一種抗蛋白質粘附塗層的製備方法與流程
2023-06-26 08:22:36 3
本發明涉及一種對蛋白質具有抗粘附作用的新型分子PEG-HQ(寡乙二醇功能化苯酚)電化學聚合塗層的製備方法。
背景技術：
蛋白質的非特異性吸附現象是生物傳感、生物醫學及生物材料等諸多領域中的一個重要問題，這些蛋白質的非特異性吸附能帶來很多的危害，如生物傳感探頭檢測失準、失效及修飾膜的生物垢堵塞；隱形眼鏡的汙染；血液在輸液導管上的凝結；蛋白分離過程中濾膜的阻塞以及海洋生物在船體上的吸附等。當生物材料或相關產品移入體內時，蛋白質的非特異性吸附會誘發體內生物排異反應、血栓形成、細菌繁殖與炎症反應等諸多嚴重問題。此外，用於生物傳感與細胞分析領域的一個普遍性的問題是除需在傳感器表面修飾對生物標記物或細胞表面受體具選擇性反應的分子外，不可避免地會遇到待測複雜體系中存在可與傳感器表面非特異性背景相互作用的問題，如何消除這種與生物分子或細胞的非特異性相互作用是一大挑戰。因此，開發抗蛋白質粘附塗層、特別是在導電傳感器表面快速形成抗蛋白質與細胞粘附的塗層對生物傳感、生物醫學及生物材料等領域具有重大意義。在眾多的抗蛋白粘附材料中，聚乙二醇(PEG)，具有生物兼容性好、無毒、免疫原性低等特點。在美國已經得到FDA(Food and Drug Administration)批准用於人體內。目前用在生物傳感領域防止蛋白質粘附最多的一類方法是經自組裝的方式，將帶有硫醇或二硫化物的寡乙二醇，經化學作用吸附到光滑的金表面。該方法不僅所適用的金屬材料種類有限、金表面必須光滑，且所形成塗層的穩定性亦有限。電化學聚合或電接枝方法可在所有導電基體上修飾不同的基團或分子及聚合物塗層，且經調控電化學參數等，可獲得厚度可調控、穩定的塗層。在導電基體上用電化學方法修飾一定的基團後、經化學耦合的方法便可接上抗蛋白吸附的PEG。可更為理想與方便的是經一步電化學反應在電極上修飾含PEG的分子。在文獻″Electrografting of Poly(ethylene glycol)Acrylate:A One-Step Strategy for the Synthesis of Protein-Repellent Surfaces，Angew.Chem.2005,117,5641–5645″中，Sabine Gabriel等首次提出了通過含丙烯酸(A)可電聚合基團的PEG，A-PEG單體，經一步電聚合在導電基體上接枝PEG的方案，並實驗證實該方案所形成的含PEG塗層可有效地防止蛋白質吸附。這是目前唯一報導的一步法在導電基體上電接枝PEG的方法，可該方法電聚合條件苛刻，需在含四乙銨高氯酸鹽的二甲基甲醯胺(DMF)有機溶劑中、很高的陰極電位(-1.5到-2.5V)下經電化學還原來進行。所製備的膜是否無毒、生物相容不得而知，至少在該電聚合條件下不利於與生物活性小分子的共電聚合。在本專利申請中，我們合成了含可電聚合苯酚基團的寡乙二醇分子PEG-HQ(寡乙二醇功能化苯酚)。苯酚及其衍生物可在非常溫和的化學與電化學條件下在導電基底上形成薄的(10-100nm)、穩定塗層。因此含有苯酚基團的PEG-HQ可以通過綠色的電化學法在導電基底上快速成膜得到抗蛋白質粘附塗層。同時，該溫合條件允許PEG-HQ與含有電聚合基團的生物活性小分子共電化學聚合、從而構成具選擇性反應的生物傳感界面和具選擇性細胞粘附的界面。
技術實現要素：
本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種抗蛋白質粘附塗層的製備方法。
為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為：
抗蛋白質粘附塗層的製備方法包括如下步驟：
(1)按如下合成線路合成單體PEG-HQ：
(2)將單體PEG-HQ分散在磷酸緩衝溶液中，得到PEG-HQ的混合溶液；PEG-HQ在PEG-HQ的混合溶液中的濃度為0.1mM—0.3mM；
