用於血紅蛋白和細胞分析的組合物與方法
2023-06-12 04:48:56 2
專利名稱：用於血紅蛋白和細胞分析的組合物與方法
技術領域：
本發明涉及用於手工或自動測定血樣中總血紅蛋白濃度及用於同時進行白細胞計數或白細胞亞群的分類計數的溶解劑組合物、稀釋劑以及方法。
現有技術的討論總血紅蛋白的測定是全血攜氧容量的指示。測定血樣中血紅蛋白(Hgb)的能力是診斷分析的十分重要的部分，在監控對影響血紅蛋白之疾病的療法的反應以及對針對其它疾病但可能對血紅蛋白水平產生不利影響的療法的反應中也是重要的。
正常人外周血液中的白細胞是由五種類型組成的，即，淋巴細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和嗜鹼性粒細胞。後三種類型的白細胞一起被稱作粒細胞。不同類型的白細胞具有不同的生物功能。血樣中的不同類型白細胞的計數和分類為臨床診斷提供了有價值的信息。
白細胞的分類和計數通常通過分類計數法(也稱為手工方法)進行。自動血液分析儀也常用於白細胞計數，該儀器使用溶血試劑以溶解紅細胞並製備僅包含白細胞的樣品。然後樣品混合物通過阻抗方法分析。現已開發了一種更先進的裝置，該裝置對包括淋巴樣細胞(淋巴細胞)和髓樣細胞(單核細胞和粒細胞)的不同類型的白細胞數量計數(分類計數)(Ledis等的美國專利4286963)。白細胞還被進一步區別為三種亞群，即單核細胞、淋巴細胞和粒細胞(Ledis等的美國專利4485185)。理想地，人們希望能在同一個自動步驟中完成多項診斷分析，如血紅蛋白測定和白細胞計數或白細胞亞群分類計數。
在許多用於血紅蛋白測定的已知方法中，氰化物血紅蛋白方法被國際血液學標準化委員會推薦為標準方法。Matsubara和Okuzono對該方法的改良導致其在臨床實驗室中廣泛地應用。按照該方法，在紅細胞的所有血紅蛋白形式的血紅素基的鐵離子由鐵氰化鉀氧化成高鐵血紅蛋白。然後高鐵血紅蛋白和氰陰離子(其對血紅素鐵離子具有十分高的親和性)結合，形成氰化正鐵血紅蛋白色原。這種極端穩定的色原在540nm具有最大吸光度，這可以通過紫外光譜測定法人工測定。
儘管通過標準的氰化正鐵血紅蛋白方法及其改良的自動方法形成的色原穩定，然而，由於使用氰化鉀，試劑廢物引起了巨大的環境關注。在過去十年中，人們付出了巨大的努力以開發不使用氰化物的自動血紅蛋白分析方法。
Oshiro等(臨床生物化學(Clin．Biochem．)，1583(1982))報導了一種用於血紅蛋白分析的試劑，該試劑包含十二烷基硫酸鈉(SLS)和Triton X-100(非離子型表面活性劑)，為中性pH(7．2)。SLS用於溶解紅細胞，並被認為進一步產生SLS-血紅蛋白複合物，它在539nm處具有最大吸光度並在572nm處有肩峰。反應在5-10分鐘內完成，總血紅蛋白測定是定量的。然而，如後來在Satata的美國專利5，242，832中所解釋的，使用Oshiro方法不可能在進行血紅蛋白測定的同時分析白細胞。
Sakata的美國專利5，242，832公開了用於對血樣白細胞計數並測定血紅蛋白濃度的無氰化物溶解劑。該溶解劑包含至少一種第一表面活性劑(季銨鹽)、至少一種第二表面活性劑(包括陽離子表面活性劑和兼性表面活性劑)以及至少一種選自下列化合物的血紅蛋白穩定劑Tiron、8-羥喹啉、聯吡啶、1-10-菲咯啉、酚類化合物、雙酚、吡唑及其衍生物、2-苯基5-吡唑啉酮及其衍生物、苯基3-吡唑啉酮以及咪唑及其衍生物。Sakata指出將白細胞分離成兩個或三個組(包括淋巴細胞的聚集體，單核細胞、嗜酸性粒細胞和嗜鹼性粒細胞的聚集體以及嗜中性粒細胞的聚集體)只有通過使用至少兩種適合的表面活性劑和嚴格控制表面活性劑濃度才能完成。Sakata還指出溶解劑優選的pH值是5．0-8．0。如果pH值是3．0或更小，對白細胞的破壞增加，這樣使白細胞的測定困難，如果pH值是9．0或更大，血紅蛋白的穩定性隨時間變差。
Kim的美國專利5612223公開了用於測定全血樣中的血紅蛋白的無氰化物方法與試劑。該試劑包括配體(選自下列化合物咪唑及其衍生物、N-羥乙醯胺、H-羥胺、吡啶、噁唑、噻唑、吡唑、嘧啶、嘌呤、喹啉和異喹啉)以及一種強紅細胞溶解能力的表面活性劑(選自十二烷基二甲基胺氧化物和辛基苯氧基多乙氧基乙醇)。該分析方法快速，不到10秒。然而，該試劑僅在極端鹼性(pH值11-14)條件下操作。此外，Kim沒有說明白細胞計數或區別白細胞亞群的能力。
Stephanos等在「單體血紅蛋白的鐵配體識別」(Biochimica etBiophysica Acta，1295(1996)p209-221)中公開了與血紅蛋白單體結合的有機配體。
Benezra等的美國專利4852338描述了測定血樣中血紅蛋白濃度的方法。該方法包括如下步驟(1)將血樣與一種包括濃度為2-4％的離子表面活性劑的試劑組合物接觸形成反應混合物，其中試劑組合物的pH為11．3-約13．7並且不含離子性氰化物；(2)測定吸光度。該方法僅用於測定血紅蛋白的濃度。Benezra等沒有教導白細胞計數或區別白細胞亞群。
