類，並具有針對天然產物的糖酵解活性。新的氧化還原酶氧化天然產物糖苷配基中的糖，從而產生各種糖苷配基。
文檔編號C12N9/02GK103237884SQ201180038765
公開日2013年8月7日 申請日期2011年6月14日 優先權日2010年6月14日
發明者樸葰星, 金德嬉, 金漢坤, 金恩美, 金秉祺 申請人:株式會社愛茉莉太平洋, 首爾大學校產學協力團