青藏高原野生大麥HsCIPK26基因的製作方法
2023-06-25 23:21:36 1
專利名稱：青藏高原野生大麥HsCIPK26基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及涉及基因工程技術領域，尤其是一種青藏高原野生大麥HsCIH^e基因。
背景技術：
目前，在已完成基因組測序工作的植物中，相關學者已從擬南芥中鑑定出沈個 AtCIPKs, 31個水稻OsCII3Ks, 43個玉米ZmCII3Ks, 27個胡楊PtCII3Ks,其他如棉花、番茄、葡萄、高粱等物種中也有相繼報導。根據已有的研究結果，植物cira主要參與各種逆境脅迫的信號傳導。由於目前大麥基因組測序仍未完成，無法確定其含有多少個HsCira基因，但理論上野生大麥基因組中至少應包含31個HsCIPKs基因家族成員。從基因結構上來看， AtCira基因分為多內含子基因和少內含子基因，通過轉錄表達和功能分析表明，Cira基因是否含有內含子與其對應的逆境脅迫沒有明顯關係。已有研究表明CBL與Cira之間並不是簡單的一對一關係，一個CBL可以與多個CII3K相結合，多個CBL也可以和一個CII3K互作， 一種脅迫可能引起多種CBL-CII3K互作。已有的研究證明，AtCIPKH基因可能參與糖信號調節途徑，0sCIPK2, OsCIPKlO, OsCIHQ 1和OsCII3KH基因在高鹽、低溫等逆境下表達量都有不同程度的變化，可能參與了多條逆境信號轉導途徑。表達序列標籤(expressed sequence tags，EST)是對某個基因cDNA克隆測序所得的部分序列片段，長度大約為200-600bp由於基因表達調控作用不同，同一個基因的 mRNA剪接位點和方式不同，所以同一個基因的全長cDNA可能包含多個EST。EST既代表了基因cDNA的某一區段，也表徵了成熟mRNA可能的剪接方式。電子克隆技術是生物學資料庫中EST資料庫、核酸序列資料庫、基因組資料庫，採用同源性序列比對和歸類分析、重疊區域組裝和拼接等方法延長EST序列，直至沒有與之同源的序列可供拼接為止，所得到的序列可以認為是相對應基因的全長cDNA，根據所得的cDNA序列設計囊括開放閱讀框兩端的引物，進行RT-PCR克隆出相應基因的方法。轉座子標籤法，DNA亞克隆，電子克隆(Cloning In Silico)，Tail-PCR, iPCR(InversePCR)，TD-PCR(Touchdown-PCR)，RACE (cRACE、3，-RACE,5' -RACE)等技術都是分子克隆中常用的技術。此外隨著轉座子的深入研究及測序技術的飛躍發展，直接分離鑑定新基因的難度變得越來越小。
發明內容
本發明利用水稻OsCira同源基因序列設計電子探針，從已有的各種大麥核苷酸序列庫如EST庫中搜索同源片段，然後用聚類分析和電子拼接等方法，獲取目標基因編碼序列(coding sequence，⑶S)。運用生物信息學方法對目標基因進行結構分析和功能預測。 提取野生大麥總RNA，製備cDNA和設計PCR引物，通過PCR技術克隆目標基因。對所獲得的目標基因進行TA克隆、測序和序列分析。青藏高原野生大麥HsCIH^e基因，源於青藏高原一年生野生大麥且它是植物所特有、與CBL特異作用的一類絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，其由SEQ ID NO :1的核苷酸序列定義。所述的青藏高原野生大麥HsCIH^e基因，它在N端有一特異的催化結構域，C端區域含有一個獨特的21-M個胺基酸組成的調節域即NAF結構域，這兩個調節域的序列在所有CII3K中高度保守，，所述的青藏高原野生大麥HsCIH^6基因，其編碼SEQ ID NO :2定義的胺基酸序列本發明從青藏高原一年生野生大麥(Hordeum spontoneum C. Koch)中鑑定並分離出HsCIPI^6基因。
圖1為HsCIH^6電泳結果；圖2為pMD18T: :HsCIPK26陽性克隆鑑定結果；圖3為青藏高原一年生野生大麥HsCIH^e基因的蛋白結構；圖4為青藏高原一年生野生大麥HsCIH^e基因的全序列；圖5本發明技術路線圖。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發明進行詳細說明。實施例1HsCIH^6基因全序列的獲得1. 1引物設計(帶下劃線的為酶切位點序列)HsCIPK26-KpnI"F :CGGGGTACCATGGAAGACAGGAGTGTTTTGACCAAACHsCIPK26-XbaI-R :TGCTCTAGATTATTGTGGCAGTGGGGAGAAAGATTTG表1反應體系
權利要求
1.青藏高原野生大麥HsCIH^e基因，其特徵在於源於青藏高原一年生野生大麥且它是植物所特有、與CBL特異作用的一類絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，其由SEQ ID N0:1的核苷酸序列定義。
2.根據權利要求1所述的青藏高原野生大麥HsCIH^e基因，其特徵在於它在N端有一特異的催化結構域，C端區域含有一個獨特的21-M個胺基酸組成的調節域即NAF結構域， 這兩個調節域的序列在所有Cira中高度保守，，所述的青藏高原野生大麥HsCIH^e基因， 其編碼SEQ ID NO :2定義的胺基酸序列。
全文摘要
本發明公開了青藏高原野生大麥HsCIPK26基因，其由SEQID NO1的核苷酸序列定義。利用水稻OsCIPK同源基因序列設計電子探針，從已有的各種大麥核苷酸序列庫如EST庫中搜索同源片段，然後用聚類分析和電子拼接等方法，獲取目標基因編碼序列(coding sequence，CDS)。運用生物信息學方法對目標基因進行結構分析和功能預測。提取野生大麥總RNA，製備cDNA和設計PCR引物，通過PCR技術克隆目標基因。對所獲得的目標基因進行TA克隆、測序和序列分析。
文檔編號C12N15/29GK102168090SQ20101060156
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月23日 優先權日2010年12月23日
發明者查笑君, 潘建偉, 王文祥, 鄭仲仲 申請人:浙江師範大學