Toda等的美國專利5250437描述了測定血紅蛋白和分析白細胞的一種試劑。該試劑不含氰化物，但含有(1)至少一種季銨鹽與另一種表面活性劑的組合，所述表面活性劑包括季銨鹽、非離子表面活性劑、吡啶鎓鹽、兩性表面活性劑和式R1R2R3N-CH2Ph(其中R1、R2和R3是烷基)的陽離子表面活性劑；和(2)至少一種能氧化血紅蛋白中血紅素的氧化劑。該試劑能將白細胞區分為至少兩個部分。該方法需要使血紅蛋白變性並氧化血紅素。
Larsen的美國專利4529705描述了一種用於白細胞電子計數和血紅蛋白濃度測定的即可稀釋又可溶解血樣的試劑。該試劑包含下列成分的水溶液(1)溶解樣品中血紅細胞的季銨鹽去汙劑(detergent)；(2)至少一種防止血樣中血小板聚集的陰離子，其選自硫酸根、碳酸根、甲酸根和乙酸根；和(3)用於將血紅蛋白轉化為色原的鹼金屬氰化物。該方法提供了使用單一試劑稀釋和溶解血樣用於白細胞計數並測定血紅蛋白濃度的便捷性。但血紅蛋白的測定仍需有氰化物的存在。
如上所述，目前的血紅蛋白測量試劑和方法或存在毒性或缺乏在同一個自動化步驟中就可完成多項診斷分析的能力，例如血紅蛋白測定以及白細胞的計數或白細胞亞群的分類計數。
這就需要新的無氰化物血紅蛋白測定方法和多功能試劑以在同一個自動化步驟中可以完成多項診斷分析。
發明概述綜上所述，本發明的目的是提供一種用於測定血樣中的血紅蛋白濃度並對白細胞計數的即可稀釋又可溶解血樣的新的無氰化物溶解劑組合物。
該無氰化物溶解劑組合物包含足以溶解紅細胞並釋放血紅蛋白量的季銨鹽或吡啶鎓鹽、和足以與血紅蛋白形成穩定的色原量的有機配體、和足以調節用於阻抗測定之溶解試劑電導率量的鹽的水溶液，所述有機配體選自三唑及其衍生物、四唑及其衍生物、4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸(oxonic acid)的鹼金屬鹽、蜜胺、苯胺-2-磺酸、喹哪啶酸、2-氨基-1，3，4-噻二唑、三嗪及其衍生物、尿唑、DL-2-哌啶酸、異煙醯胺、鄰氨基苯甲腈、6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶、3-(2-噻吩基)丙烯酸、苯甲酸以及苯甲酸的鹼金屬鹽和銨鹽、吡嗪及其衍生物。
本發明還提供使用該稀釋並溶解血細胞樣品的新無氰化物溶解劑組合物測定血紅蛋白濃度並對白細胞計數的方法。該方法包括下列步驟(1)將血樣與該新的無氰化物的溶解劑組合物混合以溶解紅細胞並形成穩定的血紅細胞色原；(2)測定該形成的血紅蛋白色原在預定波長處的吸光度；(3)由測定的吸光度計算血紅蛋白總濃度；(4)用DC阻抗測定方法在自動血液分析儀上計數白細胞的數量；和(5)報告所述血樣的白細胞數量。
由隨後對優選實施方案的詳細描述中將更清楚地認識到，本發明與現有技術相比特別有利，它提供了即可稀釋又可溶解血細胞樣品用於血紅蛋白測定和白細胞計數(無需預先稀釋血樣)的新的無氰化物溶解劑組合物。
從隨後的參考附圖的優選實施方案的描述中可以更好地了解本發明。
附圖的簡要描述
圖1a和1b是按照在實施例1中描述的方法使用本發明實施例1的溶解劑組合物處理的全血樣品的吸收光譜(配方1b和1c)。
圖2顯示了按照實施例1的方法使用配方1a的溶解劑組合物處理的血樣的一系列吸收光譜。在十二小時內以一小時間隔總共獲得了十二張圖譜。
圖3a和3b顯示了按照在實施例2中所描述的方法使用實施例2的溶解劑組合物以及標準的磷酸緩衝鹽水和商業血液稀釋劑COULTERISOTON_Ⅲ作為稀釋劑處理的全血樣圖譜。
圖4a至4d顯示了通過在商業血液分析儀COULTER COUNTER_S-Plus Ⅳ型上使用本發明實施例4的溶解劑組合物獲得的四個全血樣品的白細胞亞群分布直方圖。
圖5a和5b顯示了在自動化商業血液分析儀COULTER_STKS上使用常規溶解劑COULTER LYSE S_Ⅲ diff獲得的血紅蛋白濃度和白細胞數量與在相同儀器上使用本發明實施例3的溶解劑組合物(配方3a)獲得的結果之間的相關性。
圖6a和6b顯示了在自動化商業血液分析儀COULTER_STKS上使用COULTER_LYSE S_Ⅲ diff溶解劑獲得的血紅蛋白濃度和白細胞數量與在相同儀器上使用本發明實施例3的溶解劑組合物(配方3b)獲得的結果之間的相關性。
圖7a至7e顯示了在COULTER COUNTER_S-Plus Ⅳ上所獲得的白細胞數量、白細胞差別計數和血紅蛋白濃度與在相同儀器上使用本發明實施例4的溶解劑組合物(配方4a)和稀釋劑獲得的結果的相關性。
圖8a和8b是按照在實施例5中描述的方法使用本發明實施例5的溶解劑和稀釋劑組合物(配方5a和5b)處理的兩個全血樣品的吸收光譜。
圖9a和9b顯示按照在實施例6中所描述的方法使用實施例6的溶解劑和稀釋劑組合物處理的全血樣的圖譜和白細胞亞群的分布直方圖。
圖10a和10b顯示使用實施例7所述的溶解劑(配方7a)和方法測定的全血樣的圖譜和白細胞亞群的分布直方圖。
圖11a和11b顯示使用實施例7所述的溶解劑(配方7b)和方法測定的全血樣的圖譜和白細胞亞群的分布直方圖。
