一種用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金dna探針的製作方法
2023-06-25 21:27:56 1
一種用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金dna探針的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針。其結構為在13nm納米金顆粒AuNPs上結合一個以上的特異性探針，特異性探針包括16SrRNA保守序列的互補序列、夾著16SrRNA保守序列的互補序列的互補的兩段互補的髮夾序列、以及夾著16SrRNA保守序列的互補序列和兩段互補的髮夾序列的螢光分子FAM及其淬滅基團BHQ1。使用這種特異性納米金DNA探針對尿液樣本進行檢測，相較於尿液樣本的傳統細菌檢測方法，具備顯著、快速、靈敏和特異性強的優點。
【專利說明】一種用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種納米金DNA探針，特別是涉及一種用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針。
【背景技術】
[0002]細菌性感染是全球泛發性疾病，比如肺炎、肺結核、尿路感染等等疾病都是由細菌引起，對人類的正常工作學習帶來了極大的困擾。其中細菌性尿路感染是組織系統的第二大泛發細菌性感染疾病。每一年約有七百萬病患，超過一百萬的人需要住院治療。每年用於治療該疾病的費用巨大，這對國家的經濟發展、社會生產力都造成了極大的影響，並且有很大一部分費用用於細菌的檢測，但是尿液樣本的傳統細菌檢測最主要的缺點就是耗時長，從樣品收集到獲得檢測結果約需兩天左右，培養克隆細菌是主要的耗時過程。在臨床上，因為沒有及時獲得細菌檢測結果，僅憑經驗給藥，常在臨床上出現使用藥物不當產生的不良反應和細菌耐藥性。目前，發展起來的分子檢測技術及PCR技術的應用，具有一定的優勢，但均需要擴增目標序列，不夠方便快捷(l、Journal ofclinical microbiology2009,47(8)，2405-10.2、Journal of clinical microbiology2009，47 (7)，2067-78.)。免疫印跡技術，所需要的步驟更加繁瑣(3、Genome biology2007,8 (5),R93.)。許多研究者致力於尋找一種更加快捷，靈敏的檢測方法。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是，克服現有技術的缺點，提供一種能快速、便捷、準確且檢測步驟簡單的檢測尿路感染病原菌的載體。為了解決以上技術問題，本發明提供一種用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針，該用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針的結構為13nm納米金顆粒AuNPs上結合一個以上的特異性探針。其中，特異性探針包括16SrRNA保守序列的互`補`序列、夾著16SrRNA保守序列的互補序列的互補的兩段互補的髮夾序列，夾著16SrRNA保守序列的互補序列和兩段互補的髮夾序列的螢光分子FAM及其淬滅基團BHQl。
[0004]這樣，在自然狀態下由於兩段互補的髮夾序列特異性結合，用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針的特異性探針呈環狀，螢光分子FAM及其淬滅基團BHQl相互靠近，使得螢光分子FAM淬滅，整個用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針不發光。當溫度升高時，用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針的環狀結構打開，此時遇到16SrRNA保守序列，當溫度再下降時16SrRNA保守序列的互補序列會與16SrRNA保守序列特異性結合，用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針的螢光分子FAM及其淬滅基團BHQl相互遠離，用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針發出螢光，達到檢測的目的。
[0005]本發明進一步限定的技術方案是:
[0006]前述的用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針，其髮夾序列為:5' -ACCGAGC-3'和 5' -GCT CGGT-3'。
[0007]前述的用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針，其DNA探針還包括連接序列，並通過連接序列與13nm的納米金顆粒AuNPs相連。
[0008]前述的用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針，其連接序列為5'-GAGGTC-3;。
[0009]進一步的，上述用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針，特異性探針的具體結構為:5』 - / FAM / ACCG AGC CAT CGT TTA CGG CGT GGA CTA CCA GGG GCTCGGT /BHQl / GAG GTC-3'，其中 5' -CAT CGT TTA CGG CGT GGA CTA CCA GGG-3'為 16SrRNA保守序列的互補序列。
[0010]本發明的有益效果是:(I)本發明的用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針製備方法簡單，且部分製備環節已經實現商業化，便於批量生產並投入實際運用；
(2)本發明的用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針使用方便，在RTPCR儀上即可實現檢測；(3)利用本發明用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針的檢測方法，相較於尿液樣本的傳統細菌檢測方法，具備顯著、快速、靈敏和特異性強的優點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011]圖1為本發明的特異性探針結構示意圖
[0012]圖2為本發明的檢測原理示意圖
[0013]圖3為本發明的單個`DNA探針檢測大腸桿菌極限值圖像
[0014]圖4為本發明的納米金DNA探針檢測大腸桿菌極限值圖像
【具體實施方式】
[0015]實施例1