(3)採用工作電極-對電極-參比電極的三電極體系對所述PEG-HQ的混合溶液進行電化學聚合，得到聚PEG-HQ修飾的工作電極，即，得到修飾在電極上的抗蛋白質粘附的聚PEG-HQ塗層。
其中，步驟(2)中所述磷酸緩衝溶液的pH值為4—8，優選pH值為7.4；磷酸緩衝溶液的濃度優選為0.1mol/L。步驟(3)中所述工作電極為導電及半導體基底電極，所述導電及半導體基底電極為導電塑料、ITO電極、QCM電極、貴金屬電極、金屬電極、合金電極、碳材料電極等中的任意一種；如採用碳材料時，將玻碳電極在拋光布上用氧化鋁粉末進行拋光，依次用無水乙醇和水在超聲波清洗器中洗淨備用；所述對電極為鉑片電極；所述參比電極為飽和甘汞電極。步驟(3)中所述電化學聚合是循環伏安掃描或恆電位沉積。
所述循環伏安掃描時的掃描電位為0至2.0V，掃描速度為1-500mV/s；在循環伏安掃描中，掃描電位達到PEG-HQ出現氧化峰，隨後多次循環伏安掃描得到聚PEG-HQ的修飾電極；優選的掃描電位範圍為0-1.0V；優選的掃描速率為20mV/s，優選的循環圈數為11圈。
所述恆電位沉積時的電位為0.8至2.0V，沉積時間為5—3600s。優選的沉積電位為1.0V，優選的沉積時間為30s。
本發明提供了一種抗蛋白質粘附塗層，合成工藝簡單溫和、綠色、環保，快捷，而且聚PEG-HQ塗層的厚度可以自由調控，並能應用於不同大小和幾何形狀的所有導電與半導體材料表面。
附圖說明
圖1為PEG-HQ的MS圖；
圖2為PEG-HQ的MNR-C圖；
圖3為PEG-HQ的MNR-H圖；
圖4為PEG-HQ的FT-IR圖；
圖5為玻碳電極修飾聚PEG-HQ前後和聚PEG-HQ修飾的玻碳電極粘附BSA後的在2mmol/L鐵氰化鉀+0.1mol/L硫酸鈉溶液中的伏安循環圖；掃描速率:0.1V/s；
圖6為玻碳電極修飾聚PEG-HQ前後和聚PEG-HQ修飾的玻碳電極粘附BSA後的在2mmol/L鐵氰化鉀+0.1mol/L硫酸鈉溶液中的電化學交流阻抗圖；交流阻抗參數：100kHz-0.001Hz,10mV rms,0.2V vs.SCE.。
具體實施方式
實施例1
按照圖1所示合成路線合成PEG-HQ。
將PEG-HQ分散在磷酸緩衝溶液中,PEG-HQ在磷酸緩衝溶液中的濃度0.2mM，緩衝溶液的pH值為7.4，得到PEG-HQ混合溶液。
以玻碳電極(GCE)為工作電極、對電極為鉑片電極、參比電極為飽和甘汞電極，置於所述PEG-HQ混合溶液進行循環伏安掃描，掃描電位為0V至1.0V，掃描速度為20mV/s，掃描圈數為11圈，得到聚PEG-HQ修飾的電極，即在工作電極上得到抗蛋白質粘附塗層。
實施例2
實施例2與實施例1的不同之處在於以ITO電極為工作電極、對電極為鉑片電極、參比電極為飽和甘汞電極，置於所述PEG-HQ混合溶液中進行循環伏安掃描，掃描電位為0V至0.8V，掃描速度為20mV/s，掃描圈數為15圈，得到PEG-HQ修飾的電極，即在工作電極上得到抗蛋白質粘附塗層。
實施例3
實施例3與實施例1的不同之處在於PEG-HQ在磷酸緩衝溶液中的濃度0.3mM，以金電極為工作電極、對電極為鉑片電極、參比電極為飽和甘汞電極，置於所述PEG-HQ混合溶液中進行恆電位沉積，沉積電位為1.0V，沉積時間為30s，得到PEG-HQ修飾的電極，即在工作電極上得到抗蛋白質粘附塗層。
實施例4
實施例4與實施例1的不同之處在於PEG-HQ在磷酸緩衝溶液中的濃度0.1mM，以導電塑料為工作電極、對電極為鉑片電極、參比電極為飽和甘汞電極，置於所述PEG-HQ混合溶液中進行恆電位沉積，沉積電位為1.1V，沉積時間為120s，得到PEG-HQ修飾的電極，即在工作電極上得到抗蛋白質粘附塗層。
實施例1中PEG-HQ的表徵如圖1至圖4所示；聚PEG-HQ塗層的抗蛋白質粘附效果如圖5、圖6所示。如圖5所示，修飾了聚PEG-HQ的玻碳電極粘附BSA後與粘附BSA前相比，電流值變化很小，表明聚PEG-HQ具有良好的抗蛋白質粘附效果；如圖6所示，修飾了聚PEG-HQ的玻碳電極粘附BSA後與粘附BSA前相比，電化學交流阻抗值也變化很小，同樣表明聚PEG-HQ具有良好的抗蛋白質粘附效果。