優選實施方案的詳細描述一般來說，要用光度測定法測定血樣中的總血紅蛋白濃度，必須使用溶血試劑溶解紅細胞並釋放血紅蛋白，然後把血紅蛋白轉化成穩定的色原，這種色原可以在預定的波長由紫外光譜發現和測定。對於定量和精確的測定，所形成的色原需要是穩定的，至少在測定的時間範圍內穩定。紅細胞的溶解可以通過酸溶解、滲透溶解和使用各種天然以及合成的表面活性劑完成。釋放的血紅蛋白包括各種形式，如氧合血紅蛋白、脫氧血紅蛋白、高鐵血紅蛋白、碳氧血紅蛋白等。
大多數把血紅蛋白轉化成穩定色原的有效方法是提供配體，該配體對血紅素鐵具有高親和性以形成穩定的血紅蛋白複合物。這已用氰化正鐵血紅蛋白方法成功地證明，其中氰陰離子對血紅素鐵具有極高的親和性。術語血紅蛋白複合物和血紅蛋白色原在本發明上下文中可以互換使用。通常，在缺少高親和性配體的情況下，所形成的血紅蛋白色原不十分穩定。其吸光度有變化，並且在大多數情況下隨時間衰減。在這種情況下，分析方法不可靠(即使很好地監控並校正降解反應的動力學)，因為色原可能對環境(如溫度和樣品製備條件等)十分敏感。當提供了適合的血紅蛋白配體時，血紅蛋白轉變可以是定量的，形成的血紅蛋白複合物的穩定性確保分析方法的可靠性。
配體的選擇取決於要完成的分析，例如，僅用於血紅蛋白測定，或用於多個診斷分析，如血紅蛋白測定同時結合白細胞計數或白細胞亞群分類計數。如果配體不與其它分析相容，對於血紅蛋白測定來說極好的配體可能不適合於後者的應用。Sakata公開的例子(在U．S．5，242，832中)中用於溶解紅細胞並形成Hgb-SLS色原的SLS不能用於白細胞測定。
本發明的第一個實施方案涉及一種無氰化物的溶解劑組合物，該組合物用於測定血樣中總血紅蛋白濃度，或同時進行白細胞計數或白細胞亞群的分類計數。無氰化物溶解劑組合物包含以下物質的水溶液(Ⅰ)至少一種足以溶解紅細胞並釋放量血紅蛋白量的表面活性劑，該表面活性劑選自季銨鹽，由下述分子結構表示 其中R1是有10-18個碳原子的烷基、鏈烯基或炔基；R2、R3和R4是有1-4個碳原子的烷基，X-是氯或溴陰離子；吡啶鎓鹽，由下述分子結構表示 其中n是7-12的整數，X-是陰離子基團；烷基磺酸、或烷基磺酸的鹼金屬鹽；有機磷酸酯，或有機磷酸酯的鹼金屬鹽；
(Ⅱ)足以與血紅蛋白形成穩定的色原量的有機配體，該有機配體選自(a)三唑如1，2，3-三唑和1，2，4-三唑，及三唑衍生物如1，2，4-三唑-3-硫醇、1，2，4-三唑鈉鹽衍生物、三唑二羧酸和三唑的雜環衍生物；(b)四唑及其衍生物如5-氨基四唑；(c)下式的4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸的鹼金屬鹽 其中M是鹼金屬陽離子；(d)蜜胺 (e)苯胺-2-磺酸 (f)喹哪啶酸 (g)2-氨基-1，3，4-噻二唑 (h)下式的三嗪及其衍生物 其中R1、R2和R3是-H、-OH、-SH、-COOH以及三嗪的雜環衍生物；(i)尿唑 (j)DL-2-哌啶酸 (k)異煙醯胺 (l)鄰氨基苯甲腈 (m)6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶 (n)腺嘌呤 (o)3-(2-噻吩基)丙烯酸 (p)下式的苯甲酸或苯甲酸的鹼金屬或銨鹽 其中R是-H、NH4+或鹼金屬陽離子；(q)下式的吡嗪及其衍生物 其中R1、R2R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH或-CONH2。
如本領域普通技術人員所知，上述有機配體的衍生物是指帶有母體化合物的功能部分如三唑環、四唑環和三嗪環的衍生物分子。
溶解劑組合物的pH是1-13。
在表面活性劑中，季銨鹽是更優選的。在溶解劑組合物中的表面活性劑的濃度需要足以溶解紅細胞並釋放血紅蛋白、而同時保存白細胞核。為了對白細胞計數，不需要使白細胞膜保持完整。一般來說，使用上述的本發明溶解劑組合物中的表面活性劑時，當紅細胞完全溶解和破壞時，白細胞膜部分溶解。白細胞留下的核使得可以使用DC阻抗方法計數白細胞並將白細胞亞群區別成淋巴細胞、單核細胞和粒細胞。在溶解劑組合物中的表面活性劑濃度是大約2g／L至大約250g／L，優選地是大約4g／L至大約80g／L。
在溶解劑組合物中的有機配體的濃度需要足以形成穩定的血紅蛋白色原。該濃度隨配體類型變化而變化，取決於配體對血紅蛋白的親和性。一般來說，如果在溶解劑組合物中的配體的量不足，所形成的血紅蛋白色原不穩定。發現在本發明的溶解劑組合物中的有機配體的濃度在大約1g／L至大約30g／L、優選地大約2g／L至大約15g／L的寬範圍中有效。
在溶解劑組合物中的化學成分的濃度就是在採用常用的血液分析儀使用適合的血液稀釋劑進行血紅蛋白及白細胞測定的條件下的濃度。然而，化學成分的濃度可以依賴於溶解劑組合物和稀釋劑的體積比而改變。
任選性的添加劑也可以包含在溶解劑組合物中，濃度使其存在與溶解劑組合物的主要功能組分相容即可。這些添加劑有保存劑，它具有抗氧化性質(以增加組合物的貨架壽命)以及抗微生物性質。