[0016]本實施例提供了一種用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針，在13nm納米金顆粒AuNPs上結合一個以上特異性探針，該特異性探針為Y - / FAM / ACCG AGCCAT CGT TTA CGG CGT GGA CTA CCA GGG GCT CGGT / BHQl / GAG GTC-3'。其中 FAM 為一種螢光分子，BHQl為螢光分子FAM的淬滅基團，二者靠近後FAM螢光分子不發光，遠離後FAM螢光分子發光。如圖1所示，圖中以全黑圓形示意FAM螢光分子，以全黑矩形示意BHQl淬滅基團，5' -ACCG AGC-3'和5』GCT CGGT-3'是兩段互補的發卡序列，其作用是使得該特異性探針在未檢測到目標序列時呈環狀，FAM螢光分子及其淬滅基團BHQl互相靠近不發螢光。5' -CAT CGT TTA CGG CGT GGA CTA CCA GGG-3'為 16SrRNA 保守序列的互補序列，16SrRNA基因是細菌上編碼rRNA相對應的DNA序列，存在於所有細菌的基因組中。5' -GAGGTC-3'是連接序列，特異性探針通過它連接到13nm的納米金顆粒AuNPs上。
[0017]用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針的檢測原理如圖2所示，當細菌上的16SrRNA保守序列與加熱後打開環狀結構的用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針發生特異性結合，再回到常溫時也無法形成環狀結構，則FAM螢光分子發光。如若沒有16SrRNA保守序列參與，則用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針加熱後環狀結構打開，再回到常溫下又重新形成環狀結構，FAM螢光分子不發光。
[0018]用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針的特異性探針設計好以後，交由市場化運作的公司生產，所以在製備用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針時，首先，製備13nm納米金顆粒AuNPs。製備所需器皿均需要多次超聲清洗,徹底去除金屬離子。具體製備過程:(I)取9.8ml ddH20加熱煮沸(目的是去除O2) ； (2)加入200 μ I預冷的50mM HAuCl4(加入過程中伴隨晃動)；(3)加入Iml預冷的38.8mM 二水合檸檬酸三納(加入過程中伴隨晃動)；(4)煮沸IOmin(煮沸過程中伴隨晃動)；(5)在室溫超聲30min。通過在透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope, TEM)下觀察製備的金粒子形貌，可以判定製備的納米金顆粒大小約13nm。其次,將特異性探針連接到13nm納米金顆粒AuNPs上。具體連接過程:(I)取30μ 120μΜ的DNA探針加入到新鮮製備的30 μ 150mM三(2-羧乙基)膦(TCEP)中，並取10 μ 10.5Μ NaOH調節PH到5 ；⑵Ih後加入10nM13nm AuNPslOOy I ; (3) Ih 後加入 50mM PBS33 μ 1，並在室溫下超聲 10s，之後在 50°C下加熱IOmin ; (4)在室溫下連接12h，之後加入40 μ 150mM TCEP ; (5) Ih後，加入0.01 % SDS和8μ13Μ NaCl，並在室溫下超聲10s，之後在50°C下加熱IOmin ; (6)經過6h後，再次加入8μ 13M NaCl，室溫下超聲10s，之後在50°C下加熱IOmin ; (7)重複步驟(6) ； (8)在室溫下靜置連接48h。
[0019]大腸桿菌佔尿道感染病原菌的80%，為驗證本發明的有益效果，培養大腸桿菌DH5CI，並收集菌液，進行檢測，以驗證該探針的靈敏性和特異性。取培養的大腸桿菌菌液收集Iml離心，加入10 μ I裂解液和10 μ 10.5Μ NaOH破裂細胞，釋放16SrRNA，加入探針，製備RTPCR20 μ I反應體系，其中PBS終濃度為10mM。檢測過程在RTPCR儀中進行，設置程序80°C，3min，每20s降低1°C，從80°C降低到40°C。分析螢光值，納米金DNA探針在高於自身Tm值，環狀結構全部打開，隨著溫度的下降，在沒有目標序列存在的情況下，探針重新形成環狀結構，螢光基團被淬滅，沒有螢光信號出現；當出現目標序列，目標序列結合到探針上，探針不再形成環狀結構，螢光基團遠離淬滅基團，在RTPCR儀中可以檢測到螢光，對螢光值進行統計分析，以此來判 斷是否存在特異性序列，整個實驗過程可控制在Ih以內。結合圖3和圖4，對DNA探針和納米金DNA探針檢測菌液結果進行對比，表明連接納米金的DNA探針靈敏度是單獨DNA探針的IO3倍，證明該納米金探針與傳統檢測方法相比確實具有快速，靈敏度高和特異性強的特點。
[0020]除上述實施例外，本發明還可以有其他實施方式。凡採用等同替換或等效變換形成的技術方案，均落在本發明要求的保護範圍。
【權利要求】
1.一種用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針，其特徵在於:13nm納米金顆粒AuNPs上結合一個以上特異性探針,所述特異性探針包括16SrRNA保守序列的互補序列、夾著16SrRNA保守序列的互補序列的互補的兩段互補的髮夾序列、以及夾著16SrRNA保守序列的互補序列和兩段互補的髮夾序列的螢光分子FAM及其淬滅基團BHQ1。
2.根據權利要求1所述的用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針，其特徵在於:所述髮夾序列為:5' -ACCGAGC-3'和5' -GCT CGGT-3'。
3.根據權利要求1所述的用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針，其特徵在於:特異性探針還包括連接序列，並通過連接序列與13nm的納米金顆粒AuNPs相連。
4.根據權利要求3所述的用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針，其特徵在於:連接序列為5' -GAG GTC-3'。
5.根據權利要求1至4中任一所述的用於檢測尿路感染病原菌的特異性納米金DNA探針，其特徵在於:所述特異性探針為5' - / FAM / ACCG AGC CAT CGT TTA CGG CGT GGACTACCA GGG GCT CGGT / BHQl / GAG GTC-3'，其中 5' -CAT CGT TTA CGG CGT GGA CTACCAGGG-31為16S rRNA`保寸序列的互補序列。
【文檔編號】C12Q1/04GK103773842SQ201310495124
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2013年10月18日 優先權日:2013年10月18日
【發明者】劉斐, 曹靜, 劉紅蕊 申請人:南京農業大學