本發明的第一實施方案還涉及使用上述無氰化物溶解劑組合物測定血樣中的總血紅蛋白濃度、或同時對白細胞計數或對白細胞亞群的分類計數的方法。
將抗凝結的血樣通過適合的血液稀釋劑稀釋，然後將足量的上述溶解劑組合物與所稀釋的樣品手工混合或機械混合。血液的稀釋比是大約125∶1至大約500∶1(總試劑量相對於血液)。然後在添加溶解劑組合物後8-60秒在紫外分光計上或在裝備有紫外檢測器的自動血液分析儀上、在預定的用於總血紅蛋白測定的吸光波長下用光度法測定樣品混合物。也可以將樣品混合物引入裝備有紫外檢測器和DC阻抗測定裝置的血液分析儀中，以測定血樣的血紅蛋白濃度和對白細胞計數，或基於所獲得的群體分布直方圖進一步區別白細胞亞群。在後一種情況下，白細胞分成三個亞群，包括淋巴細胞，單核細胞和粒細胞。
利用裝備有DC阻抗測定裝置的血液分析儀對白細胞計數的檢測方法在Wallace H．Coulter的美國專利2，656，508中有綜合描述，其內容整個引入本文作為參考。使用DC阻抗測定法區別白細胞亞群的方法在美國專利4，485，175和4，528，274中有描述。
以上所述的有機配體(如三唑和蜜胺)不僅可以與血紅蛋白形成穩定的色原，而且使白細胞在處理的樣品混合物中穩定。該白細胞穩定效果阻止了白細胞溶解和核收縮，有利於基於其核體積分離白細胞亞群，並使得可能在大範圍pH值內將白細胞分成三個亞群。實施例4說明了在本發明的溶解劑組合物中使用白細胞穩定化配體的成功例子。
另一方面，上述的一些有機配體(如苯胺-2-磺酸和喹哪啶酸)表現出對白細胞亞群的核大小的中等到強的衝擊。當這些配體用於血紅蛋白測定時，白細胞亞群破裂成一或兩個組，使白細胞的區別變得困難。然而，即使有這些配體，白細胞核大小遠保持在溶解劑組合物處理樣品後的細胞碎片之上，並在常用的DC阻抗測定裝置的檢測限之上，這樣，如在實施例3中的應用所說明的，白細胞的精確計數可以方便地在商業血液分析儀上完成。
一般來說，包含上述有機配體和表面活性劑的第一實施方案的溶解劑組合物可以在非常大範圍的pH值內測定血樣的總血紅蛋白濃度。優選地，一種或幾種季銨鹽與任何有機配體的結合用於提供通過DC阻抗測定方法測定血樣中的總血紅蛋白濃度和白細胞計數。更優選地，一種或幾種季銨鹽與和白細胞分類分析相容的有機配體的結合用於提供血樣的總血紅蛋白濃度的測定、白細胞計數和白細胞亞群的分類計數。在最優選的方式中，白細胞被分成三個亞群，包括淋巴細胞、單核細胞和粒細胞。
無氰化物溶解劑組合物和使用該組合物的方法與現有技術的血紅蛋白測定方法相比具有幾個優點。本發明使得可以在無氰化物的條件下精確測定血樣中的血紅蛋白濃度並確定白細胞數量或將白細胞亞群區別成淋巴細胞、單核細胞和粒細胞。溶解劑組合物將存在於血樣中的血紅蛋白在大約8秒-60秒(取決於所使用的有機配體與稀釋劑)迅速轉化成穩定的色原，使得可以進行快速自動分析。血紅蛋白色原一旦形成，在測定時期是穩定的。
圖2顯示了按照實施例1的方法使用配方1a的溶解劑組合物(包含四唑作為血紅蛋白配體、COULTER_ISOTON_Ⅱ(商業血液稀釋劑)作為稀釋劑)處理的血樣的一系列吸收光譜。圖2說明了在添加溶解劑組合物後從12秒至12小時(以一個小時的間隔)獲得的十二個圖譜。Hgb-四唑色原的圖譜十分穩定，在十二小時的數據收集期間沒有表現出任何變化或衰減。
具體血紅蛋白色原的性質取決於用於溶解劑組合物的有機配體。通過使用以上所述的有機配體用本發明的溶解劑組合物處理血樣形成的大多數色原在大約510nm至大約560nm具有最大吸光度。因此，色原可以通過大部分商業的血液分析儀結合具體色原的吸光係數測定。
第一實施方案的溶解劑組合物可以與許多適合的血液稀釋劑一起使用。圖3顯示了使用包含四唑的溶解劑組合物(實施例2)、並使用標準的磷酸緩衝鹽水和商業血液稀釋劑COULTER_1SOTON_Ⅲ作為稀釋劑由上述方法處理的全血樣的圖譜。用這兩種稀釋劑，基本上形成了相同的血紅蛋白色原，可以在540nm下測定。
不同於以前的試劑，上述的溶解劑組合物具有寬範圍的pH值(1-13)。這加寬了可以用作血紅蛋白配體的化學藥品的範圍。例如，4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸的鉀鹽與血紅蛋白形成穩定的色原，在538nm具有強吸光度。然而，4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸的鉀鹽僅在低pH值(小於pH3)下易溶於水中。以前的中性和鹼性試劑不可能使用這種化學物質用於血紅蛋白的測定。Sakata在美國專利5，242，832中說明如果pH值是3．0或更低，對白細胞的破壞增加，這樣使白細胞的測定變得困難。圖4顯示了按照本發明的方法使用實施例4的溶解劑組合物(含有0．5％的4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸鉀鹽，並具有2．3的pH值)和COULTER_lSOTON_Ⅲ(作為稀釋劑)所獲得的白細胞亞群分布直方圖。如圖4c和4d所說明的，白細胞被清楚地分成淋巴細胞、單核細胞和粒細胞。圖6b顯示了在商業自動血液分析儀COULTER_STKS上獲得的白細胞數量與在相同的儀器上使用實施例3的溶解劑組合物之一(配方3b)獲得的結果之間具有極好的線性相關性，其中溶解劑組合物的pH值僅為1．67。
第一實施方案的溶解劑組合物和使用該組合物的方法提供了精確的血紅蛋白測定、精確的白細胞計數以及白細胞亞群的分類計數。圖5a和6a顯示了在COULTER_STKS上使用常用的溶解劑獲得的血紅蛋白濃度和使用實施例3的溶解劑組合物(配方3a和3b)獲得的血紅蛋白濃度之間具有極好的線性相關性。圖5b和6b說明了在COULTER_STKS上獲得的白細胞數量和在相同的儀器上使用配方3a和3b所獲得的結果之間具有極好的相關性。
該實施方案的溶解劑組合物提供了在常見的幹擾材料存在下精確的血紅蛋白測定。總共72個全血樣品在COULTER_STKS上使用實施例3的配方3a分析。樣品的70％是各種疾病(如鐮狀細胞危象和C型肝炎)的臨床樣品。已知這些異常的血液含有異常血紅蛋白和血紅蛋白測定的幹擾材料。然而，使用本發明的溶解劑組合物和方法的測定結果與常用的氰化物-Hgb方法相關性極好(如由圖5和6所示)，這表明了各種臨床樣品的總血紅蛋白濃度都可以通過使用本發明的溶解劑組合物測定。
本發明的第二個實施方案涉及另一種利用有機配體穩定血紅蛋白的功能的方式，它是將有機配體添加到血液稀釋劑而非溶解劑組合物中。按照以上所述的方法，血樣在與溶解劑混合之前使用血液稀釋劑預先稀釋。當稀釋劑含有以上所述的有機配體時，在通過溶解劑從紅細胞釋放之後的樣品混合物中的血紅蛋白分子立即與有機配體接觸以形成穩定的血紅蛋白色原。因此，該替代方式用於血樣中血紅蛋白測定的相同目的。然而，它使試劑設計者基於其特定需要(例如，有機配體對溶解劑或稀釋劑需要進行的血紅蛋白測定以外的其它檢測的相容性，或有機配體對溶解劑或稀釋劑中的其它化學成分的相容性)可以選擇最適合的方式。實施例5說明了有機配體在血液稀釋劑中這種應用以形成穩定的血紅蛋白色原，其中的溶解劑僅含有表面活性劑。圖9a顯示了按照實施例6的方法使用包含三唑作為血紅蛋白配體的稀釋劑處理的血樣的圖譜。色原的特徵與使用在圖1a中顯示的包含相同配體的溶解劑組合物所獲得的色原的特徵相同。圖9b顯示了通過使用實施例6的稀釋劑在COULTER COUNTER_S-Plus Ⅳ上獲得的血樣的白細胞分布直方圖，其中溶解劑僅含有表面活性劑。該例子顯示了當以這種替代方式使用時，有機配體與白細胞分類分析的相容性。
本發明的第三個實施方案使用單一溶解劑組合物稀釋並溶解血細胞樣品用於血紅蛋白測定以及白細胞分析，而無需用血液稀釋劑進行預稀釋。在該方法中，調節第一個實施方案的溶解劑組合物中的化學成分的濃度至足以溶解紅細胞並形成穩定的血紅蛋白色原。為進行白細胞計數或分類計數白細胞亞群，調節該同一溶解劑組合物的電導率使其可用於阻抗測定。通過加入足夠量的一種或多種鹽調節電導率。用於本發明的該單一的溶解劑組合物的適宜鹽包括各種陰離子的鹼金屬鹽。適宜的實例包括硫酸、鹽酸、甲酸、乙酸和檸檬酸的鹼金屬鹽及鹼金屬碳酸氫鹽。需加入足以調節所述溶解劑的電導率至使用自動血液分析儀可進行測定的水平的鹽。使用該單一溶解劑，可將血細胞樣品中的白細胞區分為至少兩個亞群，優選區分為三個亞群，同時可測定血紅蛋白濃度並計數白細胞總數。如附圖10b和11b所示，使用實施例7的單一溶解劑可獲得兩個白細胞亞群，它們是淋巴樣細胞和髓樣細胞群。
用於該單一溶解劑的表面活性劑包括季銨鹽和吡啶鎓鹽，在第一個實施方案中對它們進行了詳細描述。優選將季銨鹽用於該單一溶解劑。該單一溶解劑中的表面活性劑和有機配體的濃度通常低於與稀釋劑使用的溶解劑組合物中的濃度。表面活性劑的濃度為約0．3g／L-約200g／L。有機配體的濃度為約0．1g／L-約30g／L。該單一溶解劑的pH範圍和與稀釋劑使用的溶解劑的pH略有不同。該單一溶解劑的pH為約3-約13，優選為約3．5-約11。實施例7顯示了兩個單一試劑方法的實例。
單一試劑方法提供了一步樣品製備法，降低了設備的成本。
下列實施例是對本發明的說明，決不能解釋為限制如在權利要求書中所定義的本發明的範圍。可以理解按照以上公開的內容，可以使用不同的其它成分和比例。
實施例1製備下列組成的試劑。配方1a四唑5．0g十四烷基三甲基溴化銨15．0g蒸餾水，調整至1升pH2．77配方1b三唑 10．0g十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液)35．0ml十四烷基三甲基溴化銨 3．5g蒸餾水，調整至1升pH6．19配方1c喹哪啶酸 5．0g十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液)50．0ml蒸餾水，調整至1升pH2．55配方1d蜜胺 5．0g十四烷基三甲基溴化銨 3．6g十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液)36．0ml蒸餾水，調整至1升pH4．55配方le四唑 5．0gChemfac NB-104(由Chemax公司製造的複合磷酸鹽)30．0g蒸餾水，調整至1升pH7．11
用2500μl的ISOTON_Ⅱ稀釋11．6μl的全血樣品，然後將403μl的上述溶解劑組合物之一與預先稀釋的樣品手工混合。立即在BeekmanDU 7500分光光度計上測定樣品的吸收光譜。圖1a和1b顯示了按照上述方法使用配方1b和1c處理的血樣的圖譜。圖2顯示了從按照上述方法使用配方1a處理的血樣獲得的總共十二個圖譜。在添加溶解劑組合物之後從12秒-12小時以一小時的間隔獲得的圖譜。
實施例2製備下列組成的試劑。四唑 5．0g十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液) 36．0ml十四烷基溴化銨 3．6g蒸餾水 1升pH 2．73用2500μl的血液稀釋劑稀釋11．6μl的全血樣品，然後將403μl的上述溶解劑組合物與預先稀釋的樣品手工混合。立即在Beekman DU7500分光光度計上測定樣品的吸收光譜。使用了五種商業血液稀釋劑用於血紅蛋白測定，即COULTER_ISOTON_Ⅲ、COULTER_ISOTON_Ⅱ、Technicon H·TMSystems RBC DIL(Technicon儀器公司的商品)、標準磷酸緩衝鹽水和標準氯化鈉鹽水。所形成的色原在大約540nm具有最大吸收峰，在大約565nm具有肩峰。當不同的稀釋劑用於血紅蛋白測定時，色原的最大吸收僅有輕微不同，即用ISOTON_Ⅲ在540nm，ISOTON_Ⅱ、Technicon H·TMSystems RBC DIL以及標準的磷酸緩衝鹽水在539nm，標準的氯化鈉鹽水在538nm。在添加上述溶解劑組合物之後，色原在8秒-約35秒(取決於使用的血液稀釋劑)後立即形成。圖3顯示了按照上述方法使用標準的磷酸緩衝鹽水和ISOTON_Ⅲ(作為稀釋劑)獲得的圖譜。
實施例3製備下列組成的試劑。配方3a四唑 5．0g十四烷基三甲基溴化銨 15．0g蒸餾水，調整至1升pH12．06配方3b苯胺-2-磺酸 5．0g十四烷基三甲基溴化銨 10．0g十六烷基三甲基溴化銨 4．0g蒸餾水1升pH1．67配方3c喹哪啶酸 5．0g十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液)40．0ml蒸餾水1升pH2．58將大約70個血樣(其血紅蛋白濃度為6-17g／dL，白細胞數目為1，000／μL-40，000／μL)在校準的COULTER_STKS儀器上在標準儀器設置下(除溶解劑外，LYSE S_Ⅲ diff由上述製劑代替)分析。對於每一種配方，大約一半樣品是各種疾病的臨床樣品。在配方3a的情況下，70％樣品是臨床樣品。圖5顯示了通過使用參考試劑(LYSE S_Ⅲdiff)獲得的血紅蛋白濃度和白細胞數量(表示為以103／μL為單位的WBC)與在相同的儀器上使用配方3a獲得的結果之間的相關性。圖6顯示了通過使用LYSE S_Ⅲ diff獲得的血紅蛋白濃度和白細胞數量與在相同的儀器上使用配方3b獲得的結果之間的相關性。
圖5和6說明了在血紅蛋白濃度和WBC測定上本發明的溶解劑組合物和常用的含氰化物溶解劑之間極好的線性相關性。
實施例4製備下列組成的試劑。
溶解劑配方4a三唑10．0g十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液) 35．0ml十四烷基三甲基溴化銨3．5g蒸餾水，調整至1升pH 6．39配方4b4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸鉀鹽 5．0g十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液) 35．0ml十四烷基三甲基溴化銨3．5g蒸餾水，調整至1升用HCl將pH調整至2．3稀釋劑硫酸鈉 9．7g氯化鈉 4．0g蒸餾水，調整至1升用1％NaOH將pH調整至7．14將85個血樣(其血紅蛋白濃度為6-17g／dL，白細胞數目為1，500／μL-45，000／μL)在校準的COULTER COULTER_S-Plus Ⅳ上在標準儀器設置下使用參考試劑LYSE S_Ⅲ diff和ISOTON_Ⅲ分析。然後在相同的儀器上再次分析相同的樣品，只是溶解劑LYSE S_Ⅲ diff由上述溶解劑組合物代替，ISOTON_Ⅲ由上述稀釋劑代替。圖4顯示了在COULTER COULTER_S-Plus上獲得的四個血樣的白細胞亞群分布直方圖。圖4a和4b使用配方4a和上述稀釋劑獲得，其中圖4a顯示了正常血液的直方圖，圖4b顯示了具有高單核細胞的血樣的直方圖。圖4c和4d使用配方4b和ISOTON_Ⅲ獲得，其中圖4c顯示了正常血液的直方圖，圖4d顯示了具有大於90％粒細胞的臨床樣品的直方圖。圖7a-7e顯示了使用參考試劑獲得的白細胞數量(以103／μL為單位的WBC，圖7a)、淋巴細胞％(圖7b)、單核細胞％(圖7c)、粒細胞％(圖7d)和血紅蛋白濃度(圖7e)與使用配方4a和上述稀釋劑獲得的結果之間的相關性。回歸曲線的相關係數、斜率和截距說明了血紅蛋白濃度、WBC、淋巴細胞％和粒細胞％極好的線性相關性，以及對單核細胞％的良好相關性。
實施例5溶解劑十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液) 36．0ml十四烷基三甲基溴化銨3．6g蒸餾水，調整至1升pH 6．88稀釋劑配方5a四唑5g標準磷酸緩衝鹽水1升pH 3．86配方5b2-氨基-1，3，4-噻唑5．0g硫酸鈉 9．7g氯化鈉 4．0g蒸餾水，調整至1升pH 6．04用2500μl的上述稀釋劑之一稀釋11．6μl的全血樣品，然後將403μl的上述溶解劑組合物與預先稀釋的樣品手工混合。立即在BeekmanDU 7500分光光度計上測定樣品的吸收光譜。圖8a至8b顯示了按照上述方法分別使用配方5a和5b處理的血樣的圖譜。
實施例6溶解劑十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液) 36．0ml十四烷基三甲基溴化銨 3．6g蒸餾水，調整至1升pH 6．88稀釋劑三唑 5．0g硫酸鈉 9．7g氯化鈉 4．0g蒸餾水，調整1升pH 6．06將10個血樣在校準的COULTER COULTER_S-Plus Ⅵ上使用上述的溶解劑和稀釋劑分析。圖9a顯示了在COULTER COULTER_S-Plus上獲得的血樣的白細胞亞群分布直方圖。這些樣品也在分光計上按照實驗5中描述的方法使用上述溶解劑和稀釋劑處理和測定。圖9a顯示了用於圖9b的相同血樣的光譜。光譜和白細胞亞群分布直方圖與三唑用於溶解劑組合物時獲得的特徵相同。
實施例7配方7a十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液) 5．0ml三唑3．0g硫酸鈉 15．9g蒸餾水，調整至1升pH 6．30配方7b十二烷基三甲基氯化銨(50％溶液) 5．0ml四唑1．0g硫酸鈉 15．9g蒸餾水，調整至1升pH 3．69將10微升全血樣品與2．5毫升上面的配製品之一手工混合。立即在Beckman DU 7500分光光度計上測定吸收譜。附圖10a和11a顯示了分別加入配製品7a和7b後15秒測得的光譜。在血液學實驗分析儀上，將另外的12微升全血樣品與3．0毫升上面的配製品之一自動化混合。在加入溶解劑10秒後，通過DC阻抗測定分析樣品混合物。附圖10b和11b顯示了獲得的白細胞亞群分布直方圖。如本領域普通專業技術人員所知，根據與溶解劑接觸的白細胞的大小，調整DC阻抗測定的增益以覆蓋所有的細胞範圍。
權利要求
1．一種稀釋並溶解血細胞樣品用於測定血紅蛋白濃度和白細胞計數的無氰化物溶解劑組合物，該組合物包含下列物質的水溶液(Ⅰ)一種由下列分子結構式表示的季銨鹽 其中R1是有10-18個碳原子的烷基、鏈烯基或炔基；R2、R3和R4是有1-4個碳原子的烷基，X-是氯或溴陰離子；或一種由下列分子結構表示的吡啶鎓鹽 其中n是7-12的整數，X-是陰離子基團；其中季銨鹽或吡啶鎓鹽的含量足以溶解紅細胞並釋放血紅蛋白；(Ⅱ)足以與血紅蛋白形成穩定色原量的有機配體，該有機配體選自(a)三唑及其衍生物；(b)四唑及其衍生物；(c)下式的4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸的鹼金屬鹽 其中M是鹼金屬陽離子；(d)蜜胺 (e)苯胺-2-磺酸 (f)喹哪啶酸 (g)2-氨基-1，3，4-噻二唑 (h)下式的三嗪及其衍生物 其中R1、R2和R3是-H、-OH、-SH、-COOH以及三嗪的雜環衍生物；(i)尿唑 (j)DL-2-哌啶酸 (k)異煙醯胺 (l)鄰氨基苯甲腈 (m)6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶 (n)3-(2-噻吩基)丙烯酸 (o)下式的苯甲酸或苯甲酸的鹼金屬或銨鹽 其中R是-H、NH4+或鹼金屬陽離子；和(p)下式的吡嗪及其衍生物 其中R1、R2R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH或-CONH2；以及(Ⅲ)足以調節溶解劑的電導率以進行阻抗測定量的鹽。
2．權利要求1的溶解劑組合物，其中用於調節溶解劑的電導率的鹽包括鹼金屬硫酸鹽、氯化物、甲酸鹽、乙酸鹽、檸檬酸鹽和碳酸氫鹽。
3．權利要求1的溶解劑組合物，其中所述的表面活性劑包含大約0．3g／L至大約200g／L濃度的季銨鹽。
4．權利要求1的溶解劑組合物，其中所述的表面活性劑包含大約0．5g／L至大約130g／L濃度的吡啶鎓鹽。
5．權利要求1的溶解劑組合物，其中所說的有機配體的濃度為大約0．1g／L至大約30g／L。
6．一種稀釋並溶解血細胞樣品用於測定血紅蛋白濃度和白細胞計數的無氰化物溶解劑組合物，該組合物包含下列物質的水溶液(Ⅰ)一種由下列分子結構式表示的季銨鹽 其中R1是有10-18個碳原子的烷基、鏈烯基或炔基；R2、R3和R4是有1-4個碳原子的烷基，X-是氯或溴陰離子；其中季銨鹽的含量足以能溶解紅細胞並釋放血紅蛋白；(Ⅱ)足以形成穩定的血紅蛋白色原量的三唑及其衍生物；和(Ⅲ)足以調節溶解劑的電導率以進行阻抗測定量的鹽。
7．一種稀釋並溶解血細胞樣品用於測定血紅蛋白濃度和白細胞計數的無氰化物溶解劑組合物，該組合物包含下列物質的水溶液(Ⅰ)一種由下列分子結構式表示的季銨鹽 其中R1是有10-18個碳原子的烷基、鏈烯基或炔基；R2、R3和R4是有1-4個碳原子的烷基，X-是氯或溴陰離子；其中季銨鹽的含量足以能溶解紅細胞並釋放血紅蛋白；(Ⅱ)足以形成穩定的血紅蛋白色原量的四唑及其衍生物；和(Ⅲ)足以調節溶解劑的電導率以進行阻抗測定量的鹽。
8．一種使用稀釋並溶解血細胞樣品的無氰化物溶解劑組合物測定血樣的總血紅蛋白濃度和白細胞計數的方法，該方法包括(1)將血樣與溶解紅細胞並形成穩定的血紅蛋白色原的無氰化物溶解劑組合物混合，其中所述溶解劑組合物包含下列物質的水溶液(Ⅰ)一種由下列分子結構式表示的季銨鹽 其中R1是有10-18個碳原子的烷基、鏈烯基或炔基；R2、R3和R4是有1-4個碳原子的烷基，X-是氯或溴陰離子；或一種由下列分子結構表示的吡啶鎓鹽 其中n是7-12的整數，X-是陰離子基團；其中季銨鹽或吡啶鎓鹽的含量足以能溶解紅細胞並釋放血紅蛋白；(Ⅱ)足以與血紅蛋白形成穩定色原量的有機配體，該有機配體選自(a)三唑及其衍生物；(b)四唑及其衍生物；(c)下式的4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸的鹼金屬鹽 其中M是鹼金屬陽離子；(d)蜜胺 (e)苯胺-2-磺酸 (f)喹哪啶酸 (g)2-氨基-1，3，4-噻二唑 (h)下式的三嗪及其衍生物 其中R1、R2和R3是-H、-OH、-SH、-COOH以及三嗪的雜環衍生物；(i)尿唑 (j)DL-2-哌啶酸 (k)異煙醯胺 (l)鄰氨基苯甲腈 (m)6-氮雜-2-硫代胸腺嘧啶 (n)3-(2-噻吩基)丙烯酸 (o)下式的苯甲酸或苯甲酸的鹼金屬或銨鹽 其中R是-H、NH4+或鹼金屬陽離子；和(p)下式的吡嗪及其衍生物 其中R1、R2R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH或-CONH2；以及(Ⅲ)足以調節溶解劑的電導率以進行阻抗測定量的鹽。(2)在預定的波長下測定形成的血紅蛋白色原的吸光度；(3)由所測定的吸光度計算所述血樣的總血紅蛋白濃度；(4)在自動血液分析儀中用DC阻抗測定法計數白細胞的數量；和(5)報告所述血樣的白細胞數量。
9．權利要求8的方法，其中所形成的血紅蛋白色原在大約510nm至大約560nm具有最大吸光度。
10．權利要求8的方法，其中所述溶解劑組合物包含下列物質的水溶液(Ⅰ)一種由下列分子結構式表示的季銨鹽 其中R1是有10-18個碳原子的烷基、鏈烯基或炔基；R2、R3和R4是有1-4個碳原子的烷基，X-是氯或溴陰離子；其中季銨鹽的量在用於測定血紅蛋白濃度中足以溶解紅細胞並釋放血紅蛋白，在白細胞分類分析中還保持白細胞亞群的核；和(Ⅱ)足以與血紅蛋白形成穩定色原量的有機配體，該有機配體選自(a)三唑及其衍生物；(b)四唑及其衍生物；(c)蜜胺 (d)下式的4，6-二羥基-1，3，5-三嗪-2-羧酸的鹼金屬鹽 其中M是鹼金屬陽離子；(e)2-氨基-1，3，4-噻二唑 (f)尿唑 (g)DL-2-哌啶酸 (h)異煙醯胺 (i)下式的吡嗪及其衍生物 其中R1、R2R3和R4是-H、-CN、-OH、-SH、-COOH或-CONH2；和(Ⅲ)足以調節溶解劑的電導率以進行阻抗測定量的鹽。
11．權利要求10的方法，其中所述季銨鹽的濃度為約0．3g／L-約20g／L。
12.權利要求10的方法，還包括下列步驟按照群體分布直方圖區分白細胞亞群；和報告白細胞亞群的數量。
13.權利要求10的方法，其中的有機配體是三唑。
14.權利要求10的方法，其中的有機配體是四唑。
15.權利要求12的方法，其中的白細胞被區分為至少兩個亞群。
全文摘要
本發明描述了一種用於測定血樣中總血紅蛋白濃度、計數白細胞和分類計數三種白細胞亞群的無氰化物的溶解劑組合物以及方法。所說的無氰化物溶解劑組合物包含溶解紅細胞並釋放血紅蛋白的季銨鹽或吡啶鎓鹽、與血紅蛋白形成穩定色原的有機配體和調節試劑以進行阻抗測定的鹽,所述有機配體選自:三唑及其衍生物、四唑及其衍生物、4,6－二羥基－1,3,5－三嗪－2－羧酸、蜜胺、苯胺－2－磺酸、喹哪啶酸、2－氨基－1,3,4－噻二唑、三嗪及其衍生物、尿唑、DL－2－哌啶酸、異煙醯胺、鄰氨基苯甲腈、6－氮雜－2－硫代胸腺嘧啶、腺嘌呤、3－(2－噻吩基)丙烯酸、苯甲酸和苯甲酸的鹼金屬和銨鹽、吡嗪及其衍生物。無需預稀釋血樣即可將溶解劑組合物與血樣混合併在預定吸收波長測定樣品混合物的UV吸收。在自動細胞計數儀上,利用DC阻抗測定方法同時進行白細胞計數和白細胞亞群分類計數。
文檔編號G01N33/72GK1294682SQ99804278
公開日2001年5月9日 申請日期1999年3月16日 優先權日1998年3月24日
發明者李毅, C·楊 申請人:庫特國際公司